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CROMATOGRAFA DE ENLAZAMIENTO METLICO

Este es un tipo de cromatografa cuyo principio fue sugerido en 1961 por Hellferich quin
la nombr Cromatografa de Intercambio de Ligando (LEC) y en 1975 Porath y col.
publicaron un trabajo donde la llamaron Cromatografa de Afinidad por Quelatos Metlicos
(MCAC) y posteriormente se han usado otros nombres tal como Cromatografa de Afinidad
por el Ion Metal Inmovilizado (IMAC).

Independientemente del nombre que se le haya dado, esta cromatografa se basa en dos
principios fundamentales:

Primero: La habilidad que tienen muchos metales de transicin (Ni, Co, Zn, Cu) de formar
complejos estables con compuestos (Ligandos) capaces de enlazarse a metales,
previamente inmovilizados en una matriz cromatogrfica.

Segundo: La afinidad que tienen las protenas, dado fundamentalmente por los residuos
aminocidos Cistena e Histidina, de formar complejos reversibles con estos metales.

Dentro de los Ligandos utilizados para la formacin del quelato con el metal tenemos:
aminocidos carboximetilados, cidos salislico, 8-hidroxiquinolina, EDTA y el cido
imidodiactico (IDA), que es el ms usado ya que forma diferentes complejos metlicos
multicoordinados de acuerdo con su situacin espacial (Figura 1).

Figura 1. Mecanismo de formacin del complejo metlico.

 Cromatografa de Enlazamiento Metlico
La Sepharose-CL-6B, constituye un medio verstil para producir adsorbentes para este tipo
de cromatografa.

Las diferentes etapas del proceso cromatogrfico por IMAC se resumen en la Figura 2.

Figura 2. Principio de la cromatografa de afinidad de ion metlico inmovilizado.

Etapa I: Inmovilizacin del Ion metal.

Los iones metlicos mencionados pueden formar enlaces de coordinacin con molculas
que contengan O, N y S por interacciones Ion-dipolo.

La estructura del complejo formado debe ser tal que algunos sitios de coordinacin queden
libre para enlazar las molculas de soluto o solvente. Estos ltimos ocuparn los sitios de
coordinacin libres del metal, en ausencia de soluto con mayor afinidad por el Ion metal.

Etapa II: Adsorcin de la protena.

Ocurre mediante el desplazamiento de las molculas del solvente o buffer e interaccin del
metal con los grupos imidazoles de las Histidinas y los tioles de las Cistenas expuestos en
la superficie de la protena o sea que se ha observado que el sitio de enlace est separado
del sitio catalticamente activo, por ejemplo la enzima Nuclesido difosfatasa enlazada a
geles con Zn 2+ y Cu2+ exhibi prcticamente toda su actividad cataltica. Por otra parte se
ha demostrado que el Fe 3+ enlazado a IDA Sepharose tiene una afinidad especfica para
protenas que contienen tirosina.

Etapa III: Desorcin de la protena.

Esta desorcin puede ser debido a diferentes molculas o iones que entran a formar
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 Cromatografa de Enlazamiento Metlico
complejos ms estables o debido a que el complejo se colapsa cuando el medio es
alterado.

Etapa IV: Regeneracin de la columna.

Una vez eluida la protena, se regenera la matriz. Esta regeneracin puede ser pasando
una solucin que contenga el ion metlico (Ej. Sulfato de cobre 50 mM) usada
fundamentalmente cuando se va a continuar trabajando o pasando un agente quelante.
(Ej. EDTA), para eliminar el metal, y luego incorporarlo nuevamente, usado cuando se
emplean iones con fuerza complejante dbil (Co 2+, Zn2+ ). No obstante como regla general
se recomienda, entre corridas, eliminar el ion metal de la matriz y recargar el soporte
antes del prximo experimento.

Esta tcnica ha sido utilizada con xito en la purificacin de protenas, cidos nucleicos y
para inmovilizar enzimas.

Algunos detalles prcticos de IMAC

Para una protena con propiedades desconocidas, se recomienda usar Cu 2+ como metal y
buffer de acetato o fosfato a pH neutro con NaCl 0,15-0,5 M en los experimentos iniciales.
Si los resultados no son satisfactorios se realizaran otros experimentos con variacin del
ion metal, pH y composicin del buffer.

La saturacin de la columna en el caso del Cu 2+ puede ser seguida mediante la observacin

del calor azul de la matriz.

Cuando se usa Zn2+, la saturacin se comprueba mediante la formacin de un precipitado

en el eluato por adicin de Na2CO3.

La muestra debe estar previamente equilibrada con buffer inicial por dilisis para eliminar
componentes por ejemplo aminas que pueden interferir en el paso de adsorcin.

La elucin se puede hacer por gradientes descendientes de pH, elucin competitiva por
gradientes ascendentes de sulfato de amonio, histidina o imidazol, por adicin de solventes
orgnicos y tambin por adicin de agentes quelantes como el EDTA. En este ltimo caso,
todas las protenas adsorbidas eluirn indiscriminadamente con el ion metal.

Algunas aplicaciones.

Purificacin de CuZn-SOD de eritrocitos humanos usando Cu 2+-IMAC. (Figura 3).

Purificacin de 1-Antitripsina (Figura 4) y 2Macroglobulina (Figura 5) del plasma

humano usando Zn2+-IMAC.

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 Cromatografa de Enlazamiento Metlico

Figura 3. Cu2+-IMAC de Cu, Zn SOD. (A) Aplicacin de una solucin de SOD (365 mL),
lavando con 3200mL 10 mM de un buffer de fosfato de potasio, pH 6,4, conteniendo 1 M
de NaCl , 400mL de mismo buffer sin NaCl y (B) con 300 mL de 10 mM de acetato de
sodio. La elucin de la enzima con 20 mM de un buffer de citrato, pH 5,0. Velocidad de
flujo 150 mL /h.

Figura 4. Purificacin de 1-antitripsina (1AT) por Zn2+-IMAC. A 700 mL de muestra de

1AT en 50 mM de fosfato de sodio, 150 mM NaCl, pH 8,0, preparado de 1 L de plasma
humano por precipitacin con (NH 4)2SO4 se carg en una columna de quelato de Zn 2+ de
2,5 x 90 cm, equilibrada en el buffer de la muestra a una velocidad de flujo de 100 mL/h.
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 Cromatografa de Enlazamiento Metlico
La elucin de la muestra se comenz con el mismo buffer, y fracciones de 25 mL se
colectaron. En la fraccin 65 el buffer se cambi a 50 mM de fosfato de sodio, 150 mL de
NaCl, pH 6,5 y fracciones de 12 mL se colectaron. La columna fue lavada con 50 mM EDTA,
500 mM de NaCl, pH 7,0 hasta la fraccin 110. , A 280 ; x , Actividad especfica de 1AT.

Figura 5. Purificacin de 2-macroglobulina (2M) por Zn2+-IMAC. A 140 mL de muestra

de 2M en 50 mM fosfato de sodio, 20 mM NaCl, pH 6,0 preparado de 1 L de plasma
humano por precipitacin con (NH 4)2SO4 se carg en una columna de quelato de Zn 2+ de
2,5 x 14 cm equilibrada con 20 mM de fosfato de sodio, 150 mM NaCl, pH 6.0 a una
velocidad de flujo de 100 mL/h. La elucin de la muestra se comenz con el mismo buffer,
y se colectaron fracciones de 20 mL . En la fraccin 30 el buffer se cambi a cacodilato de
sodio 20 mM. NaCl 150 mM, pH 5,0 y se colectaron fracciones de 11 mL , , A 280; x
actividad especfica de 2M. El material de 2M en las fracciones 36-38 fue homognea
segn electroforesis en gel de poliacrilamida.

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