Anda di halaman 1dari 8

PEMERIKSAAN HbsAg

A. PRA ANALITIK
1. Ketatausahaan
Pemberian identitas pasien dan atau spesimen merupakan hal yang
penting, baik pada saat pengisian surat pengantar/formulir permintaan
pemeriksaan, pendaftaran, pengisian label wadah spesimen.
Pada surat pengantar/formulir permintaan pemeriksaan laboratorium
sebaiknya memuat secara lengkap:
a. Tanggal permintaan
b. Tanggal dan jam pengambilan spesimen
c. Identitas pasien (nama, umur, jenis kelamin, alamat/ruang) termasuk
rekam medik.
d. Identitas pengirim (nama, alamat, nomor telepon)
e. Nomor laboratorium
f. Diagnosis/keterangan klinik
g. Obat-obatan yang telah diberikan dan lama pemberian
h. Pemeriksaan laboratorium yang diminta
i. Jenis spesimen
j. Lokasi pengambilan spesimen
k. Volume spesimen
l. Transpor media/pengawet yang digunakan
m. Nama pengambil spesimen
n. Informed concern
Label wadah spesimen yang akan dikirim atau diambil ke laboratorium
harus memuat:
a. Tanggal pengambilan spesimen
b. Nama dan nomor Pasien
c. Jenis spesimen
2. Persiapan Pasien
Pasien tidak membutuhkan persiapan tertentu

3. Pengumpulan Spesimen
Volume spesimen yang diambil harus mencukupi kebutuhan
pemeriksaan laboratorium yang diminta atau dapat mewakili objek yang
diperiksa. Volume spesimen yang dibutuhkan untuk pemeriksaan HbsAg
dapat dilihat pada tabel di bawah ini

Tabel 1. Spesimen dengan jenis antikoagulan/pengawet dan wadah yang


dipakai untuk pemeriksaan HbsAg dengan stabilitasnya
Jenis Spesimen Antikoagulan Wadah Stabilitas
Pemeriksaan Jenis Jumlah /Pengawet
HbsAg Serum 2 ml - G/P 2 -8C (2 -3
hari),
Freezer
compartment
(1 bulan),
Deep freezer
-20C
(6 bulan, tidak
boleh gelas)
Keterangan:
P : Plastik (polietilen atau sederajat)
G : Gelas

4. Penanganan Sampel
a. Pembuatan Serum
1) Biarkan darah membeku terlebih dahulu pada suhu kamar
selama 20-30 menit, kemudian disentrifus 3000 rpm selama 5-
15 menit.
2) Pemisahan serum dilakukan paling lambat dalam waktu 2 jam
setelah pengambilan spesimen.
3) Serum yang memenuhi syarat harus tidak kelihatan merah dan
keruh (lipemik).
b. Penyimpanan Serum
Spesimen yang sudah diambil harus segera diperiksa, karena
stabilitas spesimen dapat berubah.
Faktor-faktor yang mempengaruhi stabilitas spesimen antara
lain:
1) Terjadi kontaminasi oleh kuman dan bahan kimia.
2) Terjadi metabolisme oleh sel-sel hidup pada spesimen.
3) Terjadi penguapan.
4) Pengaruh suhu.
5) Terkena paparan sinar matahari.
Beberapa spesimen yang tidak langsung diperiksa dapat
disimpan dengan memperhatikan jenis pemeriksaan yang akan
diperiksa. Persyaratan penyimpanan beberapa spesimen untuk beberapa
pemeriksaan laboratorium harus memperhatikan jenis spesimen,
antikoagulan/pengawet dan wadah serta stabilitasnya (terlihat pada
tabel 1)
Beberapa cara penyimpanan spesimen:
1) Disimpan pada suhu kamar.
2) Disimpan dalam lemari es dengan suhu 2 -8C.
3) Dibekukan suhu -20C, -70C atau -120C (jangan sampai
terjadi beku ulang).
4) Dapat diberikan bahan pengawet.
5) Penyimpanan spesimen darah sebaiknya dalam bentuk serum
atau lisat.
B. Analitik
1. Pereaksi
Nama Pereaksi Keterangan
Mikroplate 12 strip pada 8 sumuran yang mudah pecah dilapisi
dengan anti HBsAg, afinitas dimurnikan antibodi
monoklonal tikus, spesifik terhadap determinan a dan
disegel ke dalam tas dengan pengering.

Kontrol Negatif Kontrol siap digunakan. Kontrol negatif mengandung


serum kambing, buffer fosfat 10mM pH 7.4+/-0.1, Na-
azide 0,09% dan Kathon CG 0,1% sebagai bahan
pengawet. Kontrol negatif dikode dengan warna kuning
muda.
Kontrol Positif Kontrol siap digunakan. Mengandung serum kambing,
HBsAg rekombinan non infeksius, buffer fosfat 10 mM
pH 7.4+/-0.1, gentamisin sulfat 0.02% dan Kathon CG
0,1% sebagai bahan pengawet. Kontrol positif dikode
dengan warna hijau.

Kalibrator Kalibrator liofilis. Untuk dilarutkan dengan level air


EIA seperti yang tertera di label. Mengandung serum
janin sapi, HBsAg rekombinan non infeksius pada 0.5
ng/ml (WHO standar internasional kedua untuk
HBsAg, kode NIBSC 00/588), buffer fosfat 10 mM pH
7.4+/-0,1, gentamisin sulfat 0,02% dan Kathon CG
0,1% sebagai bahan pengawet.
Catatan : kebutuhan volume untuk melarutkan
konten botol kecil dapat berbeda dari setiap bagian.
Harap menggunakan volume yang sesuai dengan
yang tertera dalam label.

Buffer pencuci 20x larutan pekat. Pencairan pertama, larutan pencuci


pekat 20x mengandung buffer fosfat 10mM pH 7.0+/-0,2, Tween
20 0.05% dan Kathon CG 0,1%.

Diluen konjugasi Siap digunakan dan reagen berwarna merah.


Mengandung buffer tris 10 mM pH 6.8+/0.1, serum
tikus normal 1%, BSA 5%, Kathon CG 0.1% dan
gentamisin sulfat 0.02% sebagai bahan pengawet.
Larutan tersebut secara normal seperti opal.
Konjugasi 20x 20x reagen pekat. Mengandung Horseradish Peroxidase
(HRP) melabeli antibody monoklonal tikus terhadap
HBsAg., determinan a, buffer Tris 10 mMpH 6.8+/-
0.1, BSA 5% , Kathon CG 0.1% dan gentamisin sulfat
0.02% sebagai pengawet.
Kromogen/Substrat Mengandung larutan buffer fosfat-sitrat 50 mM pada
pH 3.5-3.8, dimetilsulfoxida 4%, tetrametil-benzidin
(TMB) 0.03% dan hydrogen peroksida 0.02% (H2O2).
Catatan : untuk disimpan, jauhkan dari cahaya
penerangan sensitive sampai kuat.
Asam Sulfat Mengandung larutan H2SO4 0.3 M
Perhatian : iritan (Xi R36/38; S2/26/30)
MSDS tersedia untuk kebutuhan pengguna
professional.

2. Peralatan
Peralatan yang digunakan untuk pemeriksaan HbsAg :
a. Mikropipet
Mikropipet harus dipelihara berkala dan dikalibrasi mengikuti
reccomendasi produsen untuk mengirim dan memperbaiki volume yang
dibutuhkan untuk pemeriksaan dan harus diserahkan pada dekontaminasi
biasa ( 70 % etanol , larutan 10 % pemutih , tingkat desinfeksi rumah
sakit) dari bagian-bagian yang bisa sengaja munculpada kontak dengan
sampel atau komponen kit.
b. Inkubator ELISA
Inkubator ELISA harus ditetapkan pada 37 oC (toleransi 1oC ) dan
secara teratur diperiksa untuk memastikan suhu yang benar telah
dipertahankan . Kedua ini harus kubator kering dan water bath cocok
untuk inkubasis pemeriksaan ELISA.
c. Shaker
Dalam hal pencampuran selama inkubasi , instrumen harus dipastikan
pada 350 rpm 150 . Amplitudo pencampuran sangat penting sebagai
salah satu yang dapat percikan dan oleh karena itu untuk beberapa hasil
dapat menghasilkan positif palsu.
d. ELISA Washer
Pencuci ELISA sangat penting untuk kinerja keseluruhan pengujian.
Pencuci harus divalidasi secara hati-hati dan secara benar dioptimalkan
menggunakan kontrol kit / calibrator dan panel referensi, sebelum
menggunakan kit untuk tes laboratorium rutin. Biasanyaterjadi 4-5 siklus
mencuci ( aspirasi + dispensasi dari 350 ml / sumur mencuci larutan = 1
cycle) yang memadai untuk memastikan bahwa alat itu melakukan seperti
yang diharapkan . Waktu perendaman 20-30 detik antara siklus dianjurkan
untuk menjalankan tes dengan kontrol kit / calibrator dan baik ditandai
dengan sampel referensi negatif dan positif , dan periksa untuk
mencocokkan nilai yang dilaporkan di bawah ini di bagian " Mutu Internal
Control" . Kalibrasi Reguler volume disampaikan dan pemeliharaan (
dekontaminasi dan pembersihan jarum ) dari mesin cuci harus dilakukan
sesuai dengan petunjuk dari produsen.

e. Stopwatch
Waktu Inkubasi memiliki toleransi 5 % ( atau toleransi inkubasi ke-1
antara 114 menit menjadi 126 menit; untuk inkubasi ke-2 toleransi antara
28,5 dan 31,5 menit).

f. Mikroplat pembaca
Mikroplat pembaca harus dilengkapi dengan filter pembacaan 450nm
dan idealnya dengan filter kedua ( 620 - 630nm ) untuk tujuan blanking .
Penampilan standar harus ( a) bandwith 10 nm ; ( b ) kisaran absorbansi
dari 0 sampai 2,0 ; ( c ) linearitas 2,0 ; pengulangan 1 % .
Pengosongan dilakukan pada sumur diidentifikasi dalam bagian " Assay
Prosedur " . Sistem optik pembaca harus dikalibrasi secara teratur untuk
memastikan bahwa kepadatan optik yang diukur benar. Ini harus secara
teratur dipelihara sesuai dengan instruksi dari pabriknya.
g. ELISA workstation otomatis
Bila menggunakan ELISA workstation otomatis , semua langkah kritis
( dispensasi , inkubasi , mencuci , membaca , pengocokan , penanganan
data, dll ) telah dipersiapkan secara matang , dikalibrasi, dikontrol dan
diservissecara teratur dalam rangka untuk mencocokkan nilai yang
dilaporkan dalam bagian " internal Quality Control " . Protokol uji harus
dipasang di sistem operasi unit dan divalidasi dengan memeriksa
kecocokan dengan penampilan kit . Selain itu, penanganan cair bagian
dari stasiun ( dispensasi dan mencuci ) harus divalidasi dan ditetapkan
dengan benar memberikan perhatian khusus untuk menghindari
terbawanya jarum yang digunakan untuk pengisian sampel dan untuk
mencuci . The efek berlebih harus dipelajari dan dikendalikan untuk
meminimalkan kemungkinan kontaminasi dari sumur yang berdekatan
karena sampel sangat reaktif , yang mengarah ke hasil positif palsu .
Penggunaan stasiun kerja ELISA otomatis direkomendasikan untuk
skrining darah dan ketika jumlah sampel yang akan diuji melebihi 20-30
unit per dijalankan.
3. Quality Control
Pengujian ditunjukkan pada kontrol atau kalibrasi setiap saat alat
digunakan untuk tujuan memverifikasi apakah nilai OD 450 nm atau S/Co
sesuai dengan analisis.
Pastikan bahwa hasil berikut terpenuhi:

Parameter Requirements
Sumur Blanko < 0.100 nilai OD450/620 nm
Kontrol negatif <0.050 rata-rata nilai OD450/620 nm
setelah blanko
Kalibrator 0.5 ng/ml (standar 2nd S/Co 2
WHO)
Kontrol positif >1.000 nilai OD450/620 nm
Jika hasil pemeriksaan sesuai dengan persyaratan yang disebutkan di
atas, lanjutkan ke bagian berikutnya.
Jika tidak, jangan dilanjutkan lebih jauh dan lakukan pemeriksaan
berikut:

Permasalahan Pemeriksaan
Sumur blanko 1. Jika kromogen/substrat tidak
>0.100 OD450 nm terkontaminasi ketika pengujian
Kontrol negatif 1. Prosedur cuci dan pengaturan
>0.050 OD450nm setelah mesin cuci adalah sebagai validasi
blanko dalam studi pre kualifikasi
2. Larutan pencuci yang tepat telah
digunakan dan mesin cuci telah
dicat dengan larutan tersebut
sebelum digunakan.;
3. Tidak ada kesalahan yang telah
dilakukan dalam prosedur
pengujian (dispensasi kontrol
positif bukan yang negatif)
4. Tidak ada kontaminasi dari
kontrol negatif atau sumur di
mana kontrol diisikan terjadi
akibat tumpahan sampel positif
atau konjugat enzim.
5. Micropipettes belum
terkontaminasi dengan sampel
positif atau dengan konjugasi
enzim
6. Jarum mesin cuci tidak terhalang
atau sebagian terhalang
Kalibrator 1. Prosedur telah dilakukan dengan
S/Co <2 benar
2. Tidak ada kesalahan yang terjadi
selama distribusi (ex.: dispensasi dari
kontrol negatif bukan kalibrator).
3. Prosedur cuci dan pengaturan mesin
cuci adalah sebagai validasi dalam
studi pre kualifikasi
4. Tidak ada kontaminasi eksternal dari
kalibrator yang terjadi
Kontrol positif 1. Prosedur telah dilakukan dengan
<1.000 OD450nm benar
2. Tidak ada kesalahan telah terjadi
selama pendistribusian kontrol
(dispensasi dari kontrol negatif bukan
kontrol positif. Dalam hal ini, kontrol
negatif akan memiliki nilai
OD450nm> 0.050)
3. Prosedur cuci dan pengaturan mesin
cuci adalah sebagai validasi dalam
studi pre kualifikasi
4. Tidak ada kontaminasi eksternal dari
kalibrator yang terjadi
Jika salah satu masalah di atas telah terjadi, laporkan masalah ini ke
pengawas untuk tindakan lebih lanjut.

4. Metode Pemeriksaan
Pemeriksaan HbsAg ini menggunakan metode ELISA (Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay)
5. Kompetensi Pelaksanaan
Pemeriksaan HbsAg ini dikerjakan oleh Ahli Laboratorium Medik
yang telah menyelesaikan pendidikannya dan mempunyai STR (Surat Tanda
Registrasi) dari organisasi profesi.

C. Pasca Analitik
1. Ketatausahaan
2. Perhitungan
Hasil pemeriksaan dihitung dengan menggunakan nilai cut-off
ditentukan pada nilai OD 450 nm rata-rata dari kontrol negatif dengan rumus
sebagai berikut:
NC+ 0.050 = Cut-Off (Co)

3. Penanganan Informasi
Hasil tes diinterpretasikan sebagai rasio sampel OD 450 nm (S) dan
nilai Cut-Off (Co), secara matematis S / Co, sesuai dengan tabel berikut:

S/Co Interpretasi
<0.9 Negatif
0.9-1.1 Samar-samar
>1.1 Positif
D. Penanganan Sisa Sampel
1. Jika disimpan, simpan pada suhu 2 -8C akan bertahan selama 2 -3 hari, jika
disimpan pada freezer compartment dapat bertahan selama 1 bulan, jika
disimpan pada deep freezer -20C dapat bertahan 6 bulan namun tidak boleh
menggunakan bahan gelas.
2. Jika dibuang semua specimen dan bahan yang digunankan untuk pemeriksaan,
seolah olah mereka berisi agen infeksi. Gunakan salah satu metode berikut
untuk mengelola limbah sebelum dibuang :
a. Autoklaf 60 menit pada 121 C.
b. Bakar pada Incenerator
c. Campur limbah cair dengan 5% (siap pakai) larutan natrium hipoclorit
sehingga konsentrasi akhir menjadi sekitar 0.5% natrium hipoclorit,
diamkan 30 menit sebelum dibuang.
Perhatian : Limbah cair yang mengandung asam terlebih dahulu harus
dinetralisir sebelum penambahan natrium hipoklorit.
E. Keamanan Personal
1. Komponen dalam kit ini dibuat dari serum atau plasma manusia yang telah
diuji dan di temukan tidak reaktif pada antibodi terhadap HIV, antibodi
terhadap virus hepatitis C (HCV) serta terhadap permukaan antigen virus
hepatitis B (HBsAg). Namun, tidak menjamin jika agen penginfeksi itu benar
benar tidak ada, semua bahan berasal dari manusia maka sebaiknya ditanganin
sebagaimana pemikiran mereka bahwa bahan berpotensi menular.
2. Gunakan sarung tangan sekali pakai, tangani semua bahan yang digunakan
dalam pemeriksaan termasuk sampel, larutan limbah, penampan reaksi dan
pipet dengan hati hati, seolah olah mampu menstramisikan agen infeksi.
Segera konsultasikan dengan dokter ketika terkontaminasi bahan, tertelan atau
kontak pada luka yang terbuka, lesi atau luka lain dikulit.
3. Segera bersihkan tumpahan yang mengandung agen yang berpotensi menular
dengan 1:10 dari 5% larutan (siap pakai) natrium hipoklorit. Lakukan
pembersihan bahan dengan metode yang sesuai.
4. Buang semua specimen dan bahan yang digunankan untuk pemeriksaan,
seolah olah mereka berisi agen infeksi. Gunakan salah satu metode berikut
untuk mengelola limbah sebelum dibuang :
d. Autoklaf 60 menit pada 121 C.
e. Bakar pada Incenerator
f. Campur limbah cair dengan 5% (siap pakai) larutan natrium hipoclorit
sehingga konsentrasi akhir menjadi sekitar 0.5% natrium hipoclorit,
diamkan 30 menit sebelum dibuang.
Perhatian : Limbah cair yang mengandung asam terlebih dahulu harus dinetralisir sebelum
penambahan natrium hipoklorit.