Facultad de Medicina Humana

DIAGNSTICO INMUNOLGICO: REACCIONES SEROLGICAS DE

AGLUTACIN

Tradicionalmente el diagnostico definitivo pasa por la identificacin, el

aislamiento en cultivo puro del patgeno, de este modo la morfologa,
actividad bioqumica y patrn de sensibilidad a los antimicrobianos podrn
ser examinados y evaluados. Sin embargo algunos microorganismos no se
pueden cultivar in vitro como Treponema pallidum, Mycobacterium Leprae
y en algunos otras enfermedades infecciosas un diagnstico serolgico es
mucho mas econmico y rpido, pero no definitivo. Otra forma de
diagnostico es por la deteccin de un producto especfico del agente
infeccioso que no puede formarse sin la presencia del agente en el
material clnico obtenido del paciente.

El mtodo serolgico tradicional para el diagnstico de enfermedades

infecciosas demuestra (mediante un aumento significativo del titulo) una
respuesta de anticuerpos especficos humorales contra el microorganismo
en cuestin. Ejemplos de reacciones serolgicas de aglutinacin son las
pruebas para anticuerpos contra Brucella y
Salmonella que son parte de un panel de
pruebas para aglutinaciones febriles.

Aglutinacin bacteriana

Una de las aplicaciones de aglutinacin

bacteriana es la llamada prueba de
Reacciones febriles que esta basada en la
investigacin de la presencia de aglutininas
(anticuerpos) contra la fiebre tifoidea, La
brucelosis y el tifo, que indican que el
individuo padece enfermedad o que ha
estado en contacto con el germen
(antgeno) sin llegar a contraerla. Estas
reacciones febriles comprenden la Reaccin de Widal para la fiebre tifoidea
y paratifoidea, La Reaccin de Huddlesson para la brucelosis y La Reaccin
de Weil- Flix para el tifo.

Reaccin de Widal

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La reaccin de Widal utiliza como antgeno una sepa de Salmonella Typhi

en fase O (o sea sin flagelos) y otra en fase H (flagelo). Adems se tienen
otros antigenos Salmonella paratyphi A-B.

Reaccin de Huddlesson
Se lleva a cavo con antgeno de Brucella abortus para detectar anticuerpos
contra fiebre de malta.

Reaccin de WEIL-Flix
La reaccin de Weil-Flix utiliza Proteus OX-19 como antgeno para detectar
anticuerpos contra Rickettsia prowaseki, debido a que posee los mismos
antgenos y por la facilidad de su manejo en el laboratorio.

MATERIAL.
Suero de paciente
Antigeno (tifico O y H, paratfico A y B, brucela, proteus OX-19.
Lminas de vidrio para aglutinaciones
Pipetas serolgicas de 0,2 ml
Palitos mondadientes

PROCEDIMIENTO.
Tcnica cualitativa:
1. Colocar una gota de suero problema en cada uno de los espacios
marcados en la lmina
2. Agregar una gota de cada uno de los antgenos sobre la gota de suero
problema
3. Mezclar uniformemente con un mondadientes cada gota, rotar la
lmina por 3 minutos y observa los resultados.

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Lectura.
Positivo: Aparicin de grumos de tamao variables que tienden a
agruparse en la superficie de la gota.
Negativo: La mezcla permanece homognea.

DIAGNOSTICO DE BRUCELLA

Tcnica cuantitativa.

1. Con una pipeta de 0,2 ml. Depositar 0,08, 0,04, 0,02, 0,01, 0,005 del
suero problema en la lmina.
2. Aadir una gota de antgeno que dio aglutinacin en la prueba
cualitativa a cada cuota del suero.
3. Con el mondadientes mezclar y rotar la lmina durante 3 minutos.

Lectura:
Realizar la lectura teniendo en cuenta la presencia de grumos de acuerdo a
la siguiente equivalencia:

Suero problema: Ttulo:

0.08 ml 1/20
0,04 ml 1/40
0,02 ml 1/80
0,01 ml 1/160
0,005 ml 1/320

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Ttulos mayores de 1/80 tienen significacin diagnstico.

Resultados:

Ttulos de Suero
Antgeno
1 2 3
Tfico O
Tfico H
Paratfico A
Paratfico B
Brucella

CUESTIONARIO:

1. Explique alguna (s) desventajas en el diagnstico serolgico

Existencia de falsos positivos y negativos por lo que no es definitiva.

2. Qu enfermedades a parte de las ya mencionadas, se

diagnostica mediante serologa?

Sarampin
Rubola
ntrax
Amibiasis
Infeccin mictica
VSR (virus sincitial respiratorio)
Tularemia
Sfilis
VIH
3. Mencione otras pruebas usadas para el diagnstico
inmunolgico.

Pruebas de precipitacin: En este caso se utilizacin antgenos

solubles que se difunden frente a los anticuerpos. La unin antgeno-
anticuerpo precipita de forma visible y permite establecer la
presencia de anticuerpos especficos. Un ejemplo clsico de este tipo

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de pruebas es la inmunodifusin en gel de agar utilizada

histricamente en el diagnstico de la leucosis bovina.

Fijacin del complemento: La fijacin del complemento se basa

en la capacidad del complemento para unirse a los complejos
antgeno-anticuerpo. La prueba incluye la adicin de eritrocitos
sensibilizados con una hemolisina. Si el suero posee anticuerpos
especficos, se fija el complemento y no puede unirse a la hemolisina
para lisar los eritrocitos. Se trata de una prueba muy especfica.

Pruebas de hemaglutinacin e inhibicin de la

hemaglutinacin: Estas pruebas se basan en la capacidad de
algunos patgenos (p.ej. el virus de la influenza) para causar la
aglutinacin de los eritrocitos. Pueden utilizarse para detectar el
patgeno (pruebas de hemaglutinacin) o los anticuerpos dirigidos
contra las hemaglutininas del microorganismo (inhibicin de la
hemaglutinacin). Suelen ser pruebas especficas de serotipo o
subtipo y bastante sensibles.

ELISA: Las pruebas inmunoenzimticas se basan en una reaccin

antgeno anticuerpo que tiene lugar sobre un soporte slido
(normalmente una microplaca de plstico) a la que se ha adsorbido
un antgeno o un anticuerpo. La prueba puede desarrollarse en
diferentes modalidades pero en todas ellas la reaccin final se revela
mediante un enzima que modifica un substrato que adquiere color.
Se trata de pruebas muy sensibles y especficas

Pruebas de neutralizacin: Las pruebas de neutralizacin van

dirigidas a la deteccin de anticuerpos capaces de bloquear los
eptopos crticos del patgeno. Normalmente suelen tener una
interpretacin biolgica correlacionada con la proteccin. Sin
embargo, no suelen ser tiles para diferenciar respuestas entre
animales infectados y vacunados ya que la mayora de vacunas
inducen anticuerpos neutralizantes

4. Seale en que condiciones las pruebas de Widal y Huddlesson,

puede comportarse como falso negativo y falso positivo.

FALSOS POSITIVOS

Como ejemplo de estos falsos positivos, se ha descrito en fiebre paratifoidea por

Paratyphi A, ttulos Anti-O y Anti-H 100 en un 53 y 22% de los pacientes,
respectivamente(. En pacientes con malaria, estudiados en Nigeria, con
hemocultivos negativos para Salmonella typhi, se encontraron reacciones de

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Widal positivas con ttulos 1:40, 1:80, y 1:160 en el 85, 12, y 3% de los casos,
respectivamente. En la India, se reporto test de Widal con titulos>1:100 en el 12,
17 y 24% de pacientes con malaria por Plasmodium vivax, Plasmodium
falciparum con bajas parasitemias, y altas parasitemias, respectivamente. En
Surat, se evidenciaron titulos Anti-O y Anti-H en el 15 y 10% de los pacientes con
malaria, respectivamente, informando que cuatro semanas despus estos fueron
Negativos.

Los falsos positivos de la reaccin de Widal tambin han sido descritos en

procesos no infecciosos, como enfermedades autoinmunes (artritis reumatoide-
lupus eritematoso sistmico) y hepatopatias crnicas, lo cual contribuye aun ms
a su baja especificidad.Dentro de las limitaciones de la reaccin de Widal, se debe
tener en cuenta que hasta un 50 y 33% de los pacientes con fiebre tifoidea no
tratada no presentan el aumento caracterstico en los ttulos Anti-O y tienen
negatividad en los ttulos Anti-H, respectivamente.

Falsos Positivos de la Reaccin de Widal

Bacterianas
Salmonelosis no typhi (Serogrupos A-B-D)
Infecciones por Enterobacterias+ Pseudomonas aeruginosa Klebsiella sp.
Escherichia coli Citrobacter sp.- Yersinia enterocolitica
Neumonas-infecciones urinarias-Meningitis
Tuberculosis pulmonar y miliar (36)
Brucelosis
Endocarditis bacteriana
Rickettsiosis
Infecciones por Staphylococcus aureus
Infecciones por Burkholderia pseudomallei
Ttanos
Parasitarias
Malaria
Amebiasis
Virales
Dengue
Infeccin por VIH
Hepatitis viral aguda y crnica
Hongos
Cryptococosis (Meningitis)
No infecciosas
Hepatopatias crnicas
Enfermedades autoinmunes (artritis reumatoide-lupus eritematoso sistmico)
Inmunizacin con antgeno de Salmonella

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FALSOS NEGATIVOS
En la reaccin de Widal, tambin hay que considerar los falsos negativos como
toda prueba de laboratorio, entre sus causas tenemos:

Antibioticoterapia temprana, la cual, retrasa la aparicin de anticuerpos

(descrito principalmente con cloranfenicol).
Utilizacin de corticosteroides.
Medicin temprana de anticuerpos (primera semana).
Inmunodeficiencias adquiridas y congnitas.
Portadores crnicos de Salmonella typhi.
Relacionadas a estandarizacin de la prueba.

CONTROL MICROBIANO: ACCION DE LOS AGENTES FISICOS Y

QUIMICOS

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El crecimiento de los agentes infecciosos causales de las enfermedades y

de sus mecanismos de transmisin trajo como consecuencia muy
importante la posibilidad de tomar medidas para su control. La inhibicin
del crecimiento y la destruccin de microorganismos patgenos se realizan
ya sea por medios fsicos o qumicos. Algunos mtodos de control
microbiano solo se aplica a objetos inanimados, en tanto que otros
muestran una toxicidad selectiva y pueden utilizarse in vivo.

AGENTES FSICO:

El control de microorganismos potencialmente patgenos en el ambiente,

se lleva a cabo por mtodos fsicos mediante la desinfeccin o la
esterilizacin. Entre estos tenemos:

a. Calor.
El calor es el mtodo de eleccin mas usada para la esterilizacin de todos
los materiales, excepto los que puedan ser alterados por el.
Llama directa.-Para estirilizacion del asa bacteriolgica.

Esterilizacin con calor seco.-Se hace uso del horno, para

esterilizar materiales como placas Petri.
Esterilizacin con calor hmedo.-Se usa el autoclave, el papel del
agua en la desnaturalizacin de protenas por el calor se evidencia
en la utilizacin del vapor de agua. Se utiliza para esterilizar
muestras clnicas.

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Pasteurizacin.-consiste en el calentamiento a 62C durante 30

minutos tres veces. Se utiliza en alimentos.

b. Congelacin.
Los cristales de hielo pueden lesionar a las bacterias.
c. Radiacin ultra violeta. Cuando se usan radiaciones de onda cada
vez mas cortas a partir de 330 nm se produce estirilizacion bacteriana,
la luz UV lesiona el DNA bacteriano que impide su replicacin. Estas
radiaciones tienen accin esterilizante sobre la mayora de los
microorganismos y se les emplea en ambientes quirrgicos, cubilos
bacteriolgicos ya que su accin se limita a superficies o partculas
suspendidas en el aire.
d. Radiaciones ionizantes. Pueden utilizarse fuentes de radiactividades
intensas para esterilizar materiales hospitalarios, alimentos, etc. pero
sobre todo en estos ltimos, donde deben utilizarse dosis elevadas
(millones de Rad.) alteran notablemente el sabor de los alimentos.

AGENTES MECNICOS:
a. Ondas snicas y supersnicas.- Los ultrasonidos (con frecuencias
que oscilan entre 15,000 y varios centenarios de miles de vibraciones
por segundo) desnaturalizan protenas y destruyen bacterias.
b. Filtracin.- Si se utilizan filtros con poros menores de 1nm, se pueden
obtener filtrados libres de bacterias. Esto se utiliza con soluciones que
no se pueden esterilizar con calor.

AGENTES QUMICOS:

La accin de las sustancias qumicas sobre los microorganismos varia

dependiendo de la composicin fisicoqumica del medio ambiente, la
concentracin, la temperatura y el tiempo que dura este contacto. En
relacin al efecto biolgico se tiene una accin bactericida, es decir,
destruccin de la bacteria; y una accin bacteriosttica, sea que inhibe
el crecimiento bacteriano. Dentro de los agentes qumicos tenemos a los
desinfectantes, aquellos que son utilizados en superficies inanimadas y
antispticos usados sobre piel.
Metales pesados
Halgenos
Agentes alquilantes
Agentes con propiedades tensioactivas o tensoactivas

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Fenoles
Alcoholes

Material.
Cultivos bacterianos de Bacillus, E.coli, Salmonella,
Pseudomonas.
Tubos con caldo BHI o nutritivo, pH7, pH9, pH3
Placas con agar BHI o nutritivo
Discos estriles de papel de filtro
Pinza estril
Hisopos o torundas estriles
Frascos con alcohol, fenol, mertiolate, mercurio cromo, violeta de
genciana.
Asa bacteriolgica

Procedimiento.

1. Sembrar en tres tubos con caldo nutritivo pH7 por agitacin, incubar por
18-24 hrs., uno a 60C, otro a 37C, y finalmente otro a -8C.
2. Sembrar en tres tubos con caldo nutritivo o BHI, uno a pH7, otro a pH9 y
otro a pH3, incubar todos a 35-37C por 18-24 hrs.
3. Introduzca un hisopo estril es la cepa bacteriana, y siembre en toda la
superficie de la placa con agar BHI o nutritivo, deje reposar 5 minutos y
proceda a colocar los discos de papel de filtro embebidos en los
diferentes desinfectantes y antispticos (un disco para cada
desinfectante o antisptico) coloque una a distancia prudente del otro.
Luego incube las placas a 35-37C por 18-24 hrs.

Resultados.

1. En los tubos incubados a diferente temperatura observe si hubo

crecimiento por la presencia o ausencia de turbidez. Explique a que se
debe ese resultado.

2. En los tubos sembrados a diferentes pH, tambin observe si hubo

crecimiento por la presencia y ausencia de turbidez, anote los
resultados y explique el por que.

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3. Observe alrededor de los discos impregnados con cada uno de los

deferentes antispticos o desinfectantes, si hay o no un halo alrededor,
que demuestra si el agente qumico es eficaz o ineficaz para actuar
contra el microorganismo. Anote todos los resultados y explique por que
algunos qumicos son eficaces y otros no.

CUESTIONARIO:

1. Qu agente qumico era utilizado por Lister, hoy en da se sigue

usando?

Lister public en The Lancet un artculo en el que propona el origen bacteriano

de la infeccin en las heridas y mtodos para luchar contra ella: el uso del FENOL
como antisptico para lavar el instrumental, las manos de los cirujanos y las
heridas abiertas. El efecto fue espectacular; procedimientos quirrgicos que antes
eran una sentencia de muerte por infeccin casi segura se convirtieron en rutina.

En 1870 los mtodos antispticos ideados por Lister fueron ampliamente usados
durante la guerra franco prusiana salvando la vida de miles de soldados
prusianos. En 1878, Robert Koch, el descubridor del bacilo de la tuberculosis,
demostrara la utilidad de expandir el uso de las medidas de higiene y
esterilizacin en la ropa y en el instrumental quirrgico.

2. Qu antispticos son los ms usados?

Alcoholes
cido brico
Gluconato de clorhexidina
Perxido de hidrgeno
Yodo
Mercurocromo
Dihidrocloruro de Octenidina
Compuestos de Fenol (cido carblico)
Cloruro de sodio
Hipoclorito de Sodio
Compuestos de amonio cuaternario
cloruro de benzalconio (BAC), bromuro de cetil trimetilamonio (CTMB),
cloruro de cetilpiridinio (Cetrim), cloruro de cetilpiridinio (CPC) y cloruro de
bencetonio (BZT).

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PRUEBAS DE SENSIBILIDAD IN VITRO ANTIBIOGRAMA

El aislamiento de un agente infeccioso a partir de un paciente con

frecuencia no es suficiente para establecer la terapia adecuada. Muchas
bacterias y algunos hongos presentan resistencia a los agentes
antimicrobianos y algunos virus han desarrollado resistencia a los agentes

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antivirales ms nuevos. Los patrones de resistencia cambian en forma

constante. No importa cuan rpidamente se introducen los nuevos agentes
teraputicos, los microorganismos parecen estar dispuesto a
sobrepasarles.

Cuando no se conoce o no se puede predecir la susceptibilidad de las

bacterias, hongos y virus a los agentes antimicrobianos, es necesario
estudiar la sensibilidad individual de cada agente a estas drogas, pudiendo
elegir entonces el agente adecuado (el mas activo contra el patgeno, el
menos toxico para el husped, con la caractersticas farmacolgico
apropiadas el mas econmico y que se encuentre en el mercado), que
proporciona mayores posibilidades de una evolucin favorable. El clnico
toma la decisin final, contando con los resultados obtenidos in vitro
enfermedad subyacente, condicin clnica del paciente, la administracin
de otros agentes teraputicos, experiencia clnica y otros factores.

Para realizar las pruebas de sensibilidad in vitro, es necesario emplear un

inculo estndar que contenga 10 6 a 10 8 microorganismo por ml; un
medio de cultivo que no interfiere con la eficacia de los antibiticos ni con
el crecimiento del microorganismo, en cantidad conocida y un pH regulado
como el Miuller Hinton en caldo o Agar medio suplementado con los
cationes magnesio y calcio.

MTODO DE DILUCIN EN CALDO

Mtodo que sirve para evaluar cuantitativamente la actividad de un

antibitico. Se colocan concentraciones de creciente del agente
antimicrobiano, generalmente diluciones al medio (1:2), en tubos con caldo
de cultivo Miuller Hinton que sostendr el desarrollo del microorganismo,
luego se inocula el microorganismo. Un tubo de caldo se mantiene sin el
antibitico y es conocido como el control, luego se llevan a incubar todos
los tubos y al da siguiente se observa la turbidez que indicara desarrollo
bacteriano.

El microorganismo crecer en el tubo control y en todos los otros que no

contengan suficiente agente antimicrobiano como para inhibir el
desarrollo. La concentracin mas baja que impide el crecimiento bacteriano
se considera concentracin inhibitoria mnima (CIM) del frmaco y esta es
detectada por falta de turbidez.

Material.

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Cultivo bacteriano que contenga 10 6 - 10 8 microorganismo

por ml.
Solucin de antibitico que contenga 1000 unidades
Tubos 13x 100 ml. Estriles
Pipetas estriles
Caldo Miuller Hinton

Procedimiento.
Colocar 10 tubos 13x100 ml estriles enumerados del 1al 10.
Diluir el antibitico que contenga 1000 U. en proporcin 1:5 en
caldo, obteniendo una concentracin 200 u. por ml.
Con una pipeta estril colocar 0.5 ml del caldo en los tubos
marcados del 2 al 10.
Agregar 0.5 ml del antibitico a los tubos 1 y 2, mezcle el contenido
del segundo tubo y trasvase 0.5 ml al tubo 3, continuando de igual
forma hasta el 9no tubo. Retirar 0.5 ml del 9no tubo y descartar; el
10mo no recibe antibitico y sirve como control.
Agregue 0.5 ml de la cepa bacteriana a todos los tubos
Incubar a 35-37C por 24 horas

Resultado.
Realice la lectura e interprete los resultados obtenidos.
Determine la CIM del frmaco estudiado.
Determine si el microorganismo probado es sensible o resistente al
frmaco probado haciendo uso de la tabla.
Interprete correctamente el resultado obtenido

MTODO DE DIFUSIN DE AGAR.

Conforme se dispuso de mayor numero de agentes antimicrobianos para el

tratamiento de una gran variedad de bacterias, se hicieron aparentes las
limitaciones del macro mtodo de dilucin en caldo.

Por este mtodo se prueba simultneamente un germen aislado de un

paciente frente a mas de un agente antimicrobiana, y esto se consigue
inoculando la superficie de la placa de agar Miuller Hinton con el
microorganismo en estudio, transcurrido 5 minutos se procede a colocar

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los discos de antibiticos (con una concentracin conocida) equidistante

uno de otro, los antibiticos difunden en el medio en forma radial alrededor
del disco e inhibe el desarrollo microbiano en la zona donde su
concentracin es suficientemente alta (halo de inhibicin), trascurrido la
incubacin a 35-37C por 24 hrs.

Este mtodo tambin es conocido como disco-difusin y es una tcnica

cualitativa. En 1966 despus del estudio Kirby-Bauer y otros se
uniformizaron criterios y se estandariz la prueba tomando en cuenta los
conceptos de concentracin mnima inhibitoria (CIM) y la concentracin
promedio en sangre de las drogas frecuentemente usadas.

Material.
Placas con agar Miuller Hinton
Disco de antibiticos
Torundas estriles
Pinzas estriles
Cepa bacteriana en caldo con una concentracin de 10 6
10 8 microorganismo por ml

Procedimiento.
Introduzca la torunda en la cepa bacteriana, escurrir oprimiendo
contra las paredes del tubo y extender uniformemente en la
superficie de la placa de Agar Miuller Hinton.

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Dejar reposar 5 minutos y colocar con la ayuda de la pinza los discos

de diferente antibiticos en la superficie del Agar y presionarlos
suavemente.
Los discos deben estar equidistantes unos de otros
Incube a 35C 24 hrs.

Resultados
Para realizar la lectura, mida el halo de cada disco de antibitico en
mm, conocidos los dimetros utilice la tabla para categorizar si el
microorganismo es sensible, moderadamente sensible o resistente a
los diferentes antibiticos.
Explique cual es o son los mejores antibiticos segn el antibiograma
in vitro.

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CUESTIONARIO:

1. La CIM y CBM ( concentracin bactericida mnima ) de un

agente antimicrobiano son iguales?. Explique.

MIC: Concentracin inhibitoria mnima:

Es la concentracin del antibitico requerida para impedir el crecimiento
bacteriano a partir de la incubacin de 10 5-6 bacterias en fase de crecimiento
rpido, en un medio libre de protenas con pH 7,2, aerobio, durante un periodo de
incubacin de una noche.

Este trmino es importante porque se utiliza para determinar la sensibilidad

bacteriana a un agente antibitico especfico. Es importante recordar que las
condiciones in vivo son distintas a las utilizadas para esta prueba que se realiza in
vitro.

En un ser vivo la bacteria generalmente se encuentra un medio ms cido y

anaerobio. Adems es mayor tamao del inoculo bacteriano y probablemente no
est en fase rpida de crecimiento; lo cual disminuye el valor predictivo del MIC.

MBC: Concentracin bactericida mnima:

Se refiere a la concentracin al agente antibitico necesaria para producir una
disminucin del tamao original del inoculo bacteriano en un porcentaje mayor o
igual al 99.9%. Muchas veces el MIC es equivalente al MBC.
Nota: Es importante diferenciar entre efecto bactericida y bacteriosttico, el
primero produce una disminucin en el nmero bacteriano, mientras el segundo
impide su crecimiento sin afectar por s solo su nmero inicial.

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AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE STAPHYLOCOCCUS.

El gnero Staphylococcus es miembro de la familia micrococaceae;

forman parte de la flora microbiana normal de la piel y mucosas del
hombre y en ciertas circunstancias pueden comportarse como patgeno.

El Staphylococcus aureus (en general estafilococos coagulasa positivos)

ha sido reconocido histricamente como un patgeno humano virulento e
importante causante de abscesos, diversas infecciones piognas,
neumona, endocarditis e incluso septicemia mortal. Tambin durante los
ltimos aos los estafilococos coagulasa negativos han surgido como
patgenos importantes, principalmente de huspedes deficientes
incluyendo pacientes con algn tipo de prtesis, estos son los
Staphylococcus epiderminis, los Staphylococcus saprophyticus son
responsables de ITU en mujeres jvenes. ltimamente los estafilococos
coagulasa negativos son responsables de bacteriemia en pacientes
neutropnicos, de infecciones relacionadas con catteres permanentes.

Los estafilococos son cocos esfricos, grampositivos, inmviles, aerobios

anaerobios facultativos y Catalasa positivo, no esporulados, agrupados en
racimos, tetradas o aislados. Crecen en cualquier medio de cultivo que
permita el desarrollo de los grampositivos, dando colonias redondas,
opacas y lisas, por lo general consistencia cremosa.

Material
Placas con Agar sangre
Placas con Agar Manitol hipertnico o baird Parker
Lminas portaobjeto
Set de colorantes Gram.
Tubos con caldo tioglicolato
Plasma citratado
Disco de novobiocina
Perxido de hidrgeno
Asa de kolle
Muestra clnica: Absceso, S. nasal, ntrax.etc.

Procedimiento
Examen directo de la muestra clnica. Realizar una Tincin Gram
de la muestra y buscar cocos Gram +.

Cultivo.

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a. Enriquecer en caldo tioglicolato, inoculando la muestra

previamente incube a 35-37C x 18-24 hrs.
b. Aislar en Agar sangre y/o Agar Manitol hipertnico u otro medio
selectivo, sembrado por estiras y agotamiento en 4 cuadrantes:
Incube a 35-37C x 18- 24 hrs.
c. Identificacin:

1. Identificacin preliminar de las colonias tpicas de

Staphylococcus.
2. Observacin de la morfologa bacteriana mediante una
coloracin Gram a partir de la colonia seleccionada.
3. Pruebas bioqumicas o enzimticos
Realizar las pruebas de:

Catalasa
Coagulasa
Hemolisina
Resistencia a la
novobiocina

Resultado
Anotar lo obtenido en el examen directo
Anotar el crecimiento en caldo tioglicolato
Describir las colonias tpicas de los diferentes Estafilococos segn el
medio en el que se aislado, luego la morfologa microscpica
bacteriana y las reacciones en las pruebas bioqumicas
Anotar el Staphylococcus aislado e identificado y si hay correlacin
con el ex. Directo

CUESTIONARIO

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1. Qu caracterstica tiene el tioglicolato que permite crecer a

estafilococos?

Las sustancias reductoras como tioglicolato de sodio y cistena

proporcionan una anaerobiosis suficiente y debido a los grupos -SH- de
estos compuestos, se neutralizan los efectos bacteriostticos de los
derivados mercuriales, arsenicales y de otros metales pesados. La
presencia de una baja cantidad de agar, retarda la dispersin de CO2 y O2.

2. Qu otras pruebas se utilizan para confirmar la identificacin de

S. aureus?
Catalasa, Coagulasa, hemolisina y Noboviosina

3. Si asla S. epidermidis de lesin a nivel de piel, Considerara el

patgeno?, explique.
Si, al igual hacen dao cutaneo como la S Aureus. S. Epidermidis causa
un dao a nivel genitourinario con Piuria.
4. Qu otras especies de estafilococos coagulasa negativos son de
importancia clnica?
S. Saprophytic, S. Lugdunensis , S. Haemolyticus

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE Neisseria

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La familia Neisseriaceae incluye varios gneros entre ellos el gnero

Neisseria y Branhamella. La Neisseria son cocos gramnegativos.
Algunas Neisserias son comensales y otras como N. gonorrhoeae y N.
meningitidis son patgenos. En un frotis de muestra clnica coloriado
con Gram., estos microorganismos se presentan como diplococos de
forma arrionada (o granos de caf) y se pueden observar dentro de los
neutrfilos polimorfonucleares, esta presentacin se conoce como
diplococos intracelulares gramnegativos y contribuyen a la identificacin
de una verdadera infeccin .

Aunque estos cocos son aerobios estrictos desarrollan mejor en un medio

enriquecido con atmsfera de 2-10% de co2. Las Neisseria patgenas
son muy sensibles a las variaciones de temperatura, por la que las
muestras clnicas deben ser inoculadas lo ms pronto posible. Luego de
24-48 hrs. de incubacin la N. gonorrhoeae forma colonias pequeas
(0.5.- 2 mm), traslucidas, grisceas, convexas, brillantes, con bordes
lisos, con frecuencia se despegaran completamente de la superficie del
Agar y pueden ser mucoides o gomosas. Son autoltico

Material
Placas con agar chocolate y Thayer Martn
modificado
Lminas
Set. De Gram.
Reactivo para Oxidasa
Muestra: Uretral, cervix y canal anal y de otros
localizaciones LCR.
Procedimiento
Examen directo de la muestra clnica.- Hacer un frotis de la
muestra y teir con Gram

Cultivo

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a. Sembrar la muestra en agar chocolate y/o Thayer Martn

modificado por estra y agotamiento para obtener colonias
aisladas, incubar 24-48 hrs. a 37C y con CO2 2-10%.
b. Identificacin:
1. Identificar las morfologas tpicas de las colonias
2. Realizar un Gram. de estas colonias.
3. Realizar las siguientes pruebas bioqumicas o enzimticas.
- Test de oxidasa
- Fermentacin de glucosa, maltosa, fructuosa, Sacarosa,
Lactosa.

Resultados
- Anotar los resultados obtenidos en el examen directo.
- Describir las colonias tpicas aisladas, morfologa microscpica y
reacciones bioqumicas.

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-
CUESTIONARIO:

1. Las Neisserias patgenas desarrollas a 22C.

Las Neiserias no puedes desarrollarse en un medio de 22 C, necesitan
una temperatura de 37C

2. Cmo se encuentran localizadas los gonococos en los PMN en

un proceso agudo y crnico?
En un frotis de muestra clnica coloriado con Gram., estos
microorganismos se presentan como diplococos de forma arrionada (o
granos de caf) y se pueden observar dentro de los neutrfilos
polimorfonucleares, esta presentacin se conoce como diplococos
intracelulares gramnegativos y contribuyen a la identificacin de una
verdadera infeccin .

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AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE Treponema pallidium

El gnero Treponema incluye especies

no patgenas y patgenas como el
Treponema causante de sfilis, pinta,
pian y bejel. Las cepas virulento de
estas espiroquetas son de difcil cultivo,
solo se pueden cultivar en testculo de
conejo o almohadilla plantar del ratn,
en 1981 Fieldsteel y Col. obtuvieron el
cultivo de T. pallidum, biotipo
pallidum, agente causal de la sfilis,
empleando un cultivo celular muy
complejo constituido por monocapas de
fibroblasto. Son microorganismos
microaerfilos, Gramnegativos. Como el
microorganismo no es cultivable por mtodos convencionales, el
diagnstico de laboratorio se realiza bsicamente por serologa,
visualizacin en microscopio de campo oscuro y la sintomatologa clnica.

En la muestra de una lesin primaria de sfilis en la fase precoz

denominada chancro sifiltico se puede observar la presencia de
espiroquetas mviles con un microscopio de campo oscuro.

Pruebas Serolgicas

I. Pruebas no treponmicas.
Son de gran sensibilidad y baja especificidad, de fcil ejecucin, bastante
usado en Screning, pueden ser cualitativos y cuantitativos, pueden dar
falsos positivos que pueden ser atribuidas a una variedad de
condiciones agudas o crnicas como embarazo, lupus eritematoso
etc.las pruebas no treponmicas son VDRL y RPR.

II. Pruebas treponmicas

Es ms especfica, se usa para confirmar al diagnstico serolgico de
sfilis si la prueba resultara positivo con las pruebas no treponmicas.
Dentro de ellos tenemos:
- FTA ABS
- TPI
- Hemoaglutinacin
Material
Muestra: suero sospechoso

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Reactivo de RPR, VDRL y controles

Micropipetas o pipetas automticas
Lminas de vidrio con hoyos

Procedimiento Cualitativo
1. Colocar 50 ul (1 gota) de suero muestra en un crculo de la lmina
2. Aadir al lado de la anterior 20 ul de suspensin de reactivos RPR o
UDRL.
3. Mezclar ambas gotas y rotar durante 4 minutos con VDRL y 8 minutos
con RPR.
4. La tcnica con VDRL se lleva al microscopio y se observa si hay
floculacin o agrupacin y la tcnica RPR se observa a simple vista

Resultado
Reactivo: Presencia de floculacin
No reactivo: ausencia de floculacin

Para determinar el ttulo se debe de usar la tcnica en forma cuantitativa,

haciendo uso de tubos.

Tubo 1 Tubo2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5

-0.5 ssf - 0.5 ssf - 0.5 ssf -0.5 ssf - 0.5 ssf
-0.5 suero - 0.5 del T. 1 - 0.5 del T. 2 - 0.5 del T. 3 -0.5 del T. 4
1 : 2, 2 dils 1:4, 4 dils 1:8, 8 dils 1:16, 16 dils 1:32, 32 dils

CUESTIONARIO.

1. Mencione cinco casos que puedan dar pruebas falsas positivas

en RPR.

Los falsos positivos pueden llegar a 10 a 30%, y han sido reportados en

casos de sndrome de anticuerpos antifosfolpidos, lupus eritematoso
sistmico (LES), fiebre reumtica, neumona vira, neumona neumoccica,
mononucleosis infecciosa, hepatitis infecciosa, lepra, malaria, artritis

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reumatoide, infecciones por otros treponemas, embarazo, ancianos, y

muestras hemolisadas o contaminadas.

2. En que casos esta indicado la prueba de FTA ABS?

Es un examen de sangre utilizado para detectar anticuerpos contra la

bacteria que produce la sfilis , el Treponema pallidum. Este examen se
utiliza para confirmar si una prueba de deteccin positiva para sfilis
significa que hay una infeccin real. Este examen se utiliza de manera
rutinaria para confirmar si una prueba de deteccin positiva para sfilis (ya
sea el VDRL o RPR ) refleja una infeccin real con sfilis. Tambin se puede
realizar cuando se sospecha de sfilis primaria o terciaria y las pruebas de
deteccin iniciales sean negativas, ya que dichas pruebas durante estas
etapas de la sfilis pueden ser falsamente negativas.

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