Tincin o coloracin de bacterias

Los procedimientos que ponen de manifiesto diferencias entre las clulas bacterianas o en
partes una clula se conoce como tcnica de coloracin diferenciales. Son algo mas que
elaboradas que la tcnica simple en la que las clulas se someten a una sola solucin
colorante o reactivo colorante.

Las tinciones se combinan qumicamente con el protoplasma bacteriano; si la clula no ha

muerto el proceso termina de hacerlo. El mtodo, por consiguiente, es bastante drstico y
puede producir artificios.

Las tinciones mas frecuente son sales. Las tinciones bsicas consiste en un catin
coloreado unido a un anin incoloro, mientras las cidas constituyen exactamente lo
contrario, unido a dos cationes. Las clulas bacterianas son abundantes en cidos
nucleicos, los cuales portan cargas negativas en formas de fosfatos.

Los colorantes cidos no tien a las clulas bacterias, y por tanto, pueden utilizarse para
teir al fondo con un color de contraste.

Las tinciones bsicas tien uniformemente en las clulas bacterianas, a menos que antes
de destruyan el ARN del citoplasma. Tambin se pueden usar tcnicas de tincin
especiales para flagelos, membranas celulares, paredes celulares, grnulos, nucletidos y
esporas.

Tincin acidorresistente

Las bacterias acidorresistentes son las que retiene la carbolficsina, aun cuando intente
descolorarlas con un mezcla de alcohol y cido clorhdrico. Las bacterias acidorresistentes
se tien de color rojo; el resto adquiere el color del colorante de contraste en este caso el
verde o azul.

Tincin negativa

Este procedimiento consiste en la tincin de fondo con un colorante cidos para dejar las
clulas incoloras en contraste. Comnmente se utiliza el colorante negro llamado
nigrusna. El mtodo sirve para observar bacterias o estructuras que difcilmente se tien
con las tcnicas directas.

Tincin de los flagelos

Los flagelos son estructuras demasiado finas para poder ser visibles en el microscopio de
luz. Sin embargo si se tratan con una suspensin coloidal inestable de sales de cidos
tnico para formar un precipitado denso en la pared celular y en los flagelos, se pueden
poner de manifiesto su presencia y disposicin en las clulas. De esta manera el dimetro
aparenta que la estructura aumento de tamao con fuscina bsica los hace visibles en el
microscopio ptico.

Tincin de la cpsula

La cpsula se pone de manifiesto mediante una coloracin negativa o una modificacin de

esta. Uno de los mtodos de tincin de la cpsula incluye el tratamiento de las
bacterias con un solucin caliente de cristal violeta seguido por un lavado con una
solucin de sulfato de cobre. El sulfato de cobre tambin imparte color al fondo y esto
resulta en que la clula y el fondo aparezcan teido en color azul oscuro mientras la
cpsula aparece de color azul plido.

Tincin del ncleo

Los ncleos se pueden teir por la tincin de Feulgen la cual es especifica para el ADN.

Tincin de la esporas

Las esporas se observan de la manera mas simple como cuerpos refringentes

intracelulares en suspensiones de bacterias sin teir, la parte de las esporas relativamente
impermeable, las esporas comnmente se tien con verde de malaquita y carbolfucsina o
carbolfucsina

Tincin Gram.

Una caracterstica taxonmica importante de las bacteria es su respuesta a la tincin a de

Gram esta caracterstica parece ser fundamental, reaccin a la tincin se correlaciona a
con muchas otras propiedades morfolgicas en maneras relacionadas filogenticamente.
Microorganismo potencialmente grampositivo puede verse como tal cuando concurren un
conjunto de particular de condiciones ambientales en un cultivo joven. El procedimiento
para tincin de Gram se inicia con la aplicacin de un colorante bsico el cristal de violeta.
Luego se aplica una solucin de yodo en este momento todas las bacterias de tien de
azul. Continuacin las clulas se tratan con alcohol las clulas grampsitiva contienen el
cristal violeta-yodo y permanecen de color azul; en cambio las gramnegativa se descoloran
completamente por el alcohol. Por ultimo se aplican un colorante de contraste safranina,
que es un colorante rojo. De esta manera, las clulas gramnegativas, previamente
descoloradas, toman el colorante de contraste y las clulas grampositivas ahora aparecen
prpura.

La base de la reaccin diferencial de Gram es la estructura de la pared celular. Esta tcnica

diferencial es una de las de uso mas comn en microbiologa. El frote bacteriano teido se
somete a las soluciones siguientes en el orden en que se indica: cristal violeta, alcohol y
safranina o alguna otra solucin de contraste conveniente.
Las bacterias gramnegativas contienen un gran porcentaje mas alto de lpidos que de las
bacterias grampositivas. Las paredes celulares de la bacterias gramnegativas son tambin
mas delgadas que las grampositivas con alcohol extrae lpidos con lo cual se aumenta la
porosidad o permeabilidad de la pared celular gramnegativa. As el complejo cristal
violeta-yodo (CV-I) puede extraerse en los organismos gramnegativos y de esta manera se
destien las paredes celulares de las bacterias grampositivas, por su composicin
diferente (bajo contenido lpido) se deshidratan alcohol y se logra extraer el complejo (CV-
I).

En las bacterias (CV-I) queda retenido en la pared despus del tratamiento con etanol, la
cual se supone se supone causa una disminucin de en el dimetro de los poros
glucopptido o pptidoglicano de la pared celular. Las bacterias gramnegativas tienen una
cantidad mucho menor de ppidoglicano con ligaduras cruzadas menos extensas que en
las paredes de las bacterias grampositivas.

Examen de muestras al microscopio: la tincin GRAM

La tincin de Gram es uno de los mtodos de tincin ms importantes en el laboratorio

bacteriolgico y con el que el estudiante debe estar perfectamente familiarizado. Su
utilidad prctica es indiscutible y en el trabajo microscpico de rutina del Laboratorio de
Microbiologa las referencias a la morfologa celular bacteriana (cocos, bacilos, positivos,
negativos, etc) se basan justamente en la tincin de
GRAM

Descripta en forma breve, la secuencia de la tincin es la

siguiente: el Frotis fijado con calor se tie 1 min con
Violeta Cristal, se lava con agua, se cubre con solucin
Yodada durante 1 min y se lava de nuevo con agua,
decolorar con mezcla alcohol etlico/acetona. Escurrir y
cubrir con Safranina (color de contraste) durante 20 seg.
Lavar y secar.

Esta tincin se denominada as por el bacterilogo dans Christian Gram, quien la

desarroll en 1844. Sobre la base de su reaccin a la tincin de Gram, las bacterias pueden
dividirse en dos grupos, grampositivas y gramnegativas (en este caso, los trminos
positivo y negativo no tiene nada que ver con carga elctrico, sino simplemente designan
dos grupos morfologicos distintos de bacterias).
Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tien de forma distinta debido a las
diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la clula
bacteriana sirve para dar su tamao y forma al organismo as como para prevenir la lisis
osmtica. El material de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el
peptidoglicano. La pared de la clula gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas
interconectandas de peptidoglicano as como algo de cido teicoico. Generalmente, 80%-
90% de la pared de la clula gram-positiva es peptidoglicano. La pared de la clula gram-
negativa, por otro lado, contiene una capa mucho ms delgada, nicamente de
peptidoglicano y est rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolpidos,
lipopolisacridos, y lipoprotenas. Slo 10% - 20% de la pared de la clula gram-negativa es
peptidoglicano.

Debido a su importancia en taxonoma bacteriana y a que indica diferencias

fundamentales de la pared celular de las distintas bacterias, describiremos aqu con algn
detalle la tincin de Gram y las interpretaciones que actualmente se hacen sobre el
porqu de su funcionamiento.

Las clulas fijadas al calor sobre un portaobjetos se tien, primero con una solucin de
cristal violeta (otros colorantes bsicos no son tan efectivos) y son lavadas despus para
quitar el exceso de colorante. En este estado, todas las clulas, tanto las grampositivas
como las gramnegativas, estn teidas de azul.

El portaobjetos se cubre entonces con una solucin de yodo-yoduro potsico. El

ingrediente activo es aqu el I2; el KI simplemente hace soluble el I2 en agua. El I2 entra en
las clulas y forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta. De nuevo tanto las
clulas grampositivas como las gramnegativas se
encuentran en la misma situacin.

Se lleva a cabo despus la decoloracin, usando una

mezcla de alcohol-acetona, sustancias en las que es
soluble el complejo I2-cristal violeta. Algunos organismos
(grampositivos) no se decoloran, mientras que otros
(gramnegativos) lo hacen. La diferencia esencial entre
esos dos tipos de clulas est por tanto en su resistencia a
la decoloracin; esta resistencia se debe probablemente
al hecho de que en el caso de bacterias gram-negativas, la mezcla de alcohol/acetona es
un solvente lipdico y disuelve la membrana exterior de la pared de la clula (y tambin
puede daar la membrana citoplsmica a la que se une peptidoglicano). La delgada capa
de peptidoglicano es incapaz de retener el de complejo cristal violeta-yodo y la clula se
decolora. Las clulas grampositivas, a causa de sus paredes celulares ms espesas (tienen
ms peptidoglicano y menos lpido), no son permeables al disolvente ya que ste
deshidrata la pared celular y cierra los poros, disminuyendo as el espacio entre las
molculas y provocando que el de complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de
la pared celular. Despus de la decoloracin las clulas grampositivas son todava azules,
pero las gramnegativas son incoloras.

Para poner de manifiesto las clulas gramnegativas se utiliza una coloracin de contraste.
Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina bsica.
Despus de la coloracin de contraste las clulas gramnegativas son rojas, mientras que
las grampositivas permanecen azules.

Deben destacarse algunos aspectos cruciales de la tincin de Gram:

1) El tratamiento con cristal violeta debe preceder al tratamiento con yodo. El yodo por s
solo tiene poca afinidad con las clulas.

2) La decoloracin debe realizarse con poca agua para evitar que pierdan la tincin las
clulas grampositivas. EI proceso de decoloracin debe ser corto y es esencial un clculo
preciso del tiempo para obtener resultados satisfactorios.

3) Cultivos ms viejo de 24 horas pueden perder su habilidad de retener el complejo

cristal violeta - yodo.

El carcter de grampositivo no es siempre un fenmeno del todo o nada. Algunos

organismos son ms grampositivos que otros y algunos son gram-variables, es decir, unas
veces grampositivos y otras gramnegativos.

Segn la manipulacin que efectuemos sobre la muestra a observar y segn los colorantes
que empleemos durante el proceso, podemos hablar de diferentes modalidades de
tincin.

Examen microscpico directo de las muestras clnicas

Sin Tincin

No se utiliza ningn tipo de colorante.

Es el montaje directo hmedo o examen en fresco: las

muestras se extienden directamente sobre la superficie
de un portaobjetos para su observacin. El material que
es demasiado espeso para permitir la diferenciacin de
sus elementos puede diluirse con igual volumen de
solucin salina fisiolgica estril. Se deposita suavemente un cubreobjetos sobre la
superficie del material.

Este tipo de preparacin se emplea para detectar trofozotos mviles de parsitos

intestinales como Giardia, Entamoeba, huevos y quistes de otros parsitos, larvas y
gusanos adultos, Trichomonas, hifas de hongos, etc
En la imagen: Candida sp en un examen en fresco.

Examen microscpico de las muestras clnicas levemente

modificadas Tincin Simple

Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las

estructuras celulares se tien con la misma tonalidad
(Tinta china, Azul Metileno de Loeffler, Azul de
lactofenol).

El Hidrxido de potasio al 10% (solucin de KOH) permite

ver elementos de hongos ya que el KOH digiere
parcialmente los componentes proteicos, por ejemplo de la clula husped, pero no acta
sobre los polisacridos de las paredes celulares de los hongos.

La tinta china o Nigrosina permite observar clulas levaduriformes capsuladas

(Cryptococcus), sobre todo en LCR. Los polisacridos capsulares rechazan la tinta china y la
cpsula aparece como un halo claro alrededor de los microorganismos. Azul de metileno
de Loeffler puede agregarse a las preparaciones en fresco de heces para observar la
presencia de leucocitos.

En la imagen: Cryptococcus neoformans en una tincin con tinta china.

Examen microscpico de las muestras clnicas muy

modificadas Tincin Diferencial

Se utilizan varios colorantes combinados. Las estructuras

celulares se diferencian en funcin de los diferentes
colorantes que fijan de acuerdo con su propia
constitucin qumica.

Los ejemplos clsicos sera la tincin de GRAM o la de

Ziehl-Neelsen

En la imagen: BGN y levaduras en una tincin GRAM