KOMPONEN ANTI-INFLAMASI DARI BINTANG

LAUT VIETNAM PROTOREASTER NODOSUS

NguyenPhuong Thao 1,2, Bui ThiThuyLuyen 1,2, Jung EunKoo 3, Sohyun Kim 3, Young Sang
Koh 3, NguyenXuanCuong 1, NguyenHoai Nam 1, Phan Van Kiem 1, Young Ho Kim 2 * dan
Chau Van minh 1 *

Abstrak

Latar Belakang: Dalam penelitian ini, kami meneliti efek penghambatan dari ekstrak
metanolat, fraksi diklorometana, lapisan air, dan sterol polyhydroxylated (1-4) yang diisolasi
dari bintang laut VietnamProtoreaster nodosus pada produksi sitokin pro-inflamasi (IL-12
p40, IL -6, dan TNF-) sel dendritikasal sumsum tulang (Bone marrow-deriveddendriticcells;
BMDCs) yang teraktivasi LPS menggunakan enzyme-linkedimmunosorbentassay (ELISA).

Hasil: Ekstrak metanolatdan fraksi diklorometanamemberikan efek penghambatan kuat pada

produksi dari ketiga sitokin pro-inflamasi, dengan nilai IC50 berkisar antara 0,60 0,01-26,19
0,64 ug / mL. Empat turunan steroid yang sangat murni (1-4) diisolasi dari fraksi
diklorometana dan lapisan air P. nodosus. Aktivitas penghambatan yang poten juga diamati
untuk (25S) 5-kolestan 3, 4, 6, 7, 8, 15, 16, 26-octol (3) pada produksi IL-12 p40
dan IL-6 (IC 50-an = 3.11 0,08 dan 1,35 0,03 M), dan untuk (25S) 5-kolestan-3, 6, 8,
15, 16, 26-hexol (1) dan (25S) 5-kolestan-3, 6, 7, 8, 15, 16, 26-heptol (2) pada
produksi IL-12 p40 (IC 50-an = 0.01 0.00 dan 1.02 0.01 M). Selain itu, nodososide (4)
menunjukkan efek penghambatan moderat pada produksi IL-12 p40 dan IL-6.

Kesimpulan: ini adalah laporan pertama dari aktivitas anti-inflamasi dari bintang lautP.
nodosus. Temuan utama dari studi ini adalah identifikasi derivatif steroid teroksigenasidari P.
nodosus dengan aktivitas anti-inflamasi potenyang dapat dikembangkan sebagai agen terapi
untuk penyakit inflamasi.

Kata kunci:Protoreasternodosus, bintang laut, IL-12 p40, IL-6, TNF-, BMDC teraktivasi
LPS, Anti-inflamasi
Latar Belakang

Peradangan adalah salah satu respon imun awal bawaan untuk cedera jaringan dan berbagai
rangsangan patologis. Ini juga merupakan faktor awal penting dalam penyembuhan
luka. Peradangan yang tertunda atau terganggu dapat mempengaruhi tahap akhir
penyembuhan luka, terutama pembentukan granulasi [1,2]. Peradangan, yang merupakan
bagian dari respon biologis kompleks jaringan pembuluh darah terhadap rangsangan
berbahaya eksogen berbahaya, dimediasi oleh berbagai faktor terlarut, termasuk sekelompok
polipeptida disekresikan yang dikenal sebagai sitokin, yang memainkan peran kunci dalam
modulasi respon imun [3 ].

Interleukin (IL) -12 adalah sitokin pro-inflamasi yang dihasilkan oleh sel-sel penyaji antigen
teraktivasi, sel dendritik, monosit / makrofag, dan sel B dalam merespon produk bakteri dan
sinyal kekebalan tubuh [4]. Awalnya dikenal sebagai faktor diferensiasi sel B, IL-6 sekarang
dikenal sebagai sitokin multifungsi yang berpartisipasi dalam beberapa kejadian biologis,
termasuk respon imun, hematopoiesis, dan reaksi fase akut [5]. Efek regulasi dari IL-6
melibatkan penghambatan produksi tumor necrosisfactor (TNF), memberikan umpan balik
negatif, dan membatasi respon inflamasi akut [6,7]. Sitokin seperti IL-6 sangat penting, tapi
kelebihan konstitutif mereka terlibat dalam berbagai penyakit. Hal ini memegang mekanisme
regulasi negatif dalam sistem sinyal IL-6 [8,9].

TNF sejak itu telah terlibat dalam beragam peradangan, infeksi, dan kondisi keganasan, dan
pentingnya TNF dalam peradangan ditunjukkan oleh kemanjuran antibodi anti-TNF atau
administrasi reseptor TNF terlarut (TNFRs) dalam mengendalikan rheumatoidarthritis dan
kondisi inflamasi lainnya [10,11]. TNF tidak biasanya terdeteksi pada orang sehat, tetapi
kadarnya pada serum dan jaringan didapatkan tinggi dalam infeksi dan inflamasi [12]. Selain
itu, kadar TNF serum berkorelasi dengan keparahan infeksi [11]. Oleh karena itu,
menghambat ekspresi dan produksi mediator kuat, termasuk IL-12 p40, IL-6, dan TNF-,
menggunakan komponen anti-inflamasi bisa mewakili target preventif atau terapeutik, dan
dapat digunakan untuk mengembangkan agen anti-inflamasi untuk promosi kesehatan dan
pencegahan penyakit.

Starfish ditemukan di semua lautan. Ada lebih dari 1.500 spesies yang dikenal, dan banyak
belum ditemukan. Forcipulatida, Paxillosida, Platyasterida, Spinulosida, dan Valvatida adalah
subkelas utama Asteroidea. Bintang laut telah diselidiki oleh ahli kimia organik, ahli
biokimia, dan farmasi sebagai sumber potensial dari produk bioaktif alam laut. Berbagai
metabolit sekunder, termasuk steroid, glikosida steroid, antrakuinon, alkaloid, fosfolipid,
peptida, dan asam lemak, telah dilaporkan di bintang laut [13]. Steroid dan turunannya yang
terglikosilasi dengan struktur unik diketahui memiliki aktivitas anti-tumor, anti-
inflamasi [14], immuno-modulator, anti-alergi, anti-jamur,
hemolitik [15],neuritogenik [16],antinosiseptif [17],sitotoksik [18 - 20],dan anti-virus [21].

Bintang laut Protoreasternodosus (Linnaeus, 1758) adalah invertebrata milik

ordoPhanerozonia, kelas Asteroidea, dan filum Echinodermata. Anggota dari genus
Protoreaster ditemukan di laut Vietnam hangat, dan telah secara historis digunakan sebagai
agen tonik dalam obat rakyat Vietnam. Namun, penelitian pada aktivitas biologis P. nodosus
terbatas.Dalam studi sebelumnya, konstituen utama P. nodosus yang ditemukan adalah
steroidpolyhydroxylated [22],beberapa yang dipamerkan sitotoksisitas moderat, steroid sulfat
glikosida [23],galactocerebrosides [24],dan gangliosida [25].

Sebagai bagian dari penyelidikan berkelanjutan kami dari organisme laut Vietnam
mengenai aktivitas anti-inflamasi [26 - 31], kami menemukan bahwa ekstrak metanolat dan
diklorometana sebagian kecil dari P. nodosus menunjukkan efek anti-inflamasiin vitroyang
signifikan. Penelitian ini merinci efek penghambatan turunan steroid (1-4, Gambar 1) dari P.
nodosusbintang laut di ekspresi diinduksi LPS dari sitokin pro-inflamasi IL-12 p40, IL-6, dan
TNF- di BMDCs.

Hasil dan Diskusi

Produk alam laut baru-baru ini menjadi fokus peningkatan minat penelitian karena potensi
aktivitas farmakologis dan tingkat toksisitas rendah [32,33]. Oksisterol, atau turunan oksigen
kolesterol dihasilkan melalui auto oksidasi atau dalam proses enzimatik in vivo, dan telah
diidentifikasi dalam jaringan mamalia dan sel (misalnya, darah) dan makanan
olahan. Oksisterol muncul sebagai zat yang menarik untuk diteliti dengan aktivitas biologis
beragam [34,35]. Baru-baru ini, ditunjukkan bahwa kematian sel terinduksi oksisterol banyak
memiliki kesamaan sifat dengan kematian apoptosis sel [19], yang memainkan peran penting
dalam keseimbangan antara proliferasi sel dan kematian sel. Berbagai macam rangsangan
dapat memicu kematian sel, yang merupakan proses ireversibel [20,36].

BMDC memainkan peran kunci dalam pengaturan antara sistem imun bawaan dan
diperoleh. BMDC yang diaktifkan melakukan fungsi penting dalam respon imun dan
inflamasi melalui produksi sitokin pro-inflamasi seperti IL-12 p40, IL-6, dan TNF-,yang
distimulasi pola patogen terkait molekul (pathogen-associatedmolecularpatterns; PAMPs),
yang terlibat dalam patogenesis penyakit kardiovaskular dan neurodegenerational dan kanker
melalui serangkaian jalur persinyalan sitokin. Telah menunjukkan bahwa pro-inflamasi
berhubungan dengan patofisiologi dan terhubung dengan berbagai manifestasi penyakit
klinis. Sitokin pro-inflamasi memainkan peran penting dalam pertahanan host dan
peradangan [37,38].

Di antara banyak aktivitas biologisnya, IL-12 memberikan sinyal wajib bagi diferensiasi sel
efektor T-helper tipe 1 (Th1) dan sekresi sitokin Th1, gamma interferon (IFN-), dan IL-
2. IL-12 memainkan peran penting dalam membuatrespon Th1 untuk patogen
manusia[23,24]. Meskipun induksi IL-12 oleh organisme intraselular diperlukan untuk
responpelindung Th1host, overekspresi sitokin Th1 dan IL-12 dapat berkontribusi pada
pengembangan dan keawetan penyakit inflamasi dan autoimun kronis. Dengan demikian,
memahami pengaturan ekspresi dari IL-12 dalam makrofag dapat memberikan wawasan ke
dalam patogenesis penyakit infeksi dan inflamasi, dan bisa mengungkapkan pendekatan baru
untuk mengubah respon imun [39].

Untuk saat ini, efek anti-inflamasi dari ekstrak dan / atau senyawa yang diisolasi dari bintang
laut P. nodosus belum dilaporkan. Oleh karena itu, kita menguji aktivitas anti-inflamasi dari
ekstrak metanolat, fraksi diklorometana-larut, dan lapisan air padaproduksi sitokin pro-
inflamasi (IL-12 p40, IL-6, dan TNF-) BMDC teraktivasiLPS menggunakan ELISA
(Tabel 1) . BMDC diinkubasi di piring 48-sumur dan ditumbuhkan selama 1 jam dengan
senyawa terisolasi sebelum stimulasi dengan LPS (10,0 ng / mL). Supernatandiambil 18 jam
setelah stimulasi. Setelah pemberian LPS, sel dendritik (dendriticcell; DC) diketahui
mensekresikan sitokin pro-inflamasi, termasuk IL-12p40, IL-6, dan TNF-.

Ekstrak metanolat secara signifikan menghambat produksi sitokin pro-inflamasi, sedangkan

fraksi diklorometana dan lapisan air menunjukkan efek penghambatan lebih kuat
(Gambar 2) . Ekstrak metanolatP. nodosus memiliki efek penghambatan pada produksi IL-12
p40, IL-6, dan TNF- (IC 50S = 2,48 0,08, 8,57 0,21, dan 26,19 0,64 ug / mL, masing-
masing). Karena ekstrak metanolat secara signifikan mengurangi inflamasi, zat ini mengalami
partisi dalam diklorometana / air untuk mendapatkan porsi diklorometana-larut dan
faseaqueous.Seperti terlihat pada Tabel 1, fraksi diklorometana-larut menunjukkan aktivitas
yang poten dalam penghambatan terhadap produksi IL-12 p40 dan IL-6 diaktivasiLPS (IC 50-
an = 0,60 0,01 dan 3,29 0,09 ug / mL, masing-masing), yang lebih besar dari adanya
ekstrak metanolat (IC 50-an = 2,48 0,08 dan 8,57 0,21 ug / mL). Selain itu, lapisan air
memberikan efek supresif kuat pada produksi IL-12 p40 (IC 50 = 4,03 0,10 ug / mL).

Selanjutnya, semua turunan steroid terisolasi (1-4) dari fraksi diklorometana dan lapisan air
dari P. nodosus diuji untuk efek penghambatan pada produksi sitokin pro-inflamasi IL-12
p40, IL-6, dan TNF .Hasil yang diperoleh dengan tes 3- (4,5-dimetil-2,5 tiazolil) -2,5
diphenyltetrazoliumbromide (MTT) menunjukkan bahwa turunan steroid (1-4) tidak
menunjukkan sitotoksisitas signifikan pada konsentrasi hingga 50,0 pM di 24 jam (data tidak
ditampilkan). Senyawa diuji, 1-3 memberikan efek penghambatan lebih besar dari SB203580
pada produksi IL-12 p40 dengan nilai IC50 sebesar 0,01 0,00, 1,02 0,01, dan 3,11 0,08
pM, masing-masing, di berbagai konsentrasi (Gambar 3 dan Tabel 2) . Variabilitas ini di
penghambatan respon inflamasi oleh 1-3 dapat dijelaskan oleh sekresi berbagai tingkat faktor
inflamasi pada stimulasiLPS.

Membandingkan efek yang diamati antara turunan struktural steroid, (25S) 5-kolestan-3,
6, 8, 15, 16, 26-hexol (1) adalah mirip dengan (25S) 5-kolestan-3, 6, 7 , 8, 15,
16, 26-heptol (2) dan (25S) 5-kolestan-3, 4, 6, 7, 8, 15, 16, 26-octol (3), kecuali
untuk kehadiran kelompok hidroksi berada di C-4 dan / atau C-7 dalam senyawa 2 dan
3; senyawa ini memiliki aktivitas penghambatan terbesar terhadap produksi IL-12 p40
(IC 50 = 0,01 0,00 M) distimulasi LPS, yang sebanding dengan kontrol positif, SB203580
(IC 50 = 5.00 0,16 M). Sebelumnya, senyawa 1-3 diisolasi dari Asterina pectinifera,
Pentacerasteralveolatus, dan Oreasterreticulatus [40 - 42], dan mereka dievaluasi untuk
aktivitas antivirus melawan virus herpes simpleks tipe 1 (HSV-1) dan sitotoksisitas mereka
melawan sel kanker hati manusia (HepG2) in vitro [40].Nodososide (4) adalah steroid
glikosida ter polihidroksilasi. Secara struktural, glikosida ini merupakan turunan kolesterol
beroksigen yang terglikosilasi dengan rantai disakarida, tapi zat ini menunjukkan efek
moderat (IC 50= 12,47 0,38 M) sampai dengan 50,0 pM, relatif terhadap kelompok
kontrol. Kami menemukan bahwa turunan steroid (1-3) memiliki aktivitas anti-inflamasi
signifikan menunjukkan bahwa steroid terkait mungkin menarik untuk diselidiki lebih lanjut
untuk penyakit inflamasi yang potensial.

IL-6 adalah sitokin pro-inflamasi yang menginduksi inflamasi pada sekresi oleh sel T dan
makrofag dalam menanggapi trauma, terutama luka bakar atau jenis lain dari kerusakan
jaringan [43]. Hal ini juga sangat mengaktifkan sistem kekebalan tubuh dan meningkatkan
respon inflamasi, meskipun berdasarkan beberapa efek, mungkin juga diklasifikasikan
sebagai sitokin anti-inflamasi.Mengenai IL-6, ekstrak metanolat dan fraksi diklorometana-
larut menunjukkan aktivitas penghambatan faktor silianeurotropik terhadap LPS-dirangsang
IL-6 produksi (IC 50-an = 8.57 0,21 dan 3,29 0,09 ug / mL, masing-masing). (25S) 5-
kolestan-3, 4, 6, 7, 8, 15, 16, 26-octol (3) menghambat produksi IL-6 secara
signifikan dalam BMDCs LPS-dirangsang, dengan nilai IC 50 1,35 0,03 pM ( tabel 2) . Efek
penghambatan nodososide (4) termasuk penghambatan moderat IL-6 produksi,
dengan 50 nilai IC dari 23,18 0,46 pM (Gambar 4) . Senyawa-senyawa yang tersisa tidak
menunjukkan aktivitas yang signifikan (IC 50> 100 M) terhadap IL-6 produksi.

Berlebih dari sitokin pro-inflamasi TNF- dan IL-6 dikaitkan dengan perkembangan
autoimun, inflamasi, dan penyakit immunopathological. Oleh karena itu, memblokir TNF-,
IL-6, dan jalur sinyal masing-masing mungkin efektif untuk pengobatan penyakit
radang. Menurut hasil kami, ekstrak metanolat dan fraksi diklorometana-larut menunjukkan
efek penghambatan pada produksi TNF- distimulasi LPS (IC 50-an = 26,19 0,64 dan 10,29
0,34 ug / mL, masing-masing). Khususnya, tidak semua turunan steroid terisolasi (1-4)
memiliki efek penghambatan yang signifikan pada produksi TNF- (IC 50> 100 pM,
Tabel 1 dan 2) . Namun, menarik untuk dicatat bahwa ekstrak metanolat dan fraksi
diklorometana-larut P. nodosus lebih aktif daripada derivatif steroid terisolasi (1-4),
menunjukkan adanya turunan aktif lainnya, yang bisabertindak secara individual atau dengan
sinergi dengan turunan steroid terisolasi (1-4).

Kesimpulan

Kesimpulannya, ekstrak metanolatdan fraksi diklorometana menunjukkan efek penghambatan

kuat pada produksi dari ketiga sitokin pro-inflamasi, dengan nilai IC50 berkisar antara 0,60
0,01-26,19 0,64 ug / mL. Aktivitas penghambatan yang potenteramati untuk (25S) 5-
kolestan-3, 4, 6, 7, 8, 15, 16, 26-octol (3) pada produksi IL-12 p40 dan IL-6, dan
untuk (25S ) 5-kolestan-3, 6, 8, 15, 16, 26-hexol (1) dan (25S) 5-kolestan-3, 6, 7,
8, 15, 16, 26-heptol (2) pada produksi IL-12 p40. Selain itu, nodososide (4) memberikan
efek penghambatan moderat pada IL-12 p40 dan IL-6 produksi. Studi tambahan yang
diperlukan untuk menilai mekanisme aksi senyawa ini dan potensi penggunaannya sebagai
agen anti-inflamasi baru. Hasil ini mendukung penggunaan komponen steroid bintang laut
untuk menghambat sekresi sitokin pro-inflamasi, termasuk IL-12 p40, IL-6, dan TNF-, dan
untuk mencegah dan mengobati penyakit inflamasi.

Metode

Prosedur Eksperimental Umum

Rotasi optik ditentukan pada polarimeter JASCO P-2000. Spektrum UV tercatat pada
spektrofotometer JASCO V-630. Spektrum IR diperoleh pada Bruker TENSOR 37 FT-IR
spektrometer. 1 H NMR (500 MHz) dan 13 C NMR (125 MHz) spektrum direkam pada
spektrometer Bruker AM500 FT-NMR dan TMS digunakan sebagai standar
internal. Kromatografi kolom (CC) dilakukan pada silika gel (Kieselgel 60, 70-230 mesh dan
230-400 mesh, Merck), berpori polimer gel (Mitsubishi Chemical, Diaion HP-20, 70 180
mm), oktadesil silika (ODS, Cosmosil 140 C 18 -OPN, NacalaiTesque), dan YMC RP-18
resin (30-50 pM, Fuji Silysia Kimia). Kromatografi lapis tipis (TLC) digunakan Precoated
silika gel 60 F 254 (1.05554.0001, Merck) dan RP-18 F 254S piring (1.15685.0001, Merck) dan
senyawa divisualisasikan dengan penyemprotan dengan air 10% H 2 SO 4 dan pemanasan
selama 3-5 menit.

Materi Kelautan

Sampel dari bintang laut P. nodosus dikumpulkan di Ha Long, Quangninh, Vietnam, pada
Oktober 2012 dan diidentifikasi oleh Prof. Do Cong Thung (Institut Sumber Daya Kelautan
dan Lingkungan, VAST, Hanoi, Vietnam). Sebuah spesimen (PN-VHS-2012) diendapkan di
Institut Sumber Daya Kelautan dan Lingkungan dan Institut Kelautan Biokimia, VAST,
Vietnam.

Ekstraksi dan Isolasi

Sampel beku segar dari bintang laut P. nodosus (5.0 kg) adalah diendapkan dan diekstraksi
tiga kali dengan MeOHpanas (pada 50 C selama 3 jam setiap kali). Larutan yang diperoleh
disaring, digabungkan, dan dikonsentrasikan pada tekanan rendah untuk menghasilkan residu
kental gelap (56,0 g, A). Residu ini disuspensikan dalam air (1,0 L) dan dipartisi dengan
CH 2 Cl 2 (3 1,0 L). Bagian diklorometana-larut gabungan diuapkan pada tekanan rendah
untuk mendapatkan CH 2 Cl 2 fraksi (27,5 g, B) dan lapisan air (C).

Ekstrak B secara kasar dipisahkan oleh silika gel (CC) menggunakan konsentrasi gradien etil
asetat (EtOAc) di n-heksana dari 0 hingga 100% untuk menghasilkan empat fraksi (B-1 ke B-
4). Fraksi B-4 (2,31 g) selanjutnya dipisahkan dengan silika gel CC menggunakan
CH 2 Cl 2 MeOH-H 2 O (5: 1: 0,1) sebagai eluen, untuk memberikan tiga subfraksi (B-1.1 ke
B-1.4). Subfraksi B-1,3 (1,35 g) kemudian dikenakan CC silika gel menggunakan eluen dari
CH 2 Cl 2 MeOH (3,5: 1), dan selanjutnya dimurnikan dengan fase terbalik Flash CC (YMC
Gel ODS-A, 60 , 400 / 500 mesh) dan eluting dengan MeOH-H 2 O (2: 1) untuk
mendapatkan (25S) 5-kolestan-3, 6, 8, 15, 16, 26-hexol (1, 2,1 mg). Berikutnya,
(25S) 5-kolestan-3, 6, 7, 8, 15, 16, 26-heptol (2, 1,8 mg) dimurnikan melalui
subfraksi dari B-1,2 (0,21 g) oleh CC silika gel dan eluting dengan CH 2 Cl 2 MeOH (4,5:
1). Demikian pula, subfraksi B-1,1 (4,16 g) menjadi sasaran YMC RP-18 CC, menggunakan
MeOH-aseton-H 2 O (80:10:10) untuk menghasilkan (25S) 5-kolestan-3, 4, 6, 7 , 8,
15, 16, 26-octol (3, 2,3 mg).

Lapisan air dihilangkan garamnya dengan Diaion HP-20 CC dan dielusi pertama dengan
air dan kemudian dengan MeOH. Residu air desalted (6,2 g, C) dipisahkan oleh CC silika gel
dan dielusi dengan CH 2 Cl 2 MeOH (dari 25: 10: 1, v / v / v) untuk menghasilkan lima fraksi
(C-1 ke C- 5). Fraksi C-3 (1,2 g) dipisahkan oleh CC silika gel, menggunakan
CH 2 Cl 2 MeOH (5: 1) sebagai eluen untuk menghasilkan tiga subfraksi (C-3.1 ke C-
3.3). Akhirnya, subfraksi C-3,3 (0,15 g) selanjutnya dipisahkan oleh Sephadex LH-20 CC
menggunakan aseton-MeOH (1: 2) sebagai fase gerak, diikuti oleh YMC RP-18 CC
menggunakan MeOH-H 2 O (1: 1) untuk mendapatkannodososide (4, 3,5 mg).

Derivatif Produk Kelautan

Secara total, 5.0 kg bahan dicincang halus diekstraksi dengan MeOH (5.0 L) dalam toples
kaca dengan tutupberulir. Ekstrak metanolat disaring, digabungkan, dan dikonsentrasikan
menggunakan evaporator rotarivakum pada 40 C dan kemudian lebih lanjut dikeringkan
dalam kondisi vakum pada suhu kamar selama 24 jam. Dari fraksi diklorometana dan lapisan
air P. nodosus, empat turunan steroid yang sangat murni (1-4) diisolasi dan struktur mereka
diketahui. Larutan stok dari senyawa yang diuji disiapkan dalamdimethylsulfoxide (DMSO),
disimpan pada -20 C, dan diencerkan dengan konsentrasi akhir yang diinginkan di media
segar sebelum setiap percobaan. Konsentrasi akhir DMSO tidak melebihi 0,5% dalam salah
satu percobaan untuk menghindari efek pertumbuhan sel.

Assay Viabilitas Sel

Viabilitas sel ditentukan dengan prosedur standar dari MTT tes (Sigma, St Louis, MO, USA),
yang didasarkan pada pengurangan MTT pewarna untuk formazan kristal, produk biru
intraseluler larut, oleh dehydrogenases seluler. Secara singkat, sel-sel pada konsentrasi 5
10 4 sel ditanam di piring kultur 96-sumur. Setelah inkubasi selama 1 jam pada 37 C, sel
diperlakukan dengan ekstrak, fraksi, dan senyawa pada berbagai konsentrasi selama 24
jam. Sel ditambahkan 0,2 mg MTT (Sigma, St Louis, MO) dan kemudian diinkubasi pada
37 C selama 4 jam. Piring disentrifugasi dan supernatandiambil. Kristal formazan di setiap
sumur dilarutkan dalam 250 mL DMSO (Amresco, OH). Lempeng diguncangkan untuk
memastikan disolusikomplit dari kristal formazan ungu, dan densitas optik diukur pada
panjang gelombang 540 nm menggunakan pembaca ELISA (Packard, Instrumen Co,
DownersGrove, IL).

Kultur Sel

Dalam studi ini, kami menggunakan BMDCteraktivasi LPS sebagai model untuk menguji
efek penghambatan fraksi dan senyawa terisolasi pada sekresi sitokin pro-inflamasi IL-12
p40, IL-6, dan TNF-. BMDCs (1 10 5) yang ditanam di piring 48-sumur pada suhu 37 C,
5% CO 2 selama 1 jam, dan kemudian dirawat selama 1 jam dengan senyawa pada
konsentrasi 0,1-50,0 pM, diikuti oleh stimulasi dengan LPS ( 10,0 ng / mL,
Gambar 3) . Supernatandiambil 18 jam setelah stimulasi dan sekresi IL-12 p40 diukur dengan
menggunakan ELISA. SB203580, penghambat protein pengikat sitokin supresif/ p38kinase,
digunakan sebagai kontrol positif [44]. SB203580 menghambat produksi IL-12 p40, IL-6,
dan TNF- dengan nilai IC50 sebesar 5,00 0,16, 3,50 0,12, dan 7,20 0,13 pM, masing-
masing.
 Sumsum tulang turunan sel dendritikdikembangkan dari tipe liar C57BL / 6 tikus (Orient
Bio Inc., Seoul, Korea) sebagaimana telah dijelaskan sebelumnya [45]. Semua prosedur
hewan telah disetujui oleh dan dilakukan sesuai dengan pedoman dari Komite Kelembagaan
Perawatan dan Penggunaan Hewan Jeju National University (# 2010-0028). Secara singkat,
tibia dan femurtikus diperoleh dengan pembilasan dengan modifikasi media EagleDulbecco
untuk menghasilkan sel-sel sumsum tulang. Sel-sel dikultur dalam Rosell Park Memorial
Institute (RPMI) 1640 medium yang mengandung 10% serum janin sapi yang dilemahkan
dengan panas (FBS; Gibco, Grand Island, NY, USA), 50,0 pM -mercaptoethanol, dan 2.0
mMglutamin dilengkapi dengan 3% supernatan kultur sel hibridoma J558L yang berisi
granulosit-makrofagcolony-stimulatingfactor (GM-CSF). Medium kultur diganti dengan
media segar setiap hari. Pada hari enam penumbuhan, agregat sel-sel yang tidak melekat dan
sel dendritik longgar melekat (DC) dipanen, dicuci, dan diendapkan ulang di RPMI 1640
dengan 5% FBS.

Pengukuran Produksi Sitokin

The BMDC diinkubasi di piring 48-sumurdengan volume 0,5 mL yang mengandung 1

10 5 sel per sumur, dan kemudian diberikan perlakuan dengan senyawa terisolasi (1-4) pada
konsentrasi yang berbeda selama 1 jam sebelum stimulasi dengan 10,0 ng / mL LPS dari
Salmonellaminnesota (Alexis, Famingdale, NY, USA). Supernatan dipanen 18 jam setelah
stimulasi. Konsentrasi murine IL-12 p40, IL-6, dan TNF-, dalam supernatan kultur
ditentukan dengan ELISA (BD PharMingen, San Diego, CA, USA) sesuai dengan instruksi
pabrik. Data disajikan sebagai rerata SD setidaknya tiga percobaan independen dilakukan
dalam rangkap tiga.

Kadar p40 IL-12 di DC tak terstimulasi: tidak terdeteksi. Kadar IL-12 p40 di DCteraktivasi
LPS: 51,34 0,66 (ng / mL). Kadar IL-6 di DC tak terstimulasi: tidak terdeteksi. Kadar IL-6
di DCteraktivasi LPS: 41,12 2,38 (ng / mL). Kadar TNF- di DC tak terstimulasi: tidak
terdeteksi. Kadar TNF- di DCteraktivasi LPS: 1,83 0,02 (ng / mL).

Aktivitas penghambatan (I) dinyatakan sebagai tingkat inhibisi (%), yang dihitung dari
rumus berikut:
 C dcv: Tingkat sitokin (ng / mL) dalam DCdengan perlakuan buffer;

C dcc: Tingkat sitokin (ng / mL) di DCdengan perlakuan.

Analisis Statistik

Hasilnya dinyatakan sebagai nilai rata-rata SD.Analisis statistik dilakukan dengan

menggunakan onewayANOVA. P <0,05 dianggap signifikan secara statistik.