4.

Metodologi
4.1. Pengambilan sampel tanah dan jaringan tanaman

Untuk nematoda parasit tumbuhan tertentu, seperti nematoda puru akar

Meloidogyne spp. , menimbulkan tanda serangan dan kerusakan akar yang khas
pada tanaman yang terserang sehingga mudah untuk dikenali. Akan tetapi
sebagian besar serangan nematoda parasit tumbuhan tidak memperlihatkan
tanda serangan yang jelas sehingga sulit untuk dilihat secara langsung di
lapangan. Disamping itu, secara umum gejala yang nampak di atas permukaan
tanah hampir tidak bisa dibedakan dengan gejala tanaman kekurangan unsur
hara tertentu atau karena serangan patogen.
Nematoda parasitik tumbuhan merupakan organisme yang mikroskopis dan
mempunyai pola penyebaran di lapangan yang tidak teratur (irregular). Kehidupan
nematoda tidak terlepas dari habitat tanah, karena sebagian atau seluruh siklus
hidupnya berada di dalam tanah sebelum menginfeksi tanaman inangnya.
Mengingat sifat-sifat tersebut, maka diperlukan sampel tanah dan jaringan tanaman
untuk dapat mendiagnosis apakah nematoda sebagai penyebab pertumbuhan
tanaman yang kurang balk dan juga dalam upaya pengelolaan nematoda pada suatu
pertanaman.
Beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam pengambilan sampel untuk
nematoda adalah :
a. Jumlah dan kedalaman cuplikan (core) tanah yang disesuaikan dengan
jenis tanaman dan luas lahan yang akan diambil sampel

b. Pola pengambilan sampel yang represantatif

c. Waktu pengambilan sampel

d. Cara penangangan dan penyimpanan sampel

Standar umum yang dipergunakan untuk menentukan jumlah dan

kedalaman cuplikan tanah adalah 10 20 cuplikan untuk luas pertanaman kurang
dari 1 Ha dan 30 cuplikan atau Iebih untuk luas pertanaman lebih dari 1 Ha dengan
kedalaman cuplikan 7,5 15cm untuk tanaman muda atau tanaman semusim dan
25- 40cm untuk tanaman tahunan.
Pola pengambilan sampel balk tanah maupun jaringan tanaman dapat
dilakukan dengan pola diagonal atau zigzag terhadap lahan pertanaman, terutama di

Universitas Gadjah Mada

sekitar daerah perakaran. Hindarkan pengambilan sampel nematoda di daerah
permukaan tanah, karena kemungkinan besar hanya akan didapatkan nematoda
safrofag (non parasitik tumbuhan). Hal itu disebabkan karena nematoda parasit
tumbuhan mempunyai kecenderungan untuk mengelompok atau terpusat di daerah
sumber makanannya yaitu daerah rhizosphere perakaran. Disamping itu, kondisi suhu
dan kelembaban yang sangat berfluktuasi di sekitar permukaan tanah dapat
menurunkan populasi nematoda parasit secara cepat.
Waktu pengambilan sampel untuk nematoda disesuaikan dengan tujuan kita
melakukan sampling. Untuk pengelolaan nematoda, pengambilan sampel dapat
dilakukan sebelum atau setelah panen untuk mengetahui populasi awal sehingga
dapat dilakukan upaya pengendalian sebelum terjadi peningkatan populasi lebih lanjut.
Untuk keperluan diagnosis apakah suatu tanaman terserang nematoda, pengambilan
sampel dapat dilakukan ketika tanaman memperlihatkan kenampakan/gejala terserang
nematoda.
Secara normal, sampel nematoda yang diambil segera mungkin diproses di
laboratorium. Untuk sampel dengan jumlah besar, maka perlu dilakukan penyimpanan
sampel. Untuk menjaga agar sampel yang diambil dari lapangan tetap terjaga dengan
balk dan dapat memberikan informasi yang akurat tentang nematoda yang menjadi
sasaran, maka perlu dilakukan penanganan dan penyimpanan sampel yang tepat.
Berikut adalah beberapa hal yang harus dilakukan untuk menjaga agar sampel
nematoda tetap terjaga balk :
1. Setiap sampel yang diambil berikan label yang berisi keterangan lengkap,
termasuk varietas tanaman, lokasi pengambilan sampel, dan tanggal
pengambilan
2. Letakkan sampel di tempat yang teduh dan hindarkan dari sinar matahari
langsung karena suhu yang tinggi ( dia atas 40C) akan mematikan nematoda
3. Hindarkan penempatan sampel di atas mesin kendaraan bermotor secara
langsung, kecuali sampel diletakkan / disimpan dalam tempat yang bersuhu
dingin, misalnya refrigerator atau styroform
4. Secara normal, sampel nematoda yang diambil sesegera mungkin diproses di
laboratorium. Untuk sampel dengan jumlah besar, maka perlu dilakukan
penyimpanan sampel dan sebaiknya tidak lebih dari satu minggu dari waktu
pengambilan sampel sudah harus dilakukan analisa sampel.

Universitas Gadjah Mada

 5. Usahakan penyimpanan sampel di tempat yang sejuk dengan suhu 10 15 C
untuk menjaga agar tidak banyak terjadi perubahan jumlah populasi nematoda
dalam sampel.
Hal penting yang perlu dipersiapkan sebelum melakukan pengambilan
sampel adalah menyiapkan peralatan, diantaranya : cethok, sekop, bor tanah,
gunting tanaman, kantong plastik, serta alat tulis untuk keperluan labeling data
sampel ( kondisi dan nama lokasi, jenis dan umur tanaman, tanggal pengambilan
sampel ).

4.2. Ekstraksi-isolasi nematoda

Ekstraksi-isolasi nematoda adalah suatu proses untuk memisahkan
nematoda dari habitat hidupnya balk tanah maupun jaringan tanaman,
sebelum dilakukan kajian lebih lanjut, diantaranya identifikasi dan
penghitungan populasi nematoda.
Dikenal beberapa metode ekstraksi-isolasi nematoda dari sampel tanah
maupun jaringan tanaman, diantaranya : Corong Baermann, White head tray
technique (nampan saring). Sentrifuse, kombinasi dekantasi-penyaringan
Cobb's, elutriasi, flotasi, penyaringan dan Fenwick. Pemilihan metode yang
akan dipergunakan untuk ekstraksi-isolasi nematoda sangat ditentukan dengan
ketersediaan fasilitas, objek nematoda yang ditargetkan, ukuran sampel,
jumlah sampel, tipe tanah dan lain sebagainya.
Dua contoh metode ekstraksi-isolasi yang sederhana, mudah
dikerjakan, dan tidak perlu peralatan mahal adalah metode Corong Baermann
dan Whitehead tray (nampan saring). Kedua metode tersebut dapat
dipergunakan untuk ekstraksi-isolasi nematoda balk dari sampel tanah maupun
jaringan tanaman.
a. Prosedur ekstraksi - isolasi nematoda dengan metode corong
Baermann
Atur saringan dalam corong yang sudah dilengkapi dengan slang plastik dan
penjepit (klem) pada ujung bawah. Lapisi di atas saringan dengan kertas
tissue atau kain blacu.
Ambil sampel tanah yang sebelumnya sudah diaduk rata, sebanyak 100 ml
dan ratakan secara perlahan-lahan di atas kertas tissue atau kain blacu
tersebut
Dari bagian tepi corong, tuangkan air sampir menyentuh permukaan tanah

Universitas Gadjah Mada

 Biarkan selama kurang lebih 24 jam, agar nematoda keluar dari tanah,
menembus kertas tissue/kain blacu, masuk dan mengendap di dalam air pada
ujung bawah slang plastik.
Tampung suspensi nematoda dalam air dengan beker glass dengan cara
membukan penjepit slang dan menampung air bagian bawah sebanyak 50 -
100 ml.
Suspensi nematoda slap diamati

b. Prosedur ekstraksi - isolasi nematoda dengan metode nampan saring

Prosedur cara ekstraksi-isolasi dan prinsip kerja metode nampan saring
hampir sama dengan metode corong Baermann. Pada metode nampan saving,
corong diganti dengan nampan yang berfungsi untuk merendam atau
menginkubasi tanah atau jaringan akar yang diratakan pada kertas tissue di atas
saringan. Metode ini dapat dipergunakan untuk volume sampel yang lebih
besar, 200 300 ml tanah atau 20 50 gr jaringan akar disesuaikan dengan
ukuran nampan dan saringan yang digunakan. Metode ini cocok dipergunakan
untuk mendapatkan bahan inokulum karena hanya nematoda yang hidup, sehat,
dan aktif saja yang dapat diisolasi.

4.3. Preparasi nematoda untuk pengujian mikroskopi

Setelah proses ekstraksi-isolasi, jumlah nematoda yang diperoleh dapat
dinyatakan per satuan unit sampel. Untuk jaringan tanaman dapat dinyatakan per
satuan berat, misalnya per 5 gram akar). Sedangkan sampel tanah dinyatakan
dalam satuan volume, misalnya per 100 ml tanah. Jika hasil ekstraksi didapat
nematoda dalam jumlah kecil, semua nematoda dapat dihitung dengan mengamati
menggunakan mikroskup, jika perlu volume aimya dikurangi sebelum diamati
dengan cara penyaringan menggunakan saringan 20pm atau 35 pm atau
pengetapan dengan slang platik berukuran kecil. Apabila diperoleh nematoda
dengan jumlah yang besar, maka suspensi nematoda perlu diencerkan terlebih
dahulu.
Untuk mengidentifikasi jenis nematoda yang diperoleh dari hasil ekstraksi-
isolasi, dapat diakukan secara langsung pada nematoda yang masih hidup atau
dibuat preparat awetan. Agar supaya memudahkan pengamatan, nematoda dibuat
menjadi inaktif dengan cara pemanasan beberapa detik pada suhu sekitar 30 - 50
o
C. Pemanasan dapat dilakukan dengan cara meletakkan nematoda dalam 1 tetes

Universitas Gadjah Mada

air pada gelas benda, selanjutnya dipanaskan dengan lempeng pemanas.Pada
kondisi inaktif, beberapa jenis nematoda memberikan bentuk posisi tubuh yang
khas sehingga memudahkan pengamatan. Sebagai contoh nematoda
Helicotylenchus memberikan bentuk tubuh seperti huruf G.
Proses membuat preparat awetan nematoda didahului dengan memfiksir
nematoda. Beberapa larutan fiksatif yang dapat diperunakan diantaranya FA (
Formalin Acetic acid glacial) :4:10 atau FA :1; FAA ( Formalin Acetic acid glacial
Alchohol); dan Formalin-glyserol.

Universitas Gadjah Mada