Modelo in Vitro para El Estudio Del Papel de La

AnFaMed - ISSN: 2301-1254
Artculo original
Modelo in vitro para el estudio del papel de la

unin mesopontina en la generacin del sueo de
movimientos oculares rpidos y la vigilia
In vitro model for the study of the role of the
mesopontine region in rapid eye movement (REM) sleep
and wakefulness
Modelo in vitro para o estudo do papel da unio mesopontina
na gerao do sono de movimentos oculares rpidos e da
viglia
Esteban Pino1, Hctor Kunizawa1, Jack Yamuy2, Michel Borde1*
Resumen
El estudio de las estrategias neurales para la organizacin del comportamiento en vertebrados cons-
tituye un desafo mayor para la Neurociencia. El avance del conocimiento en este campo depende de
manera crtica de la utilizacin de modelos experimentales adecuados que admitan mltiples niveles
de anlisis (p.ej: comportamental, circuital, celular, sinptico, molecular) y abordajes multitcnicos.
Nos propusimos analizar in vitro una red neural de la unin mesopontina del tronco enceflico crtica-
mente implicada en el control del sueo de movimientos oculares rpidos (S-REM). Pese al cmulo de
evidencias que apoyan el papel desempeado por esta red en relacin al S-REM, los mecanismos celu-
lares y sinpticos que subyacen a este control son poco conocidos y continan siendo objeto de intensa
investigacin. Para avanzar en el conocimiento de estos mecanismos, se llev a cabo la caracterizacin
morfolgica y funcional de una rodaja de tronco enceflico de la rata, en la que las estructuras crticas
para el control del S-REM, i.e.: ncleos tegmentales laterodorsal y pednculopontino, y su proyeccin
al ncleo reticular pontis oralis (PnO), estn presentes y son operativas. La inclusin del ncleo mo-
tor del trigmino en la rodaja permiti detectar cambios de la excitabilidad de las motoneuronas ante
manipulaciones farmacolgicas del PnO, representativos de los cambios del tono muscular asociados
a maniobras similares realizadas in vivo. La utilizacin de este modelo in vitro de S-REM, permitir
aportar a la dilucidacin de las estrategias neurales que operan en niveles intermedios de organizacin
del SN en mamferos para la generacin y regulacin de un estado comportamental.
Palabras clave
Sueo REM, vigilia, formacin reticulada pontina, PnO, ncleo tegmental laterodorsal, ncleo
tegmental pednculopontino, acetilcolina, glutamato, GABA, atona, motoneurona.
Abstract
The study of the neural basis of behavior is a major challenge in Neuroscience. Advancing our
knowledge in this field depends, critically, on the use of experimental paradigms that provide multiple
1. Laboratorio de Neurofisiologa Celular y Sinptica. Dpto. de Fisiologa, Facultad de Medicina. Universidad de la

Repblica.
2. VA Greater Los Angeles Healthcare System; UCLA School of Medicine, Los Angeles, USA
* Contacto: Michel Borde. E-mail: mborde@fmed.edu.uy
E. Pino, et al. Rodaja mesopontina para el estudio de los mecanismos del sueo REM. An Facultad Med (Univ Repb Urug). 2017;4(1):103-136 103
AnFaMed - ISSN: 2301-1254 Artculo original
levels of analysis, as well as powerful techniques. We have selected, as a model of a neural plan that
organizes a complex behavior, a neural network located in the mesopontine junction. This region is
thought to be both necessary and sufficient for the generation of rapid eye movement (REM) sleep,
although the cellular and synaptic mechanisms involved in the control of this behavioral state at the
mesopontine level are still under debate and remain poorly understood. As part of a long term effort to
gain insight into these mechanisms, we carried out the morphological and functional characterization
of a slice preparation of rat brainstem and we demonstrate that critical structures for the control of
REM sleep - the laterodorsal and pedunculopontine tegmental nuclei and their projection to the oral
part of the pontine reticular nucleus (PnO) - are present and are operational. The presence of the tri-
geminal motor nucleus in the slice sought to include in the experimental model a structure capable of
expressing changes of the excitability of the motorneurons caused by pharmacological manipulations
of the PnO, representative of changes of muscle tone associated with similar maneuvers performed in
vivo. The use of this in vitro model of REM sleep will provide critical information to elucidate neural
strategies that operate at intermediate levels of central nervous system organization in mammals to
control behavioral states.
Key Words
REM sleep, wakefulness, pontine reticular formation, PnO, Laterodorsal Tegmental Nucleus,
Pedunculo-pontine Tegmental Nucleus, Acetylcholine, Glutamate, GABA, Atonia, Motoneuron.
Resumo
O estudo de estratgias neurais para a organizao do comportamento em vertebrados constitui um
desafio maior para a neurociencia. O avano do conhecimento nessa rea depende criticamente da
utilizao de modelos experimentais adequados que suportem mltiplos nveis de anlise (por exem-
plo: comportamental, circuital, celular, sinptico e molecular) e abordagens por mltiplas tcnicas.
Decidiu-se analisar in vitro uma rede neural da unio mesopontina do tronco enceflico criticamente
envolvida no controle do sono de movimentos oculares rpidos (S-REM). Apesar da riqueza de provas
que sustentam o papel desta rede em relao ao S-REM, os mecanismos celulares e sinpticos subja-
centes a este controle so pouco conhecidos e permanecem sob intensa investigao. Para avanar no
conhecimento desses mecanismos, caracterizou-se morfolgica e funcionalmente uma fatia de tronco
enceflico de rato, na qual as estruturas crticas para o controle do S-REM, i.e.: ncleos tegmentais
laterodorsal e pedunculopontino, e sua projeo para o ncleo reticular pontis oralis (PnO) esto pre-
sentes e operantes. A incluso do ncleo motor do trigmeo na fatia permitiu detectar mudanas da ex-
citabilidade das motoneuronas provocadas por manipulaes farmacolgicas do PnO, representativas
das alteraes do tnus muscular associados com operaes semelhantes quando realizados in vivo. A
utlizao deste modelo in vitro de S-REM permitir contribuir para a elucidao de estratgias neurais
que operam em nveis intermedios de organizao do SN de mamferos para a gerao e regulao de
um estado comportamental.
Palavras-chave:
Sono REM, viglia, formao reticulada pontina, PnO, ncleo tegmental laterodorsal, ncleo
tegmental pednculopontino, acetilcolina, glutamato, GABA, atonia, motoneurnio.
104 E. Pino, et al. Rodaja mesopontina para el estudio de los mecanismos del sueo REM. An Facultad Med (Univ Repb Urug). 2017;4(1):103-136
Introduccin movements, S-REM) emerge como un modelo

El estudio de las estrategias neurales para la or- de estado comportamental, relativamente bien
ganizacin del comportamiento en vertebrados es definido y robusto en el que, an cuando su ex-
uno de los mayores desafos para la Neurociencia. presin involucra amplios sectores del SNC, los
El avance del conocimiento en este campo depen- mecanismos responsables de su generacin pare-
de de manera crtica de la utilizacin de modelos cen operar en una regin relativamente acotada
experimentales adecuados que admitan mltiples del tronco enceflico. En efecto, un cmulo de
niveles de anlisis (p.ej: comportamental, circui- evidencias obtenidas fundamentalmente de pre-
tal, celular, sinptico, molecular) as como del paraciones in vivo, han permitido postular que
uso de tcnicas variadas, corrientemente utiliza- un rea restringida del puente rostral, ventral y
das en diversas disciplinas. En este sentido, por medial al locus coeruleus, localizada en o en la
la relativa sencillez de su sistema nervioso y la vecindad del PnO -de acuerdo a la terminologa
robustez de algunos de los comportamientos que utilizada para describir los agrupamientos neuro-
despliegan, los invertebrados se han constituido nales de la formacin reticulada pontina(8)- con-
en modelos experimentales valiosos para el estu- tiene la red neural responsable de la generacin
dio de las bases neurales del comportamiento (1). y de la organizacin del S-REM(6)(7)(9)(10)(11)(12)(13).
En contraste con el avance en el conocimiento de Existe consenso en que los ncleos tegmentales
las bases neurales del comportamiento en inver- laterodorsal y pedunculopontino (LDT-PPT) y su
tebrados y vertebrados inferiores (ver p.ej. ref. (2) proyeccin colinrgica a las neuronas de la FRP,
(3)(4)(5)
), los niveles circuital, celular y sinptico de promotora de S-REM, constituyen elementos cr-
organizacin de comportamientos relativamente ticos de esta red (sin embargo, ver ms adelante).
complejos en mamferos, organizados a niveles Las neuronas de la FRP son blanco adems de
intermedios de integracin neural han sido poco influencias moduladoras mediadas por serotoni-
explorados. La dificultad en la identificacin de na (5-HT) y noradrenalina cuyos efectos asocian
los circuitos neurales responsables de estos com- la supresin de S-REM y promueven un estado
portamientos, la complejidad inherente a los me- comportamental con las caractersticas bsicas de
canismos implicados y la ausencia de modelos la vigilia. Si bien persiste el debate en este senti-
experimentales adecuados para su estudio, cons- do, se acepta que el PnO de la formacin reticu-
tituyen algunos de los obstculos ms significa- lada pontina oficiara de conmutador principal o
tivos para el progreso en la comprensin de sus de conexin nodal (traduccin de nodal link;
bases neurales. ver ref.(14)) para la generacin, organizacin y
El estudio del ciclo de sueo y vigilia ha conci- mantenimiento del S-REM. Se han elaborado
tado el inters de la comunidad cientfica no solo varios modelos con valor heurstico tendientes
por su proyeccin neurobiolgica general sino, a explicar tanto la fenomenologa del S-REM
adems, por su impacto sobre el neurodesarrollo, como su regulacin(6)(13)(15)(16)(17)(18)(19)(20). En gene-
el aprendizaje y la memoria, la regulacin de fun- ral, estos modelos suponen el control dual y an-
ciones metablicas y, ms recientemente, por su tagnico (ver modelos propuestos en(6)(14)(17)(21)(22)
vinculacin a ciertos estados patolgicos en se- (23)(24)
) sobre la red mesopontina responsable del
res humanos (ver para revisin ref.(6)(7)). Pese a S-REM, particularmente de la zona ejecutiva de
tratarse de estados comportamentales complejos, la FRP, y de alguna manera sugieren la existencia
particularmente el sueo de movimientos ocula- de una red de propsito nico cuyo nivel de acti-
res rpidos tambin llamado activo o paradji- vacin determinara la probabilidad de aparicin
co (en lo que sigue, sueo REM, de rapid eye de S-REM. En efecto, el concepto que subyace
a estos modelos establece que la aparicin del mitira acceder a los mecanismos neuronales y si-
S-REM, con sus diversos componentes, resul- npticos que operan en estructuras centrales para
ta de la activacin de neuronas glutamatrgicas la organizacin y regulacin de algunos compo-
REM-on localizadas en la FRP (revisado en(22)) nentes cardinales de estos estados comportamen-
sugiriendo un mecanismo basado en la existencia tales, particularmente del S-REM.
de una red dedicada para la generacin y control En el presente trabajo, como un paso inicial
de este estado comportamental. en el desarrollo de un proyecto de largo alien-
Sin perjuicio de lo anterior, los modelos cualita- to orientado al estudio de las estrategias neura-
tivos referidos ms arriba no incorporan la modu- les para la organizacin y regulacin de estados
lacin de la eficacia de los contactos sinpticos de comportamentales como el sueo y la vigilia,
la red, particularmente los que reciben las clulas llevamos adelante la caracterizacin de una pre-
ejecutivas para el S-REM de la FRP, como fac- paracin reducida de SNC de la rata in vitro.
tor determinante de la operativa del circuito me- Utilizando mltiples abordajes experimentales y
sopontino y, en consecuencia, como mecanismo tcnicas, demostramos que las estructuras crticas
contribuyente a la generacin, mantenimiento y para el control del S-REM estn presentes y son
control del S-REM. La participacin de este tipo operativas en la rodaja mesopontina. Ms an, la
de fenmenos plsticos a nivel de la red meso- inclusin del ncleo motor del trigmino en esta
pontina ha sido poco explorada(25)(26) y su papel en rodaja permiti detectar modificaciones de la ex-
el control del S-REM y otros estados comporta- citabilidad de las motoneuronas provocadas por
mentales queda an por determinarse. manipulaciones farmacolgicas del PnO repre-
En el curso de experimentos electrofisiolgicos sentativas de las observadas en modelos in vivo
en rodajas del tronco enceflico de la rata orien- ante similares maniobras experimentales(29)(30)(31).
tados al estudio de los efectos de las neurotrofinas La utilizacin de este modelo in vitro de S-REM,
sobre las propiedades electrofisiolgicas intrnse- contribuir a la dilucidacin de las estrategias
cas de las neuronas de la formacin reticulada neurales que operan en niveles intermedios de or-
pontina (27) uno de nosotros (J Yamuy) detect ganizacin del SN en mamferos para la genera-
la potencialidad del uso de una rodaja de tronco cin y regulacin de un estado comportamental.
enceflico -como la utilizada en el presente tra-
bajo- para el estudio de los mecanismos celulares Materiales y mtodos
y sinpticos que operan en la red mesopontina Obtencin de la rodaja
responsables de la generacin y mantenimien- Los animales se obtuvieron de la Unidad
to del S-REM y el control de la vigilia (28). Para de Reactivos y Biomodelos Experimentacin
ello, esta rodaja debera contener las estructuras (U.R.B.E.) de la Facultad de Medicina, UdelaR
clave implicadas en la regulacin del S-REM y y los procedimientos utilizados fueron aproba-
de la vigilia, cuyas interconexiones se encuen- dos por la Comisin Honoraria de Experimen-
tren conservadas y permanezcan operativas in tacin animal y la Comisin de Experimenta-
vitro y, finalmente, elementos neurales capaces cin Animal de Facultad de Medicina (Exp. N
de expresar signos caractersticos del S-REM, 071140-000654-10).
equivalentes de la atona muscular. Somos cons- Se utilizaron ratas de cepa Wistar entre P7 y
cientes de que no es posible reproducir in vitro la P15. En esta etapa de la vida post-natal la mieli-
completitud fenomenolgica de estados compor- nizacin no ha alcanzado el desarrollo del adulto,
tamentales complejos. Sin embargo, un abordaje aspecto que fue relevante a la hora de optimizar
reduccionista adecuado a los requerimientos del las condiciones de visualizacin de las neuronas
modelo experimental expresados ms arriba, per-
a registrar. mersin en agua). Una cmara digital (319CU

Las ratas fueron decapitadas y se realiz una 3.2M CMOS, Micrometrics) conectada a un or-
craneotoma ampliada para acceder y remover denador permiti la exploracin de la rodaja, la
rpidamente el tronco enceflico. Durante la di- visualizacin de las neuronas, la colocacin de
seccin, el SNC se ba continuamente con solu- los electrodos de estimulacin y registro y de las
cin de lquido cefalorraqudeo artificial (LCRA) micropipetas para aplicacin local de sustancias.
modificado: Sacarosa 213 mM, KCl 2.7 mM, Estmulo elctrico
KH2PO4 1.25 mM, MgSO47H2O 2 mM, NaHCO3 Para la estimulacin elctrica del rea del LDT-
26 mM, glucosa 10 mM, CaCl2 2 mM a 4C. La PPT, del PnO o la raz del NM V (segn el ob-
sustitucin equimolar del ion sodio por sacarosa jetivo especfico del experimento) se utiliz un
se utiliz para reducir la actividad neuronal y la electrodo metlico bipolar (nichrome, 75 micras)
actividad sinptica minimizando los procesos de conectado a un estimulador GRASS S88 (Grass
excitotoxicidad y muerte neuronal(32). Medical Instruments, Quincy Mass USA) a tra-
La pieza obtenida se fij a la platina de un vibr- vs de una SIU (GRASS SIU5) o mediante la
tomo (Vibratome 1000plus, Vibratome) sumer- utilizacin de una SIU controlada por una seal
gindola en LCRA modificado a 4C. Se realiza- de tipo TTL (2620 Stimulus Isolator, Tektronik
ron cortes transversales al eje mayor del tronco Beaverton Oregon, USA) por medio de la sali-
enceflico obteniendo rodajas de 350-450 m de da digital de la tarjeta de conversin (Digidata
espesor. Las rodajas de la unin ponto-mesence- 1322). En este caso, los parmetros de estimula-
flica se mantuvieron en una mezcla (50%-50%) cin fueron controlados por el software (Clam-
de solucin de LCRA normal NaCl 126 mM, KCl pex 8, paquete pClamp, Axon Instruments). A los
5 mM, glucosa 10 mM, NaHCO3 26 mM, HE- efectos de activar neuronas del LDT-PPT y obte-
PES 2 mM, MgCl2 6H2O 2mM, CaCl2 2 mM y ner resultados comparables entre experimentos,
LCRA modificado a temperatura ambiente (20 a el electrodo de estimulacin sistemticamente se
22C). La mezcla de LCRA se remplaz paula- coloc en una relacin topogrfica precisa con el
tinamente (en 1 hora) hasta alcanzar el 100% de extremo medial del pednculo cerebeloso supe-
solucin LCRA normal. La rodaja de trabajo fue rior (p.c.s., Fig. 1B). Para cada experimento se
transferida luego a la cmara de registro (cmara ajust la intensidad del estmulo hasta obtener
de inmersin), y se perfundi con solucin LCRA una respuesta de amplitud y latencia estable con
normal a temperatura ambiente (1-3 ml/min). El valores similares a los observados en otros expe-
LCRA fue burbujeado continuamente con carb- rimentos de modo de trabajar con una poblacin
geno (95% O2-5% CO2) a los efectos de estabili- relativamente homognea de respuestas postsi-
zar el pH (7.4) y promover la oxigenacin. Para npticas. Ocasionalmente se utilizaron pares de
conservar en una misma rodaja las estructuras estmulos a intervalos variados (5 a 150 ms) de
clave de la red mesopontina implicada en el con- acuerdo al objetivo del experimento y a la estruc-
trol del S-REM (ver ms adelante), las secciones tura en anlisis.
del tronco enceflico se obtuvieron de manera tal Registro intracelular
que el plano de corte form un ngulo de 4-6 Para el registro intracelular se utilizaron elec-
con respecto a los cortes coronales. La cmara de trodos de patch (resistencia 4-8 MOhm) fabri-
registro se dispuso en la platina de un microsco- cados con un estirador de pipetas (P-87 Sutter
pio (Nikon, Eclipse FN1) dotado de iluminacin Instruments Co.) en su configuracin de clula
infra-roja y ptica para contraste de interferencia entera (o de whole cell). Se emplearon medios
diferencial (DIC-IR) con objetivos X4 y X40 (in- intracelulares con diferentes composiciones con
el fin de controlar el potencial electroqumico de Una vez establecido el sello (> 1GOhm) entre la
ciertos iones de inters, y la optimizacin la re- pipeta y la membrana neuronal (configuracin
lacin seal-ruido de los registros bioelctricos. cell attached), se aplic una leve presin nega-
As, para el estudio de la accin GABArgica, tiva perforando el parche de membrana, ganando
se utiliz una solucin con alta concentracin de acceso elctrico al medio intracelular (configu-
Cl- (150 mM, potencial de equilibrio electroqu- racin whole cell). En estas condiciones se llev
mico calculado ~ 3 mV) (MgCl2 4.6mM, HEPES a cabo la caracterizacin electrofisiolgica de la
10mM, EGTA 1 mM, CaCl2 0.1 mM, Na2ATP 4 neurona y se busc correlacionar estas propieda-
mM Na2GTP 0.3 mM ) de tal manera que en el des con las caractersticas del soma neuronal con-
potencial de reposo (potencial de mantenimien- signadas previamente. Una vez estabilizado el re-
to, Vh -70 mV) la corriente sinptica GABAr- gistro y compensada la resistencia del electrodo
gica fue de entrada y fcilmente detectable. En se procedi a consignar el valor del potencial de
aquellos experimentos en los que se analizaron membrana (Vm) y a aplicar protocolos especfi-
corrientes sinpticas glutamatrgicas se emple cos para estimar la resistencia de entrada de la
un medio intracelular basado en gluconato de K+ neurona (Ren). De manera rutinaria, la Ren se
(Gluconato de K+ 144mM, EGTA 0,2mM, MgCl2 evalu mediante una serie de pulsos de corriente
3mM, HEPES 10mM, Na2GTP 0.3 mM, Na2ATP hiperpolarizantes y despolarizantes (fijacin de
4mM). Ocasionalmente los registros se realiza- corriente, ver para ejemplos Figs. 2A y 3A). En
ron con electrodos afilados (50 a 70 MOhm) con- Clampfit (pClamp 8) se midieron Im (corriente
teniendo Acetato de K+, 4 M. inyectada) y el cambio del Vm resultante para
Los electrodos de registro se posicionaron cada pulso, mediante cursores colocados en el
mediante un micromanipulador hidrulico (Na- instante correspondiente al mximo de respuesta
rishige MHW-13), se conectaron a un amplifi- para el pulso mximo hiperpolarizante (tpica-
cador Axoclamp 2B (Axon Instruments) y se mente a 50-70 ms del inicio del pulso). Los va-
obtuvieron registros en la modalidad de fijacin lores obtenidos se graficaron (grfico delta V vs
de corriente y/o de voltaje segn las necesidades I) y la Ren se estim por ajuste de una recta a los
especficas del experimento. Se compens la re- puntos del sector lineal del grfico (tpicamente
sistencia del electrodo (al 100% en condiciones entre 0 y -60 mV). En otras ocasiones, en condi-
de fijacin de corriente) o la resistencia en serie ciones de fijacin de voltaje, se emple una ram-
(hasta un 50%) para el registro en condiciones de pa de voltaje (520 ms, -90 a -50 mV) y se midi la
fijacin de voltaje. Los protocolos especficos en corriente durante la rampa. En estos casos, el gr-
ambas modalidades de registro fueron aplicados fico (I vs V) se obtuvo representando el trazado
utilizando el software CLAMPEX 8.0 (pClamp, de corriente contra el correspondiente trazado de
Axon Instruments). Las seales registradas se voltaje durante la aplicacin de la rampa, se ajus-
digitizaron (Digidata 1322A, Axon Instruments) t una recta a los puntos representados y se esti-
para su almacenamiento en un ordenador y su m la Ren segn los parmetros de la recta ajus-
posterior anlisis. tada (1/pendiente). Se analizaron las propiedades
A nivel del PnO, una vez seleccionada la neuro- electrofisiolgicas activas utilizando protocolos
na a registrar, de manera sistemtica se consign especficamente diseados tanto en condiciones
tanto el tamao de su soma (dimensiones aproxi- de fijacin de corriente como de voltaje. Se ana-
madas en m) como su forma. Para la obtencin liz particularmente la presencia de corrientes de
del registro de patch se procedi de manera es- potasio transitorias (de tipo IA), corrientes cati-
tndar (33) en condiciones de fijacin de voltaje. nicas activadas por hiperpolarizacin (de tipo Ih),
corrientes de calcio transitorias (IT), identificadas procesamiento para observacin. En cada rodaja
en estudios previos como representativas del fe- se marc nicamente una neurona del PnO, para
notipo electrofisiolgico de las neuronas de este facilitar su identificacin y la adecuada correla-
sector de la FRP(25)(26)(34)(35)(36)(37)(38)(39). Los regis- cin con los hallazgos electrofisiolgicos.
tros se analizaron utilizando el programa Clam- Para el revelado, se utiliz Vectastain ABC
pfit 9, parte del paquete de software de pClamp System (Vector Laboratories, Burlingame, CA,
(Axon Instruments, Inc.). Las caractersticas es- USA) empleando el procedimiento descrito ori-
pecficas de los protocolos utilizados para poner ginalmente por Kita y Armstrong (1991)(41). Des-
de manifiesto cada tipo de corriente de membrana pus de varios lavados con PBS, la rodaja fue tra-
se describen con la presentacin de los resultados tada con Triton-X100 (0,4% en PBS) durante 1 a
correspondientes. 2 horas y despus se incub en VECTASTAIN
En los experimentos orientados al anlisis de ABC reactivo en PBS durante 2 horas. Despus
la modulacin de la excitabilidad de las moto- de varios lavados con PBS, se hicieron reaccio-
neuronas por aplicacin de agentes colinrgicos nar con diaminobencidina (DAB 0,05%) y H2O2
y GABArgicos en el PnO, estas clulas fueron (0,003%) en PBS.
caracterizadas mediante la aplicacin de familias Las preparaciones histolgicas se observaron
de pulsos de corriente hiper y despolarizantes y la con microscopia de luz (Nikon Optiphot), do-
resistencia de entrada se monitoriz mediante la cumentando mediante fotografa digital (Kodak
inyeccin de pulsos de corriente hiperpolarizante MDS120). Las neuronas marcadas se fotografia-
(tpicamente 1 nA) o la aplicacin de rampas len- ron y dado que ocuparon ms de un plano focal
tas de baja amplitud (-0.3 a 0.3 nA en 1s). se procedi a su reconstruccin mediante el uso
Marcaje intracelular de un dispositivo de cmara clara acoplado a un
En una serie experimental se procedi al mar- microscopio Olympus BX60.
caje intracelular de las neuronas registradas con Marcaje retrgrado e inmunohistoqu-
vistas al establecimiento de su citomorfologa mica
general (soma y prolongaciones) y su correla- La presencia de neuronas del LDT-PPT conec-
cin con los hallazgos electrofisiolgicos. Para tadas con elementos neurales del PnO en la roda-
ello, los electrodos de patch utilizados para los ja mesopontina se explor mediante la aplicacin
registros intracelulares se llenaron con solucin por iontoforesis de marcador retrgrado en el
intracelular basada en gluconato conteniendo PnO. Para ello, una pipeta conteniendo solucin
neurobiotina (2%) lo que permiti la caracteri- de neurobiotina al 2% (42) en acetato de potasio
zacin electrofisiolgica de la neurona y dems (4 M) se posicion en el centro aproximado del
maniobras experimentales durante la difusin del ncleo y se aplicaron pulsos de corriente de pola-
colorante en el medio intracelular (40). Una vez fi- ridad alternante de hasta 5 A de amplitud y 500
nalizado el experimento se retir el electrodo de ms de duracin a una frecuencia ~ 0.8 Hz durante
registro a la vez que se ejerci una leve presin 30 min. Finalizada la inyeccin de neurobiotina
positiva. La rodaja permaneci en la cmara por se aguard un mnimo de 4 horas (usualmente
un perodo no menor a 4 horas esperando una cerca de 8 hs) antes de proceder a la fijacin de la
adecuada difusin del colorante en la clula mar- preparacin. El revelado se realiz con un proto-
cada y luego se fij durante la noche (~8 horas) colo similar al utilizado para la inyeccin intrace-
en paraformaldehdo al 4% en buffer fosfato (0.1 lular excepto cuando el marcaje se combin con
M). Finalizada la fijacin se pas a una solucin inmunohistoqumica para colina acetiltransferasa
de buffer fosfato (PBS, pH 7,3) hasta el posterior (ChAT) (ver luego). En estos casos las rodajas se
crioprotegieron y se obtuvieron cortes de 30 m rrido lser confocal (Leica TCS). En estos casos,
con criostato (Reichert-Jung, Leica, Deerfield, se obtuvieron imgenes de dos colores que fue-
IL, EEUU). ron combinadas digitalmente (Adobe Photoshop
En los casos que se realiz una doble inmuno- Software) para indagar acerca de la colocaliza-
tincin, las secciones fueron procesadas suce- cin de ambos marcadores a nivel de las neuronas
sivamente para ChAT y para neurobiotina. Los del LDT-PPT.
cortes se lavaron varias veces en PBST (0,1 M Soluciones
PBS con 0,3% Triton X-100) y se incubaron con Para la aplicacin local de soluciones de ago-
anticuerpo contra ChAT (Chemicon, CA; dilu- nistas para diversos tipos de receptores se utiliz
cin 1: 2000) en solucin PBST durante la no- un sistema de inyeccin de microvolmenes por
che. Al siguiente da, las secciones se lavaron en presin (picospritzer III, Parker Instrumentation).
PBST durante 30 minutos; luego se incubaron Usualmente los volmenes inyectados no exce-
90 min en PBST que contena anti-IgG de cone- dieron los 30 pl. El volumen se estim midiendo
jo biotinilado (Vector Laboratories, Burlingame, bajo microscopio el dimetro de la gota en el aire
CA; diluido a 1: 300) seguido por incubacin en ante pulsos de presin de entre 50 - 150 ms de
el complejo ABC (Vector Laboratories, Burlin- duracin y presiones inferiores a los 30 psi. Se
game, CA; diluido a 1: 200) durante 90 min. La utilizaron pipetas de patch conteniendo las solu-
reaccin de color se llev a cabo incubando las ciones de agonistas disueltas en solucin salina;
secciones en 50 mM de tampn Tris (pH 7,5) que NaCl 0.9%. Bajo control visual las pipetas se po-
contiene 0,02% 3,3V-diaminobenzidina (DAB) y sicionaron en las estructuras de inters. Las con-
0,015% de H2O2 durante 15 -30 min. Despus de centraciones de agonista utilizadas en la solucin
la reaccin con DAB, las secciones se lavaron en de llenado de la pipeta se ajustaron de tal manera
PBS varias veces y se montaron para su observa- de lograr concentraciones de 3 a 5 veces el EC50
cin en microscopio. del agonista. La estimacin de estas concentra-
Para la doble deteccin para ChAT y neurobioti- ciones se realiz segn las ecuaciones de difusin
na por mtodos de inmunofluorescencia, luego de simple corregidas segn las caractersticas del te-
la exposicin al anticuerpo primario para ChAT, jido nervioso y de la sustancia aplicada (43). Se
las secciones se incubaron en Alexa Fluor 488 utilizaron soluciones de ACh (1 mM), carbamil-
burro IgG anti-cabra (Molecular Probes) 1:200. colina (Carbacol, CCh 1 mM), Glutamato (Glu.,
Para neurobiotina se incubaron durante 1,5 h con 10 mM) y Muscimol (100 M) (concentraciones
estreptavidina-Alexa Fluor 568 (Jackson Immu- en la pipeta de inyeccin).
noresearch Laboratories Inc., West Grove, PA, En todos los casos, los antagonistas para diver-
EE.UU.) diluido 1: 2000. sos tipos de receptores se aplicaron en la solucin
Las secciones fueron examinadas usando un de perfusin en las siguientes concentraciones:
microscopio Olympus BX60 (Olympus Optical, para receptores glutamatrgicos ionotrpicos,
Tokio, Japn). Las fotomicrografas se obtuvie- cido quinurnico 5 mM; para receptores de tipo
ron por medio de una cmara digital conectada al GABArgicos, picrotoxina (100 M) para GA-
microscopio, se adquirieron en una computadora BA-A; para receptores colinrgicos muscarnicos
y se procesaron con el software Photoshop (Ado- atropina (1M).
be Systems, San Jose, CA). Cortes seleccionados, Tratamiento estadstico de los datos
particularmente aquellos en los que se realiz do- Salvo que se indique especficamente, los valo-
ble inmunomarcaje para neurobiotina y ChAT, se res se presentan como la media error estndar
inspeccionaron utilizando un microscopio de ba- (SE) de la media. La significacin estadstica de
las diferencias en las propiedades analizadas o en ron en el rea de la formacin reticulada ubicada
las modificaciones provocadas por una determi- a una distancia > 250 m de la lnea media (lnea
nada maniobra experimental o manipulacin se punteada en la Fig. 1B) y a > 250 m por dentro
evaluaron con el test de t pareado (p <0.05). En los del lmite medial del NM V, a la altura del centro
casos en que los datos a comparar no se ajustaron de este ncleo motor (~1250 m del lmite ven-
a una distribucin normal se emple la prueba de tral de la rodaja). La Fig. 1C (dcha.) muestra un
la suma de rangos con signo de Wilcoxon (prue- ejemplo de las neuronas del PnO (microfotogra-
ba de U de Mann-Whitney), test no paramtrico fa y reconstruccin en cmara clara) registradas
que compara la mediana de dos muestras o el de en este trabajo, que fuera marcada por aplicacin
Kolmogrov-Smirnov (test K-S), test no param- intracelular de neurobiotina. El esquema del cua-
trico que evala la diferencia entre dos muestras drante ventral de la rodaja incluido a la izquierda
independientes comparando las distribuciones de
probabilidad de cada una de ellas.
Resultados
Todos los experimentos se llevaron a cabo en
una preparacin reducida del tronco conteniendo
la red neural considerada como necesaria y sufi-
ciente para el inicio y mantenimiento del S-REM
y el control de otros estados comportamentales(6)
(8)(44)(45)
. Como se ilustra en la Fig. 1, la rodaja con-
tiene un sector de la formacin reticulada pontina
(FRP) rostral -consignado como PnO en Paxinos
y Watson (1998)(46), corte a -8.72 mm del Breg-
ma- situado ventralmente al pednculo cerebelo-
so superior (p.c.s.), medial al sector ms rostral
del NM V. El plano de corte utilizado y la presen- Figura 1. Caractersticas estructurales de la roda-
cia del p.c.s. sugiere la presencia de neuronas de ja mesopontina. A. Imagen panormica de la rodaja
mesopontina por transiluminacin. Se distinguen el
los ncleos tegmental laterodorsal (LDT) y pe- ncleo motor del V par craneano (NM V), el pedn-
dnculo pontino (PPT) en la vecindad de su polo culo cerebeloso superior (p.c.s.), la porcin rostral
medial, aspecto que se confirm con la aplicacin de la formacin reticulada pontina (PnO). Se sealan
de tcnicas de inmunohistoqumica (ver Fig. 4). adems el colculo inferior (ci) y el acueducto (aq).
Calibracin: 200 m. B. Fotografa de la preparacin
Debido a la inclinacin del plano de corte utiliza- en el microscopio con DIC-IR (objetivo 4x). Se dis-
do (Fig. 1A) para conservar estas estructuras y su tinguen las estructuras clave (PnO, NM V y el pcs)
conectividad, el sector dorsal de la rodaja (~ - 8.30 y una pipeta (asterisco) para el registro de neuronas
mm del Bregma(46)) fue relativamente ms rostral del PnO. Se seala la lnea media para referencia (l-
nea recta punteada). Calibracin 200 m. C. Esquema
que su sector ventral (~ - 8.72 mm del Bregma). del cuadrante ventrolateral de la rodaja mesopontina
Estructuras clave como el NM V y el p.c.s., uti- indicando las estructuras clave y el sitio aproximado
lizadas junto con las caractersticas de la cavidad de una neurona del PnO (circulo negro) marcada con
ventricular como referencias anatmicas para la neurobiotina. La neurona identificada electrofisiolgi-
camente como de tipo LTS, fue fotografiada (inserto
seleccin de la rodaja mesopontina, se identifica-
arriba derecha, calibracin 20 m) y reconstruida en
ron fcilmente en DIC-IR (Fig. 1B). De manera el dibujo de cmara clara (inserto abajo derecha, cali-
caracterstica, las neuronas del PnO, se registra- bracin 20 m).
muestra la localizacin aproximada de esta neu-

rona en el rea del PnO.
Caracterizacin electrofisiolgica de las
neuronas del PnO
Se seleccionaron para este estudio aquellas neu-
ronas del PnO con Vm ms negativos de -55 mV,
que mostraron respuestas monosinpticas ante la
estimulacin elctrica del LDT-PPT (n=45) ajustn-
dose a los criterios de Rose & Metherate (2005) (47)
adaptados a nuestro diseo experimental: reducida
variabilidad de la latencia con intensidades de esti-
mulacin submximas 1 ms, modificacin menor Figura 2. Caractersticas electrofisiolgicas de las
neuronas LTS del PnO. A. Familia de respuestas
a 1ms con incrementos de la intensidad de estimula- provocadas por la aplicacin de pulsos de corriente
cin y estabilidad de la latencia para frecuencias de de 800 ms de duracin (esquematizados en la parte
estimulacin relativamente elevadas (15Hz)(48)(49). inferior). La flecha seala el comienzo de la rectifica-
En conjunto, las neuronas registradas presentaron cin de entrada (sag). Note a la salida de la hiperpo-
larizacin, la ocurrencia de respuestas despolarizantes
Ren de 292.17 22.41 MOhm y en su mayora (42 lentas en cuya fase de ascenso se desencadenan poten-
en 45) no mostraron descarga espontnea de potenciales de accin de Na+. B. La aplicacin del protocolo
ciales de accin. Otros estudios in vitro(25)(26)(34)(39)(50) de corrientes ilustrado en el inserto (parte inferior), es
(51)(52)(53)(54)(55)
describen neuronas de la FRP con simi- capaz de desencadenar respuestas despolarizantes con
caractersticas de LTS (punta de flecha) a la salida de
lares caractersticas. Los potenciales de accin pro- la hiperpolarizacin. El asterisco seala un potencial
vocados por pulsos despolarizantes de escasa ampli- de accin de Na+. C. La LTS muestra un compor-
tud (apenas superiores a la reobase) mostraron una tamiento todo o nada. La hiperpolarizacin creciente
amplitud media ( desvo estndar) -medida desde del Vm (protocolo esquematizado en el inserto) re-
trasa y finalmente bloquea la respuesta de tipo LTS
el nivel de Vm alcanzado inmediatamente antes de
sin afectar su amplitud. D. Respuesta de tipo LTS a la
la espiga- de 78.9 mV ( 6.4 mV) y una duracin a salida de la hiperpolarizacin (punta de flecha) provo-
la mitad de la espiga de 2.1 ms ( 0.8 ms). La carac- cada por el pulso ilustrado en el inserto sobre la que
terizacin del fenotipo electrofisiolgico se realiz se produce una espiga rpida de Na+ (izq. Control).
En tanto la perfusin de TTX 1M (TTX), no afecta
en condiciones de fijacin de corriente e incluy la
a la LTS (punta de flecha) esta se bloquea si se aa-
aplicacin de protocolos especficamente diseados de NiCl2200 M a la solucin de perfusin (derecha,
para detectar la presencia de espigas de bajo umbral TTX + NiCl2). Los trazados 1, 2 y 3 corresponden a
(LTS, de Low Threshold Spike). Los resultados ob- los obtenidos tras 15, 20 y 30 minutos de iniciada la
perfusin con NiCl2 respectivamente. A y B misma
tenidos mediante este tipo protocolos (ver ms ade-
neurona. C y D corresponden a neuronas diferentes.
lante) permiti categorizar las neuronas registradas
en dos grupos LTS (Fig. 2) y No-LTS (sin espiga de ronas de varias estructuras del SNC e involucra la
bajo umbral, Fig. 3). Se indag asimismo acerca de participacin de una corriente de calcio transitoria
otras propiedades electrofisiolgicas activas de las (IT)(56)(57)(58). La LTS constituye un fenmeno todo
neuronas registradas compatibles con la expresin o nada que muestra un umbral usualmente 10 a 15
de conductancias de tipo IA e Ih (37). mV ms hiperpolarizado que el del potencial de
En la formacin reticulada pontina (FRP), varios accin de sodio. La corriente de calcio de tipo T
estudios electrofisiolgicos (ver p.ej. ref. (34)(35)(36) que subyace a esta respuesta, se activa por despo-
(37)
) sealan la presencia de neuronas de tipo LTS. larizacin con voltajes medios de activacin relati-
La espiga de bajo umbral ha sido descrita en neu- vamente hiperpolarizados (~ -65 mV) respecto de
otras corrientes de entrada y se encuentra parcial o tamente despus del pulso precedente, postpulso),
totalmente inactivada en el reposo (Vm ~ -60 mV). de amplitud creciente con la ejecucin del protocolo
Su desinactivacin (tambin llamado proceso de re- (tpicamente de 0 a -0.1 nA en 12 a 20 barridos) lo
cuperacin) ocurre a potenciales hiperpolarizados y que provoc su retraso y luego su fallo sin modifi-
es un proceso voltaje y tiempo dependiente. En el cacin de su amplitud (Fig. 2 C). La trayectoria del
curso de nuestros experimentos, el 47% (21/45) de Vm luego del pulso hiperpolarizante precediendo a
las neuronas registradas en condiciones de fijacin la LTS, sugiere la participacin de una corriente de
de corriente mostraron LTS, sea durante la aplica- K+ de tipo IA (ver ms adelante y Fig. 1S-D). De ma-
cin de protocolos para determinar la Ren (Fig. 2A) nera caracterstica (n=3) la LTS no se modific en
o por la aplicacin de protocolos especficamente presencia de TTX 1 M (Fig. 2 D, trazado medio)
diseados para su estudio (Figs. 2B y 2C). En to- y se bloque con la ulterior perfusin de NiCl2 (200
dos los casos la ocurrencia de la LTS requiere de M) (Fig. 2D, TTX + NiCl2, trazados a la dcha.)
la hiperpolarizacin previa del Vm cuya magnitud indicando la participacin de canales de tipo T en la
y duracin deben ser adecuadas para promover el generacin de esta espiga.
proceso de desinactivacin de la IT. La amplitud de En el 53% restante de las neuronas registradas
la LTS suele ser suficiente para desencadenar uno (24/45), la aplicacin de los protocolos habituales
o varios potenciales de accin de sodio (Fig. 2). En para desencadenar LTS no fueron capaces de gene-
nuestro estudio, las neuronas LTS presentaron Ren rar este tipo de respuestas independientemente de la
de 294.14 35.78 MOhm y respondieron a pulsos magnitud y duracin de la hiperpolarizacin aplica-
despolarizantes descargando repetitivamente mos- das (ver Fig. 3B) y fueron categorizadas como neu-
trando adaptacin de frecuencia (Fig. 2A). Debido ronas No-LTS. Un ejemplo representativo de este
al proceso de inactivacin que caracteriza a la co- tipo de neuronas se ilustra en la Fig. 3. En conjunto
rriente de calcio de tipo IT, la ocurrencia de la LTS estas neuronas presentaron una Ren de 270.07
al final del pulso de corriente hiperpolarizante re- 28.20 MOhm, valor que no mostr diferencia esta-
quiere que el pulso inyectado mantenga el Vm en dsticamente significativa con la Ren promedio de
un rango de valores especfico (relativamente hi- las neuronas LTS (Mann-Whitney U test, p=0.78).
perpolarizado) y durante un tiempo suficientemente La descarga repetitiva provocada por los pulsos des-
prolongado. En nuestro caso, con la aplicacin de polarizantes mostr adaptacin de frecuencia, com-
protocolos especficos como el ilustrado en la Fig. portamiento similar al observado en las neuronas
2B, determinamos que la generacin de la LTS re- LTS (Fig. 3A).
quiere de hipeprolarizaciones previas que manten- Tanto las neuronas de tipo LTS como No-LTS pre-
gan el Vm en el rango de -80 a -110 mV durante un sentaron comportamientos electrofisiolgicos com-
tiempo no menor a 400 ms, valores similares a los patibles con la participacin de una corriente de
descritos para otras clulas del SNC(58). A la salida potasio de tipo IA. Estas corrientes de potasio, son
de hiperpolarizaciones de menor amplitud o dura- corrientes transitorias activadas por despolarizacin
cin pueden observarse potenciales despolarizantes que presentan inactivacin (59). Reportes previos (ver
lentos, relativamente ms tardos y de amplitud va- p.ej. ref.(37)) describen la presencia de este tipo de
riable (graduada con la hiperpolarizacin previa), corrientes en neuronas de la FRP. En general las co-
probablemente debidos a la corriente Ih presente en rrientes de tipo IA se encuentran parcialmente inac-
estas clulas (ver ms adelante y Fig. 1S-D). El ca- tivadas en el reposo y los protocolos utilizados para
rcter todo o nada de la LTS se analiz combinando poner de manifiesto la participacin de este tipo de
el pulso hiperpolarizante de desinactivacin con un corrientes en las respuestas neuronales, consisten en
segundo pulso hiperpolarizante (aplicado inmedia- pulsos de corriente hiperpolarizante de amplitud y
duracin adecuadas (tpicamente -0.1 a -0.5 nA y

200 ms) para su desinactivacin seguidos de un pul-
so despolarizante de amplitud levemente superior
a la reobase (Fig. 3C). La despolarizacin provoca
uno o pocos potenciales de accin y la latencia de
la primera espiga est determinada en parte por la
activacin de este tipo de corrientes. Debido a la
expresin de este tipo de corrientes de potasio, la
magnitud de esta latencia guarda relacin inversa
con el valor del Vm alcanzado durante el prepulso
hiperpolarizante (Fig. 3D). Respuestas neuronales
compatibles con la presencia de este tipo de corrien-
tes de potasio se consignaron en el 74.04 % de las
neuronas independientemente de su naturaleza LTS
o No-LTS. En efecto, el ejemplo de la Fig. 3C-D
corresponde a una neurona No-LTS en tanto que los
registros de las Figs. 2C y 1S-D sugieren que neuro-
nas LTS tambin presentan respuestas -trayectorias
del Vm a la salida de la hiperpolarizacin- compa-
Figura 3. Caractersticas electrofisiolgicas de las
neuronas No-LTS del PnO. A. Familia de respuestas tibles con la activacin de una corriente de tipo IA.
provocadas por la aplicacin de pulsos de corriente Este tipo de corrientes se bloquea en presencia de
de 800 ms de duracin (esquematizados en la parte 4-aminopiridina (4-AP, 3 mM). En experimentos
inferior). Note la ausencia de respuestas con caracte-
seleccionados (n=3) se ensay el efecto de este blo-
rsticas de LTS a la salida de la hiperpolarizacin. B.
Este tipo de neuronas carece de respuestas de tipo LTS queante sobre el comportamiento neuronal provo-
a la salida de la hiperpolarizacin provocada por la cado por la participacin de este tipo de conductan-
aplicacin de protocolos como el ilustrado en el in- cias de membrana. Un ejemplo de los resultados de
serto y usualmente utilizados para generar LTS (com- este tipo de experimentos se ilustra en la figura 3E.
pare con Fig. 2B). C. La latencia a la primera espiga
(t, medida entre las lneas entrecortadas verticales) La dependencia de la latencia a la primera espiga
provocada por un pulso despolarizante, vara con el (t) del Vm alcanzado durante el prepulso hiper-
valor mximo de Vm alcanzado durante la aplicacin polarizante (t/Vm) se redujo sustancialmente (de
de prepulsos hiper y despolarizantes (protocolo en el 0.84 0.06 a 0.38 0.04) y de manera reversible en
inserto). D. Grfico de la latencia a la primera espiga
y el valor de Vm alcanzado durante los prepulsos que presencia de 4-AP. La reduccin del cociente t/Vm
sugiere la participacin de corrientes de K+ de tipo IA. ilustrada en la figura alcanz significacin estadsti-
E. Valor absoluto del cociente t/Vm (estimacin de ca (Mann-Whitney U test, p<0.001).
la magnitud de la corriente de tipo IA) vs tiempo para La presencia de Ih, corriente catinica que se abre
un prepulso de amplitud constante (-15 pA), calculado
antes, durante y despus de la perfusin de 4-AP 3
por hiperpolarizacin(60) (revisado recientemente
mM (el curso del experimento se ilustra en la barra en(61)), se evalu aplicando una serie de pulsos de
horizontal sobre el grfico). En el inserto, esquema de corriente hiperpolarizante de amplitud creciente
una respuesta tpica en la que se indican la latencia a la (800 ms de duracin) en condiciones de fijacin
primera espiga (t) y el instante en el que se mide Vm
al final del prepulso (cabeza de flecha). Cada punto
de corriente, explorando la eventual participacin
representa el valor medio s.d. (N=20) de este co- de esta corriente en las respuestas observadas en
ciente obtenido en 20 trazados sucesivos a intervalos un rango del Vm de entre -70 y -110 mV. Tpica-
regulares. mente, para valores de Vm alcanzados durante el
pulso hiperpolarizante ms negativos que -90 mV, permiti identificar el soma as como las principales
la presencia de Ih se manifest por la presencia del prolongaciones de este tipo de neuronas. Un ejem-
llamado sag, relajacin del Vm hacia valores re- plo representativo de las neuronas LTS se ilustra
lativamente despolarizados (ver Fig. 2A y 3A y B), en la Fig. 1C. Las dendritas (2 troncos principales)
y la existencia de rebote despolarizante post-hiper- se originan en polos opuestos del soma neuronal,
polarizacin fcilmente distinguible de la LTS por extendindose en sentido medial o lateral. La ma-
tratarse de un cambio de Vm relativamente lento y yora de las neuronas No-LTS (n=23), en cambio,
graduado con la magnitud de la hiperpolarizacin presentaron somas de aspecto variado, predominan-
previa. En condiciones de fijacin de voltaje, se temente redondeado (dim: 26.39 4.79 m), con
busc cuantificar la expresin funcional de esta co- dimensiones algo superiores a las de las neuronas
rriente a travs del clculo del ndice Ih-50-100 (Fig. LTS (Mann-Whitney U test, n=14, p=0.006). En
1S). Este ndice permite obtener la magnitud de la estas neuronas, mayoritariamente multipolares, las
corriente Ih normalizada al valor la conductancia dendritas se ramificaron en el plano de corte sin una
de entrada y por tanto, al tamao de la neurona. En orientacin dominante (no mostrado).
trminos generales, en las neuronas LTS registradas Las evidencias electrofisiolgicas y morfolgicas
(n=20), el ndice Ih-50-100 mostr una media de 0.25 aportadas muestran que las neuronas registradas
0.03. Por su parte las neuronas No-LTS (n=23) pre- en el rea de la FRP seleccionada para este estudio
sentaron un ndice de 0.18 0.03. Si bien las neuro- guardan razonable similitud, particularmente en lo
nas de tipo LTS mostraron un ndice ligeramente su- que refiere a su fenotipo electrofisiolgico, con las
perior al de las neuronas No-LTS la diferencia en el caractersticas de las neuronas de los sectores de la
ndice entre ambos grupos no alcanz significacin formacin reticulada de presumiblemente implica-
estadstica (test K-S, p=0.13). La rectificacin para dos en el control del S-REM y descritos por otros
pulsos hiperpolarizantes se elimin en presencia de autores(25)(26)(34)(35)(36)(37)(38)(39). Esto sugiere la adecua-
CsCl (3 mM, Fig. 1S-D) o de ZD-7288, bloqueantes cin de los criterios utilizados en este trabajo para la
especficos de Ih. identificacin del PnO como sector de la reticulada
Se busc establecer una relacin entre el fenotipo del tronco enceflico integrante del circuito meso-
electrofisiolgico y la citomorfologa de las dos pontino implicado en el control del S-REM.
categoras de neuronas: LTS y No-LTS. En todos Neuronas del LDT-PPT inervan neuronas
los casos, previamente a su caracterizacin electro- LTS y No-LTS del PnO
fisiolgica, se consign la forma y tamao de los Las aferencias a las neuronas del PnO proceden-
somas neuronales a la inspeccin bajo DIC-IR. Pese tes del complejo LDT-PPT son elementos consti-
a numerosos intentos de ajuste del protocolo de in- tutivos esenciales de la red mesopontina impli-
yeccin intracelular de neurobiotina y del procedi- cada en el control del S-REM a nivel del tronco
miento de revelado, slo se obtuvo marcaje intrace- enceflico (ver para revisin ref.(6)(7)(13)). Con el
lular completo en dos neuronas (una de cada tipo). propsito de determinar si este componente de la
En los restantes casos (n=12) solo se pudo observar red mesopontina est presente y es funcional en
prolongaciones dendrticas marcadas en el rea de la rodaja de la unin ponto-mesenceflica, se de-
la neurona inyectada sin poder detectar la presencia sarrollaron dos series experimentales tendientes a
del soma neuronal. Las neuronas que a posteriori obtener evidencias, morfolgicas y funcionales,
fueron categorizadas como LTS (n=21) presen- que apoyaran la indemnidad de esta conexin.
taron predominantemente somas ovoides (dim. En 6 rodajas se inyect iontoforticamente neu-
mayor: 21.12 3.86 m y dim. menor: 15.36 robiotina como marcador retrgrado a nivel de la
3.99 m). El marcaje intracelular con neurobiotina FRP precisamente en el rea tomada como refe-
algunos casos, de forma complementaria, se apli-

caron tcnicas inmunohistoqumicas para iden-
tificacin del neurotransmisor de las neuronas
marcadas retrgradamente. La inspeccin del
rea efectiva de inyeccin revel que en todos
los casos la inyeccin del marcador qued cir-
cunscripta al sector dorsal del polo rostral de la
formacin reticulada pontina (PnO, Fig. 4B1). El
revelado del marcador retrgrado permiti iden-
tificar algunos somas neuronales en el LDT-PPT
ipsilateral (Fig. 4B1 y B2). La combinacin del
marcaje retrgrado con la deteccin inmunohis-
toqumica para ChAT, busc identificar las neu-
ronas colinrgicas dentro del grupo de neuronas
Figura 4. Neuronas colinrgicas y no colinrgicas del LDT-PPT marcadas retrgradamente. Estos
del LDT-PPT inervan al PnO en la rodaja meso- ncleos del tegmento pontino son considerados
pontina. A. Esquema del diseo experimental em- el principal origen de la inervacin colinrgica
pleado para el marcaje retrgrado de las neuronas que
del SNC en general y del PnO en particular(62)
proyectan al PnO. B1. Fotografa panormica de una
seccin representativa de la rodaja procesada para
(63)(64)(65)
. La utilizacin del procedimiento estn-
neurobiotina y ChAT sin contratincin. El sitio de la dar para la inmunodeteccin para ChAT mostr
aplicacin iontofortica de neurobiotina se indica con marcaje evidente en las motoneuronas del NM
el asterisco. Note la intensa expresin de ChAT a nivel
V as como en neuronas del LDT-PPT que no
del NM V. Algunas neuronas del complejo LDT-PPT
se hacen evidentes con este nivel de magnificacin. mostraron marcaje retrgrado (Figs. 4B1 y B2).
El rea del complejo LDT-PPT comprendida en el re- Desafortunadamente, este procedimiento no
cuadro blanco se ilustra, a mayor magnificacin, en permiti distinguir la expresin de ChAT en las
el inserto en B2. A este nivel, neuronas ChAT+ (cito- neuronas marcadas retrgradamente. Para ello,
plasma marrn claro) se presentaron junto a neuronas
marcadas con neurobiotina (somas de color negro). 3 rodajas fueron procesadas para la inmunode-
El procesamiento utilizado no permiti distinguir el teccin de neurobiotina y ChAT utilizando anti-
fenotipo para neurotransmisor de las neuronas marca- cuerpos conjugados con fluorforos diferentes.
das retrgradamente. C. Detalle de un rea del LDT- Un ejemplo de los resultados obtenidos con este
PPT procesada con anticuerpos contra neurobiotina
y ChAT conjugados con fluorforos con emisin en abordaje se ilustra en las Fig. 4C1, C2 y C3. Neu-
diferentes longitudes de onda: Alexa 488 para ChAT ronas del LDT-PPT positivas para neurobiotina
(rojo) y Alexa 568 para neurobiotina (verde). C1. (Fig. 4C1) tambin mostraron positividad para
Neuronas del LDT-PPT marcadas retrgradamente. ChAT (Fig. 4C2) como se observa en la super-
Las flechas sealan aquellas neuronas que adems re-
sultaron ChAT+ (C2) en tanto que las indicadas con la
posicin de imgenes en la Fig. 4C3. Se desta-
flecha vaca no mostraron inmunomarcaje para ChAT ca que este abordaje tambin mostr neuronas
(superposicin de imgenes en C3). Note la presen- positivas para neurobiotina pero negativas para
cia de finas prolongaciones ChAT positivas de aspecto ChAT (flechas vacas en la Fig. 4C1 y C3) sugi-
arrosariado (punta de flecha en C2 y C3) prximas a
las neuronas marcadas retrgradamente.
riendo que neuronas no colinrgicas, presumible-
mente glutamatrgicas o GABArgicas, inervan
rencia en este trabajo y de la que proceden las el PnO y estn presentes en la rodaja de la unin
neuronas cuyas caractersticas electrofisiolgicas ponto-mesenceflica. Evidencias en este sentido
se incluyeron en la seccin anterior (Fig. 4A). En han sido aportadas por otros autores(65)(66)(67) an
cuando el origen de la inervacin no-colinrgica 0.45 ms, n=45) de amplitud variable (3.35
del PnO ha sido poco estudiada (13). Coincidiendo 0.59 mV). Un ejemplo representativo se ilustra
con nuestros hallazgos, se ha reportado que el n- en la Fig. 5B (control). En estas condiciones fue
mero de neuronas no colinrgicas del
LDT-PPT que proyectan a la PnO es
relativamente bajo en relacin a la po-
blacin de neuronas de este complejo.
Con vistas a la obtencin de evi-
dencias adicionales a favor de la co-
nexin entre neuronas del LDT-PPT
y de la FRP en la rodaja de la unin
ponto-mesenceflica, se procedi a 1.-
la estimulacin elctrica del LDT-PPT
y registro de respuestas sinpticas en
neuronas del PnO, 2.- la estimulacin
farmacolgica del LDT-PPT con ago-
nistas glutamatrgicos y colinrgicos
y registro de respuestas sinpticas en
neuronas del PnO, y 3.- la estimula-
cin elctrica del PnO y registro de
neuronas del LDT-PPT, diseo experi-
mental que busc detectar potenciales Figura 5. La estimulacin elctrica del LDT-PPT provoca res-
de accin antidrmicos en las neuro- puestas sinpticas en neuronas del PnO. A. Esquema del diseo
nas del LDT-PPT, producto de la es- experimental utilizado. B. Respuestas sinpticas a estmulos elc-
timulacin elctrica de sus axones a tricos del LDT-PPT (repetidos a 0.3 Hz) obtenidas en la modalidad
fijacin de corriente (medio intracelular basado en Gluconato de
nivel del PnO. K+, Vm aprox. -70 mV) en situacin control (trazado gris) y en
Para la primera serie de experimen- presencia de Picrotoxina (PTX, 100 M, trazado negro). Note la
tos, las respuestas de las neuronas del ocurrencia de IPSPs espontneos en la situacin control. C1. EPSC
PnO a la estimulacin elctrica del (promedio de 20 respuestas sucesivas a 0.3 Hz, Vh= -60 mV, me-
dio intracelular basado en gluconato de potasio) obtenido en pre-
LDT-PPT se registraron, inicialmente, sencia de PTX 100 M antes (negro) y durante (gris) la perfusin
en condiciones de fijacin de corriente de cido quinurnico (5 mM). C2. En otra neurona, en presencia de
(Vm -57.30 1.70 mV) con electro- cido quinurnico (5 mM), IPSC representativo (promedio de 20
dos de patch con medio intracelular barridos sucesivos a 0.3 Hz, Vh=-70 mV, medio intracelular basa-
do en KCl) obtenido antes (negro) y durante (gris) la perfusin de
basado en gluconato de potasio (ver PTX (100 M). D. La estimulacin del LDT-PPT con trenes de es-
Materiales y Mtodos) siguiendo el tmulos de alta frecuencia (50 Hz, 500 ms) provoca cambios de la
diseo experimental de la Fig. 5A. De excitabilidad de la neurona del PnO compatibles con un efecto co-
manera caracterstica, e independien- linrgico muscarnico. D1. Respuesta de la neurona a la aplicacin
de un pulso de corriente despolarizante (500 ms, 0.3 nA, protocolo
temente del fenotipo electrofisiolgi- esquematizado a abajo) aislado (arriba) o precedido (intervalo de
co de la neurona registrada, estmulos 1.5 s) de un tren de estmulos en el LDT-PPT (30 Hz, 500 ms, aba-
elctricos nicos del LDT-PPT (0.3- jo) D2. Grfico del nmero de espigas provocadas por el pulso de
3.0 A, 0.2 a 0.6 ms, 0.16 Hz) pro- corriente despolarizante aislado (pulso) y precedido del estmulo
sinptico condicionante (estmulo LDT-PPT + pulso) obtenido en
vocaron potenciales postsinpticos
situacin control () y en presencia de atropina (1 M, ). Cada
despolarizantes de corta latencia (9.74 punto corresponde a la media de 20 barridos sucesivos ( SE.).
posible observar adems potenciales postsinpti- intracelular basado en KCl (150 mM, Veq. Cl-
cos hiperpolarizantes espontneos. En presencia -3 mV). En estas condiciones los IPSCs se regis-
de picrotoxina (100 M, Fig. 5B, picrotoxina), traron como corrientes sinpticas de entrada que
bloqueante de los receptores GABArgicos de alcanzaron una amplitud media ( SE.) de 95.91
tipo A, esta actividad espontnea hiperpolarizan- 21.56 pA (n=54); un ejemplo se ilustra en la
te fue suprimida y sustituida por un bombardeo Figura 5C2. Los IPSCs se bloquearon comple-
sinptico despolarizante -probablemente debido tamente por la perfusin de picrotoxina 50-100
a un incremento general de la excitabilidad del M indicando su naturaleza GABArgica y la
preparado provocado por el bloqueo de la trans- participacin de receptores de tipo GABA-A. La
misin GABArgica-, al tiempo que la amplitud latencia de los EPSCs (10.09 2.77 ms) fue si-
de la respuesta sinptica provocada aument li- milar a la de los IPSCs (9.53 2.76 ms) no exis-
geramente (4.17 0.77 mV). Estos resultados su- tiendo entre ellos diferencias estadsticamente
gieren que la estimulacin elctrica del LDT-PPT significativas (Test de t, p=0.51). En ningn caso,
es capaz de provocar respuestas postsinpticas las respuestas postsinpticas a estmulos nicos
mixtas excitadora (presumiblemente glutamatr- del LDT-PPT se modificaron por la perfusin
gica) e inhibidora (GABArgica) en las neuronas de atropina (1 M) sugiriendo la ausencia de un
del PnO. componente postsinptico dependiente de la ac-
Para estudiar aisladamente la actividad sinp- tivacin de aferentes colinrgicas. La activacin
tica glutamatrgica o GABArgica provocada de este tipo de aferentes slo se logr median-
por estimulacin elctrica del LDT-PPT, estas te trenes de estmulos similares a los utilizados
respuestas se obtuvieron en presencia de picro- en el hipocampo de la rata in vitro(68). En efecto,
toxina (100 M) (Fig. 5C1), para el estudio de la como se muestra en el ejemplo de la Fig. 5D1,
sinapsis glutamatrgica o en presencia de cido la aplicacin de trenes breves de estmulos a alta
quinurnico (5mM) (Fig. 5C2) bloqueante de frecuencia (30 Hz, 500 ms) a nivel del LDT-PPT,
receptores ionotrpicos para Glu.- para el anlisis provoc un incremento de la excitabilidad neuro-
de los contactos GABArgicos. Las respuestas se nal compatible con un efecto muscarnico a nivel
registraron en condiciones de fijacin de voltaje postsinptico que se bloque parcialmente con la
(corrientes sinpticas) optimizando en cada caso perfusin de atropina 1 M (Fig. 5D2). Efectos
las condiciones de registro (potencial de man- similares de la estimulacin con trenes breves del
tenimiento y medio intracelular) para el estudio LDT-PPT sobre la excitabilidad de las neuronas
de uno u otro tipo de accin sinptica. Las co- del PnO se observ en 3 de las 5 neuronas en las
rrientes sinpticas excitadoras (EPSCs) aisladas que se ensay este protocolo (no efecto en las res-
farmacolgicamente se registraron utilizando un tantes). En estos casos, el nmero de espigas por
potencial de mantenimiento (Vh) de -60 o -70 pulso se increment en un 65.0 12.4% respec-
mV y medio intracelular basado en Gluconato de to del control (ausencia de tren) cuando fue pre-
potasio. La estimulacin del LDT-PPT provoc cedido por el tren de estmulos en el LDT-PPT,
corrientes sinpticas de entrada de una amplitud efecto consistente an cuando la diferencia en el
media ( SE) de 26.38 2.39 pA (n=11). Dicha nmero de espigas por pulso en ausencia vs en
respuesta fue bloqueada por la perfusin de ci- presencia de estmulo sinptico previo no alcanz
do quinurnico (5 mM) (Fig. 5C1). Por su par- significacin estadstica (K-S, p=0.16).
te, las corrientes sinpticas inhibidoras (IPSCs) Dado que la estimulacin elctrica con elec-
provocadas por la estimulacin del LDT-PPT se trodos convencionales aplicada en el tejido ner-
obtuvieron utilizando un Vh de -70 mV y medio vioso es capaz de activar tanto somas neuronales
propios del rea estimulada as como fibras de del LDT-PPT que contactan a las neuronas del
pasaje procedentes de otras estructuras, se anali- PnO. En estas condiciones, se asume que el efec-
zaron las respuestas provocadas en neuronas del to neto a nivel postsinptico (PnO) resultar de
PnO por la aplicacin local de agonistas glutama- la activacin de un grupo de neuronas presinp-
trgicos y colinrgicos en el LDT-PPT. An cuan- ticas (del LDT-PPT) que convergen sobre la neu-
do este mtodo no permite el estudio sistemtico rona en estudio. La estimulacin farmacolgica
de potenciales postsinpticos individuales en las (diseo experimental en Fig. 6A izq.) se ensay
neuronas del PnO -como ocurre con la estimula- en 14 neuronas realizando microinyecciones por
cin elctrica-, es posible analizar las respuestas presin (20 ms, 20 psi) de soluciones de CCh 1
postinpticas globales provocadas por la activa- mM (n=5) o Glu. 10 mM (n=9) en el LDT-PPT.
cin presumiblemente asincrnica de neuronas CCh, al tiempo que provoca la despolarizacin de
la mayora de los tipos neuronales del
LDT-PPT genera hiperpolarizacin
en las neuronas colinrgicas (69). Glu-
tamato, en cambio, se ha reportado
que promueve la activacin tanto de
las neuronas colinrgicas como no
colinrgicas del LDT-PPT (70). Para
estos experimentos, las neuronas del
PnO se registraron utilizando medio
intracelular en base de Gluconato a
los efectos de evaluar adecuadamen-
te las respuestas sinpticas excita-
Figura 6. Axones de neuronas del LDT-PPT alcanzan al PnO
doras e inhibidoras provocadas por
y establecen contactos funcionales con neuronas de este sector
de la FRP. A. Respuestas de neuronas del PnO a la estimula- la estimulacin farmacolgica del
cin farmacolgica de neuronas del LDT-PPT. Izquierda. Dise- LDT-PPT. Usualmente, las pipetas de
o experimental para el estudio de las respuestas de neuronas del inyeccin se colocaron por dentro del
PnO a la estimulacin farmacolgica de neuronas del LDT-PPT. polo medial del p.c.s. a una distancia
Se indica el sitio de registro as como el mtodo y sitio de inyec-
cin de agonistas glutamatrgicos y colinrgicos. Centro. Grfico superior a 1000 m del rea de re-
de frecuencia instantnea de la descarga espontnea de espigas en gistro en el PnO. En la mayora de
funcin del tiempo en una neurona del PnO, observada antes, du- los experimentos, para facilitar la de-
rante y despus de la aplicacin de un microvolmen de glutamato teccin de los efectos sinpticos pro-
(Glu, 10 mM, 100 ms, 20 psi, flecha) a nivel del LDT-PPT. Cada
punto representa la media ( SE.) de la frecuencia instantnea en vocados por la estimulacin farma-
un intervalo de un minuto. Derecha. En otra neurona, grfico de colgica del LDT-PPT, se modific
frecuencia instantnea de la descarga espontnea en funcin del el potencial de equilibrio del ion K+
tiempo, antes, durante y despus de la aplicacin de CCh (1 mM, ([K+]e = 9 mM), de forma de provo-
50 ms, 15 psi, flecha) en el LDT-PPT. Cada punto representa la
media ( SE.) de 5 eventos sucesivos. B. Activacin antidrmica
car la despolarizacin de las neuro-
de neuronas del LDT-PPT. Izquierda. Diseo experimental uti- nas del PnO con la consiguiente des-
lizado para el estudio de las respuestas de neuronas del LDT-PPT carga espontnea de PAs. Se busc
a la estimulacin elctrica del PnO. Derecha. Registros en con- que el bombardeo sinptico asincr-
diciones de fijacin de corriente de la primera (izq.) y la segunda
nico sobre estas neuronas provocado
(dcha.) respuestas provocadas por un par de estmulos del PnO (50
ms de intervalo, ver esquema del protocolo arriba a la izq.) y sus por la estimulacin farmacolgica
correspondientes trazados dVm/dt (abajo). del LDT-PPT, se expresara como la
modificacin del rgimen de descarga de PAs. En neuronas registradas present caractersticas

la Figura 6A se ilustran resultados representati- similares (Ih, presencia o ausencia de LTS en-
vos obtenidos por la aplicacin de Glu. (Fig. 6A tre otras) a las descritas por diversos grupos de
centro) y de CCh (Fig. 6A dcha.). Como se ilustra investigacin(69)(71)(72). En 2 neuronas de las 33
en la figura, ambos agonistas fueron capaces de registradas, a intensidades de estimulacin (tpi-
provocar incrementos transitorios en la frecuen- camente 3 A, 0.2 ms, 0.3 Hz) inferiores a las re-
cia de descarga de potenciales de accin en las queridas para la activacin ortodrmica de estas
neuronas del PnO. La respuesta a Glu. present neuronas (73), los estmulos provocaron potencia-
una latencia en el rango de 3-5 s en tanto que la les de accin cuya morfologa sugiere su natura-
respuesta a CCh present una latencia levemente leza antidrmica (Fig. 6B, dcha). La latencia de
superior (6 - 8 s). El incremento en la frecuencia la respuesta a la estimulacin del PnO fue de 7.87
de descarga de las neuronas del PnO ante la apli- 0.29 ms. Modificando levemente la intensidad
cacin de Glu. fue de 2-3 Hz. Por su parte, CCh del estmulo aplicado se constat el comporta-
gener una modificacin de hasta 15 Hz en la des- miento todo o nada de la espiga registrada as
carga de las neuronas del PnO. En estos casos la como la invariabilidad de la respuesta durante la
hiperpolarizacin de las neuronas registradas por aplicacin de estmulos supramximos repetidos
inyeccin de corriente (tpicamente -0.01 a -0.05 a frecuencias relativamente elevadas (50 Hz).
nA) capaz de detener la descarga espontnea de Ambos resultados, sugieren el carcter antidr-
potenciales de accin de las neuronas registradas, mico de la respuesta registrada. En este mismo
no permiti detectar claramente la existencia de sentido apunta la morfologa del potencial de
un bombardeo sinptico como posible causa del accin registrado. En efecto, la espiga se origina
incremento de la frecuencia de descarga observa- abruptamente desde el Vm de reposo exhibiendo
da en la situacin control. Resultados similares cambios abruptos de la trayectoria del Vm en la
pudieron ser detectados solamente en 5 de las 14 fase de ascenso y de repolarizacin que sugieren
inyecciones (2 de CCh y 3 de Glu.). En las restan- la presencia de varios componentes. Estos cam-
tes inyecciones no fue posible obtener respuestas bios se apreciaron ms claramente en el trazado
claras ni en el Vm ni en la frecuencia de descarga de dVm/dt en funcin del tiempo como se ilustra
de potenciales de accin en las neuronas del PnO. en el trazado inferior de la figura 6B (derecha).
En algunos experimentos se ensay el registro de En este trazado es posible distinguir tres com-
neuronas del LDT-PPT a los efectos de confirmar ponentes que podran representar la descarga de
su activacin por los agonistas inyectados; para diferentes compartimientos neuronales(74). El pri-
el caso del Glu., la aplicacin yuxtacelular de mi- mer componente podra corresponder a la espi-
crovolmenes de solucin (10 ms, 20 psi) provo- ga del segmento inicial del axn, el segundo -de
c despolarizaciones transitorias (tpicamente 1 a mayor amplitud- a la invasin del soma neuronal
1.7 s) supraumbrales capaces de inducir la des- y el tercero podra resultar de la invasin tarda
carga en rfaga de potenciales de accin (datos del rbol dendrtico. Estos componentes se hacen
no mostrados). ms evidentes si se utilizan pares de estmulos
Finalmente, se registraron neuronas del LDT- (protocolo en el inserto) a intervalos tales que
PPT (n=33) al tiempo que se estimul elctrica- los cambios de excitabilidad provocados por la
mente el PnO con estmulos nicos o pareados respuesta al primer estmulo afecten la propaga-
con el propsito de estimular el axn de las neu- cin de la respuesta al segundo, i.e.: la reduccin
ronas del LDT-PPT que proyectan a este ncleo de la excitabilidad provocada por la respuesta al
(Fig. 6B). El fenotipo electrofisiolgico de las primer estmulo (perodo refractario) dificult la
invasin del soma y las dendritas del potencial

de accin antidrmico provocado por el segundo
estmulo.
Manipulaciones farmacolgicas del PnO
promueven modificaciones de la excita-
bilidad de las neuronas del NM V
A los efectos de obtener evidencia adicional en
favor de la indemnidad anatmica y funcional de
la red mesopontina implicada en el control del
S-REM en nuestra rodaja de trabajo, nos propu-
simos analizar las modificaciones de la excitabi-
lidad de las motoneuronas del NM V provocadas
por la aplicacin local de agonistas colinrgicos
(4 rodajas, 6 inyecciones) y GABArgicos (3 ro-
dajas, 4 inyecciones) en el PnO, maniobras expe-
rimentales similares a las realizadas in vivo (ver
p.ej:(29)). Apoyados en un importante cmulo de
evidencias (recopiladas y revisadas p.ej. en:(6)(7) Figura 7. La aplicacin de CCh en el PnO reduce
(13)
) la aplicacin de colinomimticos en el PnO transitoriamente la excitabilidad de las neuronas
del NM V. A. Esquema del diseo experimental que
debera ser capaz de promover una reduccin de incluye el circuito hipottico que subyace a la mo-
la excitabilidad de las motoneuronas -equivalente dulacin de la excitabilidad de las motoneuronas del
de la supresin motora observada in vivo(75)(76)(77) NM V provocada por la manipulacin farmacolgi-
(78)
- en tanto que la aplicacin de agonistas GA- ca del PnO. La conexin del PnO con motoneuronas
del NM V no ha sido an caracterizada y se asume
BArgicos debera tener el efecto opuesto(30)(31)
indirecta (lnea punteada). B. Respuestas a pulsos
(79)
. Rutinariamente, las pipetas para la aplicacin despolarizantes (500 ms, 0.7 nA) de una motoneuro-
local de agonistas se colocaron cerca del centro na representativa obtenidos antes (izq.) 5 min. (cen-
del PnO a una distancia superior a las 600 m del tro, superposicin de dos trazados) y 15 min. des-
pus de la aplicacin de un microvolmen de CCh
lmite medial del NM V (disposicin similar a la
(30 psi, 100 ms) en el PnO. C. Curso temporal del
ilustrada en la Fig. 1B). nmero total de espigas por protocolo (20 pulsos de
Neuronas del NM V (centrales al ncleo) se se- corriente, ) y de la frecuencia media ( s.d., por
leccionaron bajo control visual y se registraron protocolo, ) antes y despus de la aplicacin de
CCh (en el 0 min.). D. Grfico de la resistencia de
utilizando la tcnica de patch (medio intracelu-
entrada neuronal (Ren, media para n=3) en funcin
lar basado en Gluconato de K+) en condiciones del tiempo (CCh se aplic en el 0 min.). E. Espigas
de fijacin de corriente (Figs. 7A y 8A). Luego antidrmicas provocadas por pares de estmulos se-
de la caracterizacin electrofisiolgica bsica parados por 5.3 ms. Para facilitar la comparacin, se
superponen trazados obtenidos a tres Vm diferentes:
de las neuronas registradas con la aplicacin de
a -68 mV (a), a -85 mV (b, inyeccin de corriente -1
protocolos especficos (ver Materiales y Mto- nA) y a -95 mV (c, -1.5 nA). F. Modificaciones de la
dos), la excitabilidad y/o la Ren se determina- segunda espiga antidrmica, provocadas por la apli-
ron a intervalos regulares, antes y despus de la cacin de CCh en el PnO. El agonista colinrgico
aplicacin de microvolmenes de CCh (agonista impide la invasin somato-dendrtica del potencial
de accin antidrmico. El efecto es mximo a los 8
colinrgico, 1 mM, Fig. 7) y de Muscimol (ago- min. (falla de la invasin en el 50% de los casos sin
nista GABArgico, 10 M, Fig. 8). En conjunto, cambios en el Vm) y ya no se observa a los 21 min.
previamente a la manipulacin farmacolgica del
PnO, las motoneuronas mostraron Vm relativa- mico de manera reversible (Fig. 7F), bloquendo-
mente hiperpolarizados (~ -69 mV) y Ren de se ambos componentes en un 55% de las respues-
26.3 8.5 Mohm (n=10). Pulsos despolarizantes tas (para el segundo potencial de accin del par)
prolongados (500 ms, ver Fig. 7B) de amplitud a los 8 min. luego de la inyeccin.
suficiente (tpicamente 0.7 a 1 nA) provocaron la Es razonable postular que CCh haya promovi-
descarga repetitiva de potenciales de accin sin do, directa o indirectamente, la activacin de neu-
clara adaptacin de frecuencia. ronas de la FRP integrantes de la red mesoponti-
De manera sistemtica (4 de 6 inyecciones), na de control del S-REM (REM-on) capaces de
la estimulacin colinrgica del PnO provoc la promover la reduccin de la excitabilidad de las
reduccin del nmero de espigas provocadas por neuronas del NM V, efecto equivalente de la su-
pulsos despolarizantes prolongados y de la fre- presin motora observada in vivo (recientemente
cuencia media de la descarga repetitiva (Fig. 7B - revisado en(13)(80)(81)). El efecto de los colinomim-
C). La reduccin de la excitabilidad se acompa ticos sobre neuronas del PnO se analiz en una
de la disminucin transitoria de la Ren (al 87% serie experimental utilizando indicadores de cal-
del control, n=3, Fig. 7 D) de las motoneuronas cio (ver material suplementario). La aplicacin
del NM V estimada a travs de la inyeccin de de microvolmenes de agonistas colinrgicos en
rampas de corriente (ver Materiales y Mtodos). el PnO (ver Fig. S2, material suplementario) pro-
En dos experimentos, se analiz adems el efecto voc incrementos transitorios de la concentracin
de la estimulacin colinrgica del PnO sobre la de calcio citoslico en una poblacin de neuronas
invasin somatodendrtica del potencial de ac- presumiblemente colinoceptivas. An cuando
cin antidrmico (Fig. 7E - F) provocado por la no se utilizaron tcnicas electrofisiolgicas para
estimulacin elctrica de la raz del V par (ver confirmar la descarga de potenciales de accin de
Fig. 7A para el diseo experimental). Se utiliz estas neuronas como consecuencia de la estimu-
un protocolo de estimulacin similar al ensayado lacin colinrgica, la seal de calcio observada
para la activacin antidrmica de las neuronas del sugiere su activacin a travs de receptores mus-
LDT-PPT (ver Fig. 6B) pero el intervalo de los carnicos usualmente implicados en los efectos
estmulos del par fue de 5.3 ms. Como se ilustra excitadores de los colinomimticos(82)(83) y cuya
en el ejemplo de la Fig. 7E, la hiperpolarizacin expresin en estas clulas ha sido demostrada(12)
somtica por inyeccin de corriente continua, (78)
. Recientemente, Weng et al., (2014)(26) sugie-
provoc el bloqueo de la generacin del compo- ren que la facilitacin presinptica, mediada por
nente somatodenrtico de la espiga (Fig. 7E, b) ACh, de las terminales glutamatrgicas que con-
desenmascarando el componente del segmento tactan las neuronas de la FRP podra contribuir a
inicial. Ulteriores incrementos de la corriente la activacin de estas neuronas en respuesta a la
inyectada bloquearon la generacin de este com- aplicacin de colinomimticos.
ponente (Fig. 7E, c) revelando un componente En lnea con lo observado in vivo, la aplicacin
de escasa amplitud posiblemente resultado de la de Muscimol en el PnO, tuvo el efecto opuesto
descarga de un potencial de accin en el primer al obtenido por aplicacin de CCh sobre la ex-
nodo de Ranvier(74). Acompaando la reduccin citabilidad de las motoneuronas del V par (Fig.
de la Ren provocada por la inyeccin de CCh en 8). En efecto, siguiendo el diseo experimental
el PnO, y probablemente como consecuencia de esquematizado en la Fig. 8A, se constat que la
ello, se redujo la excitabilidad de la motoneurona inhibicin de las neuronas del PnO por aplicacin
lo que impidi la invasin somatodendrtica y del local del agonista GABA-A provoc la despola-
segmento inicial del potencial de accin antidr- rizacin de las neuronas del NM V (~ 4 mV a los
7-9 min. de la inyeccin) y el incremento de su de estados comportamentales complejos. Sin em-

respuesta (nmero de espigas/pulso, incremento bargo entendemos que el abordaje reduccionista
del 131.4 37.2 %) ante la aplicacin de pulsos que ofrece este modelo in vitro, permitir acceder
despolarizantes prolongados (Fig. 8B). Estas mo- a los mecanismos neuronales y sinpticos que
dificaciones se acompaaron de un incremento operan en estructuras centrales para la organiza-
de la Ren (de hasta un 19.8 3.5 %, Fig. 8C), cin y regulacin de algunos componentes car-
efectos que en conjunto revirtieron -al menos par- dinales de estos estados comportamentales, par-
cialmente- a los 20 minutos de la inyeccin. Este ticularmente del S-REM, mecanismos neurales
incremento transitorio de la Ren pudo haber con- poco conocidos y an objeto de intensa investi-
tribuido al notable aumento de la excitabilidad
(adems del provocado por la despolarizacin)
de las neuronas del NM V.
Discusin
Los datos aportados en el presente trabajo su-
gieren que la rodaja de tronco enceflico de la
unin ponto mesenceflica de la rata constituye
un modelo experimental adecuado para avanzar
en la comprensin de los mecanismos celula-
res y sinpticos implicados en la generacin del
S-REM y el control de otros estados comporta-
mentales. En efecto mostramos que esta rodaja
contiene las estructuras consideradas clave para
la regulacin del S-REM(6)(13)(80) i.e.: el sector ros-
tral de la FRP, zona considerada ejecutiva para
los componentes cardinales del S-REM, y el
LDT-PPT, complejo neural implicado en el inicio
y, probablemente, en el mantenimiento de este es- Figura 8. La aplicacin de agonistas GABArgicos
tado comportamental, as como de la vigilia. Ms en el PnO desencadena un incremento transitorio
de la excitabilidad de las neuronas del NM V. A. El
an, nuestros datos indican que los contactos en-
diseo experimental utilizado es similar al de la serie
tre estas estructuras se encuentran conservados y experimental ilustrado en la Fig. 7 excepto en que no
son funcionales in vitro. El NM V ha sido espe- se utiliz el estmulo elctrico del axn de las moto-
cficamente incluido en la rodaja como referencia neuronas. B. Respuestas de una motoneurona a pulsos
despolarizantes (600 ms, 0.5 nA) aplicados cada 6 s.
topogrfica del nivel de corte. La presencia del
Se representan dos respuestas sucesivas obtenidas an-
polo rostral de este ncleo en la rodaja permiti tes (izq.), 7 min. (centro) y 15 minutos despus de la
indagar, asimismo, acerca del estado funcional de aplicacin de un microvolmen de Muscimol (10M)
la red mesopontina en su conjunto, a travs del por presin (20 psi, 100 ms) en el PnO. Note el incre-
mento de la respuesta neuronal acompaado de despo-
anlisis de los cambios de la excitabilidad de las
larizacin, observado a los 7 min. de la inyeccin. C.
motoneuronas trigeminales provocados por ma- Grfico del cambio de la resistencia de entrada (Ren,
nipulaciones farmacolgicas del PnO, similares a media s.d., N=3) en funcin del tiempo provocado
las realizadas in vivo (ver p.ej.(29)(30)(31)). por la aplicacin de Muscimol (en 0 min.). La evalua-
cin de la Ren se realiz manteniendo manualmente el
Somos conscientes de la imposibilidad de re-
Vm mediante la inyeccin de corriente.
producir in vitro la completitud fenomenolgica
gacin(13)(81). fundamento en evidencia farmacolgica, elec-

La rodaja mesopontina contiene las trofisiolgica y de anatoma funcional en el gato,
estructuras clave para el control del este sector de la reticulada ha sido denominado
S-REM como subcoeruleus (o SubC). Esta rea conten-
An cuando el atlas estereotxico utilizado dra subsectores asociados a la generacin de di-
como referencia (46) aplica a las caractersticas versos componentes del S-REM (peri-LCalfa,(10);
anatmicas de adultos jvenes (270-290 g de rea parabraquial,(84)). Segn otros, estos sectores
peso), la morfologa general de la rodaja obtenida estaran bajo el control de una regin ms rostral
de ratas de P7 a P14 como la utilizada en este es- y ventral de la formacin reticulada (reticularis
tudio (Fig. 1), guarda razonable correspondencia pontis oralis ventral, vRPO) que actuara como
con los cortes 53 a 55 (bregma -8.30 a -8.80 mm) un verdadero punto nodal en la organizacin del
de dicho atlas. Debido a la inclinacin con la que S-REM(14). En roedores, probablemente debido a
se obtuvo la rodaja, el sector ms ventral pare- dificultades metodolgicas derivadas de las redu-
ce contener las estructuras delineadas en el corte cidas dimensiones de las estructuras del tronco
mas caudal (bregma ~ -8.80 mm) en tanto que el enceflico, los datos no son tan claros. Aun cuan-
sector dorsal, colicular, se asemeja al ilustrado en do persiste controversia en cuanto a la localiza-
el corte ms ceflico (bregma ~ -8.30 mm). El cin precisa del sitio especfico implicado en el
perfil de la cavidad ventricular y las estructuras control de los diversos componentes del S-REM,
de la zona subventricular corresponderan a las existe acuerdo en el papel central de la formacin
ilustradas en el corte intermedio (bregma -8.72 reticulada pontina rostral(65). Evidencias farmaco-
mm). lgicas y electrofisiolgicas indican que las neu-
Como se mencionara, para este trabajo se adop- ronas (particularmente aquellas implicadas en la
t el polo rostral del ncleo motor del V par como atona muscular) parecen localizarse rostralmente
referencia topogrfica a los efectos de lograr cier- respecto del SubC, ventralmente al agrupamien-
ta homogeneidad y consistencia, experimento a to colinrgico del LDT-PPT. Esta regin ha sido
experimento, en relacin al sector de la reticula- denominada como rea sublaterodorsal (SLD)(22),
da del tronco seleccionada para nuestro estudio. y se le asigna un papel crtico en el control del
Este sector de la FRP correspondera al PnO en S-REM en roedores (ver ms adelante) como es-
su porcin ms caudal, rea respecto de la cual tructura cuya activacin es necesaria y suficiente
numerosos autores sostienen su papel como zona para la generacin de la atona caracterstica de
ejecutiva para varios componentes del S-REM(8) este estado comportamental. La utilizacin de
(14)(65)
y probablemente integrada al sector ms esta denominacin para el rea de la FRP consi-
ventral y medial del SLD (de Sublaterodorsal derada ejecutiva para los componentes cardinales
nucleus, (22)) sector de la FRP ubicado ventral- del S-REM se ha ido consolidando en la ltima
mente respecto del Locus Coeruleus (LC). La dcada aunque su localizacin precisa, caracte-
denominacin y localizacin precisa de este sec- rsticas y propiedades funcionales son an objeto
tor de la formacin reticulada, considerada como de debate y de intensa investigacin (13).
ejecutiva para los componentes comportamen- Los registros intracelulares de las neuronas
tales esenciales del S-REM vara segn el atlas del PnO presentaron, de manera caracterstica,
estereotxico utilizado, la especie en la que se dos fenotipos electrofisiolgicos signados por la
hayan obtenido las evidencias experimentales y presencia o ausencia de espiga de bajo umbral
es an objeto de debate entre los diversos grupos (LTS) lo que permiti categorizarlas como LTS
de investigacin (ver para revisin(6)(13)(45)). Con y No-LTS (ver Fig. 2 y 3). Ambos tipos neuro-
nales presentaron respuestas del Vm a diversos beloso superior (ver imagen bregma -8.72 mm)
protocolos de corriente compatibles con la pre- muy probablemente correspondan a neuronas
sencia de Ih e IA. Neuronas del PnO con similares del LDT-PPT. Ms an, la deteccin de neuronas
fenotipos electrofisiolgicos han sido descritas ChAT+ en este sector (Fig. 4) es considerado un
por otros autores (ver p.ej.:(34)(37)(38)) as como en elemento confirmatorio (ver p.ej.,(85)(86)). Final-
otros sectores de la formacin reticulada (55). Des- mente, la breve caracterizacin electrofisiolgica
afortunadamente, probablemente por problemas realizada en el curso de los experimentos dedica-
inherentes a la tcnica de marcaje intracelular dos al anlisis de la activacin antidrmica de las
con electrodos de patch, no pudimos establecer neuronas del LDT-PPT por estimulacin elctrica
una correspondencia entre la citomorfologa de del PnO as como en los experimentos de estimu-
las neuronas registradas en el presente estudio y lacin farmacolgica de estas neuronas (ver Fig.
las descritas por otros autores (ver p.ej. (37)). An 6) permiti constatar que las neuronas registradas
cuando estos autores categorizaron las neuro- exhibieron fenotipos electrofisiolgicos (datos no
nas registradas en tipo I y tipo II de acuerdo a mostrados) similares a los reportados en estudios
la ausencia (tipo I) o presencia de rectificacin electrofisiolgicos previos (ver p.ej. (69)).
mediada por Ih ( tipo II), la proporcin de neu- La presencia de neuronas colinrgicas y no-co-
ronas LTS y No-LTS reportada por estos autores linrgicas del LDT-PPT marcadas retrgrada-
(14% y 86% de LTS y No-LTS) difiere de la en- mente por la aplicacin de neurobiotina en el
contrada en nuestro estudio (47.7% y 52.3%, res- PnO (Fig. 4) sugiere la existencia de terminales
pectivamente). Esta divergencia probablemente de neuronas del tegmento mesopontino a nivel
obedezca al hecho de que en el estudio de Nez del sitio de inyeccin. La activacin antidrmica
et al. (1997) (37) el registro intracelular se obtuvo de las neuronas del LDT-PPT por estimulacin
mediante electrodos afilados convencionales lo del PnO (Fig. 6) apunta en este mismo sentido.
cual pudo haber sesgado el muestreo hacia las Datos adicionales en favor de la existencia de una
neuronas que mostraron dimetros somticos re- conexin funcional entre neuronas del tegmento
lativamente mayores (neuronas carentes de LTS) mesopontino y neuronas del PnO en la rodaja de
y limitado el control del Vm en la clula registra- la unin ponto-mesenceflica provienen de los
da. Un factor adicional que podra dar cuenta de experimentos de activacin farmacolgica del
esta divergencia es que nuestro estudio se ha li- LDT-PPT (Fig. 6), as como de los experimentos
mitado a analizar el fenotipo electrofisiolgico de de estimulacin elctrica de este complejo (Fig.
las neuronas del PnO en las que la estimulacin 5). La aplicacin de microvolmenes de ago-
elctrica a nivel del LDT-PPT provoca respuestas nistas glutamatrgicos y colinrgicos a nivel del
sinpticas muy probablemente por activacin de LDT-PPT provoc incrementos en la frecuencia
neuronas que proyectan directamente sobre estas de descarga de potenciales de accin en neuronas
neuronas (respuestas monosinpticas). del PnO. A diferencia de la estimulacin elctrica
La presencia del LDT-PPT en la rodaja de la convencional (ver ms adelante) que puede reclu-
unin ponto-mesenceflica se apoya en eviden- tar tanto somas neuronales como fibras de pasaje,
cias topogrficas (Fig. 1), inmunohistoqumi- este tipo de estmulo sera capaz de activar secto-
cas (Fig. 4) y electrofisiolgicas. En efecto, de res somato-dendrticos de neuronas que expresan
acuerdo con la rodaja seleccionada para nuestro receptores funcionales para los agonistas utiliza-
estudio y segn el atlas de Paxinos y Watson dos. En este sentido, en tanto la inyeccin de Glu.
(1998)(46), las neuronas del tegmento mesoponti- pudo haber activado los diversos tipos celulares
no prximas al polo medial del pednculo cere- presentes en el LDT-PPT (colinrgicas, gluta-
matrgicas y GABArgicas,(49)(70)(86)), CCh pudo tegmentales. La inervacin colinrgica de las

haber provocado la activacin de neuronas gluta- neuronas de la FRP generadoras de S-REM pro-
matrgicas y GABArgicas y la inhibicin de las cedente del LDT-PPT ha sido bien caracterizada
neuronas colinrgicas (69). Ambos agonistas son (ver para revisin:(13)(87)), sin embargo no fue po-
capaces de activar receptores tanto ionotrpicos sible detectar un componente colinrgico en las
como metabotrpicos. Un aspecto llamativo de respuestas postsinpticas provocadas por estmu-
estas respuestas refiere a su prolongada latencia los nicos. Probablemente la liberacin de ACh
(~ 3-8 s), que contrasta con la de las respuestas por parte de estas aferentes requiera de patrones
sinpticas provocadas por estmulo elctrico (~ de estimulacin como los utilizados en el hipo-
10 ms). La forma de evaluar las respuestas de campo de la rata in vitro(68) lo cual apunta a que
las neuronas del PnO (frecuencia de descarga de la inervacin colinrgica (conjuntamente con la
PAs) probablemente impida determinar especfi- monoaminrgica) ejerce un efecto esencialmente
camente la latencia de las respuestas sinpticas modulador como ha sido propuesto recientemen-
provocadas por el estmulo farmacolgico. En te(13)(81). En este sentido es destacable que neu-
efecto, el cambio de la frecuencia de descarga ronas colinrgicas del LDT-PPT categorizadas
de potenciales de accin, se estima que refleja como REM-on registradas in vivo (49) descargan
el efecto neto sobre la excitabilidad de la clula repetitivamente a frecuencias relativamente ele-
postsinptica de mltiples entradas asincrnicas vadas (~ 15-20 Hz) antes y durante los episodios
de diversa naturaleza (excitadoras e inhibidoras), de S-REM. De manera caracterstica el estmulo
de escasa amplitud (ver luego) que convergen nico del LDT-PPT provoc respuestas mixtas
sobre la neurona registrada. Un incremento de la glutamatrgicas y GABArgicas (Fig. 5B-C).
frecuencia de descarga de las neuronas del PnO, An cuando las aferencias glutamatrgicas y par-
como el observado en nuestros experimentos, se- ticularmente GABArgicas a las neuronas de la
ra el resultado de un efecto excitador neto sobre FRP generadoras de S-REM hayan sido reciente-
estas neuronas. Con menor latencia y precedien- mente destacadas como determinantes en el con-
do a este efecto excitador neto, la estimulacin trol de este estado(13)(22)(26)(30)(31)(88), el LDT-PPT no
farmacolgica del LDT-PPT pudo haber provo- ha sido especficamente considerado como origen
cado la coactivacin de neuronas glutamatrgicas de este tipo de inervacin (a excepcin de la men-
y GABArgicas (menos duradera) sin efecto neto cin realizada de los contactos GABArgicos en
detectable en las neuronas del PnO. El curso tem- los estudios de Semba y Fibigier, 1992 (64) y de
poral de las respuestas de las neuronas del LDT- Boissard et al., 2003 (88)). Sin perjuicio de ello, en
PPT a la aplicacin de agonistas (> 1s, ver Re- este trabajo presentamos evidencias morfolgi-
sultados) y la cintica de la difusin del agonista cas (Fig. 4) y electrofisiolgicas (Figs. 5 y 6) que
aplicado provocando el reclutamiento progresivo sustentan la existencia de contactos sinpticos
de neuronas a este nivel (43) pudo haber contribui- directos entre neuronas no colinrgicas del LDT-
do adems al establecimiento del peculiar curso PPT y neuronas del PnO. Las respuestas glutama-
temporal de las respuestas analizadas. trgicas y GABArgicas provocadas por estimu-
La estimulacin elctrica del LDT-PPT con lacin del LDT-PPT, se obtuvieron aisladamente
trenes de estmulos (Fig. 5D) provoc respuestas por perfusin del antagonista correspondiente
postsinpticas en las neuronas del PnO compati- (Fig. 5). La estabilidad de la latencia de las res-
bles con la activacin de receptores muscarnicos puestas en diversas condiciones de estimulacin
en estas clulas sugiriendo la indemnidad de la (47)
conjuntamente con la obtencin de IPSCs
entrada colinrgica originada en estos ncleos aislados farmacolgicamente por bloqueo de la
transmisin glutamatrgica, sugieren que la iner- de los colinomimticos en las sinapsis glutama-
vacin no colinrgica del PnO originada en el trgicas y GABArgicas en el SNC en general
LDT-PPT ipsilateral, involucra contactos sinp- (90) y en el PnO en particular(25)(26) de acuerdo al
ticos directos sobre neuronas del PnO. En virtud tipo de contacto analizado, acotar el estudio de
de la sensibilidad de las respuestas provocadas a esta eventual modulacin a un grupo funcional y
los bloqueantes utilizados y coherentemente con anatmicamente homogneo de entradas sinpti-
hallazgos previos en la FRP de la rata(25)(26), los cas, como el activado por el estmulo elctrico en
EPSCs involucran la activacin de receptores nuestra rodaja, puede construir un requisito im-
ionotrpicos de glutamato (NMDA y AMPA) en portante para avanzar en la comprensin de los
tanto que los IPSCs, receptores de tipo GABAA. mecanismos responsables del S-REM que operan
Tomando en cuenta la latencia de las respuestas en la red mesopontina.
postsinpticas en las neuronas del PnO provoca- Mecanismos colinrgico y GABArgico
das por el estmulo elctrico del LDT-PPT (~ 9.8 del PnO controlan la excitabilidad de las
ms) y la distancia (lineal) medida desde el sitio motoneuronas trigeminales en la rodaja
de estmulo hasta la zona de registro en el PnO (~ mesopontina
1.5 mm), estimando un retardo sinptico ~ 1 ms, Como ya se mencionara, la estimulacin coli-
la velocidad de conduccin de los axones de las nrgica de sitios especficos de la FRP es capaz
neuronas activadas por el estmulo sera cercana de inducir un estado indistinguible del S-REM
a los 0.17 m/s. Llamativamente, la velocidad de fisiolgico incluyendo la atona propia de este
conduccin de los axones de neuronas del LDT- estado comportamental(75)76)(77)(78). Por su parte la
PPT por estmulo en el PnO (activacin antidr- aplicacin de agonistas GABArgicos al mismo
mica) estimada sera similar ~ 0.19 m/s (latencia nivel, suprime el S-REM fisiolgico promovien-
~ 7.9 ms y similar distancia). Esto sugiere, en do la irrupcin de vigilia y es capaz de eliminar
lnea con observaciones realizadas por otros au- la atona muscular provocada por la aplicacin de
tores en hipocampo (ver p.ej.: (89)), que las neuro- colinomimticos(30)(31)(79).
nas del LDT-PPT que proyectan al PnO presentan Slida evidencia indica que las neuronas gluta-
axones amielnicos relativamente finos. matrgicas de la FRP promotoras de la supresin
En la actualidad se acepta que el circuito meso- motora caracterstica del S-REM, controlaran la
pontino de control del S-REM incluye los compo- descarga de neuronas premotoras glicinrgicas
nentes colinrgico -dependiente mayormente de y probablemente GABArgicas, localizadas en
la activacin de neuronas colinrgicas del LDT- la formacin reticulada bulbar (ventromedial)
PPT- y monoaminrgico -noradrenrgico proce- prximas a la oliva inferior(67)(91)(92). La estimula-
dente del Locus Coeruleus y serotoninrgicas del cin colinrgica de las neuronas de las reas de
ncleo del rafe dorsal- que inervan el sector ros- la FRP ejecutivas para el S-REM, provocaran la
tral de la FRP y asumen un papel esencialmente activacin de estas neuronas bulbares inhibiendo
modulador (revisado en:(6)(7)(22)). Recientemente, las motoneuronas espinales con la consiguiente
adems de la activacin de grupos neuronales atona caracterstica de este estado comporta-
especficos, la modulacin especfica dependien- mental(13)(22)(93)(94). An cuando se discute si este
te del estado comportamental -colinrgica o mo- constituye el nico mecanismo responsable de la
noaminrgica- de los contactos sinpticos de la inhibicin durante el S-REM de algunas motoneu-
red mesopontina ha comenzado a formar parte de ronas craneales (en las respiratorias se sumara la
los mecanismos implicados en la regulacin del inhibicin directa mediada por ACh) nuestros re-
S-REM(25)(26). En virtud de la variedad de efectos sultados sugieren que un mecanismo similar po-
dra estar operando en la rodaja mesopontina. La ronas trigeminales, ya madura en los especme-
estimulacin colinrgica de las neuronas del PnO, nes utilizados (P7 a P14, (99)), podra explicar, al
se estima similar a la ilustrada en la Fig. 2S, pro- menos en parte, la reduccin de la excitabilidad
voc reducciones de la Ren de las motoneuronas observada sin que esta se acompae de hiperpo-
trigeminales como base de la reduccin de la res- larizacin. El registro de las motoneuronas del
puesta neuronal a la aplicacin de pulsos despo- NM V durante la reduccin de la excitabilidad
larizantes y el bloqueo de la invasin antidrmica provocada por la aplicacin de CCh en el PnO
de potenciales de accin (Fig. 7). A diferencia de en condiciones de fijacin de voltaje a potencia-
los cambios observados en motoneuronas durante les de comando alejados del potencial de Veq.
la atona provocada por la aplicacin de CCh en del cloro, podra aportar evidencia relevante en
la FRP en gatos(76)(77), no fuimos capaces de detec- relacin a la participacin del bombardeo glici-
tar cambios significativos del Vm. Al margen de nrgico/ GABArgico (y su peso relativo) en el
eventuales diferencias interespecficas, o debidas mecanismo de la inhibicin de las motoneuronas
al tipo de motoneurona registrada (craneal vs es- craneales durante el S-REM.
pinal), valores relativamente hiperpolarizados del La aplicacin local de Muscimol, agonis-
Vm (-69 mV) y cercanos al Veq. del cloro (-75.3 ta GABArgico (GABAA), en el PnO provoc
mV, calculado segn la relacin de las concentra- sistemticamente un aumento transitorio de la
ciones intra y extracelulares), pueden razonable- excitabilidad de las motoneuronas trigeminales
mente explicar la escasa magnitud de los efectos acompaado de un incremento de la Ren (Fig. 8),
observados. En este sentido, pudieron haber con- efectos opuestos a los provocados por la aplica-
tribuido adems una poblacin reducida de neu- cin de CCh. Resultados similares han sido obte-
ronas de la FRP (las contenidas en la rodaja) y nidos in vivo(29)(30)(31)(100) en los que la aplicacin
volmenes relativamente pequeos (< 30 pl) de de Muscimol en la FRP fue capaz de suprimir el
CCh inyectados a ese nivel. Sin perjuicio de lo S-REM (fisiolgico o el provocado por CCh), in-
anterior, la reduccin de la excitabilidad de las duciendo un estado de vigilia y un incremento de
motoneuronas acompaada de la disminucin de la actividad motora. An cuando los mecanismos
la Ren y bloqueo de la invasin antidrmica del implicados no han sido especficamente explora-
compartimiento somatodendrtico (similares a los dos, se ha postulado que los cambios de la exci-
observados por Chase y Morales, 1983(95)), fue- tabilidad de las motoneuronas provocado por la
ron hallazgos sistemticos. Cabe consignar que aplicacin de agonistas GABArgicos en la FRP
el mecanismo responsable de la reduccin de la resultaran de la inhibicin de las neuronas impli-
excitabilidad de las motoneuronas caracterstica cadas en la generacin de S-REM y de la supre-
del S-REM, continua siendo objeto de debate. El sin motora propia de este estado comportamen-
bombardeo sinptico glicinrgico-GABArgico, tal. Como consecuencia de ello, el incremento de
capaz de reducir sustancialmente la Ren, conjun- la excitabilidad de las motoneuronas observado,
tamente con la remocin del efecto excitador de podra obedecer a una reduccin del bombardeo
la aferencia monoaminrgica procedente de los glicinrgico-GABArgico, y a la activacin de la
ncleos del tronco enceflico, inhibidos durante aferencia monoaminrgica(13)(97).
los episodios de S-REM (neuronas REM-off del An cuando un efecto directo de CCh y
Locus Coeruleus y del ncleo del rafe dorsal,(13)(96) Muscimol sobre las neuronas el NM V no puede
(97)(98)
), han sido propuestos como los mecanismos ser definitivamente descartado, es poco probable
esenciales. El eventual aporte de la disminucin que se haya producido la difusin pasiva de am-
de la aferencia monoaminrgica a las motoneu- bos agonistas desde el sitio de inyeccin debido a
los bajos volmenes aplicados (<30 pl), las bajas su apoyo experto en el desarrollo de las tcnicas
concentraciones de agonistas utilizadas y la dis- de inmunohistoqumica. Parte de la investigacin
tancia del sitio de inyeccin a las motoneuronas recibi apoyo financiero de FCE2009_3115-
registradas (43). Ms an, los cambios provocados ANII, CSIC-UdelaR y PEDECIBA.
por Muscimol son opuestos a los efectos espe-
rados por accin directa del agonista sobre las Contribucin de los autores
motoneuronas: inhibicin y reduccin de la Ren. J.Y. and M.B., concepcin y diseo de la inves-
tigacin. H.K. realiz la mayora de los experi-
Conclusiones mentos y E.P. contribuy con la caracterizacin
En virtud de las caractersticas anatmicas y electrofisiolgica de las neuronas y la elabora-
funcionales de la rodaja mesopontina caracteri- cin de las figuras correspondientes. E.P., H.K.
zada en el presente trabajo, esta preparacin re- y M.B. analizaron los datos e interpretaron los
ducida del tronco enceflico de la rata emerge resultados experimentales; E.P. y M.B. prepara-
como un modelo experimental in vitro de elec- ron las figuras y escribieron el trabajo; E.P., H.K.,
cin para el estudio de los mecanismos celulares J.Y. y M.B. editaron y revisaron el manuscrito y
y sinpticos que operan en los circuitos centrales todos los autores aprobaron su versin final.
de control del S-REM y de otros estados com-
portamentales. La utilizacin de este modelo ex- Material suplementario.
perimental permitir avanzar en el conocimiento Procedimientos experimentales
de los mecanismos que operan a niveles interme- suplementarios
dios de integracin para la organizacin de esta- Cuantificacin de Ih
dos comportamentales, entre ellos, la interaccin En condiciones de fijacin de voltaje, se bus-
entre las inervaciones GABArgica y colinrgica c cuantificar la expresin funcional de esta co-
del PnO, postulada como crtica en el control del rriente a travs del clculo del ndice Ih-50-100.
ciclo sueo-vigilia (ver para revisin(6)(7)(13)(81)). El protocolo utilizado consisti en un escaln de
En este sentido es de particular inters determi- voltaje de 800 ms de duracin desde un poten-
nar la existencia de fenmenos plsticos de los cial de mantenimiento (Vh) de -50 mV hasta un
contactos sinpticos sobre las neuronas del PnO potencial de -100 mV. Las respuestas registradas
(particularmente GABArgicos), dependientes se promediaron y se midi la magnitud del salto
de la inervacin colinrgica y monaminrgica instantneo de corriente al inicio del escaln de
voltaje (a, Fig. 1S-A) y la magnitud de la corrien-
que convergen en el rea ejecutiva del S-REM (65),
te en el estado estacionario alcanzada durante el
que podran ser categorizados como fenmenos
escaln (b). El ndice Ih-50-100 se calcul como:
plsticos dependientes del estado comportamen-
(b-a)/a, cociente que permiti obtener la magni-
tal. Esta preparacin in vitro ofrece asimismo una
tud de la corriente provocada durante el escaln
oportunidad de privilegio para profundizar en los
(con caractersticas cinticas de Ih) normalizada
mecanismos implicados en el control de la exci-
al valor de a, parmetro relacionado de manera
tabilidad de las motoneuronas craneales por parte
directa con la conductancia de entrada y por tan-
de la FRP, posiblemente implicados en la supre-
to, con el tamao de la neurona.
sin motora caracterstica del S-REM.
Imagen de Calcio
Estos experimentos se desarrollaron junto al
Agradecimientos
Prof. David Fernndez de Sevilla, en el Laborato-
Agradecemos a Sharon Sampogna de UCLA
rio de Neurofisiologa del Instituto Cajal de Ma-
School of Medicine, Los Angeles, CA, USA por
drid, en el marco de una colaboracin con el Prof.
Washington Buo. Se realizaron mediciones de

calcio en tres rodajas por microscopa de fluores-
cencia con el indicador de Calcio Green Oregon
BAPTA-1 (OGB AM-1 AM, Invitrogen, Eugene,
OR). Las clulas se iluminaron durante 40 ms
cada 200 ms a 490 nm con un monocromador po-
lcromo (IV; till Photonics, Planegg, Alemania),
y se obtuvieron imgenes sucesivas en 5 s-1 con
una cmara CCD monocroma refrigerada (Cohu
4920; San Diego, CA) conectada al microscopio
Olympus que estaba equipado con un filtro cube
(Tecnologa de croma, Rockingham, VT) opti-
mizado para la OGB AM-1 AM. El control de la
cmara y la emisin fluorescente on-line fueron
Figura 1S. A. Esquema del procedimiento empleado
para cuantificar la Ih (ndice Ih -50-100) en condiciones de realizados con el software ImagingWorkbench
fijacin de voltaje, modificado de [101]. Arriba. Proto- (INDEC-BioSystems, Santa Clara, CA) y off line
colo utilizado que consiste en un escaln de voltaje de mediante el uso del software image J (NIH). Los
800 ms de duracin que modifica el potencial de man- cambios en las seales de fluorescencia se expre-
tenimiento (Vh) desde -50 mV hasta -100 mV. Abajo,
esquema de la corriente transmembrana generada por saron como la proporcin (porcentaje) del cam-
el comando de voltaje (no se incluye la corriente ca- bio relativo en la fluorescencia (F/F0), donde
pacitiva). Se indican los tres parmetros referidos en F0 es el nivel de fluorescencia antes del estimulo
el texto para el clculo del ndice Ih -50-100. a indica cuando la clula est en reposo y F es el cambio
el salto instantneo de corriente, b la corriente en
de la fluorescencia durante la actividad. La seal
el estado estacionario alcanzada durante el escaln de
voltaje y c corresponde a la magnitud de la Ih. El * de calcio se analiz off line (image J, NIH) defi-
indica la corriente de cola. B. Ejemplo de respuesta niendo regiones de inters (clulas especficas en
(trazado inferior), obtenida en una neurona No-LTS el campo analizado) y se cuantific el F/F0 en
del PnO mediante un protocolo similar (ilustrado en
las clulas seleccionadas previamente y luego de
el trazado superior). El comando de voltaje incluye un
pulso breve de -10 mV (al inicio del barrido) utilizado la aplicacin local de un microvolumen (5 a 15
rutinariamente para monitorizar la resistencia en serie. pl) de ACh 1 mM. En todos los casos la seal de
C. Diagrama de caja del ndice Ih -50-100 calculado para Calcio se calcul como la diferencia entre la seal
ambas poblaciones de neuronas LTS y No-LTS. El l- de calcio medida en cada una de las regiones de
mite inferior de la caja indica el percentil 25 y el supe-
rior el percentil 75; la lnea dentro de la caja indica la
inters y la seal medida en una regin de igual
mediana. Las barras de error por encima y por debajo superficie que las anteriores pero ubicada en el
del cuadro alcanzan los percentiles 90 y 10, respecti- tejido, en las cercanas de las neuronas seleccio-
vamente. D. Superposicin de respuestas a un pulso nadas (ver BckG en la fig. 2S). No se efectuaron
hiperpolarizante de 100 pA, obtenidas antes (control)
correcciones para el blanqueo del indicador du-
y durante la perfusin de CsCl 3 mM, bloqueante de
la corriente Ih. El bloqueante elimina la rectificacin rante los experimentos. La tasa de decaimiento
anmala mediada por esta corriente provocando un de OGB-1 AM es suficientemente rpida para
incremento del cambio de Vm en respuesta al mismo detectar las modificaciones de calcio citoslico
pulso de corriente. En estas condiciones, a la salida cuya concentracin decrece con una constante de
de la hiperpolarizacin, se observa una LTS precedida
por una trayectoria del Vm (flecha) que sugiere la par-
tiempo cercana a los 80 ms, muy por debajo de
ticipacin de una corriente de tipo IA. las estimadas en nuestros experimentos. Por lo
tanto, las diferencias en las tasas de decaimien-
to de las seales de calcio observadas entre las
clulas (Fig. 2S) reflejan diferencias en el curso ms) y la rodaja se incub en solucin de perfusin
temporal real del calcio citoslico en las mismas. para luego ser transferida a la cmara de registro.
Para cargar las clulas con indicador un total de
0.8mM OregonGreen 488 BAPTA-1 AM (OGB- Referencias
1 AM) se disolvi en DMSO conteniendo un 20% 1. Kandel ER. Cellular basis of behavior: an
de cido plurnico. Una pipeta de patch (dime- introduction to behavioral neurobiology. San
tro de 1-2 m) se carg con esta solucin y se Francisco: Freeman; 1976.
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neuronas del PnO. A1. Fotografa panormica (20x, 7. Fraigne JJ, Torontali ZA, Snow MB, Pee-
fluorescencia) del rea central del PnO (lnea media a ver JH. REM sleep at its corecircuits, neu-
la izquierda y NM V a la derecha) en la que se aplic la
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se detecta seal de calcio en varias clulas del PnO Neurol. 2015;6:123.
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se evalu la seal de calcio antes y despus de la apli-
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200 m de la neurona 2 (N#2) hacia la lnea media gantocellular tegmental field neurons res-
en el plano focal en el que se realiz el anlisis. Ca- ponsible for paradoxical sleep? Brain Res.
libracin 100 m. B. Grfico de la seal de calcio en
funcin del tiempo evaluada en 5 neuronas (N#1, 2, 3,
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AnFaMed - ISSN: 2301-1254

Modelo in vitro para el estudio del papel de la

Esteban Pino1, Hctor Kunizawa1, Jack Yamuy2, Michel Borde1*

1. Laboratorio de Neurofisiologa Celular y Sinptica. Dpto. de Fisiologa, Facultad de Medicina. Universidad de la

Introduccin movements, S-REM) emerge como un modelo

a registrar. mersin en agua). Una cmara digital (319CU

muestra la localizacin aproximada de esta neu-

duracin adecuadas (tpicamente -0.1 a -0.5 nA y

algunos casos, de forma complementaria, se apli-

modificacin del rgimen de descarga de PAs. En neuronas registradas present caractersticas

invasin del soma y las dendritas del potencial

7-9 min. de la inyeccin) y el incremento de su de estados comportamentales complejos. Sin em-

gacin(13)(81). fundamento en evidencia farmacolgica, elec-

matrgicas y GABArgicas,(49)(70)(86)), CCh pudo tegmentales. La inervacin colinrgica de las

Washington Buo. Se realizaron mediciones de

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