Anda di halaman 1dari 34

Sintesis dan karakterisasi molekul polimer cetak untuk penentuan

spiramisin dalam susu domba


Latar Belakang:

Spiramisin (SPI) adalah kelompok obat antibiotik mikrolid yang berfungsi

mengatasi berbagai macam infeksi atau antibiotik makrolida yang dihasilkan

oleh Streptomyces ambofaciens yang bekerja dengan cara menghambat sintesa

protein bakteri. Spiramisin efektif terhadap kuman stafilokokus, streptokokus,

pneumokokus dan Bordetella pertusis. Aplikasi spiramisin dibatasi hanya

praktek pada hewan. Fungsi dari spiramisi itu sendiri adalah sebagai untuk

memodulasi usus flora mikroba, sehingga meningkatkan kinerja tingkat

pertumbuhan di betis, sapi, babi dan unggas. Konsumsi makanan seperi telur,

susu dan daging dari hewan yang diberi spiramisin, pada dosis sub-terapeutik

dapat meninggalkan residu pada jaringan. Keberadaan residu antibiotik pada

bahan makanan dapat menyebabkan berbagai penyakit atau gangguan. Selain

itu, dapat menyebabkan masalah dalam industri susu, karena untuk mengubah

atau menghambat proses fermentasi dilakukan dalam produk susu seperti keju

dan yoghurt. Oleh karena itu, untuk melindungi kesehatan konsumen dan untuk

memastikan kualitas tinggi dari susu yang dihasilkan, sehingga ditetapkan batas

maksimum residu(MRL), batas untuk spiramisin dalam susu adalah 200mgkg-1.

Untuk menjamin keamanan susu, metode analisis yang handal perlu

dikembangkan yang mampu mengukur residu dari makrolid pada tingkat ini.

Makrolida dalam susu telah umum dianalisis dengan bioassay (Nagel et al,

2013), namun tes ini menggunakan mikroorganisme tidak cukup sensitif untuk

mendeteksi banyak antibiotik digunakan untuk mengobati ternak; misalnya,


spiramisin, dan lincomycin (Linage et al., 2007). Saat ini, teknik analisis seperti

kromatografi cair digabungkan ke dioda-array (LC / DAD) (Dubois et al., 2001),

ultra-kinerja cair kromatografi / quadrupole waktu-of-spektrometri massa

penerbangan (UPLC-QTOF-MS) (Romero et al., 2011), kromatografi cair /

tandem mass spectrometry (LC-MS / MS) (Juan, & surai, 2010) atau

kromatografi cair dengan deteksi fluoresensi (LC / UV) (Gomis et al., 2004)

telah digunakan untuk penentuan spiramisin dalam sampel susu.

Di sisi lain, susu adalah sampel air yang mengandung protein dan lemak,

komponen yang dapat menghalangi perkembangan analisis. Karena

kompleksitas dari susu, metode persiapan sampel sebelumnya sangat sering

diperlukan. Beberapa metode yang dikembangkan mengenai persiapan sampel

untuk penentuan SPI dalam sampel susu menggunakan kombinasi ekstraksi cair-

cair (LLE) dan ekstraksi fase padat (SPE) sebagai ekstraksi dan pemurnian

teknik, masing-masing (Turnipseed et al., 2008) dan matriks -assisted dispersi

fase padat (MSPD) (Garca et al., 2012) telah diterbitkan.

SPE memiliki biaya-rendah dan mudah otomatis untuk pretreat sampel

makanan dan dapat digabungkan untuk kedua cair dan gas kromatografi.

Kelemahan utama dari teknik persiapan sampel ini adalah kurangnya selektivitas

dari sorben. Ini digantikan lebih dan lebih oleh agen penyerap polimer-polimer

dicantumkan molekul (MIPS). Berbeda dengan sorbents SPE klasik, MIPS

menunjukkan afinitas tinggi dan selektivitas terhadap senyawa target atau kelas

senyawa yang terkait secara struktural. Bahan-bahan ini telah diperagakan

mengikat untuk melacak tingkat analit sasaran, dan menampilkan selektivitas


tinggi di hadapan senyawa lain yang memiliki sifat fisik-kimia yang mirip, serta

sangat stabil (Cameron et al., 2006).


Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mencapai sintesis dari MIP SPI khusus untuk

penentuan SPI dalam sampel susu domba. Untuk itu, serangkaian polimer dicetak

molekuler yang disintesis oleh polimerisasi curah noncovalent menggunakan kondisi

sintesis yang berbeda. MIPS diperoleh kemudian dievaluasi dengan mengikat penelitian

untuk menyaring MIP yang tepat untuk aplikasi sebagai fase padat ekstraksi sorben.

Dalam rangka untuk menunjukkan bersih-bersih dan kemampuan prakonsentrasi dari

MIP yang dipilih, analisis SPI dalam sampel susu domba dengan HPLC-dengan foto

dioda array detektor diterapkan. The reaktivitas silang bagi orang lain antibiotik

macrolide diuji.

Metode
2.1. Bahan kimia

Spiramisin (SPI), tylosin hemitartrate (TYL), eritromisin (ERY), josamycin

(JOS) dan ivermectin (IVER) dibeli oleh Sigma Aldrich (Madrid, Spanyol).

Etilena glikol dimetakrilat (EGDMA) dan asam metakrilat (MAA) diperoleh

dari Merck (Darmstadt, Jerman), 2-2'-azobisisobutironitril (AIBN) dari Fluka

(Buchs, Swiss). Sodium monobasa fosfat, natrium hidroksida dan n-heksana

(kemurnian> 99%) diperoleh dari Merck (Darmstadt, Jerman). Semua reagen

yang digunakan adalah dari kelas analitis. Air ultra-murni diperoleh dari Milli Q

sistem air (Millipore Ibrica, Madrid, Spanyol).

Standar saham solusi (500 mg L -1 ) dari semua senyawa disusun oleh


melarutkan jumlah yang cukup zat dalam metanol HPLC-grade dari Scharlab

(Barcelona, Spanyol) dan disimpan pada 4 C. Solusi standar masing-masing

antibiotik macrolide (50 mg L -1 ) yang dibuat dengan mengencerkan larutan stok

dengan asetonitril (ACN) dari HPLC-grade dari Scharlab dan juga disimpan di

4 C. Bekerja solusi standar di memadai konsentrasi yang setiap hari disiapkan

oleh sesuai pengenceran dari yang solusi disebutkan dengan campuran cairan

NaH 2 PO 4 25 mM pada pH 7 / asetonitril (70:30).

2.2. Aparatus dan bahan

Sebuah Digiterm 3000542 dikendalikan termostat waterbath (Selecta,

Barcelona, Spanyol) digunakan untuk memberikan suhu polimerisasi konstan.

Lampu ultraviolet (Vilber Lourmat CN-6T) dipekerjakan untuk

photopolymerization UV-dimulai. pembacaan pH dibuat dengan Metrohm 654

pH meter. Tercetak dan polimer non-tercetak adalah tanah dalam mortar kaca

(Aldrich, Madrid, Spanyol) dan kemudian melewati CISA standar saringan

(200-355 m) (afora, Madrid, Spanyol). Ekstraksi Template dilakukan dengan

menggunakan sistem extractor Soxhlet dengan bidal ekstraksi selulosa. SPE

dilakukan menggunakan 20-Pelabuhan Vacuum SPE berjenis System (Supelco,

Spanyol) dengan vacuum control-tekan pompa (Selecta, Spanyol). Kosong SPE

cartridge (Supelco, Spanyol) dari 3 mL kapasitas dengan Frit polyethylene (20

m) digunakan untuk mengemas padat fase.


2.3. kromatografi analisis

HPLC analisis dilakukan menggunakan Agilent Technologies Model

kromatografi 1200 series dilengkapi dengan Agilent 1290 pompa kuaterner, auto

sampler, dan foto-dioda detektor array (Agilent Technolies, Jerman).

Pengambilan data dilakukan dengan LC-DAD Chemstation Software (teknologi

Agilent) .suatu kolom analitis adalah Prontosil Hypersorb ODS (5,0 m, 250

4,6 mm) dari Scharlab Perusahaan (Barcelona, Spanyol). Kolom termostat diatur

pada 60C. Fase gerak adalah campuran asetonitril-fosfat penyangga.

Analisis kromatografi dilakukan menyusul metode sebelumnya

dikembangkan untuk kelompok penelitian kami (Garca et al., 2006). Gradien

elusi yang digunakan adalah fosfat larutan buffer (25 mM, pH 7) sebagai

komponen A (dibuat dengan melarutkan 5 g NaH 2 PO 4 dalam 500 mL air Milli-

Q, dan natrium hidroksida digunakan untuk mengatur pH pada 7 ) dan asetonitril

sebagai komponen B. gradien dimulai dengan 50% selama 3 menit pada 1 mL

min -1 dan kemudian meningkat menjadi 58% dalam waktu 4 menit. Komposisi

ini stabil selama 8 menit pada 1,2 mL min -1 , kemudian meningkat menjadi 70%

dari eluen B dalam 1 menit. Dengan waktu equilibrium berikut 20 menit pada

1,5 mL min -1 , sehingga total run adalah 30 menit. Volume injeksi adalah 20 uL.

Panjang gelombang deteksi yang 231 nm (SPI, JOS), 210 nm (ERY), 254 nm

(IVER) dan pada 287 nm (TYL). Kuantifikasi dilakukan dengan menggunakan

pengukuran daerah puncak dan eksternal kalibrasi.


2.4. Persiapan SPI-tercetak polimer

Untuk mempersiapkan para SPI-MIPS, yang Template molekul

(2 10 -2 mmol) dan monomer MAA fungsional (2 mmol) dilarutkan dalam

asetonitril media polimerisasi (7 mL) ke dalam tabung gelas 25-mL. Campuran

disonikasi pada suhu kamar selama 5 menit. Selanjutnya, cross-linker EGDMA

(10 mmol) dan inisiator radikal AIBN (5,1 mmol) yang ditambahkan,

berikut sonikasi untuk 10 menit. Larutan gasnya dengan aliran nitrogen

bebas oksigen selama 7 menit, dan kemudian tabung kaca dengan campuran

ditempatkan dalam waterbath termostat dikendalikan pada 65 C selama 4 jam

(MIP1), atau di bawah UV cahaya di 365 nm di 5C untuk 6 h

(MIP2) untuk dilakukan keluar pada proses polimerisasi. Polimer massal

yang dihasilkan dihancurkan dalam mortar kaca dan basah-disaring oleh

metanol untuk mendapatkan partikel dengan ukuran antara 200 dan 355

m. Akhirnya, template dan senyawa non-terpolimerisasi diekstraksi dalam

alat Soxhlet dengan metanol (80 ml) selama 20 jam, sampai tidak ada SPI dapat

dideteksi dengan HPLC-DAD. Polimer dicetak non (NIP) sebagai polimer

kontrol juga disiapkan dan diperlakukan dengan menggunakan prosedur yang

sama tanpa menambahkan SPI.

2.5. Karakterisasi morfologi dari SPI-tercetak polimer


Karakterisasi tekstur polimer dibuat menggunakan Micromeritics

secepatnya 2.010 peralatan (Norcross, USA). AN 2 adsorpsi / desorpsi

eksperimen dengan porosimetri nitrogen digunakan untuk penentuan area

spesifik (S), volume spesifik pori (Vp) dan diameter pori rata-rata (Dp) dari

polimer. 1g polimer kering gasnya di 70 C di bawah aliran nitrogen selama 4

jam sebelum pengukuran untuk menghapus gas diserap dan kelembaban.

Nitrogen Data adsorpsi / desorpsi kemudian direkam pada suhu cair-nitrogen

dari -196 C. Luas permukaan spesifik dihitung dari data nitrogen adsorpsi

menggunakan Brunauer-Emmett-teller (BET) persamaan (Bruneauer et al.,

1983). Luas permukaan eksternal (Doa Siang) dan volume mikropori (V1)

dihitung dengan metode t-plot (Horvath, & Kawazoe, 1983), dan distribusi

ukuran pori dan volume pori total MIP (Vp) dengan Teori Fungsional dari

Densitas Model (DFT) (Oliver, 1995).

2.6. Batch mengikat analisis

Untuk memilih polimer disintesis optimal, studi pendahuluan dari

kemampuan rebinding dari MIPS dan NIP dievaluasi oleh angkatan percobaan

mengikat. Untuk studi ini, 43 mg setiap SPI-MIP atau NIP ditambahkan ke 4 mL


-1
SPI solusi pada 100 mg L di ACN, dan campuran diinkubasi selama malam

pada suhu kamar. Campuran yang dihasilkan disentrifugasi pada 1200 rpm

selama 5 menit. Supernatan yang mengandung non

mengikat SPI dianalisis dengan HPLC-DAD di 231 nm. Konsentrasi SPI dalam

larutan ditentukan dengan mengacu pada kurva kalibrasi sebelumnya diplot.


Jumlah terikat SPI dihitung dari selisih antara konsentrasi menambahkan

awalnya dan isi SPI dari supernatan. Kemampuan mengikat MIPS ditentukan

dengan koefisien partisi k = Cp / Cs (Cai, & Gupta, 2004), dan itu


dihitung sebagai rasio antara jumlah SPI mengikat MIP (Cp) dan konsentrasi

SPI dalam larutan (Cs). Faktor pencetakan (), mewakili tingkat pencetakan

dicapai, dihitung sebagai rasio MIP-terikat SPI untuk NIP- terikat SPI.

Untuk mengevaluasi sifat serap dari polimer optimum dipilih, isoterm

adsorpsi dilakukan. 20 mg MIP atau NIP dicampur dengan 2,5 ml SPI solusi

dalam ACN pada konsentrasi mulai dari 0 sampai 50 mg L -1 dan diinkubasi pada

20 C selama 24 jam. Campuran yang dihasilkan disentrifugasi pada 1200 rpm

selama 7 menit dan aliquot dari supernatan digunakan untuk menganalisis

jumlah SPI tidak terikat polimer.

Dari perbedaan konsentrasi larutan SPI sebelum dan sesudah inkubasi, jumlah

SPI terikat oleh polimer dievaluasi. Semua solusi menjadi sasaran untuk HPLC-

DAD analisis.

2.7. MISPE kondisi

Jumlah yang tepat dari partikel polimer kering MIPS atau NIP (200 mg)

yang dikemas ke dalam cartridge SPE dari 3 mL dengan dua Frit polyethylene

(panjang 65 mm dan id 10 mm) antara partikel polimer. Kolom siap dikondisikan

dengan 6 mL MeOH (3 2 mL) dan 6 mL ACN (3 2 mL) untuk


menghilangkan kontaminan mungkin. Kemudian, 1 mL dari larutan SPI di

ACN di konsentrasi yang memadai

telah dimuat pada kolom SPE dengan laju alir 0,2 mL min -1 . The non-spesifik

terikat analit dicuci dalam tahap pencucian tunggal dengan menggunakan 6

mL (3 2 mL) ACN. Analit itu diserap dengan 3 2 mL MeOH: asetat

acid (0,5%, v / v) larutan. Fraksi yang diperoleh diuapkan sampai kering di

bawah aliran lembut nitrogen pada 40 C dan dilarutkan kembali dalam 1

mL dari campuran NaH 2 PO 4 25 mM (pH 7) / asetonitril (70:30).

Kuantifikasi SPI dari sampel dilarutkan yang diperoleh dilakukan oleh HPLC

menggunakan metode yang dijelaskan di atas. Akhirnya, polimer diregenerasi

dengan melewati 3 2 ml MeOH dan 3 2 mL ACN untuk pengujian

berikutnya.

2.8. Sampel susu persiapan

Sampel susu domba dikumpulkan dari domba yang berbeda di panggung yang

sama laktasi oleh CERSYRA, Pusat Regional Seleksi Hewan dan Reproduksi di

Valdepeas (Ciudad Real, Spanyol). Sampel disimpan pada -20 C sampai

digunakan. Untuk memvalidasi MISPE-HPLC metode yang dikembangkan

sampel susu domba dibubuhi dengan SPI. Prosedur yang monomer fungsional
dan rasio molekul yang tepat dari reagen polimerisasi dapat menghasilkan

kinerja ekstraksi yang lebih baik, karena ini akan menentukan stabilitas

kompleks yang terbentuk sebelum dan selama proses polimerisasi dan

kemampuan berikutnya dari MIP untuk berinteraksi secara selektif dengan

molekul target (Beltran et al., 2010). Dalam karya ini, MIPS yang disintesis

menggunakan MAA sebagai monomer fungsional karena gugus karboksil dari

fungsi asam dapat membentuk ikatan hidrogen dengan hidroksil dan ikatan ion

dengan kelompok dasar template. SPI memiliki tiga gugus hidroksil, gugus

amina, dan amina tersier pada salah satu unit gula, yang dapat membentuk ikatan

hidrogen dan ikatan ion dengan fungsionalitas yang sesuai, masing-masing.

Selama proses polimerisasi, cross-linker memenuhi beberapa fungsi

utama: dipekerjakan untuk memberikan stabilitas mekanik untuk matriks

polimer, mengontrol morfologi polimer dan menstabilkan situs pengakuan

molekul. EDGMA dipilih dalam pekerjaan ini karena itu adalah yang paling

banyak digunakan cross-linker. Kelebihan monomer fungsional dibandingkan

template itu sangat diperlukan, karena meningkatkan stabilitas kompleks pra-

polimerisasi dengan menggeser keseimbangan asosiasi-disosiasi terhadap

pembentukan kompleks. Kemudian, rasio molar template / monomer / cross-

linker tetap ke 1: 100: 500.

Dalam sintesis MIPS, porogen memainkan peran penting dalam

pembentukan struktur berpori polimer. Selain itu, pemilihan porogen adalah

salah satu faktor penentu dalam pengakuan molekul efektif template karena

keakuratan perakitan antara template dan monomer yang terkait dengan


karakteristik fisik dan kimia pelarut. Dengan demikian, asetonitril terpilih

sebagai pelarut porogen karena media organik ini memastikan kelarutan yang

baik dari template dan berkontribusi terhadap pembentukan interaksi polar

seperti ikatan hidrogen dan elektrostatika interaksi antara Template dan

fungsional monomer.digunakan untuk pretreatment sampel susu berduri yang

rinci di bawah ini. Sampel susu diizinkan untuk mencair pada suhu kamar dan

dihomogenisasi dengan pemanasan (30 C selama 5 menit). Sebuah volume 1

mL susu homogen itu dibubuhi dengan jumlah yang diinginkan dari SPI menjadi

berbentuk kerucut labu 10 mL dan dicampur dengan gemetar manual. Untuk

memungkinkan equilibrium analit dengan matriks susu, sampel berduri

dipertahankan pada suhu kamar selama 20 menit. Susu berduri itu dipretreatment

menggunakan 4 ml NaH 2 PO 4 : ACN (3: 2, pH 7) dan 1 mL ACN secara

bersamaan untuk mengendapkan protein. Selanjutnya, larutan campuran

disentrifugasi (1200 rpm selama 15 menit) dan solusi supernatan yang diperoleh

disaring dengan filter lipat. Akhirnya, 1 mL sampel susu deproteinized

dilewatkan melalui kolom MISPE, dan kemudian dicuci dan dielusi mengikuti

prosedur ekstraksi yang dijelaskan di atas. Akhirnya, fraksi elusi dikumpulkan

untuk HPLC berikutnya analisis.

Hasil dan Pembahasan

3.1. Sintesis dari SPI-MIPS

polimer MIP1 dan MIP2 yang tercetak yang disintesis sesuai dengan

strategi massal polimerisasi karena kesederhanaan, dan karena bentuk non-


reguler dari partikel yang diperoleh tidak batasan nyata untuk off-line aplikasi

SPE. Kedua MIPS yang disintesis menggunakan komposisi yang sama dengan

dua prosedur polimerisasi yang berbeda: termal iniated polimerisasi dalam

waterbath termostatik dikendalikan pada 60 C selama 4 jam (MIP1) dan

photopolymerisation UV-dimulai pada 235 nm selama 6 jam (MIP2). Monolit

polimer massal kemudian hancur, tanah dan basah-diayak menggunakan

metanol untuk mendapatkan partikel terutama dalam berbagai ukuran 200-355

m. template telah dihapus oleh ekstraksi Soxtlet dengan 80 mL metanol selama

20 jam. polimer-tercetak non (NIP), berada di kedua kasus disiapkan dengan

cara yang sama tetapi tanpa SPI, sebagai polimer kontrol.

3.2. MIP's karakterisasi

Pengakuan efisiensi MIPS. Pengakuan molekul MIPS tergantung dua faktor terutama,

konfigurasi spasial tiga dimensi template molekul dan tingkat pencocokan dari situs

ikatan. Dalam penelitian ini, dua MIPS yang disintesis pada rasio yang sama dari

template untuk monomer dan menggunakan ACN sebagai porogen, tapi kondisi

polimerisasi yang berbeda diuji yang dapat mempengaruhi hasil pencetakan dan

pengakuan kekhususan.

Untuk menentukan kapasitas pengakuan MIPS, khusus mengikat, koefisien

partisi dan pencetakan faktor dipelajari dan dihitung dengan bets mengikat tes

dalam rangkap tiga (Tabel 1). Spesifik mengikat adalah mengacu pada jumlah

SPI terikat pada MIPS dan NIP dihitung sebagai persentase dari rebinding ke

MIP dikurangi persentase untuk NIP tersebut. Spesifik mengikat bagi MIP1
(53,1%) lebih tinggi daripada untuk MIP2 (37,7%). Jumlah rendah analit terikat

oleh NIP dalam kedua kasus ( 25%) menunjukkan bahwa kehadiran template

selama proses pencetakan menanamkan pengakuan kapasitas. The partisi

Dua polimer dicetak molekuler untuk SPI (MIP1 dan MIP2) disiapkan

sesuai dengan non-kovalen massal polimerisasi metode. Rasional pilihan

dari para

nilai koefisien lebih tinggi untuk MIPS daripada NIP dan nilai tertinggi

dicapai ketika MIP 1 diuji. Perbedaan antara MIPS dan NIP menunjukkan

bahwa prosedur pencetakan telah menciptakan rongga sangat spesifik

dirancang untuk SPI antibiotik di MIP. Faktor pencetakan () lebih tinggi

untuk MIP1 daripada MIP2, menunjukkan tingkat utama pencetakan di MIP1.

Menurut hasil yang diperoleh, MIP1 terpilih sebagai sorben optimum untuk

diterapkan dalam prosedur ekstraksi fase padat untuk SPI penentuan. Hasil yang

diperoleh menunjukkan bahwa kondisi polimerisasi adalah faktor kunci untuk

karakteristik pengakuan MIP.

Penelitian isoterm adsorpsi. Kapasitas adsorpsi merupakan faktor penting yang

mencerminkan efisiensi dan afinitas polimer terhadap analit. Equilibrium

mengikat percobaan dilakukan untuk mendapatkan isoterm polimer adsorpsi dan

untuk menyelidiki perilaku adsorpsi MIP1 dan NIP1. Adsorpsi Model isoterm

bi persamaan Langmuir digunakan agar sesuai dengan data. Model isoterm

Langmuir menjelaskan monolayer adsorpsi berdasarkan pada asumsi bahwa

semua situs adsorpsi memiliki sama afinitas Template dan bahwa adsorpsi pada
satu situs tidak mempengaruhi adsorpsi pada situs yang berdekatan. Isoterm

adsorpsi menunjukkan di Fig.1A menggambarkan adsorpsi kejenuhan MIP1 dan

NIP1 terikat dengan konsentrasi yang berbeda dari solusi SPI. Adsorpsi dari

MIP1 tidak linier terhadap peningkatan konsentrasi SPI awal. Pada setiap

konsentrasi SPI diuji, MIP1 bisa mengikat lebih SPI dari NIP1, dan jumlah

mengikat meningkat dengan meningkatnya konsentrasi SPI awal, akhirnya

mencapai stabil dataran tinggi.

Untuk memperkirakan parameter mengikat MIP1, data yang mengikat pada

Gambar. 1A diplot sesuai dengan Persamaan berikut. (1) (Feldman, 1972; Norby

et al, 1980.):

di mana B adalah jumlah SPI terikat MIP pada kesetimbangan, F adalah

konsentrasi SPI gratis, B MAX1 dan B MAX2 adalah nomor maksimum yang lebih

tinggi dan lebih rendah untuk afinitas situs mengikat, dan K d1 dan K d2 dua

konstanta kesetimbangan disosiasi terkait dengan afinitas situs adsorpsi.

Data karakteristik mengikat MIP digunakan untuk analisis Scatchard

oleh Persamaan. (2):

mana Kd dan B adalah konstanta kesetimbangan disosiasi dan jumlah

maksimum jelas situs mengikat, masing-masing. F adalah konsentrasi bebas dari

SPI dalam larutan mengikat. The Scatchard Plot diperoleh dengan metode ini

disajikan dalam Fig.1B dan memungkinkan untuk memperkirakan sifat


mengikat dari MIP1. Seperti yang ditunjukkan, Scatchard tidak linear dan terdiri

dari dua garis lurus, yang menunjukkan bahwa situs pengikatan MIP1 untuk SPI

yang heterogen dan agak dua jenis situs mengikat ada dalam polimer. Rupanya,

sangat selektivitas situs mengikat untuk SPI dapat dijelaskan sebagai hasil dari

kelompok karboksil dari fungsi asam dari monomer yang kooperatif terikat

dengan hidroksil dan amina kelompok SPI. Dalam sistem kami, koefisien

persamaan. (1) dihitung: untuk situs pengikatan afinitas tinggi, K d1 = 0,08706

mg L -1 dan B MAX1 = 1,27 mg g -1 ; dan untuk situs afinitas pengikatan rendah,

K d2 = 0,08705 mg L -1 dan B MAX2 = 3.56 mg g -1 . Disarankan bahwa dual-situs

Langmuir model mengikat mungkin menggambarkan rebinding SPI pada

molekuler polimer dicetak permukaan.

Karakterisasi morfologi dari polimer SPI-tercetak. Dalam rangka untuk

mengkarakterisasi struktur dan sifat berpori MIP1 analisis BET dilakukan.

Karakterisasi tekstur dari SPI-MIP dicapai oleh adsorpsi gas nitrogen pada -196

C. Permukaan spesifik daerah (BET) adalah 296 m 2 g -1 . Total volume

pori-pori adalah ditemukan 0.429 cm 3 g -1 ; yang volume mikropori dari

0,043 cm 3 g -1 , dan volume mesopori dari 0.306 cm 3 g -1 . Ukuran pori rata-

rata (DFT) dari MIP1 adalah 5,8 nm.

3.3. Optimasi MISPE prosedur

Setelah evaluasi kapasitas pengikatan MIPS disintesis, penerapan MIP1

sebagai sorben padat dalam prosedur SPE (MISPE) dipelajari. MISPE


berdasarkan prosedur ekstraksi fase padat konvensional, oleh karena itu, khas

pemuatan, cuci dan elusi langkah yang dilakukan sebagai rutinitas. Dalam

penelitian ini, serangkaian percobaan dilakukan untuk mengoptimalkan kondisi

percobaan yang mempengaruhi SPI pengakuan oleh MIP1 dalam prosedur

MISPE termasuk komposisi dan jumlah cuci dan eluting pelarut. Jumlah 200 mg

MIP1 cukup untuk digunakan sebagai sorben untuk mengembangkan MISPE

off-line untuk SPI karena afinitas tinggi polimer ini. Pertama, kolom MISPE siap

dikondisikan dengan 6 mL MeOH (3 2 mL) dan 6 mL ACN (3 2 mL). Untuk

mencapai ekstraksi selektif, langkah bersih-bersih dengan pelarut yang cocok

digunakan sebelum elusi analit dari kolom. Pelarut cuci ini adalah salah satu

faktor penting dalam prosedur MISPE untuk memaksimalkan interaksi tertentu

antara analit dan situs mengikat, dan sekaligus menghancurkan interaksi non-

spesifik untuk membuang komponen matriks dari cartridge. Dalam studi ini,

berbeda solusi cuci seperti H 2 O, ACN dan H 2 O / ACN campuran pada proporsi

yang berbeda (50-95% ACN) diselidiki. Volume sampai dengan 6 mL dinilai.

Seperti disajikan pada Gambar. 2, ketika solusi cuci H 2 O lebih dari 70% dari

SPI dimuat pulih dalam fraksi dikumpulkan dari tahap pencucian. Namun,

jumlah analit cuci dari cartridge itu kurang dari 10% saat ACN digunakan. Oleh

karena itu, 6 mL ACN terpilih sebagai optimum cuci pelarut.

Elusi pelarut memainkan peran penting dalam prosedur MISPE sejak

analit target yang harus efisien diserap dari cartridge. Biasanya, untuk pemulihan

analit sangat dibatasi, sejumlah kecil (1-10%) dari pengubah, seperti air atau

asam lemah ditambahkan untuk membantu pemecahan ikatan hidrogen.


Pengaruh pelarut elusi dan volume pada efisiensi ekstraksi SPI diuji untuk

berbagai jenis pelarut termasuk NaH 2 PO 4 : ACN (70:30, v / v) pada pH 7,

MeOH dan MeOH mengandung asam asetat pada persentase yang berbeda (0,25

, 0,5 dan 1%). Studi tersebut dikembangkan dengan

-1
1 mL dari SPI larutan standar pada 50 mg L di ACN. Hasil penelitian menunjukkan
bahwa kehadiran

asam asetat dalam elusi pelarut tersedia pemulihan yang lebih tinggi sehubungan

dengan penggunaan 100% MeOH (Gambar 3). Penggunaan MeOH: asam asetat

(99,5: 0,5, v / v) yang terbaik efisiensi elusi (95%). Pemulihan tidak membaik

ketika MeOH: asam asetat (99: 1, v / v) digunakan. Karena SPI stabil pada pH

antara 4-5, persentase asam asetat lebih tinggi dari 1% tidak diuji. Volume yang

berbeda dari elusi pelarut berkisar 4-7 mL diuji untuk mengoptimalkan volume

elusi. Volume yang lebih tinggi dari 6 mL MeOH: asam asetat (99: 1, v / v)

hampir tidak punya manfaat apapun untuk pemulihan dari SPI. Akibatnya, SPI

telah kuantitatif dielusi dari yang sorben dengan 6 mL (3 2) dari

MeOH yang mengandung 0,5% asam asetat. Polaritas elusi pelarut ini cukup

mengganggu interaksi ionik dan hidrogen obligasi didirikan antara

analit dan polimer.

3.4. Aplikasi dalam susu real sampel


Untuk mengevaluasi kinerja metode MISPE-HPLC yang diusulkan

untuk sampel membersihkan dan penentuan SPI, sampel susu domba nyata

dianalisis di bawah kondisi yang optimal. sampel susu rumit matriks, lebih dari

100.000 spesies molekul yang berbeda telah diidentifikasi di dalamnya.

Meskipun susu mengandung sekitar 90%

air, dapat digambarkan sebagai minyak dalam air emulsi dengan gelembung-

gelembung lemak terdispersi dalam fasa serum terus menerus, atau sebagai

suspensi koloid dari misel kasein, atau sebagai solusi dari laktosa, protein larut,

mineral, vitamin dan komponen lainnya (Samanidou, & Karageorgou, 2011).

Selain itu, komposisi susu dapat dipengaruhi oleh banyak faktor, variasi

misalnya berkembang biak, kawanan-to-kawanan variasi terutama dikaitkan

dengan memberi makan pertimbangan, musiman dan aspek geografis. Karena

kompleksitas, pretreatment dari matriks susu biasanya diperlukan sebelum

analisis. Dalam karya ini, sebelumnya prosedur MISPE, sampel pra-perawatan

sesuai dengan prosedur yang disebutkan di Bagian

2,8 untuk menghilangkan protein. Jika tidak, kotoran, seperti protein atau lemak

jenuh akan memblokir cartridge dan menurunkan pemulihan. Setelah langkah

protein curah hujan, sampel susu dianalisis dengan prosedur MISPE dijelaskan

di atas. Kemudian, 1 mL sampel susu deproteinized telah dimuat cartridge SPE

sebelumnya pendingin pada tingkat 0,2 mL min -1 .

The penghapusan dari lemak konten di susu, yang bisa menghasilkan


gangguan dalam
penentuan SPI, juga diperlukan. Akun trigliserida sekitar 98% dari lemak susu.

Kelas-kelas lain dari lipid termasuk fosfolipid ( 1%), yang terutama

berhubungan dengan membran globul lemak, dan kolesterol ( 5%), yang

sebagian besar berada di inti globul lemak. Berdasarkan karya sebelumnya

(Garcia et al., 2012), langkah lemak menghapus dioptimalkan. Untuk studi ini,

dua pelarut (n-heksana dan NaOH pada konsentrasi yang berbeda antara 0-2 M)

dengan melewati volume 6 mL melalui kolom SPE setelah sampel memuat diuji.

Penerimaan dari SPI yang lebih tinggi dari 90% diperoleh ketika heksana n

digunakan. Namun, ketika NaOH 0,5 M diuji pada semua konsentrasi yang diuji,

penghapusan lengkap lemak tidak diizinkan. Volume yang berbeda dari n-

heksana diuji dan hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa penggunaan lebih

dari 6 mL tidak meningkatkan cukup SPI pemulihan. Oleh karena itu, 6

mL (6 1 mL) dari n-heksana yang terpilih sebagai

kondisi pelarut optimum untuk tujuan ini. Sungguh luar biasa bahwa

penggunaan n-heksana cukup untuk mencuci kandungan lemak dan gangguan

dalam sampel susu pada langkah yang sama, menghindari mencuci langkah

dengan ACN. Hal ini menyebabkan waktu yang signifikan tabungan dan

menyederhanakan prosedur. Dalam semua kasus, elusi dilakukan dengan 3 2

mL MeOH mengandung 0,5% asam asetat. Fraksi dikumpulkan dibawa ke

kekeringan dan dibentuk kembali dalam volume 1 mL di NaH 2 PO 4 25 mM /

ACN (70:30) campuran pada pH 7. Akhirnya, SPI terdeteksi oleh HPLC-DAD.


3.5. validasi metode

Metode yang dikembangkan divalidasi untuk linearitas, pemulihan,

akurasi, presisi (antar dan intra-assay), dan batas deteksi bawah kondisi optimum

untuk matriks susu domba. Kurva kalibrasi diperoleh dengan kuadrat-analisis

regresi linear dari daerah puncak dengan konsentrasi SPI, menyiapkan sampel

susu melonjak dalam rangkap tiga di kisaran konsentrasi 24-965 mg kg -1 . Baik

linearitas (R 2 = 0,9998) didirikan

seluruh rentang konsentrasi belajar untuk SPI. Batas kuantifikasi (LOQ),

diperkirakan sebagai konsentrasi terendah dengan RSD di bawah 5%, 24,1 mg


-1
kg . Akurasi dinilai dengan menghitung recovery yang diperoleh untuk SPI

dalam prosedur MISPE dari 1 mL sampel susu berduri pada tiga tingkatan

konsentrasi: tingkat rendah (48,3 mg kg -1 ), tingkat menengah (482,6 mg kg -1 )

dan tingkat tinggi (965,2 mg kg -1 ). Residu dianalisis dengan HPLC-DAD dalam

rangkap tiga. Hasil yang diperoleh ditunjukkan pada Tabel 2. Penerimaan yang

lebih tinggi dari 90% dengan RSDs lebih rendah dari 5%. Pengulangan metode

MISPE dinilai dengan injeksi larutan SPI (tiga kali dalam satu hari) di dua
-1
konsentrasi yang berbeda (241,3 dan 965,2 mg kg ). Presisi diuji dalam hal

reproduksi dan pengulangan pada dua tingkat konsentrasi (241,3 mg kg -1 , 965,2

mg kg - 1 ). The reproduktifitas (sehari-hari variabilitas) antara tiga yang

berbeda hari itu


diperiksa dan pemulihan berkisar 97,9-99,4% dengan RSDs kurang dari 2%

diperoleh. Reproduktifitas (variabilitas sehari-hari) nilai berkisar 86,4-88,3%

dengan RSD lebih rendah dari 9% (Tabel 2).

3.6. selektivitas

Setelah prosedur MISPE untuk SPI dioptimalkan, studi reaktivitas silang

dilakukan untuk mengevaluasi selektivitas MIP digunakan sebagai ekstraksi

sorbent fase padat. MIPS tidak intrinsik selektif. Selektivitas mereka hasil dari

kombinasi prosedur polimerisasi yang menimbulkan rongga khusus untuk target

analit bersama-sama dengan asosiasi prosedur ekstraksi yang melibatkan pelarut

mampu mengembangkan interaksi yang seharusnya hanya dilakukan ke dalam

rongga. Untuk studi ini, antibiotik makrolida lainnya seperti JOS, IVER, ERY

dan TYL dipilih sebagai kompetitif molekul karena dari mereka mirip struktur.

Untuk mengevaluasi yang efek dari

hidup bersama zat pada pemulihan SPI oleh MIP, solusi campuran makrolida

pada spiramisin: rasio interferent 2,5: 25 mg L -1 (tingkat rendah), 05:50 mgL -1


- 1
(tingkat menengah) dan 10: 100 mg L (tingkat tinggi) diuji. Ara. 4

menunjukkan kromatogram yang diperoleh pada panjang gelombang yang

berbeda untuk ekstraksi makrolida oleh prosedur MISPE. Pemulihan untuk

antibiotik macrolide diteliti dihitung sebagai perbedaan antara jumlah total

masing-masing beban senyawa ke dalam cartridge dan fraksi dikumpulkan dari


langkah elusi. Tabel 3 merangkum hasil yang diperoleh. Pemulihan untuk SPI

lebih tinggi dari 90%, sedangkan pemulihan untuk sisa antibiotik yang diuji

adalah kurang dari 30%. Hasil penelitian menunjukkan selektivitas secara

signifikan lebih tinggi dari MIP1 untuk SPI dibandingkan dengan macrolide

lain yang terkait secara struktural antibiotik.

Kesimpulan

Metode ekstraksi dikembangkan disediakan pemulihan dan nilai-nilai RSD memuaskan, dan LOD rendah
dari tingkat yang ditetapkan oleh undang-undang saat. Sebuah langkah cuci unik yang diperlukan dalam
prosedur MISPE untuk menghapus kandungan lemak dari sampel susu dan untuk mengurangi interaksi
non-spesifik SPI dengan MIP, menjaga analit khusus tertahan pada MIP tersebut. Hal ini membuat lebih
mudah pengobatan susu dan mengandaikan penghematan yang sangat penting dalam pelarut dan
waktu analisis. MISPE dioptimalkan menunjukkan bahwa MIP dapat mengenali SPI tanpa reaktivitas
silang ke makrolida lainnya dipelajari. Jadi, telah menunjukkan bahwa metakrilat berdasarkan SPI-MIP
diperoleh memiliki potensi besar untuk pemanfaatan sebagai sorben SPE khusus untuk SPI bersih-
bersih dan prakonsentrasi dalam campuran kompleks seperti susu domba, menawarkan alat alternatif
yang cepat, sensitif dan biaya-efektif untuk sorbents yang ada untuk menganalisis SPI dalam susu
sampel.