FACULTAD DE PSICOLOGA
CTEDRA DE NEUROFISIOLOGA Y PSICOFISIOLOGA
Autores: Walter Krainbuhl; Leandro Magnotti; Ana Paula Rocco; Laura Legeren; Luis Cisneros; Aylen
DAlessandro; Adrin Bueno (Agosto de 2015). Basada en la Gua homnima hecha por Vernica
Balaszczuk y Christian Bender, de la cual conserva algunos apartados modificados.
INTRODUCCIN
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Obtencin de cortes mediante micrtomo
Finalizada la perfusin, se extrae el cerebro del crneo y se lo coloca en una solucin crioprotectora
que prepara al tejido para el siguiente paso de seccionamiento. El cerebro se corta en laminas finas
(por ejemplo de 40 micrones -1 micrn es la milsima parte de un milmetro-) mediante un aparato
llamado micrtomo (del latn, aquello que corta en finas laminas). Los cortes se colocan de manera
seriada, en una cubetera con solucin fijadora o con sales especiales para mantener el tejido,
dependiendo de la tcnica que se use a posteriori. Despus de aplicar la tcnica, los cortes se montan
en portaobjetos cubrindolos con un vidrio fino denominado cubreobjetos.
Figura 2: A la izquierda se muestra un micrtomo con su cuchilla especial y a la derecha cortes coronales de cerebro de rata.
APARATO ESTEREOTXICO
El aparato estereotxico fue desarrollado a principios del siglo XX por los neuroanatomistas
norteamericanos Horsely y Clark. A pesar de su antigedad y sencillez, este dispositivo contina
siendo una herramienta insustituible en la investigacin neurocientfica.
El instrumento permite inmovilizar la cabeza
del animal de manera estndar gracias a la
insercin de barras de acero en los conductos
auditivos y una prensa que se ajusta al hocico.
El aparato tambin cuenta con un brazo que
se puede mover en tres direcciones: anterior-
posterior, dorsal-ventral y lateral-medial. En la
punta del brazo se colocan las pipetas,
cnulas o electrodos segn el experimento
que se vaya a realizar. La virtud de este
sistema radica en que, con la gua de un atlas
estereotxico, es posible ubicar cualquier rea
del cerebro en donde queramos inyectar una
sustancia o implantar un electrodo.
Una vez obtenidas las coordenadas
estereotxicas a partir del atlas, se anestesia
al animal y, luego de colocarlo en el aparato,
se le practica una incisin en el cuero cabelludo. Figura 3: Esquema del aparato estereotxico.
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Posteriormente se localiza el bregma, un punto en el crneo que se toma de referencia calcular todas
las distancias, y se coloca el brazo en los nmeros adecuados segn el rea que se pretende localizar,
sitio en el que finalmente se perfora el crneo para poder insertar la pipeta, cnula o electrodo que se
vaya a utilizar para registrar actividad elctrica, estimular areas especificas, administrar drogas o
provocar lesiones. Adems, tambin es posible instalar cnulas de modo permanente que permiten la
posterior aplicacin de frmacos o para medir concentraciones de neurotransmisores u otras
molculas dentro del cerebro.
Los aparatos estereotxicos se utilizan para investigacin con animales experimentales, aunque
tambin los hay para realizar tratamientos en seres humanos. Por lo general, se valen de mltiples
puntos de referencia para verificar la localizacin del electrodo o la pipeta insertada en el encfalo,
tomando imgenes de resonancia magntica antes de realizar la intervencin.
Figura 4: Izquierda: Fotografa de una intervencin quirrgica en humanos utilizando aparato estereotxico. Derecha: Rata
anestesiada en un aparato estereotxico.
ATLAS ESTEREOTXICO
Es un mapa del sistema nervioso en que se delimitan los contornos de todas y cada una de las
estructuras. Dado que el atlas contiene las coordenadas milimtricas, su uso es indispensable para
realizar micro-cirugas con el aparato esterotxico. Se han hecho atlas de diversos animales,
incluyendo humanos, basados en series de cortes coronales, horizontales y sagitales.
Figura 5: A la izquierda se observa un esquema del atlas estereotxico de un corte coronal del cerebro de una rata, utilizado
como referencia para hacer la intervencin con el aparato estereotxico.
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ANALISIS MICROSCPICO DE LAS NEURONAS
El ojo humano puede distinguir dos puntos slo si estn separados por ms de una dcima de
milmetro (100 m). Por consiguiente, podemos decir que 100 m es prcticamente el lmite de
resolucin a simple vista. Las neuronas tienen un dimetro aproximado de 20 m, por lo que el
microscopio ptico fue un desarrollo necesario antes que pudiera estudiarse la estructura neuronal. A
pesar de que los primeros microscopios datan desde el siglo XVIII, es recin a finales del siglo XIX
cuando los padres de la neuroanatoma, Camilo Golgi y Santiago Ramn y Cajal, lo aplicaron para
estudiar las clulas nerviosas.
Con el devenir de los aos, se ha logrado incorporar en la investigacin distintos tipos de microscopios
que sirven para estudiar diferentes aspectos del sistema nervioso. El uso de uno u otro depender de
la pregunta que el investigador se haga. A continuacin se mencionan los microscopios ms utilizados.
Microscopio con focal: Con este microscopio se pueden Figura 6: Microscopio ptico.
visualizar molculas fluorescentes en un plano de foco
simple, creando una imagen muy ntida. La muestra es barrida con luz excitante desde un rayo lser.
Los rayos luminosos de la imagen que convergen, la atraviesan y son recogidos por un detector que
transfiere la informacin a una computadora para integrarlos en la pantalla de un monitor.
Microscopio Electrnico de Transmisin: Se utiliza para ver estructuras tan pequeas como las
vesculas sinpticas y detalles de los orgnulos celulares. Con l se pasa un haz de electrones de un
lado a otro del tejido a examinar. Este microscopio tiene un can electrnico con filamento de
tungsteno (fuente de electrones). Por calentamiento del filamento y diferencia de voltaje entre ctodo y
nodo se desprenden electrones que son acelerados y forman un haz que viaja por una columna al
vaco. Hay lentes electromagnticas condensadoras, con objetivos y proyectores. El campo magntico
enfoca a los electrones y la imagen se forma en una pantalla fluorescente.
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Microscopio Electrnico de Barrido: Permite obtener una imagen en tres dimensiones. Se diferencia
del electrnico de transmisin en que ofrece imgenes a menor aumento y en que sirve para revelar la
superficie de los objetos en estudio en vez de sus componentes internos.
TECNICA DE NISSL
Esta tcnica es una de las tinciones ms utilizadas y fue introducida por el alemn Franz Nissl a finales
del siglo XIX. Este cientfico puso de manifiesto que una serie de colorantes bsicos (azul de metileno,
violeta de cresilo, rojo neutro) tean los ncleos celulares y aglutinaciones presentes en el citoplasma
conocidas como retculo endoplasmtico rugoso. La tincin de Nissl sirve para el estudio de la
citoarquitectura del sistema nervioso.
Concretamente permite: describir la disposicin de las neuronas en ncleos o capas, estudiar el
nmero de neuronas que componen cada rea cerebral, y realizar apreciaciones acerca del tamao y
morfologa de las neuronas. Es importante mencionar que esta tcnica no tie axones ni dendritas.
Figura 7: Neuronas de la amgdala del cerebro de una rata tenidas con tcnica de NISSL. Ntese como esta tcnica permite
visualizar los cuerpos celulares bien definidos, pero no tie sus prolongaciones.
TINCION DE GOLGI
En 1873 el histlogo Camillo Golgi descubri que, sumergiendo el tejido cerebral en una solucin con
sales de plata, un pequeo porcentaje de neuronas se tean completamente de negro, lo que puso de
relieve que el cuerpo de la neurona, la nica regin que se pone de manifiesto con la tincin de Nissl,
es solo una pequea fraccin de su estructura.
En efecto, la tincin de Golgi evidencia un soma neuronal del que irradian numerosas proyecciones
finas, denominadas dendritas y axones, demarcando con gran detalle la morfologa total de la clula,
haciendo posible as diferenciar los diversos tipos de neuronas existentes (bipolares, estrelladas,
piramidales, granulares, de Purkinge y otras multiformes).
En este procedimiento, la coloracin negra de las clulas teidas est asociada a las sales de plata
que se depositan en las protenas de las neuronas, y por este motivo la tcnica de Golgi es
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considerada una tcnica argntica, atento a que la palabra plata en latn es argentum, vocablo del
que deriva el smbolo qumico de la plata, Ag, en la tabla peridica de los elementos.
Figura 8: Neuronas de la corteza cerebral tenidas con la tcnica de Golgi. Ntese como esta tcnica no solo tie el soma, sino
tambin sus axones y dendritas.
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Figura 9: corte sagital de la corteza parietal del cerebro de una rata tratada con el bloqueante glutamatrgico MK-801. La
tcnica argntica utilizada (de Olmos y col, 1994) permite detectar degeneracin de clulas piramidales, cuyos cuerpos se
localizan en la capa IV, con sus axones dirigindose a la superficie (ver recuadro). La densa tincin de la capa I corresponde
a los botones terminales, mientras que en las capas II y III se visibilizan fracciones de los axones de las neuronas afectadas.
TECNICA INMUNOCITOQUIMICA
La tcnica inmunocitoqumica o inmunohistoqumica es la tcnica ms popular de todos los mtodos
de tincin. El espectacular desarrollo de la neurobiologa en las ltimas dcadas se debe en gran
medida a la invencin de esta tcnica.
Esta tcnica utiliza anticuerpos, que se unen de manera ultra-especifica a la molcula que se quiere
localizar, la cual funciona como antgeno. Al administrar anticuerpos en las clulas, las molculas-
antgeno reaccionan qumicamente ante stos, provocando una seal visible en el microscopio. sta
tincin, por lo tanto, no tie la clula en s mismo, sino protenas (cualquier molcula que funcione
como antgeno).
Este mtodo sirve para definir la
distribucin de los receptores
cerebrales, neurotransmisores,
neuropptidos, enzimas, canales
inicos, hormonas u otras molculas
presentes en el sistema nervioso.
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anticuerpo secundario llamada ABC (Complejo Avidina-Biotina) que se utiliza para hacer ms visible la
unin de los anticuerpos con la molcula de inters.
Si observramos estos cortes hasta este punto, todava no se podra ver ninguna tincin. La marca
visual se obtiene luego de introducir un sustrato (de la enzima peroxidasa) y un cromgeno que da
color a la reaccin. Una vez preparados los cortes que contienen el tejido, se observan las neuronas
marcadas con la protena teida en el microscopio. De esta manera se puede establecer la
neuroqumica de los distintos ncleos del encfalo, constatando en qu clulas o en qu rea de una
neurona se concentra la protena marcada.
Figura 12: Espinas dendrticas que fueron teidas de amarillo con una tcnica inmunohistoqumica, usando como antgeno la
actina, una protena estructural, que permite observar la diferencia morfolgica en las espinas dendrticas.
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En la actualidad, existen laboratorios que se
dedican a fabricar y vender diversos
anticuerpos, lo que ha facilitado la utilizacin
de esta metodologa.
Figura 14: En estos cortes coronales, las zonas oscuras revelan la concentracin de zinc en cerebros de ratas. A la izquierda
puede verse densamente teido el ncleo principal de la estra terminal (BST), y a la derecha las reas CA3 y CA4 del
hipocampo.
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TECNICAS PARA LA TINCION DE MIELINA
Estas tcnicas se basan en el uso de colorantes con afinidad por las protenas unidas a los
fosfolpidos, por lo que tien especficamente la mielina que recubre los axones.
Mtodo de Klver-Barrera
La tincin de Klver-Barrera marca de un color los somas y de otro color la mielina que recubre a los
axones, permitiendo detectar las principales rutas por las que las neuronas proyectan a otras reas.
Esta tcnica implica una doble tincin del mismo tejido, por lo que se lleva a cabo en 2 etapas, donde
cada una de ellas comprende una de las tinciones. La primera que se realiza es la tincin de la mielina
mediante una solucin de azul luxol que pone de manifiesto a la sustancia blanca, mientras que en
segunda instancia se realiza una contra tincin de Nissl para teir los cuerpos celulares. En esta contra
tincin suele emplearse el colorante rojo neutro o violeta de cresilo, ya que contrastan mejor con el
azul de luxol.
Figura 15: Se observa el contraste entre el soma teido de rojo, y la vaina de mielina del axn, visible en color azul.
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TECNICA PARA TEIR MICROGLIA - Mtodo del carbonato de Plata Amoniacal
Tcnica desarrollada en 1919 por Pio del Rio Hortega como una modificacin del mtodo de
Achucarro. Consiste en la introduccin del carbonato de plata, reactivo mucho ms seguro y verstil
que el oxido de plata, el cual resulta de la precipitacin del nitrato de plata con carbonato sdico y la
posterior disolucin del precipitado con amoniaco. El carbonato posibilita teir aquellos elementos de la
neuroglia que haban escapado al microscopio. Gracias a este mtodo se pudo estudiar en detalle la
neuroglia, identificando dos de los principales
tipos, la microglia o clulas de Hortega, y
los oligodendrocitos.
El papel de la microglia es fundamental frente
a los procesos de muerte neuronal, pues se
activa como respuesta inflamatoria
transformndose sucesivamente en clulas en
bastoncito, clulas ameboides y, finalmente,
en corpsculos granulo-adiposos con
capacidad fagocitara. Esta activacin conlleva
la traslacin de estas clulas al sistema
nervioso, hasta alcanzar el foco inflamatorio,
por lo que su deteccin implica la presencia de
toxicidad o injuria neuronal.
Figura 17: Microglias teidas con mtodo de carbonato de plata amoniacal.
Marcadores Antergrados
Antergrado significa que se mueve hacia delante. Es un mtodo que se utiliza para marcar axones
eferentes de las distintas estructuras cerebrales, empleando sustancias que son captadas por las
dendritas y los somas celulares y transportadas, mediante transporte axoplsmico rpido, a lo largo del
axn hasta los botones terminales. La sustancia antergrada ms utilizada es una protena llamada
PHA-L (phaseolus vulgaris leukoaglutinin) producida por una planta conocida como juda.
Pocos das luego de la inyeccin, las molculas de PHA-L difunden por el soma y las prolongaciones
hasta alcanzar a los botones terminales de las neuronas. Para poder ver las molculas de PHA-L, se
aplica un mtodo de inmunocitoqumica, y las preparaciones se examinan al microscopio.
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Figura 18: Esquema que muestra el funcionamiento de PHA-L, una tcnica de marcado antergrado.
Marcadores Retrgrados
Retrogrado significa que se mueve hacia atrs. Sirve para identificar las aferencias que recibe una
determinada regin del encfalo y el proceso es similar al utilizado para identificar sus eferencias. Lo
nico que se modifica en el marcado retrgrado respecto del antergrado, es la sustancia a utilizar, en
este caso es el oro fluorado (fluoro gold). Esta molcula es absorbida por los botones terminales y
transportada a los somas celulares mediante transporte axoplsmico retrogrado. Pocos das despus
se examina el tejido bajo una luz de longitud de onda adecuada y las molculas de oro fluorado emiten
fluorescencia bajo esta luz.
Entonces, en las partes del cerebro en donde se observan los cuerpos neuronales que hayan
incorporado el trazador, son las estructuras que envan aferencias al rea donde se inyect el
marcador retrogrado.
Marcado Transneuronal
Permite identificar una serie de dos, tres o ms neuronas que forman conexiones sinpticas en serie
unas con otras. Este mtodo puede utilizarse para marcar los circuitos, ya sea en direccin
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antergrada o retrgrada. El marcado transneuronal ms eficaz emplea un virus de la seudorrabia, una
forma debilitada del virus herpes que originalmente se concibi como vacuna. El virus se inyecta
directamente en una regin cerebral y es captado por las neuronas del lugar, las cuales se infectan; la
infeccin se extiende a travs de las neuronas y finalmente es liberado de las mismas, contagiando a
las neuronas con las que establece conexiones sinpticas.
Figura 20: Las imgenes muestran las etapas de la neurona en cultivo: a) se observa la clula sin ramificaciones, recin
sembrada en la cpsula de Petri; b) muestra las primeras ramificaciones de la neurona; c) aqu ya se visibiliza el axn largo,
con sus ramificaciones, las que se consolidarn en la cuarta etapa (d).
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PALABRAS FINALES
En este trabajo se realiz un recorrido por las metodologas utilizadas para estudiar el sistema
nervioso a nivel microscpico. Muchas tcnicas han quedado afuera de esta presentacin, pero lo
fundamental ha sido expuesto. Lo que debe quedar como mensaje es que no hay una sola tcnica o
un nico experimento que pueda responder a las preguntas que plantean los neurocientficos. Esto se
obtiene del trabajo de miles de investigadores y es el conjunto de datos obtenidos desde distintas
perspectivas de donde se alcanzan las respuestas. Por otro lado, continuamente se desarrollan
nuevas tecnologas que permiten la visualizacin de componentes celulares a nivel microscpico. Por
lo tanto, el conocimiento actual viene con fecha de vencimiento. A no dejarse estar.
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