2.

1 Agrobacterium tumefaciens

Species Agrobacterium tergolong bakteri gram negatif yang tergolong bakteri aerob dan

mampu hidup baik sebagai saprofit maupun parasit. Agrobacterium berbentuk batang, berukuran 0,6

1,0 m sampai 1,5 3,0 m, dalam bentuk tunggal atau berpasangan. Agrobacterium merupakan

bakteri yang mudah bergerak (motile) dan memiliki 1-6 flagela peritrichous serta merupakan bakteri

tak berspora. Suhu optimal pertumbuhan bakteri ini adalah 25-28C. Kumpulan bakteri ini biasanya

berbentuk cembung, bulat, lembut, dan tak berpigmen. Agrobacterium diisolasi dari tanaman yang

terinfeksi Crown Gall. Agrobacterium tumefaciens dan spesies Agrobacterium lainnya telah dikenal

luas sebagai patogen bagi tanaman sejak awal abad ke-20. Namun, dalam dua dekade terakhir,

kemampuan yang dimiliki Agrobacterium untuk mentransfer DNA ke dalam sel tanaman telah

banyak dimanfaatkan untuk keperluan rekayasa genetik khususnya pada tanaman.

Gambar 6. Agrobacterium tumefaciens

(sumber: http://www.bio.davidson.edu)

Agrobacterium tumefaciens adalah bakteri yang secara alami dapat menginfeksi tanaman

dengan penyakit crown gall tumor (tumor mahkota empedu) pada tanaman-tanaman dikotiledon.

Penyakit ini dinamakan demikian karena terdapatnya tumor besar yang membengkak yang terdapat

pada tanaman. Penyakit ini adalah salah satu penyakit yang paling umum diketahui karena perubahan

yang ditimbulkannya pada sistem biologis tanaman. Secara mendasar, ketika bakteri ini menginfeksi

tanaman, sebagian dari materi DNA-nya dipindahkan ke genom tanaman yang akhirnya menyebabkan

tumor dan perubahan pada sistem metabolisme tanaman. Hal ini dapat terjadi karena materi genetik

yang diberikan kepada tanaman salah satunya mengandung gen pengkode hormon pertumbuhan

tanaman yang dalam jumlah berlebih akan menyebabkan pertumbuhan tidak terkendali dan pada

akhirnya menyebabkan kanker atau tumor.

Bakteri yang tergolong ke dalam gram negatif ini memiliki sebuah plasmid besar yang

disebut plasmid-Ti yang berisi gen penyandi faktor virulensi penyebab infeksi bakteri ini pada

tanaman. Untuk memulai pembentukan tumor, Agrobacterium tumefaciens harus menempel terlebih
dahulu pada permukaan sel inang dengan memanfaatkan polisakarida asam yang akan digunakan

untuk mengkoloniasi/menguasai sel tanaman. Selain tanaman dikotiledon, tanaman monokotiledon

seperti jagung, gandum, dan tebutelah digunakan untuk memasukkan sel asing ke dalam genom

tanaman. Agrobacterium tumefaciens adalah bakteri patogen pada tanaman yang banyak digunakan

untuk memasukkan gen asing ke dalam sel tanaman untuk menghasilkan suatu tanaman transgenik.

Gambar 7. Siklus Penyakit Crown Gall

(Sumber : https://www.cals.ncsu.edu/)

Sifatnya yang unik ini membuat bakteri Agrobacterium tumefaciens digunakan sebagai alat

pada proses pengembangbiakan tanaman. Gen yang diinginkan, seperti gen insectisidal toxin genes

atau herbicide-resistance dapat dimasukan ke dalam DNA bakteri dan kemudian dimasukan ke dalam

genom tanaman. Penggunaan bakteri ini tidak hanya memperpendek waktu pengembangbiakan

tanaman, tetapi juga memungkinkan tanaman untuk memiliki sifat baru yang tidak dimiliki tanaman

pada umumnya.

Transformasi menggunakan Agrobacterium ternyata lebih disenangi dibandingkan dengan metode lain

karena memilikin keunggulan antara lain 1). Efisiensi transformasi dengan salinan gen tunggal lebih

tinggi, 2). Dapat dilakukan dengan peralatan laboratorium yang sederhana, dan 3) Ekspresi gen

transfer yang stabil cukup banyak. Gen dengan salinan tunggal lebih mudah dianalisa dan biasanya

bersegregasi mengikuti pola pewarisan Mendel.

Infeksi Genetik Ke Tembakau Dengan Menggunakan Agrobacterium

Tembakau merupakan tanaman dikotil dan inang alami untuk A. tumefaciens (Mayo et al.,

2006). Nicotina tabacum (Mayo et al., 2006; Bhatti dan He, 2009) dan Nicotina benthamiana

(Anggraito, 2012) merupakan jenis tembakau yang sering digunakan dalam transformasi genetik. Pada

jenis N. tabaccum seperti Samsun (Stanic et al., 1999), SRI (Bhatti dan He, 2009), Bright yellow (An,

1985), Xanthi (Su, 2012), dan Kasturi (Miswar, 2005), telah berhasil dilakukan transformasi melalui

perantara A. tumefaciens. Daun muda (Jones, 1996; Su et al., 2012) dan suspensi sel (An, 1985; Mayo
et al., 2006) merupakan eksplan yang telah berhasil diintroduksi gen asing. Keberhasilan transformasi

genetic tembakau telah digunakan untuk berbagai tujuan seperti mengungkap regulasi sistem biologi

tanaman (Langbecker et al., 2004), bioremediasi untuk merkuri (He et al., 2001), tanaman model

untuk pengujian cekaman biotik (Waigman et al., 2000), dan abiotic (Rizhsky et al., 2002).

Tabel 1. Sejumlah Keterlibatan Tembakau dalam Perkembangan Tanaman Transgenik

Tahun Peristiwa

1982 Tanaman transgenik yang pertama

dihasilkan berupa tembakau

resisten antibiotik

1986 Tanaman transgenik pertama kali

diuji coba langsung di Prancis dan

AS, berupa tembakau tahan

herbisida

1987 Tanaman tahan serangga berupa

tembakau yang tersisipi gen Bt

pertama kali dihasilkan oleh Plant

Genetic System

1992 Tanaman transgenik pertama kali

diperkenalkan di Cina dalam

bentuk tembakau tahan virus

1994 Tanaman transgenik pertama kail

dikomersialkan di Eropa dalam

bentuk tembakau tahan herbisida

bromoxynil

Beberapa tahap tahap ini umumnya dilakukan dalam proses transformasi genetic pada

Tembakau dengan Agrobacterium. Umumnya pada proses ini menggunakan Agrobacterium

tumefaciens dan dilakukan dengan metode leaf disk

 Gambar 21. Pembuatan Planlet Daun Hasil Infeksi Agrobacterium

(Sumber: Primrose, et al, 2001)

4.1 Persiapan Agrobacterium dan Tembakau

Sebelum A. tumefaciens yang telah disipi gene of interest menginfeksi tembakau, dilakukan

preparasi koloni A. tumefaciens dalam medium Saint et al (1994) maupun medium Susanto et al

(2011) dan Waluyo et al (2013). Saint et al (1994) [sebagaimana diuraikan oleh Santoso et al (2000)]

menumbuhkan A. tumefaciens dalam medium cair LuriaBertani (LB) yang mengandung antibiotic

untuk seleksi A. tumefaciens yang telah tersisipi gen/plasmid yang diinginkan (biasanya kanamisin).

Susanto et al (2011) dan Waluyo et al (2013) menumbuhkan A. tumefaciens dalam dalam media YEP

(yeast extract pepton 10 g/l pepton, 10 g/l kamir dan 5 g/l NaCl) yang ditambahkan antibiotik sebagai

kanamisin. Keduanya ditumbuhan selama 24 48 jam pada suhu 28C dengan pengocokan 150-200

rpm. Kultur dilakukan hingga OD600 = 0,5. Pada medium Saint et al (1994), kultur A. tumefaciens

dilakukan dalam keadaan gelap dan dikulturkan kembali selama sekitar tiga jam pada kondisi yang

sama setelah diencerkan 100 1000 kali dengan medium yang sama.

Tembakau yang umumnya disiapkan untuk transformasi genetic biasanya diambil dari daun

tembakau muda (umumnya dari hasil perkecambahan in vitro) yang telah disterilkan. Daun tembakau

yang diambil dipotong dengan ukuran 5 mm x 10 mm kemudian diprekultur selama 60 menit untuk

dijadikan sebagai eksplan.

4.2 Inokulasi dan Kokultivasi

Inokulasi dilaksanakan dengan merendam eksplan tembakau dalam suspensi A. tumefaciens

selama 30 menit. Setelah inokulasi, eksplan diletakkan di atas kertas saring hingga kering, kemudian

eksplan ditanam di media kokultivasi berupa MS (Murashige-Skoog), asetosiringon, serta nutrisi

tambahan dan diinkubasi pada kondisi gelap pada suhu 28C selama 2-3 hari. Asetosiringon

ditambahkan untuk merangsang transkripsi gen vir agar proses transfer T-DNA ke tumbuhan

berlangsung lebih cepat.

4.3 Seleksi dan Regenerasi

Eksplan dipindahkan ke media seleksi yang berupa medium MS, antibiotic atau herbisida

untuk menentukan sel tembakau yang telah tersisipi gene of interest (umumnya antibiotic kanamisin)

dan antibiotic pembunuh A. tumefaciens (seperti sefotaksim dan karbenisilin untuk membunuh bakteri

Gram-negatif). Komposisi media dasar MS seperti pada pustaka. Kultur pada media seleksi diinkubasi

pada ruang kultur dengan suhu 27C dengan fotoperiodisitas cahaya 16 jam terang. Eksplan

disubkultur setiap 4-6 minggu.

Tabel 2. Komposisi Medium MS (Murashige-Skoog)

(Sumber: Maeda et al, 1985)

Penanda bahwa telah terjadi perpindahan T-DNA ke dalam kromosom tanaman adalah gen

resisten antibiotik. Dalam T-DNA disisipi gen resisten zat kimia tertentu, sehingga, apabila penanda

ini telah masuk ke dalam kromosom tanaman, tanaman tersebut akan tahan zat kimia itu. Berikut

beberapa penanda (selected marker) yang lazim digunakan

Tabel 3. Selectable Gene

(Sumber: Primrose et al, 2001)

Eksplan/kalus yang bertunas dipindahkan ke media pemanjangan tunas dengan medium dan

penambahan yang sama seperti media seleksi. Tunas yang terbentuk pada media pemanjangan tunas

dipisahkan dari kalus dan dipindahkan ke media perakaran beruma medium MS disertai penambahan

antibiotic seleksi dan nutrisi tambahan pada botol selai. Planlet yang terbentuk siap untuk dipindahkan

ke medium tanah