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Notas Tcnicas de Prevencin

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Riesgo biolgico: evaluacin y prevencin en


trabajos con cultivos celulares
Biological risk: Assessment and prevention in tasks with cell cultures
Risque biologique: Evaluation et prvention aux travaux avec des cultures cellulaires

Redactora: En esta nota tcnica de prevencin se revisa de forma


esquemtica las caractersticas del trabajo con cultivos
Asuncin Mirn Hernndez
celulares, contemplando los principales factores de ries-
Licenciada en Biologa
go y las principales medidas preventivas y de contencin
CENTRO NACIONAL DE NUEVAS requeridas para su manipulacin.
TECNOLOGAS

Vigencia Actualizada Observaciones

VLIDA

1. INTRODUCCIN Cultivo organotpico

Actualmente los cultivos celulares son ampliamente uti- En el cultivo de rganos (organotpico) la arquitectura
lizados en la industria de la biotecnologa para la pro- caracterstica del tejido in vivo se mantiene parcialmente.
duccin de vacunas, enzimas, anticuerpos monoclonales, El rgano se mantiene en un medio del que obtiene los
protenas, etc. Tambin son tiles en distintas disciplinas nutrientes, donde libera los desechos y en el que man-
de la investigacin biomdica como: citologa, virologa, tiene su estructura tridimensional, generalmente esfrica.
inmunologa, investigacin sobre el cncer, embriologa, Este tipo de cultivo permite mantener los tipos celulares
estudios cromosmicos y tratamientos mdicos entre los diferenciados y es por ello una buena rplica del tejido
que cabe destacar el mantenimiento y produccin de te- de origen, sin embargo, no permite su propagacin pues
jidos para trasplantes. el crecimiento, de producirse, se limita a la periferia. La
Desde el punto de vista preventivo, los cultivos celula- imposibilidad de propagacin obliga, en cada nuevo ex-
res son considerados agentes biolgicos segn la defini- perimento, a partir de nuevo material animal lo que con-
cin recogida en el Artculo 2 del Real Decreto 664/1997, lleva una elevada heterogeneidad.
de 12 de mayo, sobre la proteccin de los trabajadores
contra los riesgos relacionados con la exposicin a agen- Cultivo de explantes
tes biolgicos durante el trabajo, en la que se considera:
Agentes biolgicos: microorganismos, con inclusin de Los explantes son fragmentos de tejidos u rganos que
los genticamente modificados, cultivos celulares y en- se adhieren a una superficie y en la que proliferan las
doparsitos humanos, susceptibles de originar cualquier clulas de la periferia.
tipo de infeccin, alergia o toxicidad, y Cultivo celular:
el resultado del crecimiento in vitro de clulas obtenidas Cultivo de clulas
de organismos multicelulares. Por lo que, en las activi-
dades que implican la utilizacin o manipulacin de estos Este tipo de cultivos suponen una disgregacin celular, ya
cultivos se debern adoptar medidas para proteger la sea por medios enzimticos o mecnicos. La suspensin
salud y seguridad del trabajador y del medio ambiente. celular que se obtiene se puede cultivar como una mono-
Estas medidas se decidirn a partir de una exhaustiva capa adherente o en suspensin en el medio de cultivo.
evaluacin de riesgos, cuyas caractersticas principales Este tipo de cultivo permite su propagacin, aumentando
se describen ms adelante. notablemente la masa celular del cultivo a lo largo de las
generaciones.
Las clulas que se cultivan directamente desde un suje-
2. TIPOS DE CULTIVO CELULAR to se conocen como clulas primarias. La mayor parte de
los cultivos celulares primarios tienen un periodo de vida
El procedimiento de cultivo celular se define como el limitado, es decir, despus de un cierto nmero de divi-
conjunto de tcnicas que permiten el mantenimien- siones las clulas entran en el proceso de senescencia y
to de las clulas de organismos pluricelulares in vitro, dejan de dividirse, generalmente manteniendo la viabilidad.
preservando al mximo sus propiedades fisiolgicas, Ocasionalmente, un cultivo primario se mantiene du-
bioqumicas y genticas. Dependiendo del grado de rante ms generaciones de las esperadas. Esto es de-
preservacin de la estructura del tejido o del rgano bido a la aparicin en el cultivo de clulas inmortales, la
de origen y de su duracin se puede hablar de diferen- razn de la inmortalizacin de estas clulas es, en la
tes tipos de cultivos: de rganos, explantes, primarios mayor parte de los casos, desconocida, pero se observa
o secundarios, etc. que la frecuencia de inmortalizacin se incrementa me-
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Notas Tcnicas de Prevencin

diante infecciones virales, tratamientos con mutgenos, la confluencia o inhibicin del crecimiento celular por
etc., por lo que se cree que esta capacidad debe estar contacto,
relacionada con la prdida, espontnea o inducida por pase de clulas a otras placas (replaqueo) para la pro-
el tratamiento, de las vas de control celular. Se cree que pagacin o expansin de la lnea celular,
la capacidad de un cultivo celular primario para estable- centrifugacin para separar las clulas del medio de
cerse como lnea estable est relacionada directamente cultivo,
con su variabilidad gentica. tincin celular para distinguir entre clulas vivas y
Una lnea celular establecida o inmortal es la que ha muertas,
adquirido la capacidad de proliferar indefinidamente. Hay observacin al microscopio, para recuento y control
numerosas lneas celulares bien establecidas represen- morfolgico,
tativas de tipos celulares particulares. recuento celular.
El cultivo de las clulas presenta diversas dificultades
en funcin del tipo de clula en cuestin. Existen gran-
des diferencias que se relacionan fundamentalmente con 4. PRINCIPALES RIESGOS BIOLGICOS
el grado de diferenciacin del tipo celular. As pues, en
general se puede establecer como norma que una lnea Los cultivos celulares no contaminados generalmente no
celular ser tanto ms fcil de establecer o cultivar cuanto presentan un riesgo significativo y la posible inoculacin
ms indiferenciada sea, con las excepciones de las lneas drmica origina slo una inflamacin local. Sin embargo,
tumorales de clulas diferenciadas. estos cultivos pueden contribuir sustancialmente al riesgo
de exposicin a otros agentes biolgicos, ya que pueden
actuar como base o ayudar a la supervivencia o a la re-
3. TRABAJO EN UN LABORATORIO DE plicacin de agentes oportunistas.
CULTIVO CELULAR, ACTIVIDADES Y Los agentes contaminantes accidentales, proba-
MANIPULACIN DEL CULTIVO blemente constituyen el principal riesgo asociado a la
manipulacin de cultivos celulares, ya que a menudo
En esquema, en un laboratorio de cultivo celular se rea- son difciles de detectar. Los principales contaminantes
lizan las siguientes actividades: son: bacterias, hongos, parsitos, micoplasmas, virus y
preparacin de medios de cultivo, priones. Esta contaminacin puede provenir de la fuente
esterilizacin de medios y reactivos, (tejido o clulas origen del cultivo) o bien producirse en
lavado, esterilizacin y preparacin del material, el proceso de manipulacin del cultivo, por el empleo de
mantenimiento y uso del aparataje del laboratorio (ca- reactivos biolgicos contaminados o de material conta-
bina de seguridad biolgica, incubadores, centrfugas, minado o por el ambiente de trabajo.
microscopios, dispositivos de pipeteo, etc.), Los Centros para el Control y la Prevencin de Enfer-
el cultivo celular y la manipulacin del mismo. medades CDC, (Centers for Diseases Control and Pre-
El cultivo celular se realiza en medios artificiales prepa- vention) indican que los peligros potenciales asociados a
rados mediante la mezcla de componentes purificados los cultivos de clulas o tejidos humanos incluyen entre
o de soluciones orgnicas complejas, en el interior de otros los patgenos trasmitidos por sangre como el virus
aparatos que mantienen las condiciones fsico-qumicas de la hepatitis B (VHB) y el virus de inmunodeficiencia hu-
adecuadas para el cultivo (incubadores) y sobre sopor- mana (VIH) y agentes tales como Mycobacterium tuber-
tes o recipientes que los contienen y aslan del exterior culosis que puede estar presente en tejidos pulmonares
(placas Petri, matraces, etc.). Por lo que se considera que humanos. Estos centros han informado de varios casos
el medio de cultivo est formado por cuatro elementos: de infeccin en personal de laboratorio que manipulaba
la naturaleza del sustrato o fase en la que crecen las cultivos celulares primarios de primates.
clulas, Los cultivos de clulas humanas y de primates pueden
las condiciones fsico-qumicas y fisiolgicas del medio, contener virus de la hepatitis B y C (VHB y VHC), virus
la naturaleza y composicin de la fase gaseosa, de las leucemias humanas (VLHT), herpesvirus (Virus
las condiciones de incubacin, especialmente de hu- de Epstein- Barr, Cytomegalovirus, virus del herpes sim-
medad y temperatura. plex tipos 1 y 2), retrovirus, virus de la inmunodeficiencia
En la manipulacin de cultivos celulares se realizan ge- humana (VIH). Los cultivos de clulas animales no pro-
neralmente las siguientes tareas: cedentes de humanos o de primates pueden contener:
disgregacin celular para obtener clulas en suspen- Hanta virus, virus de la coriomeningitis linfoctica, virus
sin, que puede realizarse por mtodos qumicos, en- de la influenza, etc.
zimticos o mecnicos o por combinacin de dos o tres La contaminacin por parsitos intracelulares puede
de estos mtodos. Como ejemplos, la tripsinizacin resultar un aspecto a tomar en consideracin cuando
(la tripsina digiere las protenas responsables de la se manejan cultivos celulares primarios en sus primeras
adhesin celular al sustrato, as las clulas adheridas etapas procedentes de donantes sobre los que se sabe
al sustrato pasan a estar en suspensin) o el pipeteo o sospecha que estn infectados. Algunos ejemplos
repetido o el barrido/araado de la superficie de cultivo, seran: Toxoplasma gondii, Trypanosoma cruzi, Lehis-
siembra mediante suspensin o depsito de las clu- mania sp. etc.
las en el medio de cultivo, Tambin las clulas carcinognicas son fuente de ries-
congelacin (para la conservacin de las lneas celu- go como resultado de la auto-inoculacin accidental del
lares) y descongelacin del cultivo, trabajador.
modificacin gentica de las clulas, mediante distin-
tos mtodos: infeccin con virus, etc.,
cambios de medio de cultivo para reponer nutrientes 5. EVALUACIN DE RIESGOS
y eliminar productos de desecho que frenen el creci-
miento o produzcan la senescencia o la muerte celular, La evaluacin de riesgos en la manipulacin de los culti-
diluciones de la densidad celular del cultivo para evitar vos celulares de origen humano o animal se basa tanto en
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Fuente (especie de origen) (1) Tipos de clulas o tejidos (2) Tipo de cultivo

Orden creciente de riesgo Orden creciente de riesgo Orden creciente de riesgo

Cultivo de lneas celulares bien ca


Clulas aviares y clulas de invertebrados Fibroblastos y clulas epiteliales
racterizadas

Clulas de mamferos (ni humanas ni de primates) Clulas de la mucosa intestinal Cultivo de lneas celulares continuas

Clulas de primates no humanos Cultivos celulares primarios


Clulas endoteliales
Clulas humanas

(1) Cuanto mayor sea la relacin gentica entre las clulas Tejidos neurales
del cultivo y las humanas, mayor es el riesgo para los hu-
manos, ya que los agentes patgenos suelen tener barreras
Clulas hematopoyticas
de especies especficas.

ATENCIN!
(2) Tomar en consideracin que algunos
Algunos organismos contaminantes podran cruzar la
tipos de clulas son capaces de inducir
barrera de las especies habituales (por ejemplo, la gripe
tumores
H5N1, la EEB, el SRAS, etc.)

Tabla 1. Riesgos en funcin de las propiedades intrnsecas del cultivo

las propiedades intrnsecas del cultivo celular, incluidas Propiedades adquiridas como resultado de una
las propiedades posteriores adquiridas como consecuen- infeccin con agentes patgenos
cia de una modificacin gentica, como en la posibilidad
de que el cultivo celular pueda estar deliberadamente o En el caso de cultivos celulares deliberadamente o inad-
inadvertidamente contaminado por agentes patgenos. vertidamente contaminados por agentes patgenos, la
Esta informacin permitir determinar el nivel de riesgo evaluacin de los riesgos potenciales del cultivo celular
asociado al cultivo celular. La evaluacin de riesgos debe contaminado o infectado por el patgeno requiere un
tener tambin en cuenta las condiciones de trabajo. examen de las propiedades intrnsecas del patgeno. El
riesgo biolgico del cultivo celular infectado depender
Propiedades intrnsecas del cultivo celular del riesgo biolgico del patgeno, segn la clasificacin
en grupos de riesgos de los agentes biolgicos estable-
Las propiedades intrnsecas de los cultivos celulares que cida en el Artculo 3 del Real Decreto 664/1997.
se deben considerar en la evaluacin de riesgos son:
la fuente (especie origen de las clulas), Condiciones de trabajo
el tipo de clulas o el tejido de procedencia,
el tipo de cultivo. Finalmente, en la evaluacin de riesgos hay que tener en
Los cultivos celulares de mayor riesgo son los que proce- cuenta la posibilidad de dispersin del material infeccioso
den de humanos y de primates, especialmente si derivan y de exposicin del trabajador en funcin de las caracte-
de sangre perifrica, tejido linfoide y nervioso (ver tabla 1). rsticas del trabajo como:
En ningn caso el trabajador que realice los cultivos procedimientos y tcnicas utilizados,
celulares podr utilizar sus propias clulas para el desa- equipos y material que se va a utilizar,
rrollo in vitro. Las clulas humanas para cultivo debern cantidad o concentracin del agente infeccioso, etc.
obtenerse solamente de individuos que no tengan rela- Con toda la informacin recogida se determinar el nivel
cin con el trabajo experimental. de bioseguridad necesario para el trabajo en laboratorio
con cultivos celulares.
Propiedades adquiridas como resultado de la
modificacin gentica
6. NORMAS DE TRABAJO EN LOS
En el caso de modificaciones genticas hay que tener LABORATORIOS DE CULTIVOS CELULARES
en cuenta, que las clulas recombinantes pueden haber
aumentado o disminuido su capacidad de causar dao Las normas a seguir en el trabajo con cultivos celulares
a la salud humana y el medio ambiente en comparacin para proteger al trabajador, al medio ambiente y al cultivo
con sus equivalentes no recombinantes. son:
La evaluacin de riesgos de las clulas recombinantes proporcionar formacin y capacitacin al operador o
se realizar atendiendo a lo establecido en el Real De- al trabajador en relacin a las buenas prcticas micro-
creto 178/2004, de 30 de enero, por el que se aprueba biolgicas, los riesgos y las medidas de prevencin,
el Reglamento general para el desarrollo y ejecucin de adoptar el principio de precaucin, tratar todos los
la Ley 9/2003, de 25 de abril, por la que se establece cultivos que se utilizan por primera vez como poten-
el rgimen jurdico de la utilizacin confinada, liberacin cialmente infecciosos. Trabajar siempre dentro de
voluntaria y comercializacin de organismos modificados una cabina de seguridad biolgica tipo II (protege a
genticamente. El primer paso en el proceso de evalua- la muestra, al trabajador y al ambiente), hasta que se
cin debe consistir en identificar las propiedades nocivas demuestre que los cultivos estn libres de bacterias,
del organismo receptor (clula husped) y, en su caso, virus, micoplasmas u hongos,
del donante, as como cualquier propiedad nociva relacio- manipular los cultivos celulares de origen humano o de
nada con el vector o con el material introducido, incluidas primates, en general, en un nivel de bioseguridad 2 y
las alteraciones de las propiedades iniciales del receptor. en una cabina de seguridad biolgica tipo II,
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Notas Tcnicas de Prevencin

manipular los cultivos celulares procedentes de fuen- utilizar equipos de proteccin individual: guantes, mas-
tes infectadas mnimo en un nivel de bioseguridad 2, carillas, gafas, ropa de proteccin,
adoptar niveles superiores en funcin del riesgo del implantar programas especficos de vigilancia de la
agente patgeno, salud del trabajador, siendo recomendable la vacuna-
identificar de forma adecuada los cultivos y todo el cin contra la hepatitis B, por el riesgo de exposicin
material biolgico, a patgenos transmitidos por sangre.
obtener siempre los cultivos de centros reconocidos En resumen, la manipulacin de cultivos celulares requie-
que certifiquen el origen, por ejemplo: la Coleccin re de instalaciones, equipos y prcticas microbiolgicas
Americana de Cultivos Tipo ATCC, (American Type adecuadas para evitar la contaminacin del cultivo, la
Culture Collection), la Coleccin Europea de Cultivos dispersin de posibles agentes patgenos y para eliminar
Celulares ECACC, (European Collection of Cell Cul- o reducir al mnimo la exposicin del trabajador.
tures) o de la Coleccin Espaola de Cultivos Tipo La caracterstica principal que define a un laboratorio
CECT, etc., de cultivo celular es que ha de ser una instalacin asp-
rechazar cultivos no seguros, poco caracterizados o tica (sala de cultivo limpia, con cabinas de seguridad
sin referencia o tratarlos con la precaucin adecuada, biolgica de tipo II, incubadores y materiales estriles),
trabajar siempre con material estril (pipetas, matra- debido a que la tasa de crecimiento de las clulas en
ces, etc.). El material estril slo puede abrirse, dentro cultivo es muy inferior a la de sus contaminantes ha-
de una cabina de seguridad biolgica. Todo aquello de bituales: hongos, levaduras, bacterias, micoplasmas.
lo que no se est seguro al 100% de su esterilidad ha Por ello, para el mantenimiento del cultivo es vital evi-
de ser considerado como no estril, tar la aparicin en ste de cualquier microorganismo
descontaminar la mesa de trabajo, las cabinas de contaminante.
seguridad biolgica y el material reutilizable antes y El rea de trabajo para realizar cultivos celulares debe
despus de trabajar con material biolgico, ser una parte o habitacin del laboratorio aislada, alejada
limpiar inmediatamente cualquier derrame del cultivo, de las vas de paso y, si es posible, dedicada exclusi-
lavarse las manos antes, despus y frecuentemente vamente al cultivo de clulas. La utilizacin de cabinas
durante el trabajo con cultivos, para evitar contami- de seguridad biolgica reduce las necesidades de ais-
naciones en los experimentos, la contaminacin del lamiento, pero an as, es recomendable mantener un
usuario con material biolgico y la posible disemina- gradiente de esterilidad, desde el medio exterior o la-
cin de ste, boratorio general al interior de las cabinas de seguridad
descontaminar por agentes qumicos o calor todo el donde se manipularn los cultivos y al incubador donde
material biolgico o contaminado con ste antes de se mantendrn.
ser eliminado, El nivel de bioseguridad necesario para el trabajo en
si se trabaja con ms de una lnea celular a la vez, evi- laboratorio con cultivos celulares se decidir en funcin
tar la contaminacin cruzada. Limpiar y desinfectar las de una exhaustiva evaluacin de riesgos, en la que se
superficies y tiles de trabajo cada vez que se trabaja tendr en cuenta el nivel de riesgo asociado al cultivo
con distintas lneas. Manipular en ltimo lugar la lnea y las condiciones de trabajo. Normalmente, el nivel de
de mayor proliferacin, bioseguridad 2 es el mnimo necesario para el trabajo
en caso de cultivos de larga duracin, verificar peri- con cultivos celulares, con el empleo de una cabina de
dicamente las propiedades del cultivo. Llevar a cabo seguridad biolgica tipo II. Se debern utilizar niveles
un control de calidad de las clulas, que demuestre la de bioseguridad superiores en el caso de modificacio-
ausencia de posibles agentes patgenos, nes genticas o cuando el cultivo este deliberadamente
establecer un programa adecuado de almacenamiento contaminado con agentes patgenos o sea sospechoso
de lnea celular, de estarlo.

BIBLIOGRAFA

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Animal cell cultures: risk assessment and biosafety recommendations
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(4) Real Decreto 664/1997 de 12 de mayo. Sobre la proteccin de los trabajadores contra los riesgos relacionados con
la exposicin a agentes biolgicos durante el trabajo.

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Gua tcnica para la evaluacin y prevencin de los riesgos relacionados con la exposicin a agentes biolgicos.
INSHT 2003
5
Notas Tcnicas de Prevencin

(6) Ley 9/2003, de 25 de abril, por la que se establece el Rgimen jurdico de la utilizacin confinada, liberacin
voluntaria y comercializacin de organismos modificados genticamente, a fin de prevenir los riesgos para la
salud humana y para el medio ambiente y R.D 178/2004, de 30 de enero, para el Desarrollo y Ejecucin de esta Ley.

(7) U.S. DEPARTAMENT OF HEALTH and HUMAN SERVICES. CENTERS FOR DISEASE CONTROL and PREVEN-
TION. NATIONAL INSTITUTE of HEALTH
Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (fifth edition)
U. S. Government Printing Office. Washington.2007

(8) HEALTH CANADA


Laboratory Safety Guidelines
Health Canada, 3 ed, 2004.

(9) ORGANIZACIN MUNDIAL DE LA SALUD


Manual de bioseguridad en el laboratorio (3 edicin)
OMS. Ginebra. 2005

(10) INSTITUTO NACIONAL DE SEGURIDAD E HIGIENE EN EL TRABAJO


Nota tcnica de prevencin n 376 Exposicin a agentes biolgicos: seguridad y buenas prcticas de
laboratorio
INSHT.
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Notas Tcnicas de Prevencin

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