UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDESTE

Comunicaciones Cientficas y Tecnolgicas 2000

Comparacin de tcnicas de extraccin de DNA para la deteccin de

Trypanosoma cruzi mediante la tcnica de PCR

Bruss, Bettina L.1 - Lucero, Horacio1 - Aguirre, Mara V.2 - Gorodner, Jorge O.1

1) Departamento de Biologa Molecular - Instituto de Medicina Regional - UNNE.

Av. Las Heras 727 - (3500) Resistencia - Chaco - Argentina.
Telfono: +54 (03722) 428213 - Fax: +54 (03722) 422793 - E-mail: jbgbruses@lared.com.ar
2) Ctedra de Bioqumica de la Facultad de Medicina - UNNE - Corrientes.

ANTECEDENTES

La Enfermedad de Chagas es la infeccin de mamferos y de triatomineos, producida por un protozoo

flagelado, el Trypanosoma cruzi, protozoo mastigforo que pertenece a la familia Trypanosomatidae, en cuyo
ciclo biolgico intervienen mamferos y un insecto vector. Los huspedes mamferos pueden ser el hombre y
algunos animales domsticos o silvestres.
Este parsito se presenta bajo tres aspectos morfolgicos fundamentales: Tripomastigoto, Epimastigoto y
Amastigoto.
Esta enfermedad se puede diferenciar en tres etapas: perodo agudo, perodo latente o indeterminado y
perodo crnico.
La metodologa de PCR (Polymerase Chain Reaction), permitir realizar la extraccin del DNA del parsito
para su posterior correlacin con los resultados obtenidos en individuos chagsicos mediante las tcnicas
convencionales de serologa y xenodiagnstico, a fin de poder evaluar la efectividad del tratamiento, ya que la
respuesta humoral contra los antgenos de Trypanosoma cruzi puede permanecer a travs de los aos, aunque
el parsito no sea demostrable por xenodiagnstico o cultivo (Brito y cols. 1995); es decir que si se realiza un
estudio serolgico es este momento, seguramente dar un resultado positivo, por la denominada cicatriz
serolgica, a diferencia de la PCR que permite realizar una deteccin directa del DNA del parsito,
indicando efectivamente su presencia y actividad. Por esta razn, la PCR podra en un futuro reemplazar el
xenodiagnstico para la evaluacin de la parasitemia en pacientes chagsicos tanto agudos como crnicos
(Avila y cols, 1993).
Los porcentajes de sensibilidad de la PCR varan de 96% al 100%, como se puede observar, siempre son
mayores que los obtenidos con los exmenes de xenodiagnstico, los cuales tienen una sensibilidad de
aproximadamente 50%.
El propsito de este trabajo es el de poner a punto las diferentes tcnicas de extraccin de DNA para poder
seleccionar luego aquel mtodo de mejor rendimiento, y as realizar las amplificaciones mediante la tcnica
de PCR con los primers especficos.

MATERIALES Y METODOS

La seleccin de los pacientes se realiza teniendo en cuenta resultados anteriores de serologa y

xenodiagnstico positivos, los que son proporcionados por el Laboratorio Central de Salud Pblica de la
ciudad de Resistencia, y por el Instituto de Medicina Regional, tambin de la ciudad de Resistencia.
Es de destacar que, debido al tiempo que demand montar totalmente el Laboratorio de Biologa Molecular
(inexistente hasta el inicio del presente trabajo en el Instituto de Medicina Regional), se pudo comenzar a
recolectar muestras de pacientes chagsicos, slo despus de cumplimentada esta etapa. Es por ello que al
momento de redactar este trabajo solamente se cuentan con 4 muestras (n = 4), y sucesivamente se irn
incorporando un mayor nmero de pacientes.
 UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDESTE
Comunicaciones Cientficas y Tecnolgicas 2000

Se pusieron a punto tres tcnicas diferentes de extraccin de DNA:

a) Mtodo comercial InstaGene Matrix: se utiliz un kit comercial de extraccin de DNA a partir de
sangre entera, diseado para aislar DNA que posteriormente ser utilizado en reacciones de PCR.
En un tubo Eppendorf se agreg una solucin de Lysis Buffer (pH: 7.9) y sangre entera. Luego de varios
lavados y centrifugaciones con este buffer, se descart el sobrenadante y se agreg el InstaGene Matrix
al pellet obtenido. Por ltimo, se realizaron dos incubaciones, una a 70C y otra a 95C. Las muestra
fueron guardadas a 20C hasta la realizacin de la tcnica de PCR.

b) Mtodo Salting Out: En este mtodo se utiliza un buffer que contiene Proteinasa K ( Tris-HCl, pH 8.3,
Tween 20, Nonidet P40, Proteinasa K), la cual destruye las membranas nucleares, liberando a la solucin
los cidos nucleicos. El paso siguiente consiste en la precipitacin de los cidos nucleicos, ya que el
DNA presente en soluciones con alta concentracin de sales acetato de sodio (AcONa) puede precipitarse
mediante la adicin de alcohol etlico a dichas soluciones.

c) Extraccin de DNA de sangre perifrica con Bromuro de Cetiltrimetilamonio (CTAB): El

fundamento es similar al mtodo anterior, pero en este caso no se utiliza el buffer con Proteinasa K y, la
liberacin de los cidos nucleicos se realiza con una solucin de homogeinizacin (CTAB, NaCl, -
mercaptoetanol, EDTA, Tris-HCl pH 7.5).
El CTAB es una sal de amonio cuaternario, uno de cuyos grupos alquilo es de gran magnitud molecular,
y tiene propiedades detergentes; se conocen con el nombre de jabones invertidos, debido a que su
actividad superficial se debe a la presencia de un ion positivo y no a uno negativo, como sucede en los
sulfatos de alquilo e hidrgeno, que son los detergentes usuales.
Luego se realiz la extraccin de los cidos nucleicos con cloroformo:alcohol isoamlico, y la posterior
precipitacin del DNA con etanol absoluto primero, y posteriormente con etanol 70%.

Control de calidad del DNA.

(a) Lectura en Espectrofotmetro UV (8453E Spectroscopy System Agilent Technologies):

Se realiz la lectura espectrofotomtrica de las muestras obtenidas para poder evaluar la pureza del DNA
obtenido.
Se realiz la medida de la Absorbancia a dos longitudes de onda: UV 260 nm. y 280 nm.; debido a que las
bases pricas y pirimdicas absorben a 260 nm., y las protenas a 280 nm.
La concentracin de DNA se calcul de la siguiente manera:

Abs. 260 nm. x factor de dilucin x 50 g/ml. = g/ml. DNA

Haciendo el cociente entre la Absorbancia a 260 nm. y, la Absorbancia a 280 nm., se obtiene un valor que
refleja el estado de pureza del DNA. Si este valor se encuentra entre 1.8 2.0, el DNA obtenido se encuentra
libre de contaminantes celulares. Valores por debajo de 1.8, indican contaminacin con protenas, fracciones
de membranas o fenol.

(b) Preparacin del gel de Agarosa 0.7%, siembra y corrida electrofortica del material obtenido, y
visualizacin en el transiluminador UV:
Se prepar el gel de agarosa, el que sirvi como soporte para realizar la siembra de las muestras de DNA
obtenidas por los diferentes mtodos. Este fue teido con Bromuro de Etidio (BrEt) el cual se intercala entre
las cadenas de DNA y fluorece al ser expuesto a una fuente de luz UV.

DISCUSION DE RESULTADOS

Los resultados obtenidos nos permiten observar que con el mtodo comercial de extraccin de DNA, no se
podrn obtener valores ptimos en las lecturas espectrofotomtricas, ni se podrn observar las bandas
esperadas al realizar la corrida electrofortica en gel de agarosa, ya que es un mtodo diseado para realizar
 UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDESTE
Comunicaciones Cientficas y Tecnolgicas 2000

una amplificacin con los primers especficos; por eso es un mtodo rpido, que demanda poco tiempo, pero a
expensas de obtener una menor cantidad de DNA y con un contenido mayor de impurezas (tanto protenas
como lpidos), ya que no realiza la extraccin con solventes que purifican el DNA. No sucede lo mismo
cuando se trabaja con los mtodos convencionales (Salting Out o CTAB), en donde en un mtodo se utiliza
detergente con Proteinasa K para disgregar las membranas; y en el segundo mtodo, se usa slo un detergente
con propiedades especficas como es el CTAB.
Para poder evaluar la eficiencia en la separacin del DNA obtenido, hay que realizar corridas electroforticas,
las que se llevaron a cabo despus de haber realizado todos los mtodos de extraccin de DNA. Al colocar el
gel en el transiluminador UV, se pudo observar que en el mtodo comercial la banda no pudo ser visualizada,
y s en los otros dos mtodos, ms ntidamente con el mtodo CTAB.

Tabla comparativa de los diferentes mtodos de extraccin de DNA

MTODO g DNA/ml. INDICE Abs 280/260

COMERCIAL 34,4 9,10 0,84 0,450

INSTAGENE MATRIX

SALTING 50,22 7,88 1,532 0,207

OUT

CTAB 178,85 14,03 1,897 0,029

CONCLUSION

Es bien conocido el hecho de que en una reaccin de amplificacin por PCR, es crucial la calidad y cantidad
de la muestra a amplificar. Como la etapa siguiente en este trabajo es justamente realizar la PCR con primers
especficos del Trypanosoma cruzi, se tom muy en cuenta que la muestra de DNA sea lo menos impura
posible. Es por esto, y en base a la seleccin realizada comparando diferentes mtodos de extraccin, que
podemos concluir que, el mtodo de eleccin para la posterior amplificacin es la extraccin del DNA con
CTAB, seguido por el Salting Out y el Kit comercial como mtodos alternativos y en orden de importancia.

BIBLIOGRAFIA CONSULTADA

- Aguirre, MV. Curso de Perfeccionamiento y Actualizacin: Introduccin a la Biologa Molecular. Mdulo

V.1 23.
- Atas A., Negheme A.1987. Parasitologa Clnica. Mediterrneo.38 : 238 251.
- Avila HA., Pereira JB., y cols. 1993. Detection of Trypanosoma cruzi in blood specimens of chronic
chagasic patients by polymerase chain reaction amplification of kinetoplast minicircle DNA: comparison with
serology and xenodiagnosis. J.Clin. Microbiol. 31 : 2421 - 6.
- Breniere S., y cols. 1992. Direct Identification of Trypanosoma cruzi natural clones in vector and
mammalian hosts by polymerase chain reaction amplification. Am. J. Trop. Med. Hyg. 46 (3) : 335 41.
 UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDESTE
Comunicaciones Cientficas y Tecnolgicas 2000

- Britto C., Cardozo M., y cols. 1995. Polymerase chain reaction, detection of Trypanosoma cruzi in blood
samples as a tool for diagnosis and treatment evaluation. Parasitology. 110 : 241 7.
- Carriazo CS., Sembaj A., y cols. 1998. Polymerase chain reaction procedure to detect Trypanosoma cruzi in
blood samples from chronic chagasic patients. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 30 (3) : 183 6.
- Coura JR. 1997. Perspectivas de control de la Enfermedad de Chagas en Amrica Latina. Importancia del
apoyo internacional. Medicina. Vol. 55 (supl. III) : 5 7.
-Diaz C., Nussenzweig V., Gonzalez A. 1992. An improved polymerase chain reaction of Trypanosoma cruzi
in blood. Am. J. Trop. Med. Hyg. 46 (5) : 616 23.
- Finar, IL. 1980. Qumica Orgnica I: Principios Fundamentales. Alhambra, S. A. 443
- Gomes M. 1998. Trypanosoma cruzi: use of an optimized PCR method in chronic Chagas Disease
diagnosis, and molecular characterization of strains isolates from chagasic individuals living in northwest
Paran, Brasil. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. 31 (3) : 327 328.
- Gomes M., Macedo A., y col. 1998. Trypanosoma cruzi: optimization of polymerase chain reaction for
detection in human blood. Exp. Parasitol. 88 (1) : 28 33.
- Jantus Lewintre E. Curso Introduccin a la Biologa Molecular. Obtencin de Acidos Nucleicos. Geles de
Agarosa y Poliacrilamida. Mdulo V. 1 10.
- Ruiz A., Ba J. 1997. Genoma del Trypanosoma cruzi. Medicina. Vol.55 (supl. III) : 2 3.
- Russomando G., Figueredo A., Almirn M., Morita K. 1992. Polymerase chain reaction-based detection of
Trypanosoma cruzi DNA in serum. J. Clin. Microbiol. Vol. 30 (11) : 2864 8.
- Shikanai-Yasuda M., Ochs D., y cols. 1996. Use of the polymerase chain reaction for detecting
Trypanosoma cruzi in triatomine vectors. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg: 90 (6) : 649 51.
- Solari A., Venegas J., y cols. 1991. Detection and classification of Trypanosoma cruzi by DNA
hybridization with nonradioactive probes. J. Protozool. 38 (6) : 559 65.
- Wincker P., Britto C., Borges Pereira J., y cols. 1994. Use of simplified polymerase chain reaction procedure
to detect Trypanosoma cruzi in blood samples from chronic chagasic patients in a rural area. Am. J. Trop.
Med. Hyg. 51 (6) : 771 777.