PENDAHULUAN

Pertumbuhan jasad renik dapat ditentukan secara kuantitatif dengan

metode langsung maupun tidak langsung. Pengukuran pertumbuhan secara
langsung dapat dilakukan dengan cara menghitung jumlah sel menggunakan
Haemocytometer atau dengan mengukur kepekatan (turbiditas) selnya
menggunakan spektrofotometer. Jumlah sel dapat dihitung secara langsung jika
jasad renik ditumbuhkan dalam medium cair. Dalam perhitungan secara langsung
jasad renik yang dihitung adalah jasad renik yang masih hidup maupun yang
sudah mati. Sedangkan, pertumbuhan tidak langsung (indirect count) menghitung
jumlah sel atau mikroorganisme dalam sampel yang dikonsentrasikan dan ditanam
pada media yang sesuai dengan pertumbuhan mikroorganisme. Contohnya,
pembentukan koloni dalam pelat agar, digunakan untuk memperkirakan jumlah
mikroorganisme yang terdapat di dalam sampel. Pertumbuhan secara tidak
langsung dilakukan dengan cara metode penuangan (plating) dan metode
penyebaran pada medium padat. Metode penyebaran adalah teknik dengan
menyebarkan sampel (yang telah diencerkan) di atas permukaan pelat agar dalam
cawan petri. Umumnya antara 0.1 ml dan 1 ml sampel disebarkan di permukaan
media padat dengan menggunakan segitiga penyebar. Cawan kemudian diinkubasi
dan jumlah koloni yan tumbuh dihitung. Metode cawan tuang, yaitu metode
dengan mengencerkan spesimen dalam medium agar yang telah disterilkan dan
dicairkan kemudian didinginkan 50C yang kemudian dituang ke cawan. Karena
kadar sel-sel mikroba di dalam spesimen pada umumnya tidak diketahui
sebelumnya, maka pengenceran perlu dilakukan beberapa tahap sehingga
sekurang- kurangnya satu di antara cawan-cawan tersebut mengandung koloni-
koloni terpisah. Dalam metode penuangan, jumlah sel ditentukan dengan
menghitung jumlah koloni yang tumbuh dalam medium padat sehingga yang
terhitung hanya sel-sel yang masih hidup.

TUJUAN
Tujuan pada praktikum kali ini yaitu, untuk mempelajari cara melakukan
pengenceran serial dan menentukan jumlah bakteri dalam suatu sampel dengan
metode hitungan cawan.

ALAT DAN BAHAN

Alat yang digunakan pada praktikum kali ini yaitu, tiga cawan petri steril,
tiga cawan petri berisi media agar, bunsen, yellow tips, pipet mikro (10-100
mikro), segitiga penyebar, tabung, rak tabung, dan korek api.
Bahan yang digunakan pada praktikum kali ini yaitu, PCA (Plate Count
Agar) cair, Bacillus sp cair, alkohol 70%, alkohol 90%, dan larutan fisiologis
0.85%.
PROSEDUR
Praktikum kali ini yaitu menghitung jumlah mikroba secara tidak langsung
dengan metode cawan sebar dan cawan tuang. Untuk melakukan kedua metode
tersebut, hal yang harus pertama kali dilakukan yaitu dengan pengenceran
Bacillus sp terlebih dahulu. Pertama-tama siapkan semua alat dan bahan di atas
meja praktikum. Untuk menghindari kontaminasi terhadap bakteri, tangan dan
meja praktikum disemprotkan dengan alkohol 70%. Bunsen dinyalakan untuk
mematikan mikroba sekitar yang tidak diinginkan. Buka kotak berisi yellow tips
dan pasangkan dengan pipet mikro. Pemasangan dilakukan dekat dengan api
bunsen. Volume pipet mikro untuk pengambilan Bacillus sp diatur terlebih dahulu
dengan memutar kunci pada pipet mikro dan setel sampai 100 mikro. Tabung
berjumlah lima yang berisi larutan fisiologis 0.85% yang telah disiapkan di rak
tabung diberi label (10-1, 10-2, 10-3, 10-4, dan 10-5). Tabung pengencer pertama
(10-1) di genggam di tangan kiri dan buka tutup tabung dekat dengan api bunsen.
Bacillus sp cair di dalam erlenmeyer di pipet dengan pipet makro sebanyak 9ml
(karena kapasitas pipet makro hanya 1ml, maka Bacillus sp di pipet dengan pipet
mikro sebanyak sembilan kali) dan dimasukkan ke dalam tabung pengencer
pertama. Mulut tabung dibakar setelah pemindahan Bacillus sp agar tidak
terkontaminasi dengan mikroba yang tidak diinginkan. Tabung di kocok secara
homogen dan diletakkan kembali ke rak tabung. Yellow tips pada pipet mikro
dibuang di tempat yang sudah disediakan. Untuk pemindahan selanjutnya, pipet
mikro dipasangkan kembali dengan yellow tips. Setelah itu tabung pengencer
pertama dan kedua di genggam di tangan kiri, dibuka tutup tabungnya dan secara
aseptik 1ml sampel dari tabung pengencer pertama dipipet dan dimasukkan ke
dalam tabung pengencer kedua. Hal tersebut dilakukan sampai tabung pengencer
yang kelima. Pengerjaan pengenceran harus dilakukan dekat dengan api bunsen
dan setiap pemindahan larutan sampel, yellow tips pada pipet mikro harus diganti
dan dibuang di tempat yang sudah disediakan serta setelah pemindahan
pengenceran tabung di kocok secara homogen.
Setelah sampel Bacillus sp sudah diencerkan di kelima tabung, tiga cawan
petri berisi PCA yang sudah menjadi agar disiapkan untuk melakukan metode
cawan sebar. Masing-masing dari ketiga cawan petri di beri label cs10-3, cs10-4,
dan cs10-5. Bunsen dinyalakan dan sebanyak 0.1 ml sampel dari tabung pengencer
ketiga (10-3) dipipet dengan pipet mikro dan dipindahkan ke cawan petri berlabel
cs10-3. Pada saat pemindahan sampel dari tabung ke cawan petri, tutup cawan
hanya dibuka sebagian dan pengerjaan dilakukan dekat dengan api bunsen agar
tidak terjadi kontaminasi. Setelah itu, cawan petri dipanaskan di dekat api bunsen.
Segitiga penyebar yang berada di dalam larutan alkohol 90% dikeluarkan.
Segitiga penyebar di rendam didalam alkohol agar terjaga keaseptikannya.
Segitiga penyebar dibakar diatas api bunsen agar steril dan sampel yang telah
dipindahkan ke cawan petri ketiga disebar dengan segitiga penyebar. Setelah
segitiga penyebar sudah selesai digunakan, bakar kembali segitiga penyebar diatas
api bunsen dan dimasukkan kembali ke dalam larutan alkohol 90%. Hal tersebut
dilakukan serupa untuk cawan petri keempat dan kelima. Setelah ketiga cawan
petri telah terisi sampel Bacillus sp, cawan petri diputar dengan pola angka
delapan agar terbentuk koloni secara merata. Yellow tips pada pipet mikro dibuang
di tempat yang sudah disediakan. Penyebaran dengan segitiga penyebar dilakukan
dengan hati-hati (media agar jangan ditekan). Pastikan bahwa media agar tidak
sobek sehingga Bacillus sp dapat tumbuh membentuk koloni yang merata.
Selanjutnya dilakukan metode cawan. Sebanyak tiga cawan petri steril
disiapkan di atas meja praktikum. Masing-masing dari ketiga cawan petri di beri
label ct10-3, ct10-4, dan ct10-5. Bunsen dinyalakan dan cawan petri ketiga
dipanaskan di dekat api bunsen. Sebanyak 0.1 ml sampel dari tabung pengencer
ketiga (10-3) dipipet dengan pipet mikro dan dipindahkan ke cawan petri berlabel
ct10-3. Pada saat pemindahan sampel dari tabung ke cawan petri, tutup cawan
hanya dibuka sebagian dan pengerjaan dilakukan dekat dengan api bunsen agar
tidak terjadi kontaminasi. PCA cair yang telah diautoklaf dituangkan ke cawan
petri ketiga (+/- 15 ml). PCA yang dituangkan tidak perlu terlalu tebal, tetapi rata
dan menutupi semua bagian dasar cawan petri. Cawan petri digoyangkan secara
perlahan-lahan agar merata. Cawan petri didiamkan sampai media menjadi padat.
Hal tersebut dilakukan serupa untuk cawan petri keempat dan kelima. Pengerjaan
pemindahan sampel dari tabung ke cawan petri steril harus dilakukan dekat
dengan api bunsen dan setiap pemindahan larutan sampel, yellow tips pada pipet
mikro harus diganti dan dibuang di tempat yang sudah disediakan. Setelah ketiga
cawan petri telah terisi sampel Bacillus, ketiga cawan petri diletakkan dalam
posisi terbalik untuk diinkubasi pada suhu kamar selama 24 jam. Setelah 24 jam
jumlah koloni yang tumbuh (30-300) dihitung dan dikalikan dengan faktor
pengencernya.

DATA DAN HASIL PEMBAHASAN

Data

Jumlah Koloni
No Metode Jumlah bakteri (CFU/ml)
10-3 10-4 10-5
Cawan
1 TBUD TBUD TBUD TBUD
Sebar
Cawan
2 56 242 TBUD 8253333
Tuang

Jumlah bakteri pada cawan petri sebar 10-3

= jumlah koloni x faktor pengencer x pengencer
1 1
= 56 x 103 x 0.1

= 560000 CFU/ml
 Jumlah bakteri pada cawan petri sebar 10-4
= jumlah koloni x faktor pengencer x pengencer
1 1
= 242 x 104 x 0.1

= 24200000 CFU/ml

Jumlah baketri rata-rata (10-3, 10-4, dan 10-5)

= (560000 + 24200000) : 3

= 8253333 CFU/ml

Hasil Pembahasan
Praktikum kali ini yaitu menghitung cawan bakteri secara tidak langsung
dengan metode cawan tuang dan cawan sebar. Sebelum melakukan metode hitung
cawan, Bacillus sp harus diencerkan terlebih dahulu. Pengenceran yaitu suatu cara
atau metoda yang diterapkan pada suatu senyawa dengan jalan menambahkan
pelarut yang bersifat netral, lazim dipakai yaitu aquadest dalam jumlah tertentu.
Penambahan pelarut dalam suatu senyawa dan berakibat menurunnya kadar
kepekatan atau tingkat konsentrasi dari senyawa yang dilarutkan/diencerkan.
Pengenceran bertujuan agar konsentrasi dari suspensi menurun sehingga akan
mempermudah untuk melakukan perhitungan Bacillus sp. Pada praktikum kali ini
media yang digunakan adalah media PCA. Media PCA baik untuk pertumbuhan
total mikroba (semua jenis mikroba) karena di dalamnya mengandung komposisi
casein enzymic hydrolisate yang menyediakan asam amino dan substansi nitrogen
komplek lainnya serta ekstrak yeast mensuplai vitamin B kompleks. Metode
cawan sebar menggunakan PCA padat yaitu PCA yang sudah menjadi agar,
sedangkan untuk metode cawan tuang yang digunakan adalah PCA cair yaitu
PCA yang masih dalam bentuk larutan dan bersuhu diatas suhu kamar, karena
apabila dibawah suhu kamar maka PCA sudah membeku menjadi agar.
Kelompok Bacillus merupakan bakteri berbentuk batang (basil), tergolong
dalam bakteri gram positif, umumnya tumbuh pada medium yang mengandung
oksigen (bersifat aerobik) sehingga dikenal pula dengan istilah aerobic
sporeformers. Kebanyakan anggota genus Bacillus dapat membentuk endospora
yang dibentuk secara intraseluler sebagai respon terhadap kondisi lingkungan
yang kurang menguntungkan. Oleh karena itu anggota genus Bacillus memiliki
toleransi yang tinggi terhadap kondisi lingkungan yang berubah-ubah.
Berdasarkan pada tabel data, dapat diketahui bahwa jumlah koloni pada
metode cawan sebar 10-3, 10-4, dan 10-5 semuanya TBUD (Terlalu Banyak Untuk
Dihitung). Sedangkan jumlah koloni pada metode cawan tuang 10-3 berjumlah 56,
pada cawan tuang 10-4 berjumlah 242, dan pada cawan tuang 10-5 TBUD. Jumlah
bakteri rata-rata per ml pada cawan tuang berjumlah 8253333 CFU/ml. Hasil dari
jumlah bakteri yang diperoleh didominasi oleh TBUD baik pada cawan sebar
maupun cawan tuang. Faktor-faktor yang menyebabkan hal tersebut terjadi, pada
saat memasukan Bacillus sp kemungkinan lebih dari 1ml dan ketidak akuratan
pipet mikro yang digunakan, sehingga percobaan yang dilakukan sudah tidak
sesuai sejak proses pengenceran. Kemudian, pada saat metode cawan sebar media
PCA robek karena pada saat penyebaran menggunakan segitiga penyebar terlalu
keras menekannya, sehingga bakteri tidak tumbuh secara merata dan menumpuk
dan pada saat metode cawan tuang, PCA cair yang dituangkan ke dalam cawan
petri tidak merata (tidak menutupi semua bagian permukaan cawan.

KESIMPULAN
Kesimpulan dari praktikum kali ini, bahwa pengenceran harus dilakukan
secara aseptik jangan sampai terkontaminasi sehingga hasilnya akurat dan dalam
melakukan metode cawan sebar jangan sampai media PCA robek sehingga koloni
pada bakteri dapat tumbuh dengan merata.

DAFTAR PUSTAKA
Yuwono, Triwobowo. 2005. Biologi Molekular. Jakarta: Erlangga.
Harmita, Maksum radji. 2008. Buku Ajar Analisis Hayati edisi ketiga.
Jakarta: EGC.
Brady, J.E. 1999. Kimia Universitas Asas dan Struktur. Jakarta: Binarupa
aksara.
Lawley, Richard; Laurie Curtis dan Judy Davis. 2008. The Food Safety
Hazard Guide Book. RSC Publishing.
LAMPIRAN

No Metode Gambar/Foto Keterangan

1 Cawan Sebar 10-3 TBUD (Terlalu Banyak Untuk
Dihitung). Pada hal ini jumlah
koloni yang tumbuh melebihi
300.

2 Cawan Sebar 10-4 TBUD (Terlalu Banyak Untuk

Dihitung). Pada hal ini bakteri
tumbuh menumpuk sehingga
tidak dapat dihitung dengan
akurat.

3 Cawan Sebar 10-5 TBUD (Terlalu Banyak Untuk

Dihitung). Pada cawan ini
media PCA robek sehingga
bakteri yang tumbuh tidak
merata dan tidak dapat dihitung
jumlahnya.

4 Cawan Tuang 10-5 TBUD (Terlalu Banyak Untuk

Dihitung). Pada cawan ini,
media PCA yang dituang tidak
merata (tidak menutupi semua
permukaan cawan) sehingga
bakteri tidak dapat tumbuh
dengan merata.