.

PRCTICA 05

PRUEBAS INMUNOLGICAS

REACCIN ANTGENO ANTICUERPO

I. INTRODUCCIN:
Gran parte de los progresos alcanzados por la biologa moderna se deben al
perfeccionamiento de los mtodos analticos de medida. La introduccin de los
procedimientos basados en las reacciones inmunolgicas ha representado un importante
avance en el anlisis de sustancias de inters
en biologa animal y vegetal difciles de medir
empleando los mtodos bioqumicos
habituales. Dentro de los procedimientos
inmunolgicos, los ms tiles y prcticos son
aquellos que se basan en la especificidad de la
unin Ag-Ac. La propiedad que tienen las Igs
de unirse a un Ag, la especificidad de esta
unin y el hecho de que pueda ser visualizable
por los fenmenos de precipitacin,
aglutinacin y otros mecanismos indirectos
(marcaje con fluorescena, con radioistopos o
con enzimas) hacen que estos mtodos se
empleen ampliamente. Existen diversos mtodos basados en procedimientos distintos
para visualizar la unin Ag-Ac. As tenemos:
1. Tcnicas de aglutinacin. Cuando el antgenos e encuentra unido o formando parte
de clulas, bacterias o partculas, la reaccin Ag-Ac se puede detectar y cuantificar por
el aglutinado celular o bacteriano formado.
2. Tcnicas de fluorescencia y citometra de flujo. Para la realizacin de estas tcnicas
el anticuerpo se marca con un fluorocromo detectndose la formacin del complejo Ag-
Ac por la fluorescencia emitida.
3. Tcnicas de radioinmunoensayo. En estas tcnicas al anticuerpo se une un istopo
radiactivo siendo posible la cuantificacin del complejo Ag-Ac a travs de la
radiactividad emitida.
4. Cromatografa de afinidad. La especificidad de la unin Ag-Ac puede utilizarse para
obtener Acs y Ags puros.
5. Inmunoprecipitacin e inmunoblotting. Permite detectar la presencia y cantidad de
antgenos y anticuerpos especficos.
TCNICAS DE PRECIPITACIN
Para la realizacin de estas tcnicas se requiere que tanto el Ac como el Ag se
encuentren en un medio fluido en el que sea posible la precipitacin del complejo Ag-
Ac. Existen diferentes modalidades siendo las principales:
1. Tcnica de precipitacin propiamente dicha.
2. Tcnica de difusin radial de Ouchterlony.
3. Tcnica de inmunoelectroforesis.
4. Tcnica de difusin radial simple de Mancini.

TCNICAS DE AGLUTINACIN:
En estas tcnicas se hacen visibles los complejos Ag-Ac por la aglutinacin que
producen los anticuerpos cuando el Ag forma parte o se ha unido artificialmente a la
superficie de glbulos rojos, plaquetas, leucocitos, partculas de ltex, etc. Normalmente
se utilizan glbulos rojos (hemaglutinacin) o partculas de ltex.
TCNICAS DE INMUNOFLUORESCENCIA:
La fluorescencia es una propiedad de ciertas molculas que, al ser irradiadas con
energa electromagntica de longitud de onda adecuada, emiten radiacin de longitud de
onda caracterstica permitiendo su cuantificacin. Las molculas de un colorante
fluorescente absorben luz en una longitud de onda y convierten la luz absorbida de alta
energa (longitud de onda ms corta) en luz de menor energa (longitud de onda ms
larga). Cada fluorocromo tiene un espectro de emisin y excitacin caractersticos; si se
utilizan dos con el mismo espectro de excitacin pero distinto espectro de emisin, se
pueden medir dos caractersticas al mismo tiempo (fluorescencia de dos colores) La
inmunofluorescencia se utiliza esencialmente en la deteccin de autoanticuerpos y
anticuerpos contra antgenos de superficie de clulas y tejidos. Para ello se emplean
anticuerpos preparados frente a la protena que se desea detectar marcados con
molculas fluorescentes. Se aprecia si hubo unin del anticuerpo con el antgeno por la
fluorescencia emitida, que se observa bajo microscopio de luz ultravioleta. Este
procedimiento (Inmunofluorescencia directa) tiene la limitacin del marcaje con un
fluorocromo de cada uno de los anticuerpos necesarios para cada una de las sustancias a
investigar. Para evitar esto, lo que se hace es tratar el tejido o clulas con antisueros
anti-antgeno producidos, por ejemplo, en conejo y secundariamente anti-
inmunoglobulinas marcadas con un fluorocromo (Inmunofluorescencia indirecta).
Objetivos:

Conocer el fundamento terico y prctico de los principales mtodos inmunolgicos

basados en la reaccin antgeno anticuerpo; ejecutando algunas pruebas de uso
comercial.
II. MATERIAL Y MTODOS:
II.1. MATERIALES:
Material biolgico:

Suero sanguneo (proporcionado por un alumno)

Materiales:

Algodn hidroflico (06 torundas)

Aguja 21 G1l (02 unidades)

Gradillas para tubos de ensayo (02 unidades)

Laminas serolgicas de fondo oscuro (02 unidades)

Liga de goma para toma de muestra de sangre (02 unidades)

Pipeta pasteur o gotero (02 unidades)

Portapipetas (02 unidades)

Puntas para micropipeta (04 unidades).

Tubo de ensayo de vidrio de 10 x 75 mm (02 unidades)

Tubo de ensayo de vidrio de 13 x 100 mm (02 unidades)

Varillas o palillos mezcladores (10 unidades)

Reactivos y/o soluciones de
laboratorio:

Agua destilada (100 mL.)

Alcohol yodado o alcohol de 70 (20

mL.)
Pruebas inmunolgicas:

Kit de prueba de aglutinacin en

placa para el diagnstico de
Salmonelosis:
Antgenos de Salmonella typhi H y O
Placa de vidrio (20 x 20 cm) dividida con lpiz de cera y regla en cuadrados
(2,5 1,27 cm) de preferencia, 5 hileras de 6 cuadrados.
Un aplicador o un palito de dientes (agitador)
 Test de Ltex directo para la deteccin del antgeno de superficie de la hepatitis B
(HbsAg):
Reactivo de ltex 1 x 2,5 mL (las partculas de ltex estn sensibilizadas con gamma-
globulinas de conejo)
Control positivo 1 x 0,5 mL. Prediluido
Control negativo 1 x 0,5 mL. Prediluido
Lmina o placa serolgica (placa de reaccin)
Agitadores desechables.

Test de aglutinacin en Ltex en placa para la determinacin cualitativa de la

hormona Gonadotropina Corinica Humana HCG en orina MONO ACU -
SLIDETM:
Reactivo de ltex: HCG-Bound latex reagent mono acu-slide test x 5 mL
Anticuerpos monoclonales: Monoclonal antibody reagent mono acu-slide test x 5 mL
Control positivo 1,0 mL
Control negativo 1,0 mL
Lmina o placa serolgica de fondo oscuro.
Agitadores desechables.
Instrumentos y/o equipos de laboratorio:

Micropipeta (02 unidades).

II.2. PROCEDIMIENTO:
MTODOS SEROLGICOS EN EL DIAGNSTICO DE SALMONELOSIS:
Principios generales:

La serologa del gnero Salmonella constituye el complemento

necesario para el diagnstico de la fiebre tifoidea.

El gnero Salmonella tiene principalmente dos clases de

antgenos: el antgeno O (o antgeno somtico termoestable) y el
antgeno H (o antgeno flagelar termolbil.

A partir de la segunda semana, el paciente que sufre de fiebre

tifoidea, contiene anticuerpos en la sangre, que pueden ser
identificados probando el suero del paciente contra antgenos de
salmonelas, los cuales pueden ser demostrados por la reaccin de
Widal.
RESULTADOS:

CONCLUSIONES:
No se logr fundamento prctico de los principales mtodos inmunolgicos basados en
la reaccin antgeno anticuerpo; es decir reconocer la Salmonella que constituye el
complemento necesario para el diagnstico de la fiebre tifoidea ejecutando algunas
pruebas de uso comercial ya que los reactivos estaban vencidos.
Ya que si esta reaccin antgeno-anticuerpo se hubiese podido observar la
neutralizacin del efecto txico de una toxina bacteriana o a la inhibicin de la
multiplicacin de un virus, tambin se hubiese podido observar directamente como la
formacin de un precipitado o la aglutinacin celular, a la vez puede presentar
reacciones biolgicas subsiguientes a las anteriores (lisis bacteriana)