INTRODUCCIN

Una sonda es un reactivo biolgico constituido por un fragmento de ADN que

posee una secuencia de bases complementaria a la del genoma de un
microorganismo. Las sondas gnicas son molculas de ADN sealadas con un
marcador que tienen el poder de reconocer genes en los cromosomas y
establecer si dichos genes son normales o portadores de alteraciones.
Las ventajas de las tcnicas moleculares han sido ampliamente publicitadas en
los ltimos 7 aos, lo que sin duda ha aumentado la presin en los laboratorios
clnicos para comenzar a usarlas en una amplia variedad de enfermedades
infecciosas, genticas, oncolgicas y neurolgicas.

Usando las nuevas tcnicas de la ingeniera gentica, es posible localizar y

analizar un gen entre miles, utilizando el PCR o construyendo y usando sondas
genticas. Estos hechos han convertido a las tcnicas de gentica molecular y
biotecnologa en herramientas fundamentales para la deteccin y tratamiento
de estas enfermedades no slo en la especie humana, sino en el mundo de la
veterinaria.

Hasta hace algunos aos, slo se poda saber que un individuo haba heredado
tal o cul enfermedad gentica, cuando los sntomas se hacan evidentes y
slo poda darse una estimacin de la probabilidad de que sus hijos heredaran
un desorden en particular. Usando las nuevas tcnicas de la ingeniera
gentica, es posible localizar y analizar un gen entre miles, utilizando la
Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR, del ingls Polimerase Chain
Reaction) o construyendo y usando sondas genticas.

Las sondas pueden ser usadas para detectar microorganismo directamente de

una muestra clnica (secreciones bronquiales, orina, etctera) o para confirmar
la identificacin de un cultivo que por otros mtodos tarda varios das
(Legionella pneumophila, Chlamydia trachomatis, etctera). Adems, las
sondas pueden ser usadas para hibridacin in situ para evaluar la respuesta
del husped a un agente infeccioso en particular y tambin para determinar la
extensin de la infeccin mediante el estudio de muestras de tejidos de varios
rganos. Muchos de ellos han sido desarrollados por varios fabricantes y slo
se diferencian en la secuencia a la cual est dirigida la sonda.

El diagnstico mediante el empleo de sondas gnicas puede utilizarse tambin

despus del nacimiento, por ejemplo, para precisar la naturaleza y amplitud de
una alteracin gentica; o para el caso de parejas procedentes de familias "de
riesgo" en particular para las mujeres que deseen saber si son "portadoras " de
un determinado precursor de enfermedad.

OBJETIVOS
 Determinar el concepto de sondas gnicas, sus tipos e importancia.

SONDAS GNICAS COMERCIALES

Muchos mtodos de anlisis de ADN implican el uso de sondas de cidos
nucleicos y el proceso de hibridacin

Sonda
Una sonda gentica consiste en un fragmento de ADN complementario a la
secuencia que se busca y a la que se unir de manera especfica. La unin al
ADN, puede detectarse marcando la sonda con "etiquetas qumicas"

El uso de PCR y de sondas moleculares que reconozcan secuencias de ADN

asociadas a enfermedades genticas, permite detectar al gen involucrado, en
cantidades nfimas material gentico obtenido de tejido de adultos o de
embriones de humanos y animales.

Una sola sonda puede reconocer su homlogo nico entre millones. La sonda
precisa en un mnimo de 20 nucletidos.

Tcnicas de la biologa molecular resultan ser importantes herramientas:

identificacin de individuos y sus productos

deteccin y diagnostico de enfermedades tanto genticas como
infecciosa
seleccin de individuos portadores de un genotipo especifico como
progenitores en programas de mejoramiento gentico

La informacin gentica de un organismo dado est contenida en el ADN (cido

desoxirribonucleico) que se ubica en el ncleo de cada clula de este
organismo.
Por su parte, un nucletido est formado por una azcar, un grupo fosfato y
una de cuatro diferentes bases nitrogenadas. Estas bases son representadas
de manera simple utilizando la inicial en mayscula de su nombre, de modo
que:
A: Adenina
T: Timina
G: Guanina
C: Citosina.

Aunque todos los organismos de una misma especie tienen caractersticas

comunes, los genes que codifican para esas caractersticas y la naturaleza
misma de la caracterstica no son idnticas en todos los individuos, pues en
millones de aos de evolucin se han ido produciendo pequeos cambios en
los genes que codifican para caractersticas individuales, los que han sido
heredados a las generaciones siguientes.

Sondas de cidos nucleicos

Las sondas de cidos nucleicos son secuencias de ADN o de ARN que se han
marcado, radiactivamente o no, y que se pueden utilizar para detectar
fragmentos de ADN o de ARN con homologa de secuencia. Las sondas de
cidos nucleicos son generalmente sondas de ADN. Pueden proceder de
mltiples fuentes incluyendo secuencias de ADN genmico aleatorias,
secuencia de ADNc, genes especficos y secuencias de oligonucletidos
obtenidos mediante sntesis basada en la secuencia de protenas. Una sonda
de ADN puede marcarse de diferentes maneras, ya sea mediante nucletidos
marcados con 32P o sistemas no radiactivos de marcado, como los nucletidos
biotinilados que se introducen en las molculas de ADN. Los sitios donde las
sondas de ADN marcadas radiactivamente hibridan con las secuencias de ADN
complementarios sobre un filtro de celulosa se pueden localizar mediante
autorradiografas mientras que el marcador con biotina se puede detectar por
su elevada afinidad a la estreptavidina.

Hibridacin de los cidos nucleicos

La hibridacin con los cidos nucleicos implica la mezcla de ADN de diferentes
orgenes que han sido desnaturalizados por calor o tratamiento con lcalis para
separarlos en hebras nicas y permitir el emparejamiento de las bases
complementarias de las secuencias homlogas en las condiciones adecuadas.
Si una de las fuentes de ADN se ha marcado de alguna manera, es decir, si se
trata de una sonda de ADN, pueden identificarse secuencias especficas. Los
dos mtodos principales de hibridacin de los cidos nucleicos son el Southern
blot y el Nothern blot.

Hibridacin por sondas

Las sondas son segmentos de ADN o ARN que han sido marcados con
enzimas, sustratos antignicos, quimioluminiscencia o radioispotos, los que se
pueden unir con una alta especificidad a una secuencia complementaria de
cido nucleico.

Existen varias condiciones que afectan el proceso de unin o hibridacin entre

la sonda y el segmento blanco, como:
Temperatura
concentracin de sal
pH de la reaccin.

Indicaciones para el uso de sondas en el laboratorio

Las sondas pueden ser usadas para detectar microorganismo directamente de
una muestra clnica (expectoracin, orina, etctera) o para confirmar la
identificacin de un cultivo que por otros mtodos tarda varios das (Legionella
pneumophila, Chlamydia trachomatis, etc).

Adems, las sondas pueden ser usadas para hibridacin in situ para evaluar la
respuesta del husped a un agente infecciosos en particular y tambin para
determinar la extensin de la infeccin mediante el estudio de muestras de
tejidos de varios rganos.
TECNOLOGAS GENTICAS
Los cientficos han desarrollado una serie de tcnicas bioqumicas y genticas
mediante las cuales el ADN puede ser separado y transferido de una clula a
otra. Algunos de esos mtodos de laboratorio ayudan a los investigadores a
estudiar las propiedades de los genes en la naturaleza (permiten, por ejemplo,
comparar los ADN de diferentes animales para establecer distancias
evolutivas).

Otras tcnicas de ADN constituyen herramientas bsicas en el campo de la

ingeniera gentica (alteracin de genes de un organismo).

Para localizar un gen especfico en un cromosoma determinado se

utiliza una sonda de ADN, que es un gen clonado o copiado al que se
agrega un tomo radiactivo. La sonda marcada selecciona un segmento
de ADN complementario y se une a dicho segmento; la sonda en
cuestin se puede detectar entonces mediante sofisticadas tcnicas de
fotografa. Con este procedimiento se diagnostica un buen nmero de
enfermedades antes del nacimiento o despus del mismo.

Southern blot
El Southern blot, denominado as en honor de Ed Southern, que desarroll la
tcnica, consiste en la digestin del ADN mediante una enzima de restriccin y
que a continuacin se somete a electrofororesis en un gel de agarosa. Con ello
se consigue separar los fragmentos de restriccin del ADN por tamaos, siendo
los fragmentos ms pequeos los que corren ms rpido en el gel. Los
fragmentos de ADN del gel se desnaturalizan a continuacin con lcalis,
convirtindose en fragmentos de hebra simple. Una copia permanentemente
de estos fragmentos se transfieren a un filtro de nitrocelulosa que se une al
ADN monocatenario marcado radiactivamente con 32P que hibridar con el
fragmento de ADN homlogo del Southern blot, el cual a su vez puede ser
detectado mediante autorradiografa.

Secante de Southern.
Para encontrar una mutacin de un gen determinado en una muestra de ADN
los cientficos usan una sonda de ADN, un tramo de ADN de un solo filamento
que coincide con parte del gen y se une a un tomo radioactivo.

La sonda de un solo filamento busca y se une al gen. Las seales radioactivas

de la sonda aparecen despus en la radiografa, mostrando dnde se
emparejan la sonda y el gen.

Northern blot
El Northern blot difiere del Southern blot en que utiliza ARN mensajero como
cido nucleico diana en el mismo procedimiento. El ARNm es muy inestable
debido a las ribonucleasas celulares intrnsecas. El uso de inhibidores de
ribonucleasas permite el aislamiento del ARN mensajero que, si se corre en un
gel electrofortico, se puede transferir a un filtro. Hibridando el blot con una
sonda de ADN marcada radiactivamente se puede determinar el tamao y la
cantidad del transcrito de mensajero, denominndose a esta tcnica Northern
blot. En una alteracin gnica en la que no se han identificado mutaciones en la
secuencia codificante, una alteracin en el tamao del transcrito sugiera la
posibilidad de una mutacin en una regin no codificante del gen, como la zona
de unin intrn-exn. El Northern blot puede utilizarse tambin para demostrar
un modelo de expresin diferente de un determinado gen en diferentes tejidos
o en diferentes estadios del desarrollo.

Hibridizacin con sondas

Los recientes avances en el campo de la biologa molecular y el conocimiento
cada vez mayor de los virus que causan infecciones importantes en la
comunidad, han hecho posible que en el momento se disponga de fragmentos
de ADN del material genmico especfico y altamente conservado de un
determinado virus que se utiliza como sonda.

Para estudios de ARN se requieren tejidos frescos congelados

rpidamente con nitrgeno lquido y para estudios de ADN se pueden
emplear tanto tejidos fijados como congelados.

Las sondas preparadas a partir del ADN o ARN especfico se pueden

purificar por clonacin o copia en un plsmido del ADN o del ADNc
(complementario) obtenido de transcripciones de ARN. Utilizando el
plsmido como vector y bacterias como huspedes, es posible producir
sondas genticas en grandes cantidades.
 Los fragmentos de ADN o ARN (sondas) se someten a un anlisis de
hibridizacin (o apareamiento con el complementario que se encuentra
en el material que se va a probar); ste se puede hacer ya sea con ADN
o ARN tisular en solucin, directamente en tejidos o clulas por
hibridizacin in situ, o se puede efectuar sobre ADN o ARN transferidos
en membranas de nitrocelulosa a partir de una electroforesis en gel de
agarosa.

La sensibilidad de las sondas depende de la cantidad de material gentico para

la hibridizacin y su especificidad depende de la calidad de la sonda.

Una de las principales limitaciones de esta tcnica se ve cuando existe una

baja cantidad de ADN o ARN y ste no se descubre. Muchas de estas pruebas
tienen una sensibilidad que les permite descubrir 105-106 molculas o aun
103-104 molculas; sin embargo, esto puede ser insuficiente en muchas
situaciones clnicas.

Sondas gnicas comerciales

La caracterizacin de genes que codifican caracteres cuantitativos con

importancia econmica o de genes causantes de enfermedades
congnitas ha llegado a tener mucha importancia.

Por su parte las enfermedades genticas, aunque menos diseminadas,

producen un resultado similar, afectando poblaciones humanas y
animales.

Caractersticas

Consiste en un fragmento de ADN complementario a la secuencia que

se busca y a la que se unir de manera especfica.

Estas etiquetas pueden ser molculas marcadas con radiactividad o

molculas portadoras de tomos fluorescentes que pueden ser
detectadas por autorradiografa la primera o con detectores de
fluorescencia las segundas

El diagnstico implica un entendimiento de la causa y, si es posible, un

conocimiento de los factores contribuyentes significativos que influyan
en la aparicin de la enfermedad.

La identificacin de los agentes causales o etiolgicos de la enfermedad

es hecha mediante la aplicacin de mtodos cientficos de investigacin.

DEMOSTRACIN DEL AGENTE

Pueden ser:

Altamente sensitivos.
 Adicionalmente utilizados para una demostracin definitiva de que un
organismo pertenece a una especie particular

Se pueden dar a travs de

Antgenos: son sustancias moleculares complejas y los anticuerpos

especficos
Formados para ellos, reconocen figuras particulares conocidas como
determinadores de antgenos o eptopos.

Eptopos: son cada uno de los sitios discretos de una macromolcula

que son reconocidos individualmente por un anticuerpo especfico o por
un TCR especfico.
Anticuerpos: La R.C. son ms comunes para los anticuerpos policlonales que
para los anticuerpos monoclonales

PRUEBAS DE DETECCIN USANDO ANTICUERPOS

Inmunofluorescencia y Elisa, se usa para la deteccin de antgenos

virales en la preparacin de diagnsticos.
El anticuerpo fluorescente es usado para detectar antgenos en los
tejidos.
ELISA, es usado para detectar antgenos en fluidos o extractos crudos
de tejidos.
Todos los organismos vivientes poseen ADN excepto los virus q poseen
ARN.
S.G. es un pequeo segmento de bases de ADN, el cual se combinar
con un filamento homologo de ADN.
La S.G. puede ser altamente sensible y muy especifica.
El microorganismo de ADN puede ser detectado en las secciones de
tejido fijadas con un proceso llamado hibridizacion in situ.

SONDAS DE ADN Y ARN

Para identificar cada fragmento no es necesario determinar la secuencia

total de sus bases los mtodos mas usados para identificar un ADN o un
ARN.
Las sondas de ADN son muy tiles para fines diagnsticos.
Fragmento de cadena simple de ADN o ARN de varios cientos o miles
de nucletidos de longitud, que permite poner de manifiesto la presencia
de una secuencia complementaria en una muestra biolgica.
La Hibridacin del ADN por una sonda de ADN se llama tcnica de
Southern Blot. Las sondas gnicas permiten encontrar un determinado
trozo de ADN de unas pocas bases pares en una cadena de 6 x 109
bases pares. y ello lo consigue gracias al marcaje con P32.
Cuando el uso de una sonda gnica, marcada con un producto
fluorescente, se hace sobre una clula, a la tcnica se la denomina
"fluorescence in situ hybridization" (FISH).
El ARN mensajero, procedente del ADN, puede volver a reconstituirse en
ADN mediante la enzima transcriptasa inversa, y ser clonado en una
bacteria. Este ADN no tiene intrones, es decir, equivale a los axones del
 ADN de la clula. Se le denomina ADN complementario (ADNc), siendo
utilizado para actuar como sonda gnica.

MARCADORES MOLECULARES

Estas tcnicas utilizan los fundamentos de la tcnica de PCR y las ms

usadas incluyen polimorfismos en el largo de fragmentos de restriccin
(RFLP), nmero variable de secuencias nucleotdicas repetidas en
tandem (VNTR), polimorfismos conformacionales de hebra simple
(SSCP), electroforesis en gel denaturante en gradiente (DGGE),
amplificacin al azar de ADN polimrfico (RAPD) y por ltimo, los
mtodos que usan el polimorfismo de secuencias nucleotdicas cortas
repetidas en tandem como son los microsatlites

Esta identificacin permite:

Seleccionar los progenitores en un programa de mejoramiento gentico

Identificar el gen (o grupos de ellos) que codifican para la caracterstica
a seleccionar, pero cuyo genotipo es difcil de visualizar a simple vista.
Determinar a qu variedad gentica pertenece un individuo, estimar su
pool gentico y determinar su origen.

Electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante

Hibridacin in situ fluorescente (FISH)

FISH (del ingles fluorescent in situ hybridization) es una herramienta

tecnolgica relativamente nueva que combina la citogentica convencional con
la gentica molecular que se basa en la capacidad nica de una hebra sencilla
de ADN, por ejemplo, una sonda para unirse o hibridar con su secuencia
complementaria donde quiera que sta est localizada en la extensin
metafasica aunque con menos frecuencia que otros mtodos usados para el
anlisis cromosmico, FISH puede tambin usarse para estudiar cromosomas
durante la interfase, periodo de descanso entre las divisiones celulares de aqu
que este rea de estudio se denomine interface citogentica.
En esta tcnica la sonda de ADN se conjuga con nucletidos modificados, los
cuales, despus de hibridar con la muestra problema, permiten que la regin en
la cual ha ocurrido la hibridacin se pueda visualizar con luz ultravioleta. Esta
tcnica FISH tiene ahora una amplia difusin para diagnsticos clnicos, ya que
sus resultados se obtienen rpidamente.

Diferentes tipos de sondas FISH

Sondas centromricas
Consisten en secuencias repetitivas de ADN a nivel centromrico en un
cromosoma especfico. Se utilizan en diagnostico prenatal para una deteccin
rpida de aneuploidas (trisomia 13, 18, 21) usando clulas en interfase
obtenidas de las vellosidades corinicas.
Sondas unilocus

Son especficas para un locus particular. Se utilizan con xito en la

identificacin de minsculas deleciones y duplicaciones submicroscpicas. En
grupo de trastornos conocidos como sndromes por microdeleciones

Pintar cromosomas
Consiste en la mezcla de sondas de diferentes partes de un cromosoma en
particular. Cuando esta mezcla de sondas se usa en una hibridacin, el
cromosoma entero floorece, por lo que decimos que esta pintado. Pintar
cromosomas es muy til para caracterizar reordenamientos complejos, tales
como translocaciones sutiles y para identificar el origen de material adicional de
un cromosoma, como pequeos marcadores de supernumerarios o anillos.

Pintar a la inversa
En este procedimiento una porcin de material cromosmico no identificado,
pequeos marcadores supernumerarios o anillos, se usa para pintar por
hibridacin una metafase normal. El cromosoma no identificado se obtiene por
separacin de clulas activadas por fluorescencia, el cual es amplificado
utilizando la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) para preparar dicha
pintura. El origen del segmento no identificado se obtiene mediante la
identificacin del cromosoma sobre el cual se hibrida.
Deteccin a nivel de reacciones inmunolgicas
Hay numerosos marcadores en los antgenos de los eritrocitos

SONDEOS GNICOS EN MBITOS CLNICOS

Caractersticas:

El PGH nos acerca a un nuevo tipo de prctica clnica, la que se ha dado

en llamar Medicina Genmica y Predictiva.
Determinacin de anomalas genticas.
Revolucin Del diagnstico y el pronstico

Posibilidades de diagnstico gentico

Sondeo prenatal
Amniocentsis
Extraccin de vellosidades corinicas (transcervical o transabdominal).
Extraccin y purificacin de sangre perifrica materna muestras de
clulas fetales.
Sondeo neonatal: Fenilcetonuria, Hipotiroidismo congnito,
Galactosemia, Anemia falciforme, Tay-Sachs.

ESTUDIOS EN EL LABORATORIO

Antes: pruebas se reducan al cariotipo.

Herramientas de la Ingeniera Gentica y con la informacin del PGH.
Objetivo: informacin a las parejas sobre la situacin del feto, actual o
 futura. Obviamente, el horizonte es el del recurso al aborto en el caso de
"malformacin" o posibilidad de enfermedad grave futura.

PRUEBAS GENTICAS PREDICTIVAS

Si la enfermedad en cuestin es incurable e inhabilitante, esa

informacin puede ser ms peligrosa que el mismo factor gentico de
riesgo.
Psicolgicamente devastadora para el individuo.
Actualmente existen tests predicativos para enfermedades monognicas
de manifestacin tarda como la corea de Huntington, Alzheimer
hereditario, poliquistosis renal, hemocromatosis y cncer hereditario de
ovario.
Pruebas de susceptibilidad a enfermedades multifactoriales.
 CONCLUSIONES

Las sondas gnicas son molculas de ADN sealadas con un marcador

que tienen el poder de reconocer genes en los cromosomas y establecer
si dichos genes son normales o portadores de alteraciones. Tienen una
gran importancia para el diagnstico temprano y la prediccin de la
aparicin de diferentes enfermedades gnicas.

BIBLIOGRAFA
 ROBERT F MUELLER. LAN D YOUNG. Gentica Mdica. 10ma. Edicin
Emerys. Madrid Espaa.2001

JORDE L, CAREY J, BAMSHAD M, WHITE R. Gentica del Desarrollo.

En: Gentica Mdica. 2 Edicion. Harcourt, Madrid, 2000.