TEMAS:

Preparacin de medio de cultivo, aislamiento de rganos de la planta

enferma (raz, hoja) en medio de cultivo, cmara hmeda, inoculacin del
hongo en cultivo puro, montaje de hongos y prueba patogenicidad de las
semillas

CURSO : FITOPATOLOGIA AGRICOLA.

DOCENTE : Ing. LUISA MADOLYN ALVAREZ BENAUTE.
ALUMNO : EVANGELISTA VARGAS, Yonson
CICLO : VIII
FECHA DE ENTREGA: 27/10/2017

MONZON PER
2017
 I. INTRODUCCION

El medio de cultivo constituye el aporte de nutrientes indispensables para el

crecimiento de los microorganismos. La composicin precisa depender de la
especie que se quiera cultivar, porque las necesidades nutricionales varan
considerablemente. Hay microorganismos muy poco exigentes que crecen bien
en medios de laboratorio normales y microorganismos muy exigentes que
necesitan determinadas sustancias como vitaminas, suero o sangre para
crecer. Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de
crecimiento. El aislamiento de microorganismos nos permite saber en qu
condiciones puede crecer y reproducirse con mayor rapidez En todos los
ambientes naturales habitan mltiples microorganismos de diversos tipos y
actividad fisiolgica. Un dispositivo para cultivo en cmara hmeda es un
sistema que consta de una placa Petri conteniendo un disco de papel filtro y una
varilla de vidrio de U que soporta dos laminas porta y cubre objetos.
Aspticamente se selecciona una pequea porcin de medio de cultivo estril
(Agar Saboraud), y se coloca sobre la lmina porta objetos. Realizada la
siembra del hongo en estudio, la preparacin se cubre con la otra lamina y el
papel filtro humedece conservando la asepsia. La placa es incubada a
temperatura ambiente (20 25 C) por 4 a 5das. Por su tamao microscpico,
los hongos generalmente no pueden observarse a simple vista, a excepcin de
hongos macroscpico que por su propio tamao pueden ser observados
superficialmente sin aparatos, siempre y cuando no se requiera estudiar detalles
de las esporas, etc. Para su observacin al microscopio compuesto, los hongos
requieren ser preparados y montados en portaobjetos. En estudios preliminares
o de rutina se hacen preparaciones temporales desechables, pero si se desea
preservar especmenes por largo tiempo es necesario elaborar montajes
permanentes, los que de hacerse correctamente duran uno o varios aos en
buenas condiciones.

Objetivos
Realizar la preparacin de medio de cultivo PDA
Realizar el aislamiento de microorganismos de en el medio de cultivo y
condiciones de incubacin empleadas para el aislamiento de
microorganismos.
Preparar la cmara hmeda para el cultivo de hongos en tejidos
vegetales infectados por hongos.
Realizar la prueba de patogenicidad en semillas de maz y frijol en
laboratorio.
 II. REVISIN BIBLIOGRFICA
PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO
Existen medios cuya composicin permite el crecimiento de:
Un gran nmero de especies (agar nutritivo, caldo ordinario, agar de
Sabouraud).
Determinados microorganismos (impidiendo el desarrollo de otros), son
los denominados medios selectivos.
Otros en cambio, se desarrollan para el estudio de determinadas pruebas
fisiolgicas o test bioqumicos (utilizacin de citratos, acidificacin a partir
de azcares, etc.).

CONSTITUYENTES HABITUALES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
A continuacin, se da una idea general sobre algunos de los constituyentes
habituales de los medios de cultivo.
AGAR. Se utiliza como agente gelificante para dar solidez a los medios de
cultivo. En el agar bacteriolgico el componente dominante es un polisacrido
que se obtiene de ciertas algas marinas y que presenta la indudable ventaja de
que, a excepcin de algunos microorganismos marinos, no es utilizado como
nutriente. Un gel de agar al 1-2% se licua alrededor de los 100C y se gelifica
alrededor de los 40C, dependiendo de su grado de pureza.
EXTRACTOS. Su preparacin consiste en que ciertos rganos o tejidos
animales o vegetales (p.e. carne, hgado, cerebro, semillas, etc.) son extrados
con agua y calor y posteriormente concentrados hasta la forma final de pasta o
polvo. Estos preparados deshidratados son a menudo empleados en la
elaboracin de los medios de cultivo. Los ms utilizados son el extracto de
carne, de levadura y el de malta.
PEPTONAS. Son mezclas complejas de compuestos orgnicos, nitrogenados
y sales minerales, que se obtienen por digestin enzimtica o qumica de
protenas animales o vegetales (soja casena carne, etc.). Las peptonas son
muy ricas en ppticos y aminocidos, pero pueden ser deficientes en
determinadas vitaminas y sales minerales.
PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO
Preparacin de una cantidad suficiente de un determinado medio de cultivo,
para ser utilizado, en su momento, por todos los alumnos del grupo de prcticas.
Las instrucciones a seguir dependern del nmero de mesa y el medio de cultivo
asignado, pero en todos los casos, los pasos son los siguientes:
2. Esterilizar la disolucin.- Una vez disuelto el medio se debe esterilizar para
evitar el crecimiento de contaminantes. Dependiendo de la forma en que vaya
a utilizarse el medio, el procedimiento ser diferente:
a) Medios slidos en placa.- Tapar el matraz con tapn de algodn y cubrir
con papel de aluminio. Llevar a esterilizar al autoclave (1210C) durante 15-20
minutos. Una vez estril repartir en placas de Petri estriles y dejar en reposo
para que solidifique.
b) Medios lquidos.- Una vez disueltos los componentes repartir en tubos a
razn de unos 2-4 ml por tubo, tapar con tapn de aluminio y llevar a esterilizar
en autoclave.

AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS

Cuando lo que se busca es aislar hongos filamentosos, el pH de los medios

comerciales (5,4) se puede reducir adicionando cido tartrico al 10% (1 mL
por cada 100 mL de medio de cultivo ya estril y a 50 C). Los medios no deben
calentarse luego de esta acidificacin pues provocara la hidrlisis del agar y
por lo tanto la prdida de su capacidad para gelificar.

Si se desea favorecer el aislamiento de levaduras se debe alcanzar el pH ptimo

mediante adicin de cido clorhdrico o cido fosfrico, no con cidos orgnicos
pues muchos inhiben el crecimiento de las levaduras. Se procede de igual forma
a como se explic para los hongos filamentosos.

En tubos de ensayo o en placas Petri

Las placas de medio de cultivo con hongos, a diferencia de aquellas donde se

siembran bacterias, no se invierten (salvo en contadas excepciones).
Tras el tiempo de incubacin las placas se observan y se analizan los hongos y
levaduras que han crecido en las mismas para luego tomar muestras aisladas
de una sola colonia que pueden resembrarse en nuevas placas con medio de
cultivo.
Tras incubar las placas con las diluciones de hongos y habiendo contado el
nmero de colonias en estas se puede proceder a establecer cultivos puros
como se seal ya resembrndolas en nuevas placas con medios de cultivo. Un
cultivo puro de levaduras se obtiene dispersando el material tomado de la
colonia a estudiar, mediante estras sucesivas sobre la placa de medio.
En cambio, un cultivo puro de hongos filamentosos se obtiene por repique de
un pequeo manojo de hifas o grumo de esporas en varios puntos de una placa
de medio selectivo. En algunos casos esta tcnica no es satisfactoria y entonces
conviene hacer una dispersin de esporas sobre la superficie de agar estril. Se
toman las esporas del hongo en el cultivo primario y luego se ponen sobre la
placa de agar estril. Por lo general es necesario resembrar sucesivamente los
hongos de un cultivo puro, para garantizar que efectivamente solo haya un tipo
de hongos en este
III. MATERIALES Y MTODOS
PREAPARACION DE MEDIO DE CULTIVO

3.1. Materiales e insumos

Placas Petri
Autoclave
Erlenmeyer, olla y vaso precipitado
trpode
mechero de bucen
Agua destilada
Balanza
Insumos, papa, dextrosa, agar - agar

3.2. Mtodos

1) Desinfeccin de los materiales a usarse.

2) Pesar sustancias a utilizar.

Agar Agar : 18 g
Dextrosa : 10 g
Papa : 100 g
Agua destilada 1000 Ml.
3) Prendemos el mechero de bucen y ponemos sobre el tripode la olla con
agua y lo echamos la papa ya pesada en la balanza.

4) Alistamos el vaso precipitado de 1 l. ponindole gasa para filtrar la papa

hervida y luego vertimos el caldo en el vaso precipitado.

5) Una vez que el caldo es vertido se agrega agua destilada hasta 1000 ml,
donde se adiciona las sustancias el agar- agar, dextrosa y homogenizar
las sustancias.
6) Esterilizamos las placas Petri y el matraz.

7) Se vuelve a filtrar el caldo homogenizado con las sustancias con la gasa

y se traspasa a un matraz.

8) Una vez esterilizado las placas Petri, vertimos el medio de cultivo en las
placas Petri. El medio de cultivo que sobro se guard en un matraz.

9) Aseguramos las placas Petri y rotulamos. Guardamos en lugar seguro y

fresco y el medio de cultivo que sobr se guarda en el matraz tapado con
algodn y cinta adhesiva.
AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS A PARTIR DE TEGIDOS
ENFERMOS

I. MATERIALES Y METODOS

Materiales e insumos

Mechero
Pinza
Papel suave
Vaso precipitado
Alcohol, hipoclorito de sodio y agua destilada
Porcin vegetal con sntomas
Agua destilada
Cloro
Alcohol

MTODOS

1. Ponemos tres vasos precipitado uno de ellos conteniente agua

destilada con alcohol, el segundo agua destilada y la tercera agua
alcohol cloro.

2. Cortamos las porciones de hoja de caf y las raices con sintomas

de la enfermedad.
3. Envolvemos las porciones con gasa, y con una pinza se le pone al
vaso con agua y alcohol por 1 minutos, ponemos al vaso con agua
y cloro por 1 minuto y enjuagamos tres veces en el vaso con agua

4. Prendemos el mechero de alcohol

5. Luego de haber desinfectado la muestra se procede a la siembra

de microorganismos para ello ponemos el medio de cultivo en la
meza.

6. Desinfectamos en el mechero la pinza y realizamos la siembra al

lado del mechero para evitar la contaminacin.
 7. De esta manera se siembra en las tres placas Petri donde se
encuentra el medio de cultivo PDA.

8. Rotulado de las placas petri y luego se le asegura con cinta o un

papel para evitar la contaminacin, guardamos en un lugar fresco
donde se incuba a 24 C y se observan resultados despus de
cuatro a 5 das.

INOCULACION DE HONGOS EN CULTIVO PURO PDA

1. Para hacer la inoculacin se tiene en la meza un medio de cultivo

2. Desinfectamos la pinza en el mechero para sacar el microorganismo del
medio incubado

3. Una vez desinfectado la pinza se saca una porcion del hongo con mucho
cuidado ya sea de la placa como del tubo de ensayo donde huvo
cresimiento de hongos.

4. Se siembra en el medio de cultivo en la parte superficial en forma de

surcos.

5. Luego se procede a la rotulacin y la proteccin con un papel para la

incubacin
 CULTIVO EN CAMARA HUMEDA
Materiales e insumos
cuchillo, cinta adhesiva, bolsas, algodon y agua destilada
material vegetal enfermo y sano.
vasos precipitado
Procedimiento
1. Desinfeccin de los materiales a usar. Cortamos en forma triangular el
material sano y el enfermo del mismo tamao.

2. Colocamos el material enfermo en el sano y lo cubrimos con una cinta

3. Ponemos en la base del vaso precipitado una porcin de algodn y sobre

ella ponemos el material vegetal, lo humedecemos y lo cubrimos el vaso
con una bolsa para evitar la contaminacin por otros organismos.
Observamos la germinacin de las esporas, el crecimiento y ramificacin
del micelio, la aparicin de hifas diferenciadas y el desarrollo de las
estructuras de reproduccin.
MONTAJE DE HONGOS MICROSCOPICOS DE HONGOS FITOPATGENOS
Materiales
Porta objetos, cubre objeto, cinta adecente y tincin lactofenol
Asa coli, pinza y mechero
Agua destilada
Microscopio.
Mtodos
Montaje con agua destilada
Es til para montar estructuras que desarrollan abundantemente en la superficie
del hospedante, o a partir de cepas que crecen en medio de cultivo. Es la tcnica
obligada para hacer preparaciones a partir de races infectadas.
1. Colocar una pequea gota de agua en el centro de un portaobjetos.

2. con la punta de la asa de coli humedecida tomamos ligeramente las esporas

y/o micelio del material vegetal enfermo.

3. Transferir el material a la gota del medio de montaje, colocamos

cuidadosamente un cubreobjetos y observamos en el microscopio.
 Montajes con agua o lactofenol

4. Lavamos con agua destilada el exceso de color y lo flameamos en el

mechero.

5. Una vez desinfectada tomamos las esporas y/o micelio de material vegetal
con una cinta adhesiva y lo ponemos en el portaobjeto.

6. Observamos en el microscopio.
PRUEBA DE PATOGENICIDAD EN SEMILLAS DE MAZ
Materiales e insumos
Vasos presipitado
Pinza
Placas petri
Agua destilada
Alcohol
Hipoclorito de sodio
Gasa
Semillas
Procedimiento
1. Preparacion de agua alcohol y hipoclorito de sodio para la desinfeccion
de a muestra.

2. Desinfeccin de la muestra en el agua y alcohol por 1 minuto, 1 minuto

en agua, cloro y se enjuaga en el agua

3. Cortamos un papel tamao de la base de la placa Petri y se lo

humedece.
4. Ponemos las semillas en la placa Petri 20 semillas y se lo deja en un
ambiente seguro regndolo hasta la germinacin.

5. Observacin de las semillas.

Frijol maz

Crecimiento de hongo Fusarium graminearum en las semillas de maz

III. RESULTADOS

Rhizopus- en zanahoria

Rhizopus stolonifer en tomate

Penicillium digitatum - en limn dulce

Cercospora - en col
 IV. CONCLUSINES
La preparacin de los medios de cultivo se realiz de manera correcta con todos
los procedimientos teniendo cuidado que no se adicionen insumos que no son
adecuados que anteriormente se realiz.
La siembra de los microorganismos se realiz con xito obteniendo resultados
de crecimiento de los microorganismos en el medio de cultivo se presentaron en
algunas placas hasta tres colonias de hongos.
La cmara hmeda dio resultados en el crecimiento de hongos como es el caso
Rhizopus stolonifer en tomate que se desarrollo muy bien y se pudo observar a
simple viata el cresimiento de este hongo.
En la prueva de patogenesidad en las semillas de frijol y maiz se observo que en
la muestra uno que es el frijol no presento cresimiento de hongos por lo tanto no
esta contaminada pero en la otra muestra que es del maiz se prento el
cresimiento de hongos eso quiere decir que la semilla estaba contaminada por
hongos.

IV. RECOMENDACIONES
Preparar el medio de cultivo correctamente para que el microrganismo se
desarrolle y as tener un buen resultado
Es recomendable tener cuidado al realizar el aislamiento de
microorganismos para evitar la contaminacin.
Al realizar el cultivo de hongos en cmara hmeda proteger bien el vaso
para evitar la contaminacin.
Al realizar la prueba de patogenicidad desinfectar bien los materiales.

V. REVISIN BIBLIOGRFICA
Madigan, M. T., J. M. Martinko y J. Parker. 2003. Brock. Biologa de los
microorganismos. 10 Ed. Prentice Hall Iberia. Espaa.
Ramrez-Gama, R. M., B. Luna Milln, O. Velsquez Madrazo, L. Vierna
Garca, A. Meja Chvez, G. Tsuzuki Reyes, L. Hernndez Gmez, I.
Mggenburg, A. Camacho Cruz y M del C. Urza Hernndez. 2006.
Manual de Prcticas de Microbiologa General. 5 edicin. Facultad de
Qumica, UNAM. Mxico.
Tortora Gerard J., Fonke Beidell R. y Case Christine L. 1995.
Microbiology an Introduction. 5a. ed. The Benjamin/Cummings
Publishing Company, Inc. 801 pp.
CAFATI, C. R.; SAETTLER; A. W. 1980. Transmission of Xanthomonas
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