Anda di halaman 1dari 33

Proposal Penelitian

UJI TOKSISITAS HEPATOPROTEKTOR EKSTRAK ETANOL

KELOPAK BUNGA ROSELLA (Hibiscus sabdariffa L.) PADA TIKUS

Sprague Dawley YANG DIINDUKSI 7,12- DIMETILBENZ(a)ANTRASEN

SECARA INVIVO

OLEH:

ISMAR WULAN

O1A114017

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS HALU OLEO

KENDARI

2016

i
DAFTAR ISI

DAFTAR ISI ii
KATA PENGANTAR iv
BAB I. PENDAHULUAN 1
A. Latar Belakang Masalah 1
B. Rumusan Masalah 3
C. Tujuan Penelitian 3
D. Manfaat Penelitian 3
BAB II. TINJAUAN PUSTAKA 5
A. Bunga Rosella 5
B. Uji aktivitas 7
1.Uji aktivitas SGPT 7
1. Uji aktivitas SGOT 8
2. Uji aktivitas ALP 9
3. gambaran histopologi hepar 13
C. Mencit (Mus muscullus) 14
D. Kerangka Konsep 17
BAB III. METODE PENELITIAN 18
A.Waktu dan Tempat Penelitian 18
B. Jenis Penelitian 18
C. Bahan atau Materi Penelitian 18
D. Alat Penelitian 18
F. Prosedur Penelitian 21
1. Pengumpulan Bahan 21
2. Aklimatisasi Hewan Uji 21
3. Pengelompokan Hewan 21
4. Pemberian Sediaan Uji 21

ii
5. Pengamatan Perilaku dan Aktivitas Motorik 22
6. Monitoring Berat Badan dan Konsumsi Makanan 22
7. Pengamatan Jumlah Hewan Mati 22
8. Pengambilan Darah 22
9. Pengamatan Biokimia Klinis 23
10. Pengamatan Indeks Organ 23
9. Pengamatan Mikroskopik Organ 24
10. Evaluasi Hasil 24
11.Analisis Data 25
DAFTAR PUSTAKA 26

iii
KATA PENGANTAR

Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT, atas berkah dan

rahmat-Nya penulis dapat menyusun Proposal Penelitian: Uji Toksisitas

Hepatoprotektor Ekstrak Etanol Kelopak Bunga Rosella (Hibiscus Sabdariffa L.)

Pada Tikus Sprague Dawley Yang Diinduksi 7,12- Dimetilbenz(a)Antrasen

Secara Invivo ini. Penulis ucapkan terima kasih sebesar-besarnya kepada seluruh

pihak, khususnya kepada orang tua dan keluarga yang terus memberikan

semangat dan dukungannya serta kepada dosen atas kesediaanya dalam

membimbing dan mengarahkan selama kegiatan penilitian berlangsung.

Penulis berharap semoga proposal ini dapat memberi manfaat bagi kita

semua.Namun demikian, penulis menyadari bahwa dalam proposal ini masih

terdapat banyak kekurangan dan jauh dari kesempurnaan.

Dengan selesainya proposal ini, akhirnya saya sebagai penulis tetap

mengharapkan kritik dan saran yang membangun dari semua pihak terutama

pembaca sebagai masukkan untuk perbaikan.

Kendari, Desember 2016

Penulis

iv
BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang Masalah

Peningkatan penggunaan bahan alam, baik sebagai obat maupun

tujuan lain didorong oleh berkembangnya slogan back to nature. Dewasa ini,

obat tradisional sering dipromosikan sebagai produk alami dan aman untuk

dikonsumsi. WHO memperkirakan ada sekitar 4 milyar atau 80% penduduk

dunia menggunakan tanaman tradisional untuk perawatan kesehatannya.

Penggunaan tanaman obat sebagai pengobatan tradisional merupakan pilihan

pengobatan yang kini makin diminati karena relatif aman, murah, dan

mendapat perhatian bagi alternatif pelayanan kesehatan. Dari berbagai

penelitian, obat tradisional telah diakui keberadaannya oleh masyarakat,

dengan demikian meningkatkan manfaat tanaman bagi kesehatan dan

menciptakan kondisi yang mendorong pengembangan obat tradisional.

Perkembangan penggunaan obat khususnya dari tumbuh-tumbuhan untuk

membantu meningkatkan derajat kesehatan masyarakat sudah cukup meluas

(Awoyinka dkk., 2007). Hal ini dibuktikan dengan hadirnya produk-produk

obat tradisional seperti jamu, obat herbal terstandar (OHT), maupun

fitofarmaka. Salah satu obat tradisional yang kini ada adalah bunga rosella.

Pohon rosella adalah sejenis perdu yang mudah ditanam. Cara

penanamannya dengan menggunakan biji yang kering kemudian disemai.

Dari segi kesehatan, ternyata rosella mempunyai manfaat untuk mencegah

penyakit. Menurut Balittas Malang, bunga rosella terutama dari tanaman yang

3
berkelopak tebal, misalnya rosella merah berguna untuk mencegah penyakit

kanker dan radang, mengendalikan tekanan darah, melancarkan peredaran

darah dan melancarkan buang air besar. Dalam eksperimen ditemukan juga

bahwa ekstrak kelopak bunga rosella mengurangi efek alkohol pada tubuh

kita, mencegah pembentukan batu ginjal, dan memperlambat pertumbuhan

jamur/bakteri/parasit penyebab demam tinggi.

Penelitian obat tradisional Indonesia mencakup penelitian obat

tradisional tunggal maupun dalam bentuk ramuan. Jenis penelitian yang telah

dilakukan selama ini meliputi penelitian budidaya tanaman obat, analisis

kandungan kimia, toksisitas, farmakodinamik, formulasi, dan uji klinik. Uji

toksisitas menjadi sangat penting dilakukan sebagai langkah awal parameter

keamanan obat sebelum menjadi produk obat yang dapat digunakan pada

manusia. Hal ini dikarenakan setiap bahan atau zat memiliki potensi bersifat

toksik tergantung takarannya dalam tubuh (Dewoto, 2007). Beberapa tahap

uji toksisitas dikembangkan untuk mengetahui tingkat keamanan suatu

produk obat yaitu uji toksisitas akut, uji toksisitas subkronis dan juga uji

toksisitas kronis. Beberapa tahap uji ini dibedakan berdasarkan tingkat

penggolongan hewan uji dan lama pemejanan zat yang digunakan pada

hewan uji yang dapat digunakan sebagai parameter efek toksik yang

ditimbulkan dari zat tersebut.

Uji toksisitas merupakan suatu pengujian untuk mendeteksi efek

toksik yang muncul setelah pemberian sediaan uji dengan dosis berulang

yang diberikan secara oral pada hewan uji selama sebagian umur hewan,

3
tetapi tidak lebih dari 10% seluruh umur hewan. Uji ini sangat diperlukan

karena akan memberikan informasi tentang efek toksik suatu zat berupa efek

kumulatif dan efek reversibilitas pada sistem biologi yang tidak terdeteksi

pada uji toksisitas akut; informasi kemungkinan adanya efek toksik setelah

pemaparan sediaan uji secara berulang dalam jangka waktu tertentu. Pada

umumnya informasi tersebut dapat diperoleh dari percobaan menggunakan

hewan uji sebagai model yang dirancang pada serangkaian uji toksisitas.

Hewan uji yang biasa digunakan dalam penelitian uji toksisitas adalah mencit

(Mus muscullus). Mencit merupakan hewan pengerat yang memenuhi

persyaratan tersebut diatas, sehingga paling banyak digunakan pada uji

toksisitas.

B. Rumusan Masalah

Berdasarkan uraian diatas maka permasalahan yang akan diteliti

adalah bagaimana toksisitas hepatropotektor bunga rosella pada mencit

setelah penggunaan sediaan uji secara berulang dalam jangka waktu tertentu

secara invivo.

C. Tujuan Penelitian

Tujuan yang ingin dicapai dalam penelitian ini adalah untuk

menegetahui bagaimana toksisitas hepatropotektor bunga rosella pada mencit

3
setelah penggunaan sediaan uji secara berulang dalam jangka waktu tertentu

secara invivo.

D. Manfaat Penelitian

Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan manfaat berupa :

1. Memberikan informasi ilmiah tentang bagaimana hepatropotektor bunga

rosella pada mencit setelah penggunaan sediaan uji secara berulang dalam

jangka waktu tertentu secara invivo.

2. Memberikan pengetahuan kepada pembaca dan masyarakat mengenai efek

pemaparan sediaan uji secara berulang dalam jangka waktu tertentu secara

invivo.

3. Memberikan informasi dan tambahan pustaka bagi mahasiswa Fakultas

Farmasi Universitas Halu Oleo sebagai referensi dalam menyelesaikan tugas

akhir.

4. Bagi diri sendiri, menambah wawasan, pengetahuan dan keahlian

mengenai metode dan proses uji toksisitas pada mencit secara invivo

3
BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A. Bunga rosella

Pengelompokan dan Penandaan Obat Bahan Alam Indonesia menurut

Surat Keputusan Kepala BPPOM-RI No.HK.00.05.4.2411 (2004) tentang

obat tradisional terbagi menjadi tiga yaitu jamu, obat herbal terstandar dan

fitofarmaka. Jamu adalah obat tradisional yang disediakan secara tradisional,

misalnya dalam bentuk serbuk, seduhan, pil, instan, minuman, dan cairan

yang berisi seluruh bahan tanaman yang menjadi penyusun jamu tersebut

serta digunakan secara tradisional. Obat herbal terstandar merupakan salah

satu obat tradisional yang bahan bakunya telah distandarisasi serta khasiat

dan keamananya telah terbukti secara praklinik, sedangkan fitofarmaka

adalah obat tradisional yang bahan bakunya telah distandarisasi dan khasiat

serta keamanannya telah terbukti secara praklinik maupun klinik.

Obat tradisional Indonesia dikenal dengan nama jamu yang berasal

dari keraton Surakarta dan Yogyakarta di Jawa Tengah yang sebagian

pengaruh dari Arab, Cina, dan India (Heinrich. 2009). Selain di Jawa,

masing-masing daerah juga memiliki ramuan tumbuhan yang digunakan

sebagai obat seperti di Bali, Sumatera, Kalimantan termasuk Sulawesi.

Tanaman rosella (Hibiscus sabdariffa L), sejak abad ke-19 mulai

dikembangkan di Indonesia. Di pulau jawa, tanaman rosella banyak

dibudidayakan di daerah yang rutin dilanda banjir (bondorowo). Adapun

13
lahan alternative pengembangan tanaman rosella di luar Pulau Jawa antara

lain adalah di lahan-lahan Podsolik Merah Kuning (PMK) misalnya

Kalimantan Selatan, Rawa Lebak di Rawa Sragi Lampung, serta lahan

Gambut di Kalimantan Barat dan Bengkulu.

Rosella memiliki lebih dari 300 spesies yang tersebar pada daerah

tropis dan non tropis. Kebanyakan tanaman rosella dipergunakan sebagai

tanaman hias dan beberapa diantaranya dipercaya memiliki kasiat medis,

salah satu diantaranya adalah rosela merah atau roselle (Hibiscus sabdariffa

L). Bunga rosella memiliki putik sekaligus serbuk sari sehingga tidak

memerlukan bunga lain untuk bereproduksi. Rosella (Hibiscus sabdariffa L)

dapat hidup di daerah yang memiliki iklim lembab dan hangat pada daerah

tropis dan sub tropis.

Rosella memiliki kelebihan dibandingkan dengan tanaman tropis dan

subtropis lainnya yaitu dapat bertahan dalam cuaca yang sangat dingin serta

dapat hidup dalam ruangan yang memiliki sedikit pencahayaan akan tetapi

pertumbuhan terbaik diperoleh pada ruang terbuka dengan cahaya matahari.

Rosella merupakan tumbuhan semak umur satu tahun, tinggi

tumbuhan mencapai 2,4 m. Batang berwarna merah, berbentuk bulat dan

berbulu; daun berseling 3-5 helai dengan panjang 7,5-12,5 cm berwarna hijau,

ibu tulang daun kemerahan, tangkai daun pendek. Bentuk helaian daun

bersifat anisofili (polimorfik), healaian daun yang terletak di bagian pangkal

batang tidak berbagi, bentuk daun bulat telur, tungkai daun pendek. Daun-

13
daun di bagian cabang dan ujung batang berbagi, menjadi 3 toreh, lebar toreh

daun 2,5 cm, tepi daun beringgit, daun penumpu bentuk benang; panjang

tangkai daun 0,3-12 cm, hijau hingga merah; pangkal daun meruncing, sedikit

berambut. Bunga tunggal, kuncup bunga tumbuh dari bagian ketiak daun,

tangkai bunga berukuran 5-20 mm kelopak bunga berlekatan, tidak gugur,

tetap mendukung buah, berbentuk Ekstrak kelopak rosella, Gigitiruan,

Candida albicanslonceng; mahkota bunga berlepasan, berjumlah 5 petal,

mahkota bunga berbentuk bulat telur terbalik, warna kuning, kuning

kemerahan; benang sari terletak pada suatu kolom pendukung benang sari,

panjang kolom pendukung benang sari sampai 20 mm, kepala sari berwarna

merah, panjang tangkai sari 1 mm; tangkai putik berada di dalam kolom

pendukung benang sari, jumlah kepala putik 5 buah, warna merah. Buah

rosella berbentuk kapsul kadang bulat telur, ukuran buah 13-22 mm x 11-20

mm, tiap buah berisi 30-40 biji. Ukuran biji 3-5 mm x 2-4 mm,warna coklat

kemerahan. Habitat aslinya berasal dari nigeria, tetapi tumbuh berkembang di

seluruh dunia, terutama daerah tropis. Tanaman ini banyak dibudidayakan di

Eropa.

13
Gambar 1. Biji bunga rosella

B. Uji aktivitas

Indonesia dikenal sebagai salah satu negara yang mempunyai

keanekaragaman hayati berupa tumbuhan yang banyak digunakan sebagai

obat tradisional. Tetapi belum banyak dilakukan penelitian untuk

mengevaluasi tingkat keamanannya sedangkan pengetahuan tentang potensi

efek toksik yang ada dalam tumbuhan obat adalah penting untuk menjamin

keamanan dalam penggunaannya (Soemardji dkk., 2002).

Salah satu tujuan terpenting toksikologi ialah memberikan keterangan

sehingga kerugian kesehatan manusia dan lingkungan akibat senyawa

beracun dapat dicegah atau dibatasi. Seiring perkembangan zaman, manusia

semakin sadar tentang pentingnya kesehatan diri, maka keamanan bahan-

bahan yang dikonsumsi perlu diperhatikan. Toksikologi merupakan kajian

tentang hakikat dan mekanisme efek toksik berbagai bahan terhadap makluk

hidup dan sistem biologi lainnya. Tosikologi lebih ditujukan untuk

mendeteksi resiko keracunan pada manusia baik resiko yang telah diketahui

maupun yang masih menjadi dugaan. Uji toksisitas sangat penting untuk

mencegah resiko akibat pemaparan senyawa tertentu pada manusia (Koeman,

1987).

13
Pada umumnya metode uji toksisitas dapat dibagi menjadi 2 golongan

yaitu, uji toksisitas yang dirancang untuk mengevaluasi seluruh efek umum

suatu senyawa (uji toksisitas akut, subkronis, kronis), dan uji yang dirancang

untuk mengevaluasi secara rinci tipe toksisitas spesifik (teratogenitas,

mutagenitas, karsinogenitas) (Hayes 2001; Loomis, 1987; Lu, 1995).

Penelitian jangka pendek yang menyeluruh akan memberikan informasi

toksisitas senyawa uji dalam kaitannya dengan organ sasaran, efek pada organ

tersebut dan hubungan dosis efek dan dosis respons. Evaluasi hasil uji

toksisitas dilakukan pengamatan umum, pengamatan parameter klinik, dan

pemeriksaan setelah kematian (Hendriani, 2007).

1. Uji aktivitas SGOT

Penetapan aktivitas SGOT ditetapkan berdasarkan reaksi enzimatik

menggunakan reagen kit Dyasis SGOT (R1) TRIS pH 7,65 sebanyak

110 mmol/L, L-aspartate 320 mmol/L, MDH (malate dehidrogenase) =

800 U/L dan LDH (laktate dehidrogenase) = 1200 U/L; reagen SGOT

(R2) 2-oksoglutarate 65 mmol/L dan NADH 1 mmol/L. Larutan sampel

berisi campuran R1 dan R2 dengan perbandingan 4 : 1. Sebanyak 600 l

reagen kit SGOT direaksikan dengan 60 l sampel, divortex dan

diinkubasi pada suhu kamar selama 1 menit selanjutnya sampel dibaca

absorbansinya menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang

340 nm. Prosedur penetapan aktivitas SGOT berdasarkan prosedur kerja

dari Dyasis.

13
2. Uji aktivitas SGPT

Penetapan aktivitas SGPT ditetapkan berdasarkan reaksi enzimatik

menggunakan reagen kit Dyasis SGPT (reagen I) TRIS pH7,15

sebanyak 140 mmol/L, L-alanine 700 mmol/L dan LDH (laktate

dehidrogenase) =2300 U/L; reagen SGPT (reagen II) 2oksoglutarate85

mmol/L dan NADH 1mmol/L. Larutan sampel berisi campuran reagen I

dan reagen 2 dengan perbandingan 4 : 1. Sebanyak 600 l reagen kit

SGPT direaksikan dengan 60 l sampel, divortex dan diinkubasi pada

suhu kamar selama 1 menit selanjutnya sampel dibaca absorbansinya

menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 340 nm.

Prosedur penetapan aktivitas SGPT berdasarkan prosdur kerja dari

Dyasis.

3. Uji aktivitas ALP

Penetapan aktivitas ALP ditetapkan berdasarkan reaksi enzimatik

menggunakan reagen kit Dyasis ALP yang terdiri darin(reagen 1)

diethanolamine pH 9,8 sebanyak 1,2 mmol/L dan magnesium chloride

0,6 mmol/L; (reagen 2) -nitrophenylphosphate 50 mmol/L. Larutan

sampel berisi campuran reagen I dan reagen 2 dengan perbandingan 4 : 1.

Sebanyak 600 l reagen kit ALP direaksikan dengan 12 l sampel,

divortex dan diinkubasi pada suhu kamar selama 1 menit selanjutnya

sampel dibaca absorbansinya menggunakan spektrofotometer pada

panjang gelombang 405 nm. Prosedur penetapan aktivitas ALP

berdasarkan prosdur kerja dari Dyasis.

13
4. Gambaran histopologi hepar

Organ hati yang telah diambil kemudian dicuci dengan NaCl 0,9%

selanjutnya dimasukkan dalam pot ditimbang bobot heparnya kemudian

dimasukkan dalam larutan formalin 10% dan organ hepar diperiksa.

Jaringan yang telah difiksasi kemudian didehidrasi dengan alkohol mulai

dari konsentrasi 70%, 80%, 90%, 95% masing-masing selama 24 jam

dilanjutkan dengan alkohol 100% selama 1 jam yang diulang tiga kali.

Setelah dehidrasi dilanjutkan dengan penjernihan dengan menggunakan

xilol sebanyak tiga kali masing-masing selama satu jam, dilanjutkan

dengan infiltrasi parafin. Jaringan kemudian ditanam dalam media

parafin. Berikutnya dilakukan penyayatan dengan ketebalan 4-5 mikron.

Hasil sayatan dilekatkan pada kaca objek, kemudian diwarnai dengan

pewarnaan hematoksilineosin (HE).

C. Mencit (Mus muscullus)

Dari seluruh spesies mamalia yang tersedia untuk uji toksisitas suatu

agen kimia maka hewan rodensia merupakan pilihan yang paling berguna dan

sesuai. Diluar perbedaan ukuran dan anatomi minor, fisiologi hewan rodensia

hampir identik dengan manusia. Sehingga dikatakan bahwa rodensia

merupakan spesies hewan yang dapat menggantikan manusia dalam tes

toksisitas umum. Keuntungan dari tikus percobaan toksik adalah tikus tidak

dapat muntah (vomit). Hal tersebut dikarenakan tikus memeiliki pembatas

kuat antara perut dan esophagus, tidak memiliki hubungan saraf kompleks

13
antara batang otak dan organ vital visceral yang mengkoordinasi otot. Tikus

memiliki strategi lain untuk menghindari toksik (OECD, 2014).

13
Mencit merupakan hewan yang paling umum digunakan pada

penelitian laboratorium sebagai hewan percobaan, yaitu sekitar 40-80%.

Mencit memiliki banyak keunggulan sebagai hewan percobaan, yaitu siklus

hidup yang relatif pendek, jumlah anak per kelahiran banyak, variasi sifat-

sifatnya tinggi dan mudah dalam penanganannya (Moriwaki, 1994).

Mencit memiliki klasifikasi sebagai berikut (Arrington, 1972):

Kingdom : Animalia

Filum : Chordata

Klas : Mamalia

Ordo : Rotentia

Famili : Muridae

Genus : Mus

Spesies : Mus musculus

Mencit putih memiliki bulu pendek halus berwarna putih serta ekor

berwarna kemerahan dengan ukuran lebih panjang dari pada badan dan

kepala. Mencit memiliki warna bulu yang berbeda disebabkan perbedaan

dalam proporsi

15
darah mencit liar dan memiliki kelenturan pada sifat-sifat produksi dan

reproduksinya (Nafiu, 1996).

Hewan uji disarankan satu jenis hewan dewasa sehat baik jantan

maupun betina. Hewan uji yang dipilih adalah hewan yang memiliki pola

metabolisme terhadap senyawa uji semirip mungkin dengan manusia

(Donatus, 2001). Hewan uji dibedakan menjadi dua kelompok, yaitu

kelompok kontrol dan kelompok perlakuan yang dilakukan secara acak atau

random (Gad, 2002). Deleranko dan Hollinger (2002) menyatakan bahwa

jumlah hewan uji paling tidak sebanyak empat kelompok, yaitu satu

kelompok kontrol dan tiga kelompok perlakuan peringkat dosis. Jumlah

hewan uji slam perlakuan paling tidak terdapat lima jantan dan lima betina

dalam tiap kelompok perlakuan. Hewan uji harus diadaptaikan terlebih

dahulu selama beberapa hari sebelum dilakukan perlakuan agar hasil

percobaan yang akan didapatkan benar-benar merupakan hasil perlakuan

bukan karena faktor lingkungan yang baru bagi hewan uji.

17
D. Kerangka Konsep

Obat Tradisional

Obat Herbal Jamu Fitofarmaka

Terstandar

Bunga rosella

3 x pemberian dosis/24 jam (2 Secara empirik dimanfaatkan sebagai


gangguan pencernaan dan makanan,
g/kgBb manusia) memperlancar buang air besar,
mengurangi nafsu
makan(BPOM,2010).

Dosis uji LK1 Dosis uji LK2 Dosis uji LK3 Dosis uji LK3S
(2,6 mg/KgBb) (2,4 mg/KgBb) (10,4 mg/KgBb) (10,4 mg/KgBb)

Pengamatan Pemeriksaan Pemeriksaan Pemeriksaan

Perilaku Biokimia Klinis Indeks Organ Mikroskopik

Hati, limpa,
Pengamatan Kadar SGPT,SGOT Bobot Organ
dan ALP
jantung, ginjal,
Perilaku Relatif
paru, uterus
Aktivitas

Motorik

Aktivitas hepatropotektor

17
Keterangan :

= Variabel terikat

= Variabel bebas

Gambar 3. Kerangka Konsep

17
BAB III

METODE PENELITIAN

A.Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Penelitian Fakultas

Farmasi Universitas Halu Oleo. Penelitian ini akan dilaksanakan mulai

bulan AprilJuli 2017.

C. Jenis Penelitian

Jenis penelitian ini termasuk eksperimental laboratorium yaitu

penelitian yang dilakukan dalam laboratorium dengan menggunakan

bunga rosella sebagai sampel dan mencit sebagai hewan uji.

D. Bahan atau Materi Penelitian

Rosella, Etanol, asam gallat standar, reagen folin, Mencit, Pakan,

DMBA, Corn Oil, Tween 20, NaCl 0,9%, aquadest, kloroform, Formalin

10 %, Zat warna (hematoksilin dan eosin), reagen kit SGPT SGOT

Dyasis yang terdiri dari: Reagen SGPT (reagen I) Tris, L-alanin, laktat

dehidrogenase, reagen SGPT (reagen II) 2oksoglutarat, NADH. Reagen

SGOT (reagen I)Tris,L-aspartat, malat dehidrogenase, laktat

dehidrogenase, reagen SGOT (reagen II) 2oksoglutarat, NADH, dan

reagen kit Dyasis ALP yang terdiri dari (reagen 1) diethanolamine pH

17
9,8 1,2 mmol/L dan magnesium chloride 0,6 mmol/L; (reagen 2)

nitrophenylphosphate 50 mmol/L.

E. Alat Penelitian

Timbangan analitik, gelas ukur, beker gelas, batang pengaduk,

corong Buchner, labu, kertas saring, kompor listrik, alat penggilingan,

ayakan mesh 10, labu takar, erlenmeyer, kandang tikus, botol air minum,

spuit injeksi untuk DMBA 1,0 ml, spuit oral ukuran 5 ml, spuit untuk

mengambil darah ukuran 5 ml (Terumo), alat bedah, pengukuran aktivitas

SGPT, SGOT dan ALP :spektrofotometer.

F. Prosedur Penelitian

1. Pengumpulan Bahan

Sediaan bunga rosella diperoleh dari produsen penanam bunga

rosella kita yang berada di Jawa Tengah, sedangkan hewan uji diperoleh

dari peternak mencit yang ada di Kendari.

2. Aklimatisasi Hewan Uji

Mencit yang telah disiapkan, selanjutnya diaklimatisasi di ruang

percobaan selama lebih kurang 7 hari dan dikelompokkan secara acak

sedemikian rupa sehingga penyebaran berat badan merata untuk semua

kelompok dengan variasi berat badan tidak lebih 20% dari rata-rata berat

badan.

17
3. Pengelompokan Hewan

Hewan uji dikelompokkan dalam 5 kelompok mencit jantan yang

masing-masing terdiri dari 10 ekor. Kelompok tersebut terdiri dari

kelompok kontrol dosis uji bunga rosella, kelompok dosis bunga rosella

satu, kelompok dosis bunga rosella dua, kelompok dosis bunga rosell tiga,

kelompok satelit, dan kelompok kontrol satelit.

4. Pemberian Sediaan Uji

Sediaan uji diberikan melalui penyuntikan dan diberikan setiap hari

selama 30 hari sedangkan kelompok satelit diberikan hingga hari ke 40.

Kelompok dosis uji diberikan dosis 15mg/KgBB mencit,

5. Pengamatan Perilaku dan Aktivitas Motorik

Pengamatan terjadinya gejala-gejala toksik dan gejala klinis yang

berupa aktivitas lokomotor, reaksi-reaksi aneh, kesadaran, gerak refleks,

responsi somatik, perubahan cara jalan, tingkah laku yang aneh, mata,

defekasi dan sebagainya, dilakukan setiap hari selama 34 hari.

6. Monitoring Berat Badan dan Konsumsi Makanan

Monitoring kenaikan berat badan dilakukan seminggu dua kali.

Hewan uji ditimbang setiap hari untuk menentukan volume sediaan uji

yang akan diberikan. Sedangkan jumlah makanan yang dikonsumsi

ditimbang dua hari sekali.

17
7. Pengamatan Jumlah Hewan Mati

Pengamatan dilakukan selama 2 jam setelah pemberian sediaan uji

dan selama pemberian sediaan uji sampai hari ke 34. Apabila terjadi

kematian maka hewan tersebut dilakukan otopsi dan diamati secara

makropatologi secara seksama untuk setiap organ.

8. Pengambilan Darah

Setelah hari ke-28 darah diambil menggunakan alat suntik steril

dan selalu dijaga agar tidak terkena air (untuk menghindari terjadinya

hemolisa). Setelah hewan di anestesi dengan eter darah diambil dari vena

lateralis ekor secara perlahan-lahan menggunakan alat suntik steril

sebanyak 35 mL, satu alat suntik digunakan untuk satu hewan. Sebanyak

0,5 mL darah dimasukkan kedalam tabung mikrosentrifus yang telah diisi

antikoagulan (EDTA) sebanyak 10 L. Sampel darah disentrifus dan

didiamkan pada suhu kamar selama 10 menit, kemudian dipindahkan

kedalam tangas es tidak lebih dari 20 menit dan segera disentrifus 8 hingga

10 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Selanjutnya serum dipisahkan dan

disimpan dalam lemari beku untuk pemeriksaan biokimia klinis.

9. Pengamatan Biokimia Klinis

Pada pengamatan biokimia darah sampel yang digunakan

merupakan suatu plasma darah yang kemudian dilakukan pengukran

secara kualitatif. Pemeriksaan biokimia klinis yang diperiksa adalah kadar

SGPT,SGOT,ALP,dan gambaran histopologi hepar. Sejumlah 100 L

17
serum darah uji direaksikan dengan 1000 L pereaksi uji untuk

pemeriksaan SGPT di dalam tabung reaksi 5 mL dihomogenkan dengan

bantuan vortex. Absorbansinya diukur dengan spektrofotometer pada suhu

370C tepat setelah menit ke 1, 2, dan 3 pada panjang gelombang 340 nm.

Hal yang sama dilakukan terhadap blangko (pereaksi + aquades). Kadar

SGOT dapat ditentukan dengan menghitung rata-rata selisih absorbansi

sampel permenit dikalikan faktor 1745 (GOT (U/I) ( A Sampel - A

blangko ) x faktor 1745).

Penyerap, kemudian segera ditimbang untuk mendapatkan bobot

organ absolut. Bobot organ relatif dapat diperoleh dengan rumus sebagai

berikut :

10. Pengamatan Indeks

Hewan yang telah dikorbankan harus segera diotopsi dan dilakukan

pengamatan secara makropatologi secara seksama untuk setiap organ.

Adapun organ-organ yang ditimbang adalah hati, limpa, jantung, ginjal,

paru dan uterus. Organ yang akan ditimbang harus dikeringkan terlebih

dahulu.

11. Pengamatan Mikroskopik Organ

Pengamatan mikroskopik organ dilakukan dengan cara dibuat

preparat histologi. Organ yang diperiksa secara histopatologi meliputi: hati,

17
limpa, jantung, ginjal, paru dan uterus. Satu hewan dari tiap kelompok

dikorbankan 24 jam setelah terapi selama 30 hari dengan cara dianestesi

dengan eter. Kemudian dilakukan pengambilan jaringan pada masing-

masing organ. Pengambilan jaringan dilakukan dengan metode reitz serum.

Setelah jaringan diambil, lalu difiksasi dengan formalin, dicuci dengan

akuades, didehidrasi dan dibuat blok dengan parafin kemudian dipotong

menjadi sayatan tipis dan diberi pewarnaan teknik pewarnaan hematoxilen-

eosin, kemudian diamati di bawah mikroskop cahaya dan dilakukan

pemotretan.

17
12. Evaluasi Hasil

Kajian yang dilakukan antara lain: evaluasi hubungan dosis dan

efek yang terjadi untuk semua kelompok yaitu terjadinya efek toksik dan

derajat toksisitas, yang meliputi perubahan berat badan, gejala klinis,

biokimia klinis, makropatologi, histopatologi organ sasaran, kematian dan

efek umum lain atau efek yang spesifik yang akan muncul.

13.Analisis Data

Data pengamatan yang diperoleh dianalisis menggunakan

menggunakan ANOVA (Analysis Of Varians) dahulu dengan kertas Organ.

I. Jadwal Penelitian

Penelitian ini akan dilakukan mulai bulan April-Juni 2016. Rincian

jadwal penelitian lebih jelas dapat dilihat pada tabel di bawah ini.

Tabel 1. Jadwal penelitian

Jenis Kegiatan Bulan


1 2 3
1. Studi pustaka
2. Perizinan
penggunaan
laboratorium
3. Penyiapan Alat,
Bahan, Hewan Coba
dan sediaan uji
4. Aklimatisasi
Hewan Coba
5. Pemberiaan
Sediaan Uji
6. Pemeriksaan
Klinis
7. Pemeriksaan

23
Patologi
8. Penulisan laporan

23
DAFTAR PUSTAKA

Arrington, L. R. 1972. Introductory Laboratory Animal Science, the Breeding,


Care and Management of Experimental Animal. The Interstate Printers and
Publisers, Inc. Denville.

Dewoto, H.R. 2007. Pengembangan Obat Tradisional Indonesia menjadi


Fitofarmaka. Majalah kedokteran indonesia, 57(7): 205-211.

Donatus, I.A., 2001, Toksikologi Dasar, Laboratotium Farmakologi dan


Toksikologi Fakultas Farmasi. Yogyakarta : Universitas Gadjah Mada.

Heinrich. 2009. Farmakognosis dan Fitoterapi. Jakarta: EGC.

Koeman, J.H. 1987. Pengantar Umum Toksitologi. Yogyakarta: UGM Press.

Loomis, T.A., & Hayes, A.W. 1996. Loomiss Essentials of Toxicology, 4 th


edition, 3-6, 18, 205-208. California : Academic Press.

Lu.F.C. 1995. Toksikologi Dasar: Azaz, Organ Sasaran dan Penilaian Resiko,
diterjemahkan oleh Nugroho, E. 1, 208-213. Jakarta : UI-Press.

Moriwaki, K, T. Shiroishi, H. Yonekawa. 1994. Genetic in Wild Mice. Its


Aplication to Biomedical Research. Tokyo : Japan Scientific Sosieties Press.
Karger.

Nafiu, L. O. (1996). Kerenturan Fenotipik Mencit Terhadap Ransum Berprotein


Rendah. Bogor: IPB.

23
19
21
25
9