Ragi HOST STERILE (SHY): Sebuah SISTEM eukariotik DARI KENDALI

HAYATI UNTUK EKSPERIMEN DNA REKOMBINAN

(Saccharomyces cerevisiae; HV2; plasmid vektor pBR322; 2- / ~ plasmid;

nonmating mutan)

DAVID BOTSTEIN, S. CARL FALCO, SUE E. STEWART, MILES BRENNAN *,

STEWART SCHERER *, DAN T. STINCHCOMB *, KEVIN STRUHL * dan
RONALD W. DAVIS *
Departemen Biologi, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA 02139, dan *
Departemen Biokimia, Stanford University School of Medicine, Stanford, CA 94305 (USA)
Kantor R ecombinant DNA Kegiatan (Orda). Pedoman H NI membagi "containment" ke
dalam dua kategori: fisik dan biologis. penahanan biologis berarti penggunaan host dan
vektor dalam DNA rekombinan experi-ment s yang rende r hidup productsof percobaan
ini secara substansial kurang mampu bertahan dan multipl luar th lingkungan elaboratory
y. Sampai saat ini, semua sistem penahanan biologis bersertifikat telah lebah n
berdasarkan bacteriu mE. coil K-12 dan bakteriofag nya.
Dalam makalah ini kami menjelaskan secara singkat eukaryoti c syste mof biologis
mengandung-m ent yang telah kami merancang berdasarkan yeas t Saccharomyces
cerevisiae.Kami menjelaskan onl y th e syste m sendiri dan teori di b d penahanan nya.
Rincian lengkap ofthe secara eksperimental yang luas untuk sertifikasi recen t sebagai
HV 2 syste MBY NI H {DHEW, NIH, 1 9 7 9; lihat juga Szybalski, 1979) yang tersedia
dari Orda.

Teori dasar penahanan syste m dimulai dengan alunan ide tha tlaboratory dari
Saccharomyces cerevisiae(Brewer ragi / Baker) sudah intrinsik "berisi". Tidak ada
memberOf th e genusSaccharomycesberkolonisasi ma atau hewan dan non e
menyebabkan penyakit. Spesies ini adalah nota norma l penghuni selokan e th atau th e
udara, yang dianggap th e pokok non - huma n "ESCAP eroutes" outof th elaboratory
untuk r mikroba s membawa kembali c ombinant DNA. Selain itu, th strain elaboratory
donotcompete baik dengan mereka nenek moyang "liar" (misalnya, strain digunakan
dalam Kultur industri n untuk anggur, bir, dan roti}. Dengan demikian th e pokok routeof
"melarikan diri" fo segmen ra DNA "kloning" dalamSaccharomyceshost
hypothesizedtobe kemungkinan ofa kawin antara th e in vitro rekombinan dan hardier
"liar" ragi ketegangan. F atau alasan ini th e primar y dasar untuk penahanan biologis
dibangun ke e strain SHY th adalah sterilitas: yaitu, th e ketidakmampuan untuk tikar e
dengan ragi yang lain.

GAMBARAN TH E SH Y HOSTS

F derivatif SHY kami memiliki n lebah diuji, disertifikasi oleh NIH, dan equi-
valent di properti mereka. Mereka genotipe s adalah:
Shyi: ~ ste-VC9 ura3-52 trp1-289 leu2-3 leu2-112 his3-A1 adel - LO1
SHY2: a ste-VC9 ura3-52 trp1-289 leu2-3 leu2-112 his3-A1 canl - lo0
SHY3: a ste-VC9 ura3-52
trpl - 289 leu2-3 leu2-112 his3-A1 adel - LO1 canl - lo0
SHY 4: a ste-VC9 ura3-52 trp1-289 leu2-3 leu2-112 his3-A1
Itu ste-VC9mutasi adalah kawin - jenis - non - spesifik mutasi sterilitas penyebab
diisolasi dengan Macka y dan Manne y (1974a, b) dan diklasifikasikan kelas 6 {yaitu un-
mampu tikar e terlepas dari jenis kawin; membuat faktor nodetectablea, sebuah sel kawin
hormonemadebya). Strain membawa th e VC9 mutasi mate, r kondisi optimal unde, abouta
juta kali lipat kurang frequentl y tha n liar - jenis strain induk fro m yang th e VC9 mutasi
diisolasi.
ura3-52 The mutasi stabil (kurang dari 10 -9 revertants dalam suatu budaya} dan
 19
alah dimasukkannya ofayeast urut memungkinkan replikasi otonom,
 21

R tetR tot R
BS P BS RHR tetR R
AMP
amp R ty, ip ~ amp R
X =3
S "-" ' "" ", ~ ...., ~ - ura 3 ~S

trp 1
AMP
R "~ S pf ) '~ S / '~ AMPR /" ~M
AMPR amp leu 2 :

-nya 4

M ura 3 RM
AMPR ~ ura 3 ~ jM ura 3 ..... ura 3 M R ~ -) ~ _ ura 3

s s

Gambar 1. Vektor saat ini disertifikasi untuk digunakan dengan strain SHY untuk percobaan tingkat
HV2. Setiap lingkaran mewakili komposisi DNA vektor. Masing-masing hanya sekitar untuk skala;
lihat Tabel II untuk ukuran mutlak. ~, Merupakan pBR322 DNA; A / ~ / v, merupakan DNA ragi
kromosom; oooooo mewakili 2- # plasmid DNA. Beberapa endonu pembatasan - situs clease
ditunjukkan sebagai berikut: R =E co RI; B = B am HI; S = S al I, M = S ma I; P = P st I;
H = ttind III; X = X ho I; V = P vu saya.

mungkin karena ragi DN A membawa kromosom replicon normal

(Struhl et al., 1979). Ini memberikan frekuensi tinggi
transformasi dan hasilnya di transforman tidak stabil, dan
disebut YRP, untuk Ragi Replikasi Plasmid.
Sifat-sifat plasmid ini, semua yang mengandung fragmen
didefinisikan dengan baik dari pBR32 2 (satu-satunya sumber
urutan prokariotik), ragi 2- ~ plasmid, dan / atau kromosom
ragi dirangkum dalam Tabel II dan Gambar. 1.
Sehubungan dengan penahanan biologis, semua vektor ini setara. Dasar untuk
penahanan biologis ragi HV 2 sistem adalah kegagalan segmen kloning akan
ditransfer ke kuat "liar" strain, dan ini tidak dapat ditransfer dari strain
SH Y karena mereka tidak mampu untuk kawin. Dengan hormatE. coli, vektor ini
semua didasarkan pada pBR32 2 dan dengan demikian EK2.
22

TABEL II

KARAKTERISTIK VEKTOR HV2 ragi

V ektor Ukuran (kb) P henotypes situs kloning S umber

YI pl 9 0,8 Sebuah mp H iss E co RI Sa | IX ho I S Tanford Univ. (RWD) S

YE p 210. 4 T et P stl B am HI SalI Tanford Untv, (RWD) S
YE p 410. 4 tet P st IB am HI SalI Tanford Univ. (RWD) Stanfor
B am HI S al d Univ. (RWD) Stanford
YI p 5 5.5 Sebuah mp T et Ura3 E co RI Saya H ind IIIS inaia Univ. (RWD) S Tanford Univ.
YE p 6 7,9 A mp His3 E co RI X ho Saya SalI (RWD) Cold Spring Harbor
YR p 7 5.7 Sebuah mp T et T RPL B am HI SalI Lab. Cold Spring H punjung
YE p 2 0 10. 4 Sebuah mp L eu 2 BamHI SalI P st I Lab.
YE p 2 1 s.8 Sebuah mp L eu 2 BamHI SalI Univ. dari Strasbourg
YED24 7,6 A mp Ura3 B am HI 8 mo saya S al I Cornel]Univ.
YI p 2 5 11,9 T et His4 B am HIH ind saya n MIT
YI p 2 67,8 Sebuah mp L eu 2 Ura3 B am HI SalI Sinaia MIT
YI p 2 77.8 Sebuah mp L eu 2 Ura3 B am HI SalI S inaia MIT
YI p 2 87,8 Sebuah mp L cu 2 ~ JRA 3 B am HI SalI S inaia MIT
B am HI SalI S ina MIT
YI p 2 97.8 Sebuah mp L eu 2 Ura 3 besarbesaran MIT
YI p 3 05.5 A mp Ura3 E co RI S am HI S ail S inaia MIT
YI p 3 15,5 Sebuah mp [T et] b Ura3 E co RI B am HI SalI S inaia MIT
YI p 3 26,7 Sebuah mp L eu 2 B am HI SalI P stl H ind saya n
YI p 3 3 6.7 Sebuah mp L eu 2 B am HI SalI P SFL H ind III
S ma aku situs nea rtheendof URA 3 DNA, tetapi ha ~ notyetbeen penggunaan d untuk r kloning.
b Bracket s menunjukkan leve LRE rendah. tahoe.

KESIMPULAN

Dengan sertifikasi oleh NIH dari SHY strain prinsip nyaman penahanan
biologis (mutan steril dari Saccharomyces cerevisiae) memilikididirikan. Di
masa depan banyak vektor w ne terdiri dari plasmid EK2 bersertifikat atau fag
(terutama yang terakhir) harus bermutu dan dengan demikian meningkatkan
kegunaan dari sistem.
Preliminar y deskripsi sistem ini diumumkan di Recombinant yang DN A
Techn. Banteng. (Vol 2, No.2, Juli 1979, hlm 49 -.. 54), tapi itu komunikasi-
kation mengandung beberapa kesalahan (terutama pada Gambar 1.) Yang
dikoreksi dalam tulisan ini.

UCAPAN TERIMA KASIH

W e terima I. Herskowitz, J. Hicks, J. Broach, G. Fink, dan F. Lacroute

untuk strain giftof dan informasi yang tidak dipublikasikan. Penelitian ini
didukung oleh dana ke DB dari American Cancer Society (VC245) dan oleh
hibah untuk RWD dari National Science Foundation (PCM-77-27.859).

REFERENSI

Beggs, JD, Transformasi ragi oleh plasmid hybrid mereplikasi, Nature, 275 (1978) 104--
109.
Bolivar, R., Rodriguez, RL, Greene, PJ, Betlach, MC, Heyneker, HL, Boyer, HW, Crosa,
JH, dan Falkow, S., Konstruksi dan karakterisasi kendaraan kloning baru, II. Sebuah
sistem serbaguna kloning, Gene, 2 (1977) 95--113.
 23

Curtiss, R., III, Pereira, A., Hsu, J., Hull, C., Clark, E., Maturin, J., Goldschmidt, R., Moody,
R., Inoue, M., dan Alexander, L., dalam Micro 76 - laporan tahunan,
Menghasilkan DBY 7 4 8 * = a ste-VC9 met1 can1

menyeberangi 2: AH 2 2 DBY 6 3 0
Hasil dby 7 0 4 = a his4 ura3-52 leu2-3 1eu2-112
dan DBY 7 3 6 = ~ his4 ura3-52 leu2-3 1eu2-112

menyeberangi 3: DBY 7 0 3 x DBY 7 0 4

Hasil dby 7 4 7 = a his3- ~ l leu2-3 1eu2-112 ura3-5 2 trp1-289

menyeberang 4: DBY 7 4 8 * x DBY 7 4 7; selecttenprototrophs, membedah semua whichsporulate:

Menghasilkan DBY 7 4 9 * = a ste-VC9 his3-A 1 trp1-289 ura3-52 can1

menyeberangi 5: DBY 7 3 6 xaadel - 1 0 1

Hasil dby 7 4 5 = a leu2-3 1eu2-112 ade1-101 ura3-52

menyeberangi 6: DBY 7 4 9 * x DBY 7 4 5; selectten A de +, dissectthosewhichspor ulate-Nya:

Hasil SHY1 = ~ ste-VC9 ura3 - 52t rp I - 2 8 9 leu2-3 1eu2-112 his3 - ~ l adel - 101
SHY 2 = ~ Ste-VC9 ura3 - 52 trp l -289 leu2-3 1eu2-112 his3- ~ l bisa l l O0 SHY 3 = a
ste-VC9 ura3-52 trpl - 2 8 9 leu2-3 1eu2-112 his3 - ~ l ade1-101
can1-100
SHY 4 = a ste-VC9 ura3-52 trpl - 289 leu2-3 Ieu2-112 his3-t ~ l
Saya n lintas ini, semua heterozygousmarkersse gregated 2: 2 termasuk ste-VC9 andmatingtype.

* Semua strain steril (strain unabletomate) adalah markedwith tanda bintang.