nologia Oral TP Aula 16/17 de Abril de 2012

Programa geral das aulas TP

Tcnicas imunolgicas utilizadas em investigao e

diagnstico

Tcnicas serolgicas
com base na deteco de reaces antignio-anticorpo

Tcnicas baseadas em interaces primrias.

Tcnicas baseadas em interaces secundrias.

Tcnicas de imunidade celular

(que permitem o estudo dos linfcitos e outras clulas)

Isolamento dos linfcitos e outras clulas

Caracterizao da especificidade, frequncia e funo dos linfcitos.

19

Isolamento de PBMC
(Peripheral blood mononuclear cells)
cells)
Sangue Plasma
Por centrifugao em gradiente de Ficoll-Hypaque
Definio: Substncia
Constituio: coloidal com colorao
amarela plida
Componente Lquida (55%) : Plasma
Plasma
Componente Slida (45%) : PBMC91%
contm
Elementos Figurados (PBMC) gua
Ficoll
linfcitos e
moncitos
9%
Plaquetas Protenas
Leuccitos Ies
Eritrcitos Substncias nutritivas
Gases
1. Diluio do sangue em PBS (phosphate Produtos de degradao
buffer saline).
2. Adio do sangue diludo no topo do ficoll (cuja densidade maior do que a
dos linfcitos, mas inferior dos eritrcitos e granulcitos).
3. Aps centrifugao, os eritrcitos e granulcitos descem atravs do ficoll
formando um pellet no fundo do tubo.
4. As clulas mononucleadas do sangue perifrico (linfcitos+moncitos) ficam
na interface (anel) entre o plasma e o ficoll. 20

10

Fraccionamento de PBMC
(Peripheral blood mononuclear cells)

Centrifugao
Separao magntica
Cromatografia de afinidade
Citometria de fluxo
FACS

1
 1. Centrifugao
A centrifugao uma operao
unitria para separao de duas
fases (camadas separadas) duma
mistura, por aco da fora
centrfuga a que fica sujeita,
quando em movimento de rotao .

Separao de diferentes fases

Centrifugao diferencial
Centrifugao em gradiente

1. Separao de diferentes fases

Partculas insolveis numa amostra sedimentam no fundo do tubo
de centrfuga, restando o chamado sobrenadante (fase lquida) por
cima do sedimento.

O sobrenadante ento aspirado ou decantado e o sedimento

retirado do tubo.

usada para a separao dos elementos figurados do sangue e o

plasma sanguneo, em que as clulas (eritrcitos, leuccitos,
plaquetas) so depositadas no tubo, podendo o plasma ser
separado e analisado.

Centrifugao Diferencial
Tcnica introduzida por Albert Claude, em 1940

Definio:
Partculas so separadas de acordo com a forma, densidade e
tamanho e segundo passos com aumentos gradativos no tempo e
na velocidade de centrifugao.

Aplicaes:
Utilizada na separao das clulas sanguneas do plasma (o
plasma fica no cimo do tubo e as clulas sanguneas, devido sua
maior densidade, depositam-se no fundo do tubo centrfuga).

2
 Centrifugao de Gradiente
Tcnica introduzida (1950) por N. G. Anderson e M. K. Brake

Definio:
Separao de partculas com base na sua massa e forma
numa soluo de densidade (de sacarose) e/ou concentrao (de
sais) crescente.

Princpio:
A amostra colocada no cimo do tubo e durante a centrifugao
migra de acordo com a sua velocidade e sedimentao.

Ex: gradiente de Ficoll-Hypaque

Centrifugao em gradiente de Ficoll-Hypaque

Os linfcitos humanos podem ser separados do sangue

Centrifugao em gradiente de densidade sobre um tubo

de centrfuga com uma mistura de Ficoll.

Ficoll
Polmero de hidratos de carbono e metrizamida

Gradiente de Ficoll-Hypaque
Mistura de solues de concentraes
progressivamente crescentes que se distribuem
ao longo do tubo de centrfuga, ficando as
solues de maior densidade no fundo.

3
 Centrifugao em
Gradiente de Ficoll-Hypaque

PBMC
contm
linfcitos e
moncitos

1.Diluio do sangue em PBS (phosphate buffer saline).

2.Adio do sangue diludo no topo do ficoll (cuja densidade maior do que a
dos linfcitos, mas inferior a dos eritrcitos e granulcitos).
3.Aps centrifugao, os eritrcitos e granulcitos descem atravs do ficoll
formando um sedimento (pellet) no fundo do tubo.
4.As clulas mononucleares do sangue perifrico (linfcitos+moncitos) ficam
na interface (anel) entre o plasma e o ficoll.

CONTAGEM DAS CLULAS

Cmara de Neubauer (Hemocitmetro)

CONTAGEM DAS CLULAS

(exerccio)

4
 Contagem das clulas no hemocitmetro
N de clulas contadas: 48
Volume de suspenso celular: 10 ml
A suspenso celular inicial foi diluda 1:1 (0,1ml suspenso + 0,1 ml de meio)
antes da contagem
Determinao de n clulas/ml
Utilizando o n obtido (482), multiplicamos por 1x104 factor do hemocitometro e
por 2 (factor de diluio):

(482) x (1x104) x (2) = 9,6 0,4 x 105 clulas/ml

Determinao do n de clulas total

Multiplicamos o n de clulas/ml obtido pelo volume total (10 ml):
(9,6 0,4 x 105) x (10) = 9,6 0,4 x 106 cells

2. Separao magntica
Mtodo de isolamento de populaes celulares pela
utilizao de anticorpos monoclonais contra molculas da
superfcie das clulas conjugados com beads magnticas.

2.1 Separao magntica directa

O anticorpo especifico est

directamente conjugado com
partcula magntica.

Separao mais rpida: requer

somente um nico passo de
marcao.

5
 2.2 Separao magntica indirecta
Usada quando no existem
microbeads directas.

As clulas so marcadas com

um AC 1rio (puro, biotinilado ou
conjugado com fluorocromo)

Adio de AC 2rio (anti-Ig, anti-

biotina, antifluorocromo) ou
conjugado com estreptavidina.

Mtodo adequado para separar

clulas com expresso reduzida
do marcador em causa, uma vez
que permite amplificar a
marcao.

2.3 Separao magntica positiva

As clulas-alvo desejadas so
magneticamente marcadas e retidas
na coluna. Em seguida a coluna
retirada do magneto e as clulas alvo
so eludas com um tampo
apropriado.

Vantagens:
rapidez
excelente pureza
enriquecimento de clulas raras
viabilidade e funo das clulas no
so afectadas.

2.4 Isolamento por depleo magntica

O isolamento de clulas feito por
depleo de clulas no
desejadas.

Clulas no desejadas so
marcadas magneticamente e
eliminadas da mistura celular.

As clulas-alvo esto contidas na

fraco no marcada.

Utilizao:
remoo de clulas indesejadas
se no desejvel ligao do AC
s clulas-alvo
subsequente isolamento de uma
subpopulao celular atravs de
seleco positiva.

6
 3. Cromatografia

A Cromatografia um dos mtodos mais comuns de

purificao de protenas.
Consiste na passagem da protena atravs de uma
coluna (fase estacionria) que desenhada para reter
ou diminuir a velocidade da passagem da fase mvel
onde esto as macromolculas (protenas).
Esta tcnica baseia-se numa propriedade particular,
como o tamanho, carga ou afinidade qumica.

Cromatografia de Afinidade

Esta tcnica pode ser utilizada para

analisar um AC especfico a partir de
um antisoro, atravs da unio
especfica dos anticorpos ao antignio
imobilizado numa matriz slida.

4. Citometria de fluxo

Citometria: anlise quantitativa de parmetros

celulares (clulas, ncleos, cromossomas,
mitocndrias, etc).

Citometria de fluxo: Anlise multiparamtrica de

clulas (uma a uma) em suspenso atravs de
ferramentas pticas.

7
 CITOMETRIA DE FLUXO

Citometria de fluxo princpio:

Passagem das partculas (clulas) em suspenso, de uma
forma alinhada num fluxo continuo, atravs de um feixe de
luz (ex: laser).
Deteco de sinais gerados pela interaco das partculas
com o feixe de luz. Os sinais podem ser gerados por:
Light scatter: disperso do feixe de luz.
Intensidade de fluorescncia: luz emitida por fluorocromos
(ligados a clulas) aps excitao pelo feixe de luz.

Converso dos sinais pticos em sinais electrnicos pelos

detectores.
O computador analisa os sinais electrnicos emitidos pelos
detectores, transformando-os em grficos, permitindo uma
anlise multivariada.

CITOMETRIA DE FLUXO

Componentes do citmetro de fluxo:

I-

II-

III-

CITOMETRIA DE FLUXO

I- Fludos:
Injeco da amostra no lquido de envolvimento (sheath
fluid), passando por um orifcio central do fluxo (50-300
Rm).
As partculas flem no centro no se misturando com o
restante liquido de envolvimento.
A amostra injectada em fluxo laminar.

8
 CITOMETRIA DE FLUXO

II- ptica:

Fontes de iluminao produzem a luz que irradia as

clulas:

Lasers (350-363, 405, 420, 457, 488, 514,

532, 600, 633, 660 nm).

Argon ion, Krypton ion, HeNe, HeCd, YAG,

diodes.

Lmpadas de mercrio

CITOMETRIA DE FLUXO

Sistemas de deteco:
Medem a luz que vm dos componentes das clulas

CITOMETRIA DE FLUXO

Sistemas de deteco:

Detectores de disperso de luz (Light Scatter) do

informao sobre o tamanho e granulosidade da clula.

Foto-sensor de disperso frontal (FSC)

Foto-sensor de disperso lateral (SSC)
Tubos fotomultiplicadores (PMT) medem a fluorescncia
emitida pelos componentes fluorescentes da clula, dando
informao da ligao dos ACs marcados clula e, desse
modo, da expresso de protenas a superfcie da clula.

9
 CITOMETRIA DE FLUXO

Detectores de disperso de luz (Light Scatter)

1 2

CITOMETRIA DE FLUXO

1. Foto-sensor de disperso frontal (FSC):

Capta a intensidade da luz dispersa frontalmente.

A intensidade da disperso frontal proporcional ao
tamanho das partculas.

CITOMETRIA DE FLUXO

2. Foto-sensor de disperso lateral (SSC):

Capta a intensidade da luz dispersa a 90

A intensidade dessa disperso proporcional
granulosidade e forma das partculas.

10
 CITOMETRIA DE FLUXO

Detector de disperso de fluorescncia (PMT):

A fluorescncia emitida detectada por foto-sensores
que recebem o comprimento de onda seleccionado.
A especificidade da deteco de cada sensor
controlada pela seleco do comprimento de onda,
atravs de uma conjugao de filtros e de espelhos.

CITOMETRIA DE FLUXO
FLUORESCNCIA

CITOMETRIA DE FLUXO

FLUORESCNCIA

11
 CITOMETRIA DE FLUXO

FLUORESCNCIA

< Intensidade > Intensidade

de fluorescncia de fluorescncia

CITOMETRIA DE FLUXO

III- Electrnica:
Processamento electrnico do sinal gerado nos sensores
que traduzido num histograma ou dot plot.

Histogramas Dot plot

CITOMETRIA DE FLUXO

Anlise segundo direco de disperso da luz:

Dot plot tpico obtido a partir de sangue total

12
 CITOMETRIA DE FLUXO

Anlise segundo disperso de fluorescncia:

Um fluorocromo encontra-
se ligado a um AC que vai
reconhecer o receptor
celular, para o qual
especfico, aps incubao
das clulas com esse AC.

A intensidade de
fluorescncia representa a
quantidade desse compo-
nente (receptor da superf-
cie celular, molculas intra-
celulares, DNA, RNA)

CITOMETRIA DE FLUXO

Anlise segundo disperso de fluorescncia:

Dot Blot

CITOMETRIA DE FLUXO

Anlise segundo disperso de fluorescncia:

Histograma

< Intensidade > Intensidade

de fluorescncia de fluorescncia

13
 CITOMETRIA DE FLUXO

Anlise segundo
disperso de fluorescncia:

Histograma:
- intensidade de fluorescncia
- percentagem de clulas que
expressam um marcador

Dot plot:
- percentagem de clulas que
expressam um ou dois
marcadores.
- Correlao com 2 marcadores.
> Intensidade
de fluorescncia

CITOMETRIA DE FLUXO

Informao obtida por Citometria de Fluxo:

Tamanho (FSC)
Complexidade (SSC)
Fluorescncia relativa (FL1, FL2, FL3,...)
Anlise multiparametrica complexa.

CITOMETRIA DE FLUXO

Informao obtida por Citometria de Fluxo (cont.):

Quantifica clulas em suspenso.
Separa clulas vivas de clulas mortas.
Qualifica 105 a 107 partculas em ~ 1 min.
Mede a disperso da luz da partcula, a fluorescncia
inata, bem como a fluorescncia adquirida por ligao
a um AC marcado com fluorocromo.
Separao de subpopulaes de clulas para
subsequente anlise.

14
 CITOMETRIA DE FLUXO

reas de aplicao

Imunologia
Hematologia
Anatomia patologica
Biologia celular
Oncologia

CITOMETRIA DE FLUXO

Aplicaes na Imunologia

Separao de clulas sanguneas

Diferenciao de sub-populaes de linfcitos T
Diferenciao de linfcitos B
Diferenciao de clulas NK
Variaes linfoproliferativas (idade, imunodeficincias,
neoplasias, transplantes, doenas autoimunes,
inflamaes)
Fagocitose

ologia Oral TP Aula 16/17 de Abril de 2012

Citometria deCITOMETRIA
Fluxo DE FLUXO
Aplicaes na Imunologia
APLICAES NA IMUNOLOGIA

55

15

Citometria de Fluxo
Aplicaes na Imunologia
 55

CITOMETRIA DE FLUXO
Citometria de Fluxo
Aplicaes na Imunologia
APLICAES NA IMUNOLOGIA

Anlise de moncitos

Anlise de moncitos

56

unologia Oral TP Aula 16/17 de Abril de 2012

28
CITOMETRIA DE FLUXO

Citometria
APLICAES NA de Fluxo
IMUNOLOGIA
Aplicaes na Imunologia

57

CITOMETRIA DE FLUXO

Citometria
Citometria dede fluxo
fluxo
Mede propriedades de clulas num fluxo.
Mede propriedades de clulas num fluxo.
Fluorescence-Activated Cell Sorter
(FACS)
Fluorescence-Activated Cell Sorter (FACS)
Separa as clulas com base nas propriedades
Instrumento
medidas emque permite separar clulas com base na
fluxo.
citometria de fluxo.

Separa as clulas com base nas propriedades medidas

em fluxo.

58

16
29
 FACS
Fluorescence-Activated Cell Sorter (FACS)
Permite separar subpopulaes de linfcitos com base nas diferentes protenas
expressas a superfcie (ex: clulas B, clulas T CD4+, clulas T CD8+)
Cada tipo celular e marcado com um AC especifico que se encontra acoplado a
um fluorocromo.
O citmetro de fluxo detecta e conta individualmente as clulas que passam
atravs do laser.
Os sinais gerados pelos detectores criam uma carga elctrica (+ ou -) no fluxo de
clulas que, entretanto, quebrado, gerando gotas constitudas por uma nica
clula.
As gotas, por terem uma carga elctrica, vo ser desviadas ao passarem por
placas carregadas: as gotas carregadas positivamente so atradas pela placa
negativa e vice-versa, sendo assim separadas e conduzidas para os tubos de
colheita respectivos. As gotas no carregadas (que no contm clulas ou
aquelas cujas clulas no cumprem os critrios pr-seleccionados de
fluorescncia e tamanho) so transferidas para um outro tubo de colheita.

FACS

FACS

17
 Componentes da Resposta Imunolgia
Adaptativa (especfica de AGs)

Caracterizao da
especificidade, frequncia e
funo dos linfcitos

Avaliao de respostas de linfcitos

especficas de AGs
INTERESSE
Medir a eficincia com que um indivduo responde a um
determinado AG.
Medir o grau com que se estabeleceu uma memria
imunolgica especfica.

MTODOS
Deteco da activao das clulas de modo a exercerem
uma funo em particular (secreo de citoquinas,
citotoxicidade).
Deteco directa das clulas atravs do seu receptor.

18
 Determinao da frequncia dos linfcitos
especficos de antignio

Mtodos que detectam activao das clulas

Proliferao celular
Cultura de diluio limitante
ELISPOT
Deteco intracelular de citoquinas por citometria de fluxo
Captura de citoquinas secretadas na superfcie de clulas T vivas.
Ensaios de citotoxicidade (para clulas T citotoxicas)

Mtodo de deteco directa das clulas atravs do

seu receptor
Tetrameros de complexos MHC:peptido biotinilados conjugados com
estreptavidina-fluorocromo.

PROLIFERAO de LINFCITOS em RESPOSTA a AGs

Para que se produzam clulas efectoras (com determinada

especificidade) em n suficiente, os linfcitos especficos de Ag tm
de proliferar.

As clulas T de ratinhos ou humanos imunizados com Ag A proliferam

quando expostas ao antignio A juntamente com clulas
apresentadoras de antignio, mas tal no acontece quando expostas a
antignios contra os quais no houve imunizao (ex. Antignio B).

Este ensaio, apesar de medir respostas de clulas T aps imunizao,

revela pouco acerca das capacidades funcionais das clulas que
respondem.

PROLIFERAO de LINFCITOS
em RESPOSTA a MITOGNIOS

dificil detectar a proliferao de linfcitos em resposta a um Ag

especfico, uma vez que somente uma pequena proporo de clulas
so estimuladas a dividir-se.

Antignios
Induzem a mitose somente em
linfcitos especficos para esse
Ag.

Mitognios policlonais
Substncias que induzem a
mitose em linfcitos de diferentes
especificidades e origens clonais.
So estmulos no especficos.

19
 MTODOS PARA AVALIAR A PROLIFERAO

Incorporao de timidina tritada ([3H]-timidina) avaliada por

contagens de cintilaes por minuto num contador de radiao .

Incorporao de bromodeoxiuridina (BrdU) avaliada por

citometria de fluxo ou imunofluorescncia.

Marcao com CFSE (5,6 Carboxyfluoroscein Diacetate

Succinimidyl Ester) avaliada por citometria de fluxo.

Resposta proliferativa linfocitria avaliada por

incorporao de 3H-timidina no ADN de clulas em diviso
Ensaio baseado na capacidade das clulas em proliferao incorporarem
[3H]-timidina no seu ADN.

1. As clulas so incubadas na presena

de um estmulo apropriado.
2. O processo de diviso celular, associado
duplicao do ADN, comea aps cerca
de 48h.
3. A adio de [3H]-timidina nessa altura vai
permitir a incorporao de trtio radioactivo
no ADN das clulas em diviso.
4. Aps 16-24h em[ 3H]-timidina, a cultura
terminada, as clulas so colhidas num
aparelho automtico (harvester), ficando
presas num filtro, enquando a timidina no Resposta proliferativa de um clone de
Incorporada removida por lavagens.
clulas T humano ao toxide tetnico.
5. A radioactividade do filtro, corres-
pondente extenso de replicao de ADN
e proliferao, medida num contador de
radiao .

Resposta proliferativa linfocitria avaliada por incorporao de

5-bromo-2-deoxiuridina (BrdU) no ADN de clulas em diviso

Ensaio baseado na capacidade das clulas em proliferao incorporarem

BrdU (anlogo da timidina) no seu ADN.

1. As clulas so incubadas com o estmulo apropriado

(antignio ou mitognio) na presena de BrdU (nas
ltimas horas da cultura).
2. No fim da cultura, as clulas so fixadas e marcadas
com anticorpo anti-BrdU conjugado com um
fluorocromo.
Para que o anti-BrdU tenha acesso ao ADN
necessrio desnaturar o ADN (ex: DNAse).
3. As clulas marcadas com anti-BrdU correspondem
s clulas em proliferao.
4. Resultados avaliados por citometria de fluxo ou
imunofluorescncia.

Atravs de marcaes com anticorpos (conjugados com outros fluorocromos)

dirigidos para marcadores da clula, possvel perceber quais as clulas que
proliferaram.

20
 Resposta proliferativa linfocitria avaliada por incorporao de
5-bromo-2-deoxiuridina (BrdU) no ADN de clulas em diviso
Imunologia Oral TP Aula 23/24 de Abril 2011

Clulas CD8+ que

no proliferaram
ogia Oral TP Aula 23/24 de Abril 2011

Clulas CD8+
que proliferaram
Resposta proliferativa linfocitria avaliada por
incorporao de 5-
5-bromo
bromo--2-deoxiuridina (BrdU)
no DNA de clulas em diviso
Resposta
Clulas CD8+ proliferativa linfocitria avaliada por
que no proliferam Clulas CD8-
incorporao de 5- 5-bromo
bromo- -2-deoxiuridina (BrdU)
que proliferaram
no DNA de clulas em diviso
Clulas CD8+
que no proliferam Clulas CD8+
que proliferam

Clulas CD8- que

Clulas CD8+
no proliferaram que proliferam

Clulas estimuladas com anti-CD3

(mimetiza ligao de antignios
Clulasao
CD8-
que proliferam
receptor das clulas T). Clulas CD8-
Clulas CD8- que proliferam
que no proliferam
Clulas CD8-
Clulas pancreticas
Clulas estimuladas com anti-CD3
que no proliferam

(mimetiza ligao de antignios ao

Clulas estimuladas com anti-CD3
receptor das clulas T).
em proliferao
(mimetiza ligao de antignios ao
receptor das clulas T).

Clulas pancreticas em
Clulas pancreticas
proliferao
9 em
9
proliferao

Resposta proliferativa linfocitria avaliada por

CFSE (5,6 Carboxyfluoroscein Diacetate Succinimidyl Ester)
Resposta proliferativa linfocitria avaliada por
Resposta
CFSE ( proliferativa linfocitria
5,6 Carboxyfluoroscein avaliada
Diacetate por
Succinimidyl Ester)
CFSE (5,6 Carboxyfluoroscein Diacetate Succinimidyl Ester)
CFSE um corante fluorescente
CFSEque
um no prejudicial
corante fluorescente s clulas.
Aps entrar nas clulas, sofre
que no prejudicial s clulas.
clivagem do seu ster e difunde-
Aps se
entrar nas clulas,
pelo citoplasma. sofre
clivagem do seu ster
medida que e difunde-
as clulas se
se pelo citoplasma.
dividem, a molcula CFSE
CFSE medida que as clulas
repartida se
igualmente entre as
clulas-filhas,
dividem, a molcula CFSE resultando
na
CFSE diminuio
repartida igualmenteda deteco
entre as do sinal
CFSE.
clulas-filhas, resultando na
Aplicaes in vitro e in vivo.
diminuio da deteco do sinal
CFSE.Aplicao in vivo:
Aplicaes
- Colherin vitro e in vivo.
clulas de um animal e
PBMC marc-las com CFSE.
+ - Inocular
Aplicao in vivo:clulas marcadas no
Antignio Aplicao
animal.
- Colher clulas deinumvivo:
animal e
(6 dias)PBMC - Colher as clulas mais tarde e
marc-las com CFSE.
analisar quantas divises
+ - Colher
- Inocular clulas
clulas
celulares marcadas
de um
ocorreram noanimal
num e marc-las
Antignio animal.determinado periodo de tempo.
com
- Colher asCFSE.
clulas mais tarde e 10
(6 dias)
analisar quantas divises
- Inocular
celulares clulas
ocorreram num marcadas no animal.
determinado periodo de tempo.
- Colher as clulas mais tarde
10
e analisar
quantas divises celulares ocorreram
num determinado periodo de tempo.

5
Imunologia Oral TP Aula 23/24 de Abril 2011

Resposta proliferativa linfocitria avaliada por

CFSE (5,6 Carboxyfluoroscein Diacetate Succinimidyl Ester)

O sinal CFSE Resposta

avaliado por citometria de fluxo.linfocitria avaliada por
proliferativa
A populao inicial
CFSE(IP) aCarboxyfluoroscein
(5,6 populao com maior intensidade de
Diacetate Succinimidyl Ester)
fluorescncia de CFSE.
O sinal CFSE avaliado por citometria de fluxo.
Cada diviso celular (1-5) resulta numa reduo do sinal.
A populao inicial (IP) a populao com maior intensidade de
fluorescncia de CFSE.
Cada diviso celular (1-5) resulta numa reduo do sinal.

Esta tcnica d informao da cintica da proliferao.

Esta tcnica d informao da cintica da proliferao.
possvel determinar o nmero
possvel determinar de divises
o nmero celulares
de divises e a efrequncia
celulares a frequnciade
declulas
clulas em
em cada diviso.
cada diviso.

Atravs de marcaes com anticorpos (conjugados com outros

fluorocromos) dirigidos para marcadores da clula, possvel 11
perceber quais as clulas que proliferaram.

Ensaio ELISPOT
(Frequncia de clulas T especficas)
Variante do ELISA em que anticorpos imobilizados em placas so usados para
capturar citocinas secretadas por clulas T individuais. 21
1. Estimulao das clulas T com o antignio
de interesse.

2. Adio das clulas T estimuladas a poos de

microplacas revestidos com anticorpos para
a citocina a ser medida.
As clulas T activadas secretam
citocinas que sero capturadas pelos
anticorpos imobilizados.

3. Remoo das clulas aps um perodo de

tempo.
 Esta tcnica d informao da cintica da proliferao.
Esta tcnica d informao da cintica da proliferao.
possvel determinar o nmero de divises celulares e a frequncia de clulas em
possvel determinar o nmero de divises celulares e a frequncia de clulas em
cada diviso.
cada diviso.
Atravs de marcaes com anticorpos (conjugados com outros
Atravs de marcaes com anticorpos (conjugados com outros
fluorocromos)
fluorocromos) dirigidos
dirigidos parapara marcadores
marcadores da clula,
da clula, possvel
possvel 11
11
perceber
perceber quais
quais as as clulas
clulas queque proliferaram.
proliferaram.

Ensaio
Ensaio ELISPOT
ELISPOT
ELISPOT
(Frequncia dede
(Frequncia clulas T(Freq.
clulas de clulas T especficas)
especficas)
T especficas)
Variante dodo
Variante ELISA emem
ELISA que anticorpos
que imobilizados
anticorpos emem
imobilizados placas soso
placas usados para
usados para
capturar citocinas
capturar secretadas
citocinas porpor
secretadas clulas T individuais.
clulas T individuais.

1. 1.Estimulao
Estimulaodasdas
clulas T com
clulas o antignio
T com o antignio
de interesse.
de interesse.

2. 2.Adio dasdas
Adio clulas T estimuladas
clulas a poos
T estimuladas de de
a poos
microplacas
microplacasrevestidos comcom
revestidos anticorpos parapara
anticorpos
a citocina a ser
a citocina medida.
a ser medida.
As Asclulas T activadas secretam
clulas T activadas secretam
citocinas que sero capturadas pelos
citocinas que sero capturadas pelos
anticorpos imobilizados.
anticorpos imobilizados.
3. Remoo das clulas aps um perodo de
3. Remoo das clulas aps um perodo de
tempo.
tempo.
4. Adio de um segundo anticorpo anti-
4.citocina
Adio marcado
de um segundo com anticorpo e,
enzima anti-
citocina
posteriormente, marcado compara enzima
do substrato, revelar o e,
posteriormente,
crculo de citocinas doemsubstrato, para revelar
volta da posio de o
cada clula T activada (correspondente de
crculo de citocinas em volta da posio
cada clula
formao de um T activada
ponto -spot(correspondente
- colorido). Cada clula
formao de um ponto -spot - colorido). Cada clula
secretora de
5. O clculo da frequncia de clulas T que secretora
citocinas d de
5.secretam
O clculo
umadadeterminada
frequncia citocina
de clulas T que
feito citocinas
origem a umd
secretamcada
contando uma spot
determinada citocina ofeito
e considerando
contando cada T inicialmente
spot e considerando origem
nico a um
spot.
nmero de clulas adicionado o
nmero de clulas T inicialmente adicionado
placa. nico spot.
placa. 12
12

Imunologia Oral TP Aula 23/24 de Abril 2011

6
6

Desvantagens
Desvantagens das
dastcnicas
tcnicasde
de
Cultura
Culturadede
diluio limitante
diluio e ELISPOT
limitante e
ELISPOT
No avaliam o fentipo das clulas.

No avaliam o fentipo dasseclulas.

difcil determinar clulas individuais so capazes
de secretar diferentes citocinas simultaneamente.
difcil determinar se clulas individuais so capazes de segregar
diferentes citocinas simultaneamente.

SOLUO:
Tcnica com base na citometria de fluxo que
permite SOLUO:
detectar citocinas marcadas com
Tcnica com base na
fluorescncia citometria
dentro de fluxo
de clulas que permite detectar
T activadas.
citocinas marcadas com fluorescncia dentro de clulas T
activadas.

13

Marcao intracelular de citocinas

Marcao intracelular de citocinas
Permite avaliar o perfil de produo de citocinas a nvel da clula individual.
1. Para evitar a perda da associao entre as citocinas e a clula produtora, usado um inibidor do
transporte das citocinas para o exterior da clula, permitindo a acumulao das citocinas no retculo
endoplasmtico.

2. As clulas so fixadas para manter as protenas no interior das clulas e nas membranas celulares
aquando da subsequente permeabilizao.

3. As clulas so permeabilizadas para que anticorpos anti-citocinas marcados com fluorocromos tenham
acesso ao interior da clula.

4. As clulas podem tambm ser incubadas com anticorpos (marcados com outros fluorocromos) que se
ligam a protenas da superfcie, o que permite avaliar que subpopulaes de clulas T produzem uma
ou mais citocinas.

5. As clulas so adquiridas num citmetro de fluxo.

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7 22
munologia Oral TP Aula 23/24 de Abril 2011

Marcao intracelular de citocinas

Marcao intracelular de citocinas
Avaliao por Citometria de Fluxo
Avaliao por Citometria de Fluxo

Esta abordagem permite:

IL2

R2

Definir a % de clulas
R1
produtoras de citocinas
numa populao.
CD3
Clulas CD8-
Produtoras de IL-2
Clulas CD8+
Produtoras de IL-2
Caracterizar
fenotipicamente a clula
produtora da citocina.
IL2

IL2

Estudar a produo
simultnea de vrias
citocinas.
Clulas CD8- no Clulas CD8+ no
Produtoras de IL-2
IFN CD8 Produtoras de IL-2

15

Desvantagens das tcnicas de

marcao intracelular de citocinas

Desvantagens das tcnicas de

marcao
As clulas intracelular
tm de ser mortas de citocinas
(fixadas) e permeabilizadas com
detergentes para que seja possvel a deteco das citocinas.
As clulas T tm de ser mortas (fixadas) e permeabilizadas
com detergentes para que seja possvel a deteco das
citocinas

SOLUO:
Tcnica de captura, na superfcie de clulas T vivas, de
citocinas secretadas marcadas.
SOLUO:
Tcnica de captura, na superfcie de clulas T
vivas, de citocinas secretadas marcadas.

Imunologia Oral TP Aula 23/24 de Abril 2011

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Captura de citocinas
CAPTURA DE CITOCINAS
(Ensaio de secreo de citocinas)
(Ensaio de secreo de citocinas)
Permite analisar as clulas produtoras de citocinas sem as matar nesse
Permite analisar as clulas produtoras de citocinas sem as matar nesse
processo.
processo.
Clulas T activadas so incubadas com anticorpos hbridos (em que os dois stios
de ligao ao antignio reconhecem diferentes ligandos um marcador especfico da 8
clula T e a citocina em questo).
Se a clula T produz uma determinada citocina, esta capturada antes de se difundir para fora
da superfcie da clula.

A deteco da citocina produzida feita com um segundo anticorpo anti-citocina

marcado com um fluorocromo.

Anticorpo Segundo anticorpo

hbrido Citocina
anti-citocina marcado
17
com fluorocromo

Captura de citocinas
(Ensaio de secreo de citocinas) 23
Possibilidade de isolar as clulas secretoras das citocinas

Marcao das clulas

 Anticorpo Segundo anticorpo
hbrido Citocina
anti-citocina marcado
17
com fluorocromo

CAPTURA DE CITOCINAS
Captura de citocinas
(Ensaio de secreo de citocinas)
(Ensaio de secreo de citocinas)

Possibilidade
Possibilidade de isolar
de isolar asas clulassecretoras
clulas secretoras de
dascitocinas.
citocinas

Marcao das clulas

com anticorpo anti-
fluorocromo conjugado
com Microbeads
magnticas.

Separao magntica
das clulas secretoras
das citocinas.

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munologia Oral TP Aula 23/24 de Abril 2011

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ENSAIOS DE CITOXICIDADE
Ensaios de citotoxicidade
Ensaios com base na morte de clulas-alvo causada por clulas T
Ensaios com base na morte de clulas-alvo causada por clulas Tc
citotxicas (clulas T CD8+ activadas).
(clulas T CD8+ activadas).
Ensaio de libertao de 51Cr

Incubao das clulas-alvo com cromato de sdio marcado radioactivamente.

Adio de clulas T citotxicas provocando a morte de clulas-alvo que, assim,
libertam 51Cr. As clulas vivas no libertam 51Cr.
Medio de 51Cr nos sobrenadantes das co-culturas de clulas T citotxicas: clulas-
alvo.

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Deteco directa das clulas T especficas

(atravs do seu receptor)
Ao contrrio das clulas B, as clulas T no reconhecem antignios sozinhos. Em vez
disso, reconhecem complexos de fragmentos peptdicos de antignio ligados a
molcula MHC do prprio.
Impossibilidade de utilizao de Ag estranho para detectar
directamente clulas T especficas.

A afinidade de interaco entre o receptor da clula T e o complexo

MHC:pptido demasiado baixa para permitir a marcao das clulas T
com o seu complexo MHC:pptido especfico.
Soluo: Tetrmeros MHC:pptido aumentam afinidade de interaco
com clulas T especficas do pptido

Permite quantificar a
frequncia de clulas T
CD8 especficas para
um dado pptido.

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10