ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA

Oleh:
Nama : Sekar Tyas Pertiwi
NIM : B1A016080
Rombongan : IV
Kelompok : 2
Asisten : Muhammad Ilham Fahmi

LAPORAN PRAKTIKUM GENETIKA

KEMENTERIAN RISET, TEKNOLOGI, DAN PENDIDIKAN TINGGI

UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
FAKULTAS BIOLOGI
PURWOKERTO

2017
 HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil
HASIL ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA SAMPEL DNA

Gambar 1. Hasil Visualisasi Elektroforesis DNA

1. DNA marker
2. Segmen DNA hasil praktikum
B. Pembahasan

Elektroforesis adalah teknik yang digunakan untuk memisahkan dan memurnikan

suatu makromolekul khususnya protein dan asam nukleat berdasarkan perbedaan ukuran.
Elektroforesis merupakan metode yang paling banyak dipakai saat ini dalam percobaan
biokimia dan biologi molekuler (Magdeldin, 2012). Elektroforesis gel agarosa adalah teknik
paling baik yang pernah dibuat dan secara rutin digunakan di laboratorium klinis untuk
analisis protein dan DNA pada berbagai cairan biologis (serum, urin, CSF). Teknik ini
merupakan teknik yang menggunakan prinsip elektroforesis zona. Seperti yang diketahui,
molekul protein bermigrasi pada medium padat/gel yang direndam dengan suatu larutan
penyangga di bawah pengaruh medan listrik. Migrasi ini tergantung pada muatan listrik, titik
isoelektrik bersih dan massa molekul protein (Jean, 2010).
Prinsip kerja elektroforesis gel dimulai saat makromolekul yang bermuatan listrik
ditempatkan pada medium berisi tenaga listrik. Molekul-molekul tersebut akan bermigrasi
menuju kutub positif atau kutub negatif berdasarkan muatan yang terkandung di dalamnya
(Magdeldin, 2012). Molekul-molekul yang bermuatan negatif (anion) akan bergerak menuju
kutub positif (anoda), sedangkan molekul-molekul yang bermuatan positif (kation) akan
bergerak menuju kutub negatif (katoda) (Klug, 1994).
Menurut Wolfe (1993), dalam proses elektoforesis terdapat beberapa faktor yang
mempengaruhi laju pergerakan dari molekul DNA, yaitu:
1. Ukuran Molekul DNA
Molekul yang berukuran lebih kecil akan cepat bergerak melewati gel karena
hambatan yang akan dihadapi tidak lebih banyak dibandingkan molekul berukuran besar.
2. Konsentrasi gel
Semakin tinggi konsentrasi agarosa, semakin kaku gel yang dibuat sehingga sukar
untuk dilewati molekul-molekul DNA. Konsentrasi agarosa yang lebih tinggi memudahkan
pemisahan DNA yang berukuran kecil, konsentasi agarosa yang lebih rendah memudahkan
pemisahan DNA dengan ukuran yang lebih besar.
3.Bentuk molekul
Molekul yang memiliki bentuk elips atau fibril akan lebih cepat bergerak
dibandingkan dengan yang berbentuk bulat.
4. Densitas muatan
 Densitas muatan yaitu muatan per unit volume molekul. Molekul dengan densitas
muatan tinggi akan bergerak lebih cepat dibandingkan molekul dengan densitas muatan yang
rendah.
5. Pori-pori gel
Semakin kecil pori-pori gel yang digunakan, semakin lambat pergerakan molekul
DNA.
6. Voltase
Semakin tinggi tegangan listrik yang diberikan, semakin cepat pergerakan molekul
DNA.
7. Larutan buffer elektroforesis
Buffer dengan kadar ion tinggi akan menaikkan konduktansi listrik sehingga
mempercepat migrasi DNA.
Praktikum elektroforesis gel ini dimulai dengan pembuatan gel agarose 0,8%.
Praktikan tidak melakukan pembuatan gel agarose 0,8% karena dilakukan oleh asisten
praktikum. Secara umum, proses pembuatan gel agarose 0,8% dilakukan dengan cara
mencampurkan bubuk agarosa dengan larutan buffer TAE, yang kemudian dipanaskan di
dalam microwave, selanjutnya dituangkan ke dalam cetakan yang telah disiapkan dengan
comb-nya dan tunggu sampai mengeras. Bubuk agarose yang digunakan sebanyak 0,4 gr dan
larutan running buffer TAE (Trisasetat-EDTA) sebanyak 50 mL yang berperan untuk
memudahkan migrasi dari fragmen DNA berdasarkan perbedaan kekuatan ionik (Magdeldin,
2012). Setelah gel mengeras, gel dimasukkan ke dalam ruang elektroforesis dan dilakukan
penambahan running buffer. Penambahan running buffer dilakukan dengan tujuan
mempermudah pengerasan gel saat dilakukan pemanasan (Gardner, 1991).
Tahap selanjutnya adalah mencampurkan DNA dengan loading buffer yang memiliki
fungsi membantu sampel turun ke dalam well dan membantu memonitor berapa lama proses
elektroforesis telah berlangsung karena memiliki pewarna bromofenol biru (Magdeldin,
2012).
Selanjutnya dilakukan penuangan campuran loading buffer dengan produk DNA
sebanyak 4l dan juga larutan marker 1kb sebanyak 3l pada sumur/well yang telah dibentuk
pada gel. Sedangkan untuk marker 1kb dituang pada dua sisi ujung (atas dan bawah) well
yang ada. Proses pemindahan dilakukan dengan memakai mikropipet dan harus dilakukan
secara hati-hati agar campuran DNA dengan loading buffer tidak meluber ke bagian well
yang lain. DNA memiliki muatan negatif (DNA mengandung gugus PO4) sehingga
diharapkan akan bergerak menuju kutub positif (Martin, 1996).
 Praktikum dilanjutkan dengan memasang penutup ruang elektroforesis dan diberikan
arus listrik untuk tahap running. Running elektroforesis dilakukan pada tegangan 90 Volt dan
dengan arus sebesar 400 mA selama 30 menit. Kecepatan migrasi DNA sangat dipengaruhi
oleh tegangan listrik dan arus listrik yang di berikan oleh power supply ke tangki
elektroforesis. Fragmen DNA yang besar akan bergerak lebih cepat dibandingkan dengan
fragmen DNA yang kecil (Magdeldin, 2012). Gel agarose nantinya akan dikeluarkan dari
ruang elektroforesis setelah mengalami perubahan warna. Dokumentasi dilakukan dengan
gel doc (Davis, 1994).
Untuk elektroforesis, ada beberapa bahan yang diperlukan, salah satunya adalah gel
agarosa yang merupakan suatu kolodial laut yang dimurnikan dari alga. Gel agarosa
digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang lebih besar (lebih dari 200 bp) dan gel
poliakrilamida digunakan untuk fragmen kecil (kurang dari 200 bp). Ketika dididihkan dalam
suatu larutan bufer, agarosa akan larut dan ketika didinginkan akan memadat membentuk gel.
Pendinginan dilakukan sekitar suhu 50-60oC apabila terlalu panas akan merusak karet-karet
penyimpan agar. Selain itu, viskositasnya rendah sehingga akan menimbulkan gelembung-
gelembung sehingga apabila dituangkan dikhawatirkan ada udara yang terjebak (Birren,
1999).
TAE (tris asetat, EDTA pH 8) berfungsi sebagai media penghantar arus. Pada media
tersebut, fragmen mDNA akan bergerak dengan perbedaan kecepatan akibat adanya
perbedaan kekuatan ionic (Birren et. al., 1999). Fragmen DNA akan terpisah berdasarkan
kekuatan ukuran pasangan basa. Untuk melihat pita DNA maka harus menandai gel dengan
ethidium bromide yang merupakan warna fluoresence (merah-oranye) yang menginterhelat
DNA dan kemudian dapat dilihat dengan sinar UV (Poedjiadi.1994).
Loading buffer (loading dye) terdiri atas sukrosa 50%, EDTA Ph 8 dan brom fenol
biru yang digunakan sebagai pewarna guna mempermudah pengamatan berpindahnya noda
dalam gel dan menentukan sejauh mana proses elektroforesis telah berlangsung dengan
adanya warna biru yang bergerak dalam agar. Selain itu, penambahan sukrosa ini adalah
sebagai pemberat bagi sampel sehingga tenggelam ke dalam sumur gel. Loading dye adalah
senyawa yang digunakan sebagai pewarna dari DNA target yang ingin dipisahkan dengan
metode elektroforesis. Proses elektroforesis juga dapat ditentukan sejauh mana proses
tersebut telah berjalan, dilihat dari pergerakan senyawa berwarna yang berwarna biru yang
bergerak melewati gel. Loading dye juga berfungsi sebagai pemberat bagi sampel DNA yang
ingin dipisahkan. Loading dye akan membuat sampel DNA menjadi lebih berat sehingga
dapat tenggelam ke dalam sumur gel (Poedjiadi, 1994).
 Etidium bromida dapat berfungsi sebagai pewarna (fluorescence) karena menyisip di
antara basa asam nukleat. Hal ini dapat terjadi karena ethidium bromida sedikit mirip
pasangan basa dan dapat masuk ke dalam rantai ganda DNA di antara pasangan basanya.
Peristiwa tersebut sangat mutagen. Ethidium bromida merupakan fluoresence yang lemah.
Fluoresensi terjadi karena ekeltron tereksitasi ke tingkat energi yang lebih tunggi (dengan UV
265 nm). Ketika elektron kembali pada tingkat energi yang lebih rendah, muncul perbedaan
energi (sinar tampak) (Poedjiadi.1994).
Praktikum elektroforesis gel juga menggunakan alat-alat yang mempunyai fungsi
dan peranan masing-masing. Alat-alat tersebut yaitu mikropipet, aparatus
elektroforesis, power supply, sumber sinar UV, dan sarung tangan. Mikropipet berfungsi
untuk memindahkan sampel dan larutan lainnya dari tube ke dalam wells pada aparatus
elektroforesis. Aparatus elektroforesis terdiri atas comb (sisir) yang
membentuk well (sumur) pada gel agarosa, tray yang merupakan wadah cetakan gel, dan
chamber yang merupakan medium tempat berlangsungnya proses elektroforesis. Power
Supply (DC) sebagai sumber energi untuk aparatus elektroforesis. UV transluminator
berfungsi untuk membantu mengamati hasil band yang tampak sehingga terlihat lebih
jelas (Amersham, 1999).
Interpretasi dari praktikum elektroforesis yaitu akan didapatkan pita-pita protein yang
terpisahkan berdasarkan berat dan ukuran molekulnya. DNA marka sebagai acuan akan
menunjukkan seberapa jauh DNA sampel bermigrasi dari wells, semakin jauh jarak DNA
sampel bermigrasi menunjukkan semakin kecil molekul yang mampu menembus gel agarose,
dan sebaliknya jika molekul terlalu besar maka kemampuan bermigrasi pun akan semakin
sulit. Visualisasi akan terlihat hasil migrasi apa terlihat jelas DNA sampelnya atau tidak, jika
terlihat jelas maka itu berarti clear atau tidak terdapat RNA yang tercampur didalamnya,
sedangkan jika tak terlihat jelas maka itu disebut smear atau terdapat RNA yang tercampur di
dalamnya. Hasil praktikum kelompok empat menunjukkan bahwa DNA yang terlihat di
visualisasi merupakan clear karena terlihat jelas.
 KESIMPULAN

1. Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan

atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya.
2. Prinsip kerja elektroforesis yaitu molekul yang bermuatan negatif (anion) akan
bergerak menuju kutub positif (anoda) dan sebaliknya molekul yang bermuatan positif
(kation) akan bergerak menuju kutub negatif (katoda).
 DAFTAR REFERENSI

Amersham. 1999. Protein Electrophoresis. USA: Amersham Biosciences.

Birren, B., & Lai. 1993. Pulsed Field ge Electrophoresis: A Practical Guide. San Diego:
Academic Press, Inc.

Davis, L. M., Kuehl & Battey, J. 1994. Basic methods: Molecular Biology 2nd Ed. Norwola:
Appleton & Lange.

Gardner, E.J., Simmons & Snustad, D. P. 1991. Principles of Genetics 8th Ed. New York:
John Wiley & Sons Inc.

Jean, F. G. 2010. Agarose Gel Electrophoresis Aplications in Clinical Chemistry. Journal

of Medical Biochemistry, 29(1), pp. 20-27.

Klug, W. S. 1994. Concept of Genetics 4th Ed. Ohio: Merrill Publishing Co.

Magdeldin, S. 2012. Gel Electrophoresis - Principles and Basics. Rijeka: InTech Publisher.

Martin, R. 1996. Gel electrophoresis: Nucleid acids. Inggris: Bros Scientific Publishers Ltd.

Poedjiadi, A. 1994. Dasar-dasar Biokimia. Jakarta: UI Press.

Wolfe, S. L. 1995. Introduction to Cell and Molecular Biology. Belmont: Wardworth

Publishing Company.