Farmacopea
Brasilea
Volumen 1
Esta traduo um produto de termo de cooperao entre a Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria
(ANVISA) e a Organizao Pan-Americana de Sade (OPAS), e no substitui a verso em portugus.
This translation is a product of a cooperation agreement between Brazilian Health Surveillance Agency
(ANVISA) and Pan American Health Organization (PAHO), and does not replace the portuguese version.
Esta traduccin es un producto del acuerdo de cooperacin entre la Agencia Brasilea de Vigilancia Sanitaria
(ANVISA) y la Organizacin Panamericana de Salud (OPAS), y no sustituye la versin en portugus.
5 edicin
Brasilia
2010
5 edicin
Presidente
Paulo Gadelha
Presidente de la Repblica
Luiz Incio Lula de la Silva Vicepresidente de Ensino, Informacin y Comunicao
Maria del Carmo Leal
Ministro de Estado de la Sade
Jos Gomes Tiemporo
Director-Presidente
Dirceu Raposo de Mello
Brasil. Farmacopea Brasilea, volumen 2 / Agencia Nacional de Vigilancia Sanitaria. Brasilia: Anvisa, 2010.
546p., 1v/il.
ISBN 978-85-88233-41-6
La Direccin Colegiada de la Agencia Nacional de Vigilancia Sanitaria, en el uso de la atribucin que le otorga el inciso
IV del art. 11 del Reglamento aprobado por el Decreto n. 3.029, de 16 de abril de 1999, y teniendo en vista lo dispuesto
en el inciso II y 1 y 3 del art. 54 del Reglamento Interno aprobado en los trminos del Anexo I de la Ordenanza N
354 de la ANVISA, del 11 deagosto del 2006, reeditada en el DOU (Diario Oficial de la Unin) de 21 de agosto de 2006,
y adems lo que consta del art. 7 inciso XIX de la Ley n. 9.782,del 26 de enero de 1999, en reunin realizada el 11 de
noviembre del 2010, adopta la siguiente Resolucin de la DireccinColegiada y yo, DirectorPresidente, determino su
publicacin:
Art. 1 Queda aprobada la Farmacopea Brasilea, 5a edicin, constituida del Volumen 1 - Mtodos Generales y textos y
Volumen 2 - Monografas.
Art. 2 Los insumos farmacuticos, los medicamentos y otros productos sujetos a la vigilancia sanitaria deben atender a
las normas y especificaciones establecidas en la Farmacopea Brasilea.
Prrafo nico. En la ausencia de monografa oficial de materia prima, formas farmacuticas, relacionados y mtodos
generales en la quinta edicin de la Farmacopea Brasilea, para el control de insumos y productos farmacuticos se admi-
tirla adopcin de monografa oficial, en su ltima edicin, de cdigos farmacuticos extranjeros, en la forma dispuesta
en normas especficas.
Art. 3 Estprohibidala impresin, distribucin, reproduccin o venda de la Farmacopea Brasilea, 5a edicin sin la pre-
via y expresa anuencia de la ANVISA.
Prrafo nico. Sin perjuicio delo dispuesto en el encabezado de este artculo, la ANVISA dispondr gratuitamente en su
sitio web copia de la quinta edicin y de sus actualizaciones.
Art. 4 Queda autorizada la Fundacin Oswaldo Cruz, por medio de la Editora Fiocruz, para la comercializacin de los
ejemplares de la quinta edicin de la Farmacopea Brasilea
Art. 5 Quedan revocadas todas las monografas y mtodos generales de las ediciones anteriores de la Farmacopea Bra-
silea.
Art. 6 Esta Resolucin entrar en vigor noventa (90) das despus de a su publicacin.
Volumen 1
1 PREFACIO
2 HISTRICO
3 FARMACOPEA BRASILEA
4 GENERALIDADES
5 MTODOS GENERALES
5.1 Mtodos generales aplicados a medicamentos
5.2 Mtodos fsicos y fsico qumicos
5.3 Mtodos qumicos
5.4 Mtodos de farmacognosia
5.5 Mtodos biolgicos, ensayos biolgicos y microbiolgicos
5.6 Mtodos inmunoqumicos
5.7 Mtodos fsicos aplicados a materiales quirrgicos y hospitalarios
6 RECIPIENTES PARA MEDICAMENTOS Y RELACIONADOS
6.1 Recipientes de vidrio
6.2 Recipientes plsticos
7 PREPARACIN DE PRODUCTOS ESTRILES
7.1 Esterilizacin y garanta de esterilidad
7.2 Indicadores biolgicos
7.3 Proceso asptico
7.4 Salas limpias y ambientes controlados asociados
7.5 Procedimientos de liberacin
8 PROCEDIMIENTOS ESTADSTICOS APLICABLES A LOS ENSAYOS BIOLGICOS
8.1 Glosario de smbolos
8.2 Fundamentos
8.3 Valores atpicos
8.4 Ensayos directos
8.5 Ensayos indirectoscuantitativos
8.6 Promediosmviles
8.7 Ensayos indirectos todo o nada
8.8 Combinacin de estimativas de potencia
8.9 Tablas estadsticas
8.10 Ejemplos de clculos estadsticos aplicados en ensayos biolgicos
9 RADIOFRMACOS
Volume 2
ESTRUCTURA GENERAL DE LAS MONOGRAFAS 555
MONOGRAFAS 557
NDICE ALFABTICO 1383
a
1
Farmacopea Brasilea, 5 edicin
1 PREFACIO
Realizar el prefacio de una obra de la magnitud de una far- culos, presentacin de trabajos en congresos, discusiones
macopea nacional no es tarea fcil. Al presentar un trabajo, en mesas redondas, charlas en eventos nacionales e inter-
en que se tuvo participacin en todo el proceso construc- nacionales, elaboracin de tesis de doctorado, disertacio-
tivo, debe tenerse cuidado para emitir una opinin con la nes de maestra y monografas de conclusin de cursos de
mayor exencin posible. especializacin.
No obstante, es un enorme orgullo poder expresar, en La produccin cientfica emanada de la quinta edicin lle-
nombre de una Comisin y de diversos Comits, las im- v a FB 5 a un grado de destaque tcnico cientfico con
presiones finales de una obra de caractersticas tcnicas reconocimiento por congneres internacionales.
y cientficas, que ser instrumento para acciones de salud
pblica que se destinan a proteger la poblacin de su pas Nada de eso habra sido realizado, si no fuese por la estruc-
por medio de la prevencin del riesgo sanitario. No se debe tura construida por la Comisin Permanente de Revisin
olvidar la fuerza poltica que la Farmacopea Brasilea, 5a de la Farmacopea Brasilea, responsable de la cuarta edi-
edicin (FB 5) trae para el Pas. cin, que tiene el mrito de haber establecido la dinmica
necesaria para la elaboracin de un documento de tamaa
Fuimos convocados, por la Agncia Nacional de Vigiln- responsabilidad y, principalmente, haber consolidado la
cia Sanitria (Anvisa) para presidir los trabajos que iran a mentalidad de la real importancia de ese compendio para
dar forma a la quinta edicin de la Farmacopea Brasilea, una sociedad en constante evolucin.
no titubeamos ni un minuto porque conocemos el nivel de
competencia, compromiso y responsabilidad de los inte- De esa forma, puede la CFB y sus Comits, en consonancia
grantes de la Comisin de la Farmacopea Brasilea (CFB). con la Anvisa, traer a la sociedad brasilea un nuevo cdi-
Posteriormente, la CFB nombr a los coordinadores de los go totalmente revitalizado, presentado en dos volmenes
Comits Tcnicos Temticos (CTT) y estos formaron sus divididos en Mtodos Generales y Monografas. Estn in-
equipos utilizando el mismo criterio. cluidos ciento setenta y seis mtodos generales y quinien-
tas noventa y nueve monografas, de las cuales doscientas
Tenemos, ahora, una obra que es un marco divisor de esta setenta y siete de insumos farmacuticos, doscientas diez
y de las futuras ediciones, as como en las relaciones pro- de especialidades, cincuenta y siete de plantas medicinales,
fesionales entre el cuerpo tcnico cientfico, el administra- seis de relacionados, treinta de productos biolgicos y die-
tivo y la sociedad. cinueve de hemocomponentes y hemoderivados.
Las ediciones anteriores de la Farmacopea Brasilea no En el captulo de Generalidades (4), fue realizada la ac-
fueron, hasta entonces, revocadas y, por lo tanto, legalmen- tualizacin de las definiciones y la inclusin de numerosas
te estaban en vigor. Adems del perjuicio cientfico, por la otras, atendiendo a las particularidades de cada Comit.
brecha de los mtodos descritos, haba un cierto obstculo
para las acciones sanitarias que se basan en las descrip- En Procedimientos tcnicos aplicados a medicamentos
ciones farmacopeicas tanto para el rea de registro, como (5.1) se destacan la completa revisin del mtodo de uni-
para el rea de control de calidad, as como tambin para formidad de dosis unitarias (5.1.6), ahora armonizado con
la fiscalizacin. nuevos mtodos publicados por las principales farmaco-
peas internacionales. Otro destaque es la inclusin de la
Por determinacin superior, la CFB realiz arduo trabajo prueba de goteo (5.1.8), de gran importancia para los estu-
de revisin de las mil setecientas veintisiete monografas dios de equivalencia farmacutica de las formas farmacu-
insertadas en las cuatro ediciones anteriores y propuso ex- ticas lquidas de uso oral.
clusiones, reevaluaciones textuales, reevaluaciones meto-
dolgicas, actualizaciones para procedimientos ms segu- En Mtodos fsicos y fsico qumicos (5.2), fue realizada
ros, inclusiones de nuevos textos, entre otros. una revisin completa de los Mtodos de espectrometra
atmica (5.2.13), as como de los mtodos de cromato-
Se dio inicio a proyectos financiados por la Anvisa con grafa (5.2.17) que fueron reescritos y se encuentran ms
participacin de conceptuadas Instituciones de Enseanza completos. Fue incluido texto sobre mtodos de electrofo-
e Investigacin en una forma pionera de trabajo que envol- resis capilar (5.2.22.1) e inmeros otros que pasaron o por
vi dos centenas de profesionales del rea de la salud, entre revisin completa o por modificacin de texto.
ellos una buena parte del medio acadmico, proveyendo al
pas mano de obra calificada para atencin al sector farma- Para los Mtodos qumicos (5.3), fue realizada revisin
cutico brasileo. completa de los ensayos lmite, con nfasis para la elimina-
cin del uso de cido sulfhdrico y la inclusin de la espec-
El envolvimiento con la Academia, como era de esperar- trometra atmica en el Ensayo lmite para metales pesados
se, llev a la produccin de una centena de informaciones (5.3.2.3). Se incluye el Ensayo yodomtrico de antibiticos
tcnicas y cientficas por medio de publicaciones de art- (5.3.3.10), cuyo procedimiento era, anteriormente, descrito
en cada monografa pasando, ahora, a contar con un mto- dando una lectura ms dinmica por medio de la utiliza-
do general propio. cin del captulo especfico. Son descritos, actualmente,
mil cincuenta y un ttulos que representan un aumento de
Los Mtodos de farmacognosia (5.4) fueron revistos y am- cien por ciento con relacin a la edicin anterior.
pliados, destacando los Mtodos de preparacin y anlisis
de extractos vegetales (5.4.3), con el aumento de seis nue- Todos los anexos fueron revisados y fue incluido el Anexo
vos mtodos generales. C, que trata de solventes comnmente empleados en anli-
sis cromatogrficos
Los Mtodos biolgicos, ensayos biolgicos y microbio-
lgicos (5.5) son presentados con la inclusin de una serie No podemos tener la ingenuidad de pensar una farmaco-
de Mtodos biolgicos (5.5.1), tales como la determina- pea sin errores. A pesar de que todos los textos hayan sido
cin de cantidades de factores de la coagulacin sangunea sometidos a consulta pblica y a una revisin cuidadosa,
humana, totalizando diecisis nuevos mtodos. Se realiz en el caso de que haya sido incluida alguna informacin
el trabajo de reorganizacin; revisin y ampliacin de los inadecuada, que pueda llevar a la dificultad de la compren-
ensayos biolgicos (5.5.2) y microbiolgicos (5.5.3). sin final, habr en la Coordinacin de la Farmacopea Bra-
silea un procedimiento para aclarar las dudas y proveer
En Recipientes para medicamentos y relacionados (6), as la sustitucin, se llegara a ser el caso, con rapidez. Nuevos
como en Mtodos de preparacin de productos estriles (7), textos o correcciones estarn expuestos en el medio elec-
fueron realizadas revisiones completas con reorganizacin trnico de la farmacopea, novedad de la presente edicin.
y ampliacin de textos para medicamentos y relacionados.
No estaramos entregando la FB 5 no fuese por la dedi-
Nuevos ejemplos de ensayos fueron incorporados y, aque- cacin extrema de todos los miembros de la CFB, de los
llos constantes de la cuarta edicin de la Farmacopea Bra- CTT, de la COFAR y de todos los colaboradores. Sin el
silea fueron revisados en Procedimientos estadsticos conocimiento tcnico cientfico de esas personas y sin la
aplicables a los ensayos biolgicos (8). conduccin firme de la Directora Maria Ceclia Brito Mar-
tins, nuestro camino hubiese sido ms difcil.
Tres nuevos captulos fueron incluidos: Equivalencia Far-
macutica y Bioequivalencia (10); Agua para uso farma- A pesar de insistir en los agradecimientos, entendemos que
cutico (11) y Sustancias qumicas de referencia (12). La esas personas, por identificarse con los problemas sanita-
inclusin de nuevos captulos fue iniciativa de los referidos rios del Pas, participaron de todo ese proceso imbuidos en
Comits y trae a la luz informaciones de literatura aliada un espritu cvico ya que son, en su mayora, voluntarios.
a las experiencias profesionales de sus respectivos miem-
bros. El captulo de Sustancias colorantes (13) fue revisto Reiteramos que todo el proceso que culmin con la publi-
y ampliado. cacin de la FB 5 se perder se no es implementada una
real poltica de Estado que nos garantice la continuidad de
Trabajo especial fue la consolidacin del captulo de Re- los trabajos de la Comisin de la Farmacopea Brasilea y
activos (14). En ese captulo fueron congregados todos los de los CTT responsables de los dems productos: Farma-
indicadores, soluciones indicadoras, reactivos, soluciones copea Homeoptica, Formulario Nacional, Denominacio-
reactivas, soluciones volumtricas y tampones descritos en nes Comunes Brasileas, Sustancias Qumicas de Referen-
las monografas del volumen 2 de la FB 5. Con eso, se cia y Formulario Fitoteraputico.
elimin la descripcin del reactivo en la propia monografa
Presidente de la CFB
a
1
Farmacopea Brasilea, 5 edicin
cho Sal de Carlsbad artificial Soluto de acetotartarato verificadas, as como el de darle uniformidad al lenguaje
de aluminio, de creosoto, de cresol, de phosphato de sodio farmacopeico adoptado por la Comisin Revisora Oficial.
compuesto y de sulfato basico de hierro Jugo de anan
Jugo de cereza Tintura de coto Valerianato de zinc En la elaboracin de la presente edicin, la COMISIN
Vino aromtico Vino de cacao DE REVISIN DE LA FARMACOPEA sigui, en princi-
pio, la misma orientacin adoptada por la FARMACOPEA
Vinho de ipecacuanha Jarabe de abacaxi, de acido yod- NORTEAMERICANA y, en parte, a la de la FARMACO-
hdrico, de cereza, de cip azougue, de dulce-amarga, de PEA INTERNACIONAL, en lo que se refiere a la distri-
espelina, de gengibre, del manac, del mangerona, de mui- bucin de la materia y estudio de las monografas; en lo
rapuama y de poejo. referido a la ltima Farmacopea, hay que tener en cuenta
que fue Brasil uno de los primeros pases, que adoptaron
PREFACIO DE LA FARMACOPEA DE BRASIL, 2 aquel Cdigo de carcter internacional.
EDICIN
Las monografas que constan en la primera edicin y que
Ya haca treinta aos que estaba en vigor la primera edicin van a continuar en la segunda sufrieron una completa re-
de la Farmacopea BRASILEA, editada en 1929. En ese visin, para ser actualizadas, en cuanto a los procesos de
largo lapso de tiempo, el Cdigo Farmacutico Brasileo ensayo, de medicin de cantidades y otros requisitos, a fin
se torn anticuado y desactualizado, por el inmenso pro- de cumplan con las exigencias de la tcnica moderna.
greso que alcanzaron las ciencias mdicas y farmacuticas,
en todo el mundo. Fue mantenida la nomenclatura de los medicamentos en
portugus, en orden alfabtico, como en la edicin anterior,
Desde 1.950 la obra estaba completamente agotada, crean- as como los sinnimos y corregida la nomenclatura oficial
do, as, serias dificultades a las nuevas Farmacias y La- en latn.
boratorios Industriales Farmacuticos, que legalmente no
pueden funcionar sin la presencia de ese Cdigo Oficial. Para los productos patentados o registrados, fueron adopta-
Consecuentemente, de todas las localidades del Pas eran dos los nombres por los cuales son conocidos, sealndose
enviadas a los poderes pblicos constantes advertencias re- con el clsico asterisco (*).
saltando la necesidad de ser elaborada una nueva edicin,
lo que solamente aument durante los nueve aos de su En la 1a Edicin de la Farmacopea Brasilea, a pesar de
agotamiento total. que Brasil no haba firmado los Protocolos de Bruselas de
1.906 y 1.929, relativos a la Unificacin de la Frmula de
Eran estas fuertes razones las que empujaban para que se los Medicamentos Heroicos fueron acogidas en casi su to-
pusiera en marcha la elaboracin de una segunda edicin. talidad las prescripciones en ellos contenidos, conforme se
No obstante, dificultades de todo tipo fueron apareciendo, puede verificar en los cuadros comparativos incluidos en
impidiendo que la obra fuera realizada en tiempo y forma, la Farmacopea.
pese el empeo y la buena voluntad de nuestras autorida-
des sanitarias. Por el nuevo Protocolo del 20 de Mayo de 1.952 fueron
derogados los anteriores, siendo adoptadas en cambio las
Era necesaria una completa revisin y actualizacin de prescripciones correspondientes a las de la Farmacopea In-
todo el contenido de la primera edicin, y esa tarea era, sin ternacional, de la Organizacin Mundial de Salud. La Far-
duda, muy difcil y delicada, especialmente en un Pas de macopea Internacional fue recibida con aplausos en Brasil,
larga extensin territorial, como es Brasil, cuando se preci- como bien tradujo su delegacin en el 2 Congreso Pana-
sa de una colaboracin o contribucin de carcter nacional, mericano de Farmacia y Bioqumica, realizado en Per en
como es exigido en el caso. 1951. La 2a edicin de la Farmacopea Brasilea atendi
tanto como fue posible a las referidas prescripciones.
Poco tiempo despus de la publicacin de la Farmacopea
y de su uso en los laboratorios farmacuticos, empezaron a La Comisin de Revisin, despus de un meticuloso estu-
surgir crticas, observaciones, las cuales fueron siendo re- dio, deliber que un gran nmero de drogas y preparacio-
copiladas y coordinadas por la ASOCIACIN BRASILE- nes galnicas oficinales diversas, de poco uso, fuese supri-
A DE FARMACUTICOS, con sede en la Capital de la mido de la 2a edicin, siendo incluidas, en gran parte, en
Repblica, antes no exista, y tambin la Comisin Oficial el Formulario Nacional, que ser publicado a la brevedad,
para su estudio y revisin. como complemento de la Farmacopea.
a
1
Farmacopea Brasilea, 5 edicin
Farmacia, fueron incluidas en la presente edicin numero- Al someter los originales de esta 3a edicin a la aproba-
sas monografas de valiosos medicamentos, que hoy en da cin del Presidente Ernesto Geisel, el Ministro no slo lo
dominan la teraputica moderna tales como: antibiticos, obtuvo, como pudo, y era de su empeo, conmemorar el
sulfas, hormonas, vitaminas, barbitricos, etc., conforme a cincuentenario de la 1a edicin, lanzada, exactamente, en
la relacin que se ver ms adelante. el da 25 de noviembre de 1927, da y mes coincidentes con
los de esta publicacin.
Por fin va transcrita la relacin completa de todas las per-
sonalidades, que, con tanto empeo y entrega, dieron su La revisin realizada sobre la edicin anterior fue laboriosa
valiosa colaboracin, para que la nueva edicin se vuelva y minuciosa, de modo que los medios interesados pudie-
una brillante realidad. En este punto, sera injusto se no sen, contar con un instrumento de normas y consultas de
fuese destacada especialmente la COMISIN DE ESTAN- mayor credibilidad y seguridad, lo que se dejar en eviden-
DARIZACIN FARMACUTICA DE SO PAULO que, cia al examinar las grandes modificaciones aadidas en el
patriticamente, dio preciosa y constante contribucin, texto actual.
empleando su mximo esfuerzo para que la nueva edicin
llegase a su fin, al nivel de las ms avanzadas Farmacopeas Se consider que la experiencia internacional gan ms
del Mundo. fuertes convicciones que los frmacos utilizados, y los
medios de su identificacin y control, se generalizan cada
La Comisin de Revisin de la Farmacopea se sentir vez ms. Por lo tanto es debido fortalecer los fundamentos
recompensada por el gran esfuerzo realizado, si la nueva de los valores teraputicos regionalizados, sobresaliendo
edicin puede corresponder, como es de esperar, a su gran evidentemente la uniformizacin de los controles. Adems
finalidad prctica, que es la perfecta seleccin de las ma- de los recursos teraputicos provenientes de la flora cada
terias primas de empleo medicinal y su estandarizacin, vez con menos representacin- respondiendo a las distin-
condicin principal de la actividad y eficiencia de los me- ciones locales, crecen los quimioterpicos, en volumen y
dicamentos, prestando as, un relevante servicio a la salud en calidad, favoreciendo la uniformizacin de los mtodos
pblica del Pas. de identificacin y control. Se desarrollaron de ah las Far-
macopeas Europeas e Internacional, esta ltima ganando
Rio de Janeiro, 22 de febrero de 1959 fama de parmetro a ser respetado y seguido.
Luis Salgado Lima Filho No fue otro el plan de la Comisin. Mientras fue posible,
Presidente de la Comisin de Revisin de la Farmacopea prevalecieron las normas de la Organizacin Mundial de la
Salud. As, la nomenclatura latina precediendo a la nacio-
PRESENTACIN DE LA FARMACOPEA BRASILE- nal, el nombre qumico y la frmula molecular, y tambin
A, 3a EDICIN los mtodos generales de anlisis.
En el contexto de los numerosos eventos que vienen sea- No se perdieron de vista los recursos laboratoriales dentro
lando la ejecucin de los Planes Nacionales de Desarrollo, de la realidad nacional Por eso mismo, y cuando fue posible
como marcos histricos en el crecimiento global del pas, y necesario, se adoptaron mtodos diversos, simples y so-
no podra estar ausente el sector Salud y, entre sus realiza- fisticados, para un mismo examen. Por otro lado, teniendo
ciones bsicas, el lanzamiento de la Farmacopea Brasilea, presente como necesidad esencial la debida identificacin de
en edicin revista y actualizada, para los tiempos de hoy. los agentes teraputicos constantes de los fitofrmacos, slo
fueron incluidos en la Farmacopea aquellos para los cuales
De ah vienen algunas providencias no fructificadas, a par- ya disponemos de mtodos eficaces de identificacin y me-
tir de 1962, que slo se corporificaron y vinieron a tener dicin de dosis. Ediciones subsiguientes bajo la forma de
culminacin en la actual gestin del Ministro Paulo Al- Suplementos, y el propio Formulario Nacional que cierta-
meida Machado, mediante nueva iniciativa, concretizada mente se editar vendrn a llenar lagunas existentes.
a travs de la Secretara Nacional de Salud y de su rgano
especfico, el Servicio Nacional de Fiscalizacin de la Me- El amplio listado de nuevos agentes teraputicos obliga,
dicina y Farmacia. necesariamente, a considerar su efectiva necesidad a nivel
nacional.
El Sr. Ministro design la nueva Comisin de Revisin de la
Farmacopea, mediante la Odenanza 276/75, colegiado que La industria farmacutica fue invitada a manifestarse, ofre-
cumpli su misin, en plazo satisfactorio, habiendo contado ciendo subsidios por va de las entidades representativas,
con la valiosa cooperacin del Consejo Federal de Farmacia. contribucin que mereci prudente clasificacin de la Co-
misin.
Aprobando esta 3a edicin de la Farmacopea, con la expe-
dicin del Decreto 78.840/76, refrendado por el Ministro Adems, que a la par de esa relacin y de los subsidios, se
de la Salud, el Excmo. Sr. Presidente de la Repblica con- tom por legtimo, tambin, un levantamiento de los me-
templ el Ministerio de la Salud y la clase mdica y farma- dicamentos de mayor representatividad en el recetario y
cutica del pas, con ese importante instrumento frmaco consumo nacionales.
tcnico y normativo de grande alcance, en la secuencia de
otras medidas de operacionalizacin que vienen siendo im- Se tiene, pues, que ese elenco y, las monografas revis-
plantadas en ese destacado Sector de la vida nacional. tas, remanentes de la 2a edicin, constituyen, en el todo,
el acervo monogrfico de la 3a edicin de la Farmacopea de la Farmacopea. Para facilitar estas revisiones y posi-
Brasilea. bilitar introduccin de nuevas monografas y mtodos de
anlisis necesarios, la Comisin adopt esta nueva forma
Por cierto quedarn otras monografas para aadir, tanto de presentacin.
como algunas existentes, o persistentes, tal vez puedan ser
susceptibles a supresin. Esta evidencia slo habla a favor El presente volumen constituye la Parte I de la Farmacopea
de la propia Farmacopea, dinmica como la teraputica, y y comprende las generalidades, y los mtodos generales de
pendiente de actualizaciones ms frecuentes, como suele anlisis. La Parte II ser constituida de monografas de ma-
ser la propia Farmacologa. terias primas y especialidades farmacuticas, publicadas en
fascculos. Un ndice indicar el ttulo de las monografas,
Teniendo en cuenta que la 2a edicin de la Farmacopea sus nmeros de referencia y la fecha para su entrada en
Brasilea se encuentra agotada, y que muchas monogra- vigor.
fas constantes de la misma, no revistas, representan ade-
ms fuente bibliogrfica de mrito y con fuerza legal, la La Farmacopea Brasilea en su 4a edicin tiene vigencia
Comisin decidi que el 1 Suplemento de la 3a edicin en todo el Territorio Nacional. La nomenclatura, los mto-
representar, en el todo y exclusivamente, la constante de dos de identificacin y anlisis y todos los dems datos en
aquel acervo, a ser publicado en secuencia inmediata a esta ella contenidos prevalecen sobre otros sealados en cdi-
nueva edicin. gos farmacuticos diversos. En los casos omisos, pueden
ser utilizados la Farmacopea Internacional, la Farmacopea
Crticas, correcciones y observaciones sern aceptados. Y Europea y otros cdigos farmacuticos en sus ltimas edi-
se ruega, desde ahora, que sean hechos de modo claro y ciones.*
objetivo, para mayor facilidad de las ediciones venideras.
Todos ellos, cuando sean constructivos, representarn un Las monografas de la Farmacopea Brasilea 4a edicin
valioso subsidio para el perfeccionamiento de la Farmaco- establecen parmetros que el producto deber satisfacer en
pea Brasilea, como este trabajo pretende ser, comparado cualquier momento durante su perodo de uso y no para ser
con la edicin anterior. interpretados solamente como especificaciones para libera-
cin por parte del fabricante.
PREFACIO DE LA FARMACOPEA BRASILEA, 4
EDICIN La no inclusin de un frmaco o adyuvante de fabricacin
en la 4a edicin de la Farmacopea Brasilea no dispensa
Cumpliendo las disposiciones del Decreto Federal n estas sustancias de anlisis segn otros cdigos oficiales;
78.840, del 25/11/1976, la nueva edicin de la Farmacopea as como la presencia de impureza no descrita especfica-
Brasilea viene al encuentro de los deseos de la comunidad mente en la Farmacopea no significa que la sustancia pue-
tcnico-cientfica brasilea, interesada en la revisin de la de ser usada por el simple hecho de que la Farmacopea no
edicin anterior. lo especifique. En estos casos, la decisin debe ser toma
con base en el buen sentido tcnico y en las buenas prcti-
La Comisin Permanente de Revisin de la Farmacopea cas de fabricacin.
Brasilea, constituida por la Ordenanza n 151/82 del Exc-
mo. Ministro de Salud, slo puede realizar su trabajo gra- La Farmacopea es obra para profesionales debidamente
cias al apoyo decisivo de la Secretara Nacional de Vigilan- preparados y entrenados. Por este motivo, no provee ex-
cia Sanitaria SNVS del Ministerio de Salud. Acuerdos plicaciones didcticas, presentando las monografas con
y convenios celebrados entre la SNVS, la Central de Me- redaccin clara, sucinta y desprovistas de explicaciones
dicamentos CEME del Ministerio de la Previdencia y juzgadas desnecesarias por la Comisin.
Asistencia Social MPAS y el Consejo Nacional de De-
sarrollo Cientfico y Tecnolgico CNPq -, aseguraron a la La Comisin Permanente de Revisin de la Farmacopea
Comisin recursos financieros indispensables, incluyendo Brasilea torna pblicos sus agradecimientos a todos aque-
becas de estudios para ejecucin de los trabajos. llos que colaboraron en la preparacin de esta edicin y, en
especial, al Consejo Federal de Farmacia por el apoyo que
La elaboracin de las monografas fue confiada a profesio- posibilit la publicacin oficial de la F. Bras. IV.
nales con efectiva experiencia en el asunto; estas mono-
grafas fueron revisadas por otros profesionales del mismo * Normas Nacionales extrafarmacopeicas debern obtener
campo de actividad. A pesar de esto, eventuales imperfec- previamente aprobacin de la Comisin Permanente de
ciones, errores u omisiones son de responsabilidad exclu- Revisin de la Farmacopea Brasilea del Consejo Nacio-
siva de la Comisin Permanente de Revisin de la Farma- nal de Salud.
copea Brasilea, a quien le corresponde la aprobacin del
texto final.
2 HISTRICO
culo para las acciones reguladoras de vigilancia sanitaria. Se para resguardar la autenticidad y suministrar al lector la
decidi, por lo tanto, trabajar la quinta edicin para realizar impresin de, tambin, estar participando de esa historia.
un levantamiento profundo de todos los textos publicados en
las cuatro ediciones, evaluar necesidades de permanencia, Como Presidente de la Comisin de la Farmacopea Brasi-
Tener una farmacopea es una cuestin de seguridad nacio- Para la composicin de los remedios oficinales se seguir
nal, desarrollo tcnico y cientfico, insercin en un nivel de la Farmacopea Francesa, hasta que se haya organizado una
reconocimiento mundial y no est ms en la esfera de una Farmacopea Brasilea, para lo que el Gobierno nombrar
simple poltica de Gobierno y si de Estado. Este hecho trae una Comisin de personas competentes. Despus de publi-
a la CFB la tranquilidad de saber que ejecuta un proyecto cada la Farmacopea Brasilea, que lo ser por autorizacin
de inters nacional sin vuelta atrs y con una agenda a ser del Gobierno, los Boticarios debern, tener los remedios
cumplida dentro de la poltica sanitaria practicada por el preparados segn las frmulas de esa Farmacopea, lo que
rgano regulador y por el Ministerio de la Salud. no inhibe que los puedan tener segn las frmulas de otras
Farmacopeas para satisfacer a las prescripciones de los fa-
No se puede ser ingenuo en no asumir que algunas fallas cultativos, los cuales pueden recetar como entiendan.
en esta quinta edicin sern rpidamente identificadas, sin
embargo est en fase de creacin en la Coordinacin de la En el anexo al Reglamento, que contiene la Tabla de los
Farmacopea Brasilea, estructura que espera atender rpi- medicamentos, envases, instrumentos, utensilios y libros,
damente a los cuestionamientos de los usuarios dando res- organizado para las boticas del Imperio, vino la lista de
puestas rpidas y objetivas que puedan aclarar dudas sobre los libros que deban tener las boticas: Cdigo Francs;
los textos publicados. Se pretende, al final del 2011, lanzar Observacin de las Farmacopeas, por Jourdan; Materia
el primer suplemento trayendo las modificaciones, correc- mdica y Formulario de Bouchardat; Farmacopea Gene-
ciones e inclusiones. ral; Farmacopea de Foy; Cdigo Farmacutico y Farma-
cografa de Agostinho Albano da Silveira Pinto (ltima
Es necesario informar que todos los textos publicados en edicin).
la quinta edicin pasaron por consulta pblica para acceso
del ciudadano y libre manifestacin, por tanto es una obra El artculo 58 del Decreto n 8.387, del 19 de enero de
cuya construccin fue colectiva con la participacin de los 1.882, reprodujo las determinaciones del artculo 45 del
interesados en el tema. Todas las manifestaciones externas Decreto n 828 de 1.851; apenas hubo la modificacin
fueron consideradas. de algunas palabras y de la lista de libros, de cuya ltima
edicin, el farmacutico deba siempre tener un ejemplar.
La historia de nuestra farmacopea viene siendo contada, Adems del Codex francs, eran exigidos los formularios
como primicia, por nuestros sucesores y contiene datos de Dorvault, Bouchardat. Fosagrives, Jeannel, Rveil,
muy importantes para la comprensin de toda su evolu- Gallois, Chernoviz, Langaard, Farmacia prctica de Des-
cin. Optamos en reproducirlos, con excepcin del hist- champs (dAvallon), Anuario de Mhu, Gua prctica de
rico no contemplado en la 1a edicin, sin ningn retoque Le Page y Patrouillaud, Tratado de Farmacia de Soubeiran,
Diccionario de alteraciones y falsificaciones de Chevalier cin, como Cdigo Nacional Farmacutico, con la supre-
y Baudrimont, Vademecum de Ferrand. sin, sin embargo, de ciertos artculos por ella considera-
dos de uso restricto para ser oficializados, los cuales vienen
Durante el largo perodo de 1.851 a 1.929 fue obligatorio el enumerados en el prefacio de la primera edicin.
Codex francs, para la confeccin de los preparados ofi-
cinales, hasta que estuviera organizado el Cdigo Farma-
cutico Brasileo. As determinaron todos los reglamentos
El 4 de noviembre de 1.926, por el Decreto n 17.509,
firmado por el Presidente de la Repblica, Dr. Arthur da
2
sanitarios, entre ellos los de los Decretos n 169 de 1.890; n Silva Bernardes, y por el Ministro de Interior y Justicia,
1.172, de 1.892; n 1.647, de 1.894; n 2.449, de 1.897, cuya Dr. Affonso Penna Junior, en los trminos del artculo 252
tabla de libros fue reducida al Codex francs y a los Formu- del Decreto n. 16.300, de 31 de diciembre de 1923, fue
larios de Dorvault, Bouchardat, Chernoviz y Langaard; n aprobada y adoptada como Cdigo Farmacutico Brasi-
2.458 de 1.897; 5.156 de 1.904; 14.189 y 14.354, de 1.920 leo la Farmacopea Brasilea, elaborada por el Farma-
(D. N. S. P.); 15.003, de 1.921 y 16.300, de 31-12-1923. cutico Rodolpho Albino Das da Silva, con las enmien-
das de la comisin revisora. El Cdigo entrara en vigor
No obstante, el deseo de los farmacuticos brasileos tener 60 das despus de la publicacin de la primera edicin
su propio Cdigo Nacional fue manifestado en muchas opor- oficial, quedando su ejecucin a cargo del Departamento
tunidades por los rganos cientficos de clase. Varias comi- Nacional de Salud Pblica, por intermedio de la Insectora
siones fueron nombradas para su elaboracin, sin resultado. de Fiscalizacin del Ejercicio de la Medicina. Ejecut la
obra, mediante competencia pblica, la Compaa Edito-
Fueron vanos los esfuerzos de Ezequiel Corra dos Santos, ra Nacional, de So Paulo, que termin su publicacin en
de Silva Costa, de Corra Dutra, Oliveira Fausto, Almeida 1.929. Pas a ser obligatoria la Farmacopea a partir del 15
Rego, Eugnio Marques de Hollanda, Eduardo Julio Jan- de agosto de 1.929.
vrot y otros.
Al final, Brasil tena su Farmacopea, obra de un slo hom-
Solamente en 1.887, atendiendo a las solicitudes de los bre, obra que era, en opinin de eminentes farmaclogos
centros cientficos nacionales, el Gobierno Imperial pro- del mundo, uno de los ms avanzados y actualizados cdi-
cur resolver el problema, instituyendo una comisin, de gos farmacuticos de la poca.
la cual formaban parte, entre otros, Ezequiel Corra dos
Santos Filho, Agostinho Jos de Souza Lima y Marques Rodolpho Albino, natural del Estado del Rio de Janeiro,
de Hollanda. nacido en la ciudad de Cantagalo, falleci prematuramente
en Rio de Janeiro, a los 42 aos de edad, el 7 de octubre
De esa comisin, sin embargo, nada prctico dio resultado, de 1931.
por suerte que, pasados diez aos, en 1.897, el Ministro
del Interior y Justicia, Amaro Cavalcanti, nombr otra co- Todos los cdigos farmacuticos son revistos peridicamen-
misin con la misma finalidad y de la cual formaban parte te; y as, a fin de recopilar, coordinar y estudiar sugeren-
los profesores Agostinho de Souza Lima, Csar Diogo y cias, para proporcionar facilidades para una futura revisin,
Orlando Rangel. Fracas tambin la nueva tentativa. en 1.932, por propuesta hecha en una de las sesiones de la
Asociacin Brasilea de Farmacuticos, fue nombrada una
Brasil, sin embargo, que siempre ha sabido tratar con las comisin para tal fin, con la presidencia del Prof. Joo Vi-
dems naciones civilizadas en todos los ramos de las cien- cente de Souza Martins, que elabor un reglamento interno,
cias, de las artes, etc., no poda continuar siendo regido, creando varias secciones. Esta comisin trabaj hasta 1.938,
con respecto al ejercicio de la Farmacia, por un cdigo cuando el presidente de la Asociacin Brasilea de Farma-
extranjero, que, a pesar de que ptimo para su pas, no sa- cuticos, Prof. Virglio Lucas, dirigi al Ministro de Edu-
tisfaca en absoluto a las nuevas necesidades. Por eso, a cacin y Salud el pedido de nombrar una comisin oficial
pesar de que reconociendo el arrojo de tal iniciativa, resol- para proceder a la revisin del nuestro Cdigo, viendo ya
vimos llevar adelante la ardua tarea y alta responsabilidad que haba bastante materia a estudiar y deliberar.
de redactar nuestro futuro cdigo farmacutico, confiados
en que nuestro gran amor a la profesin venciese todos los Esa Comisin, nombrada por la Ordenanza n 1.21-A, del
bices, superase todos los obstculos. (*) El Farmacuti- 23 de junio de 1.938, por el Ministro Gustavo Capanema,
co, en la ocasin adems de nombre poco conocido, Ro- fue constituida por los siete miembros siguientes: Profs.
dolpho Albino Das da Silva, en 1.924, despus de ms de Renato Guimares de Souza Lopes, Oswaldo de Almeida
diez aos de paciente trabajo, pudo presentar su proyecto Costa, Virglio Lucas y Abel Elias de Oliveira; Farms. An-
de Farmacopea Brasilea al Dr. Carlos Chagas, Director tnio Caetano de Azevedo Coutinho y Oswaldo de Lazza-
General del Departamento Nacional de Salud Pblica. Para rini Peckolt y mdico Sebastio Duarte de Barros. Por la
juzgar ese trabajo, nombr el Dr. Chagas una comisin, ordenanza n 141, del 22 de abril de 1.939, la comisin fue
constituida por los Profesores Doctores Antnio Pache- aumentada con dos miembros, el Prof. Artidnio Pamplona
co Leo, Renato de Souza Lopes y Artidnio Pamplona, y el Farm. Jos Eduardo Alves Filho.
y Farmacuticos Alfredo da Silva Moreira, Jos Malhado
Filho y Isaac Werneck da Silva Santos. Esa Comisin, a pesar de las dificultades encontradas, rea-
liz alguna cosa til, proponiendo exclusiones de drogas
Despus de examen minucioso de la obra, esa Comisin obsoletas e inclusiones de otras de mayor inters, confor-
resolvi aceptarla, solicitando del Gobierno su oficializa- me el informe presentado por el Farm. Oswaldo Peckolt al
Tercer Congreso Brasileo de Farmacia, reunido en Belo seguida, determin el nombramiento, para la Comisin de
Horizonte, del 14 al 21 de abril de 1.939. Revisin de la Farmacopea y sus subcomisiones, de cient-
ficos de todo el pas, especializados en las materias en es-
El Decreto n 810, del 1 de julio de 1.942, que aprob el tudio e incumbiendo de reeditar decenalmente la Farmaco-
Siguieron los estudios, bien coordinados y con buen ren- En esa misma oportunidad fueron criadas Comisiones
dimiento, constituyendo el aparecimiento del Segundo Su- Regionales en los Estados de Paran, Minas Gerais, Rio
plemento y del Tercer Suplemento, aprobados, respectiva- Grande do Sul y So Paulo.
mente, por las Resoluciones n 24, de 14 de abril de 1.945,
y n 39, de 13 de junio de 1.950. En este Estado los trabajos tuvieron gran impulso, por haber
sido en su Capital instalada, para fines idnticos, una Comi-
Esas publicaciones se presentaron muy interesantes, bajo sin de Estandarizacin Farmacutica, por comn acuerdo
varios aspectos, entre ellos la inclusin de drogas naciona- entre el Instituto Adolfo Lutz, la Universidad de S. Paulo,
les como sucedneas de similares importadas, el registro la Fiscalizacin del Ejercicio Profesional y las asociaciones
de nuevas frmulas y la sustitucin, en otras, de sustancias estaduales representativas de la industria y del comercio de
extranjeras por nacionales, todo eso sin compromiso de las la Farmacia, integrndola las figuras de mayor evidencia de
respectivas acciones teraputicas. medios cientficos de aquella unidad de la Federacin, don-
de el Dr. Ariosto Bller Souto y el Farm. Jlio Sauerbronn
El Reglamento Interno expresado en el Decreto n 21.339, de Toledo son presidente y secretario, respectivamente.
del 20 de junio de 1.946, y modificado por el Decreto n
29.828, del 30 de julio de 1.951, teniendo por finalidad la Cuando se reuni, en la ciudad de So Paulo, el V Congreso
organizacin y la competencia de los diversos rganos de Brasileo de Farmacia, conjuntamente con el III Congreso
salud pblica, no alter sustancialmente las disposiciones Farmacutico y Bioqumico Panamericano, del 1 al 8 de
que haban sido establecidas anteriormente, continuando la diciembre de 1954, la contribucin paulista se concretiz
Comisin a funcionar regularmente. en un anteproyecto de la Farmacopea, presentado a aquel
certamen, siendo dados nuevos rumbos a los trabajos.
La Ordenanza n 147, del 6 de noviembre de 1.951, apro-
bando las Instrucciones sugeridas por el Servicio Nacional El Congreso, ratificando mocin aprobada en el III Con-
de Fiscalizacin de la Medicina, de acuerdo con el Regla- greso Brasileo de Farmacia, realizado en Belo Horizonte
mento citado, y modificando la orientacin hasta entonces del 14 al 21 de abril de 1.939, y el voto expreso en el II
Congreso Farmacutico y Bioqumico Panamericano, lle- De la primera edicin mucho se aprovech, tan sabiamente
vado a cabo en Lima del 1 al 8 de diciembre de 1.951, reco- fue ella redactada; numerosas monografas de ella retiradas
mend la organizacin de un Formulario Nacional, como pasarn a constar del Formulario Nacional, cuya realiza-
unidad complementaria, del cual pasaran a constar las dro- cin ya se encuentra en fase de conclusin, esperndose
gas y los medicamentos de empleo usual que no constasen
de la Farmacopea.
su publicacin en corto plazo, como segundo volumen del
Cdigo Farmacutico Brasileo. 2
De los debates realizados result la deliberacin de exa- (*) Rodolpho Albino Das da Silva Farmacopea de Bra-
men en conjunto, por las comisiones de Rio y de So Pau- sil- Prefacio, pg. VIII, 1a edicin, 1.929.
lo, de todo el material de estudio hasta entonces reunido,
para posibilitar el trmino de la revisin en corto plazo. Fallecido.
A travs del Dr. Luiz Salgado Lima Filho, el Ministro de la Quince de agosto de 1.929 fue el marco de esa redencin,
Salud Mano Pinotti present al Presidente de la Repblica, por lo que a partir de aquella fecha entr en vigor la Far-
Dr. Juscelino Kubitschek, decreto con nuevas inclusiones macopea de Brasil, en todo el territorio nacional, conquista
y modificaciones y que torn obligatoria la Farmacopea en ampliamente festejada, adems porque se exaltaba tambin
las farmacias, laboratorios industriales farmacuticos y es- el gran responsable de la misma, el extraordinario farma-
tablecimientos congneres. ste decreto tom el n 45.502 cutico Rodolfo Albino Das da Silva, que consumi doce
del 27 de febrero de 1959. aos enteros, en una labor silenciosa y benedictino, en la
composicin de las pginas iluminadas de saber que tu-
Aqu se encuentran la codificacin de los frmacos y vieron que erigirse en breviario para los de su grey, tan
frmulas de actualidad, la normalizacin de las tcnicas harmonioso a punto de inclursele como uno de los mejores
empleadas en las diversas prcticas farmacuticas, la es- entre los coetneos, a pesar de que debido a la competencia
tandarizacin de los mtodos, ensayos, reactivos y tablas, de artfice nico, hecho difcil de ser repetido.
necesarios al ejercicio profesional.
Cuanto ms de la historia de los cdigos farmacuticos, la En la imposibilidad material y tcnica de resolver todos
2a edicin de la Farmacopea Brasilea constituye reposito- los problemas, la Comisin se vali de la experiencia de
rio de mrito irrefutable, hasta el tiempo de aquella edicin, otras comisiones y rganos Tcnicos, y de Farmacopeas,
motivo plausible para no entrar en detalles ya conocidos. marcadamente en lo que respectaba a las orientaciones de
Con esta orientacin, las etapas fueron superadas paulati- Se admite, finalmente, que no se ignora la tendencia univer-
namente, y ganando celeridad a la medida en que los pro- sal de integrar farmacopea y formulario en un slo texto.
blemas se delineaban ms claros. Tentada desde luego a eso, la Comisin, decidi, no obs-
tante, optar por un trabajo dividido, dispuesta a elaborar, blicada en 1835 y hoy considerada como la 2a edicin de
a continuacin, el Formulario Nacional. Adems as, esta la Farmacopea Portuguesa.
segunda providencia nada ms representar el despliegue
de un trabajo que se busca unificar en la etapa subsiguiente Ya el Decreto 8.387 del 19/01/1882 establece textualmen-
a la elaboracin del Formulario, y que se pretende, efecti-
vamente cumplir.
te: para la preparacin de los remedios oficiales se segui-
r la Farmacopea francesa, hasta que est compuesta una
Farmacopea brasilea..., situacin que ira perdurar hasta
2
HISTRICO DE LA FARMACOPEA BRASILEA, 4 1926, cuando el Decreto 17.509 del 04/11/1926 aprob la
EDICIN primera Farmacopea Brasilea, de autora de Rodolpho Al-
bino Das da Silva, tornada obligatoria a partir del 15 de
Son de naturaleza efmera los libros de esta orden, destina- agosto de 1929.
dos a mostrar uno de los lados de la farmacologa, ciencia
que va a recorrer actualmente la fase ms acelerada de su La primera edicin de la Farmacopea Brasilea se compa-
evolucin. SOUZA MARTINS, in Informe de Introduc- raba con las Farmacopeas de la poca, de los pases ms
cin de la 3a edicin de la Farmacopea Portuguesa, 1876. desarrollados, revelndose notable por la precisin de las
monografas y, sobretodo, por el gran nmero de inclusio-
El vocablo Farmacopea proviene de la junta de dos trmi- nes de frmacos obtenidos de la flora brasilea, no existen-
nos griegos, a saber, pkov = medicamento o veneno, tes en ninguna otra Farmacopea.
y oo = fabricante y fabricacin. Las Farmacopeas consti-
tuyen cdigos farmacuticos oficiales u oficialmente adop- La constante evolucin de la farmacologa, la introduccin
tados, en los cuales se establecen la identificacin, los estn- de nuevos frmacos en la teraputica, el surgimiento de
dares de calidad y los mtodos de anlisis de los frmacos en nuevos mtodos de anlisis, ms modernos y precisos, y
uso. Existentes desde el siglo III, los primeros compendios la necesidad de especificaciones actualizadas para el con-
eran de carcter regional, pues los frmacos de entonces trol de materia prima y productos farmacuticos son fac-
eran provenientes de rganos de animales, de minerales y, tores fundamentales determinantes de la obsolescencia de
sobretodo, de la flora local y nativa. Algunos llegaron a ser los cdigos farmacuticos y de la necesidad de revisarlos
oficializados, a pesar de que en carcter regional, como, por y actualizarlos peridicamente. El Decreto que aprob la
ejemplo, el formulario de la Escuela de Salerno Rgimen primera edicin de la Farmacopea Brasilea fue omiso en
Sanitatis, de 1066, adoptado en 1240 por Frederico II, Rey cuanto a las revisiones; as, la segunda edicin vino casi 30
de las Dos Siclias. Los intentos iniciados individualmente aos despus de la primera y represent cinco aos de tra-
por diversos autores en el sentido de unificar la descripcin bajo de diez subcomisiones especializadas. La 2a edicin
e identificacin de los frmacos ms importantes datan del incorpor las adquisiciones derivadas de la propia actuali-
final del siglo XVII, y del siglo XVIII. Entre otras obras, zacin de la farmacologa. No consigui, a pesar de ello,
merecen citacin la Farmacopea Internationalis de Lme- ser ms rica y precisa que la primera edicin, fruto de un
ry (1690), las Farmacopeas de James (1747), de De Quincy slo autor. El Decreto Federal 45.502 del 27/02/1959, al
(1758), de Triller (1764) y, especialmente, la Farmacopea aprobar la 2a edicin de la Farmacopea Brasilea, fij su
Universalis, de Jourdan (1828), que juntaba datos de casi revisin cada diez aos. Infelizmente, problemas diversos
50 Farmacopeas y compendios diferentes. Ninguno de estos no permitieron el cumplimiento de ese Decreto. Ms de
trabajos, no obstante, tena carcter oficial. 15 aos pasaron, hasta que se elaborara una nueva edicin.
Las Farmacopeas nacionales, de carcter oficial y adopcin As es que, el 25 de noviembre de 1976, fue oficializada,
obligatoria, comienzan a surgir al final del siglo XVIII e por el Decreto 78.840, la tercera edicin de la Farmacopea
inicio del siglo XIX. As, fueron publicadas las primeras Brasilea. El mismo Decreto fij en cinco aos el plazo
ediciones de las Farmacopeas, portuguesa (1794), holande- para su revisin. Realizada en tiempo determinado y muy
sa (1805), francesa (1818) y americana (1820). corto, tarea posible de llevar a trmino solamente gracias
al apoyo del Consejo Federal de Farmacia, la obra despert
Brasil Colonia adoptaba la Pharmacopia General para el sensibles manifestaciones de la comunidad tcnico cient-
Reino y Dominios de Portugal, de 1794, cuya autora es fica, que recomienden rpida revisin de su texto, indepen-
atribuida a Francisco Tavares, profesor de la Universidad diente del dispositivo legal.
de Coimbra.
As, la 4a edicin surge con algn atraso. Se busca, en esta
Con la Independencia, Brasil se vuelca a la orientacin edicin, sanar las deficiencias de la anterior. Se busc, tam-
cultural francesa y, en el campo de la Farmacia, el Codex bin, adoptar mtodos modernos de anlisis, compatibles,
Medicamentarius francs adquiere fuerza legal. El Regla- sin embargo, con la realidad nacional. La publicacin de
mento de la Junta de Higiene Pblica, mandado a ejecutar esta parte y la adopcin de una nueva sistemtica de pre-
por el Decreto 828 del 29/09/1851, sin especificar cual la sentacin que posibilita su continua actualizacin a travs
Farmacopea a ser cumplida, establece lista de libros que de revisiones permanentes son las metas prioritarias que la
las farmacias deban tener, constando en ella, entre otros, Comisin Permanente de Revisin de la Farmacopea Bra-
la Farmacopea Portuguesa de 1794, el Codex Francs y el silea se propone alcanzar.
Cdigo Farmacutico Lusitano, de la autora de Agostinho
Albano de la Silveira Pinto, cuya primera edicin fue pu-
3 FARMACOPEA BRASILEA
3
FERNANDO AYRES CUNHA 3a edicin
JOO GILVAN ROCHA 4a edicin Parte I
CELSO FIGUEIREDO BITTENCOURT 4a edicin Parte II
PRESIDENTE
GERSON ANTNIO PIANETTI
VICEPRESIDENTE
MIRACY MUNIZ DE ALBUQUERQUE
MIEMBROS
3
Universidade de So Paulo USP
3
PAULO CHANEL DEODATO DE FREITAS
Universidade de So Paulo USP LUCIANE VARINI LAPORTA
Centro Universitario Franciscano UNIFRA
RICARDO CHIAPPA
Unin Educacional del Planalto Central UNIPLAC MNICA DA LUZ CARVALHO SOARES
Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria Anvisa
ROSANA MIGUEL MESSIAS MASTELARO
Sindicato de la Industria de Productos Farmacuticos en NADIA MARIA VOLPATO
el Estado de So Paulo Sindusfarma Universidade Federal do Rio Grande do Sul UFRGS
3
Universidade Federal del Ro Grande del Norte UFRN
SEVERINO BARBOSA
MARIA DE LAS GRAAS LINS BRANDO Universidade Federal del Pernambuco UFPE
Universidade Federal de Minas Gerais UFMG
HOMEOPATIA
RODNEY ALEXANDRE FERREIRA RODRIGUES
Universidade Estadual de Campinas UNICAMP LEANDRO MACHADO ROCHA Coordinador
Universidade Federal Fluminense UFF
TATIANE PEREIRA DE SOUZA
Universidade Federal del Amazonas UFAM BIANCA RODRIGUES DE OLIVEIRA (Ad hoc)
Universidade del Vale del Itaja UNIVALI
GASES MEDICINAIS
CARLA HOLANDINO QUARESMA
ALADE ALINE XAVIER LEAL Coordinadora Universidade Federal do Rio de Janeiro UFRJ
Instituto de Tecnologa en Imunobiolgicos Bio
Manguinhos FIOCRUZ EZEQUIEL PAULO VIRIATO
Laboratorio Homeoptico Almeida Prado Ltda
CRISTIANE RODRIGUES AUGUSTO
Instituto Nacional de Metrologia, Normatizacin y FRANCISCO JOS DE FREITAS
Calidad Industrial INMETRO Universidade Federal de Ro de Janeiro UFRJ
3
MARCADORES PARA FITOTERPICOS Universidade Federal de Minas Gerais UFMG
3
Farmacia de Manipulacin de Cosmticos Ltda FACIAL VALRIA PEREIRA DE SOUSA
Universidade Federal do Rio de Janeiro UFRJ
PATRICIA HAUSCHILDT DE OLIVEIRA MENDES
Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria Anvisa COLABORADORES DE LA 5a EDICIN DE LA
FARMACOPEA BRASILEA
PAULA RENATA APARECIDA NIGRO RIVERA
CARAZZATTO ADILSON SARTORATTO
Asociacin Nacional de Farmacuticos Magistrales Universidade Estadual de Campinas UNICAMP
ANFARMAG
DLEY ANTONINI NEVES DE LIMA
ROBERTO PONTAROLO Universidade Federal del Amazonas UFAM
Universidade Federal de Paran UFPR
ADRIANA BUGNO
RADIOFRMACOS Instituto Adolfo Lutz IAL
3
Instituto de Tecnologa de Frmacos Farmanguinhos / ANNA KAROLINA PASTOREK
FIOCRUZ Universidade Estadual de Campinas UNICAMP
3
Universidade Federal do Rio Grande do Sul UFRGS Universidade del Vale del Itaja UNIVALI
3
Universidade Federal de Santa Maria UFSM Laboratorio Homeoptico Almeida Prado Ltda
3
Universidade Federal do Rio de Janeiro UFRJ
IARA COUTINHO DESMARALES
GABRIELA GONALVES DA SILVA Universidade Federal Fluminense UFF
Asociacin Brasilea de los Distribuidores y Importadores
de Insumos Farmacuticos, Cosmticos, Veterinarios, ILIO MONTANARI JNIOR
Alimenticios y Aditivos ABRIFAR Universidade Estadual de Campinas UNICAMP
3
JOO PAULO SILVRIO PERFECTO Universidade Estadual de Campinas UNICAMP
Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria Anvisa
KATIA ANDREA DOMINGOS DE MORALES
JONATHAS FELIPE REVOREDO LOBO Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria Anvisa
Universidade Federal Fluminense UFF
KATIA REGINA TORRES
JOS ALEIXO PRATES Y SILVA Ministrio da Sade MS
Comisin Permanente de Revisin de la Farmacopea
Brasilea 4a edicin KATIA SUZI DE LA SILVEIRA SILVA
Instituto de Investigaciones Energticas y Nucleares
JOS ANGELO SILVEIRA ZUANAZZI IPEN
Universidade Federal do Rio Grande do Sul UFRGS
KOICHI MIZUTA
JOS ANTNIO DE AQUINO RIBEIRO Instituto de Investigaciones Tecnolgicas del Estado de
Empresa Brasilea de Investigacin Agropecuaria So Paulo IPTSP
EMBRAPA
LAS SANTANA DANTAS
JOS ANTONIO DE OLIVEIRA BATISTUZZO Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria Anvisa
Facultades Oswaldo Cruz
LARISSA SAKIS BERNARDIS
JOS CARLOS BARBRIO Universidade Federal de Santa Catarina UFSC
Genese Productos Diagnsticos Ltda.
LAURA JANE MOREIRA SANTIAGO
JOS CARLOS TAVARES CARVALHO Universidade Estadual del Norte Fluminense UENF
Universidade Federal do Amap UNIFAP
LAURA TERUMI UEDA HERNANDES MELERO
JOS LAMARTINE SOARES SOBRINHO Instituto de Investigaciones Energticas y Nucleares
Universidade Federal del Piau UFPI IPEN
3
LEOPOLDO CLEMENTE BARATTO Centro de Excelencia en Salud Integral de Paran
Universidade Federal de Paran UFPR CESIP
3
MARCOS ANTONIO SEGATTO SILVA MARIANE GEHLEN PERIN
Universidade Federal de Santa Catarina UFSC Universidade Federal de Santa Maria UFSM
3
MAX WEBER PEREIRA Universidade Federal Fluminense UFF
Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria Anvisa
NEUZA TAEKO OKASAKI FUKUMORI
MELNIA DE FTIMA CORDELINO Instituto de Investigaciones Energticas y Nucleares
Baxter Hospitalar Ltda IPEN
3
Universidade Estadual de Maring UEM Universidade Federal do Rio de Janeiro UFRJ
3
Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria Anvisa Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria Anvisa
3
Comisin Permanente de Revisin de la Farmacopea Universidade Federal del Par UFPA
Brasilea 4a edicin
WALFREDO DA SILVA CALMON
THIELE FACCIN DE BRUM Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria Anvisa
Centro Universitario Franciscano UNIFRA
WILSON CAMARGO
TIAGO ASSIS MIRANDA Instituto Nacional de Control de Calidad en Salud
Universidade Federal de Minas Gerais UFMG INCQS / FIOCRUZ
4 GENERALIDADES
TTULO Adhesivo
El ttulo completo de esta obra es Farmacopea de la Rep- Es el sistema destinado a producir un efecto sistmico por
blica Federativa de Brasil, 5a edicin. Puede ser denomi- la difusin del(de los) principio(s) activo(s) en una veloci-
nada Farmacopea Brasilea, 5a edicin o FB 5. dad constante por un perodo de tiempo prolongado.
Es considerada alcalina cuando toma color azul el papel Es un bao de agua hirviendo, a no ser que la monografa es-
rojo de tornasol o 1 ml toma color azul por una gota de azul pecifique otra temperatura. Las expresiones agua caliente y
de bromotimol SI (pH 7,6 a 13,0). agua muy caliente indican temperaturas aproximadas entre
60 C y 70 C y entre 85 C y 95 C respectivamente.
Es considerada levemente alcalina cuando toma color azul
el papel rojo de tornasol o 1 ml toma color rosa por una Bao a vapor significa exposicin al vapor fluente u otra
gota de rojo de cresol SI (pH 7,6 a 8,8). forma de calor, correspondiendo en temperatura a la del
vapor fluente.
Es considerada fuertemente alcalina cuando toma color
azul por una gota de timolftaleina SI (pH 9,3 a 10.5,) o de
rojo por una gota de fenolftaleina SI (pH 10,0 a 13,0).
duro o blando, de formatos y tamaos variados, usualmen- Es el recipiente metlico, perfectamente cerrado, de pare-
te, conteniendo una dosis nica del principio activo. Nor- des resistentes, destinado a contener gas bajo presin, ob-
malmente es formada de gelatina, pero puede, tambin, ser turado por vlvula regulable, capaz de mantener la salida
de almidn o de otras sustancias. Abreviatura: cap. del gas en un caudal determinado.
Es la cpsula que consiste de dos partes cilndricas pre- fa- Es la preparacin farmacutica lquida destinada a la apli-
bricadas (cuerpo y tapa) que se encajan y cuyas extremida- cacin sobre la mucosa ocular. Abreviatura: col.
des son redondeadas. Es tpicamente llenada con principios
activos y excipientes en la forma slida. Normalmente es Complejo protrombnico humano total liofilizado
formada de gelatina, pero puede tambin ser de otras sus-
tancias. Abreviatura: cap. dura Es una fraccin de protenas plasmticas que contienen
obligatoriamente los Factores II, VII, IX y X de la coagu-
Cpsula dura de liberacin prolongada lacin humana.
Es el comprimido que contiene, en adicin a los ingredien- Es el comprimido que posee una o ms camadas finas de
tes activos, sustancias cidas y carbonatos o bicarbonatos, revestimiento, normalmente polimricas, destinadas a mo-
los cuales liberan dixido de carbono cuando el comprimi- dificar la velocidad o extensin de la liberacin de los prin-
do es disuelto en agua. Es destinado a ser disuelto o disper- cipios activos, presentando una liberacin retardada del
so en agua antes de la administracin. Abreviatura: comp. principio activo. Vea definicin de liberacin retardada.
efer. Abreviatura: comp. rev. lib. ret.
Es el comprimido formulado para que pueda ser mastica- el comprimido en que excipientes usados no son desti-
do, produciendo un sabor residual agradable en la cavidad nados, especficamente, a modificar la liberacin del prin-
oral. Abreviatura: comp. mast. cipio activo en los fluidos digestivos. Abreviatura: comp.
sin rev.
Comprimido bucal
Control de calidad
Es el comprimido que desintegra o disuelve, rpidamente,
cuando colocado sobre la lengua. Abreviatura: comp. buc. Es el conjunto de medidas destinadas a garantizar, en cual-
quier momento, la produccin de lotes de medicamentos y
4
Comprimido para colutorio dems productos, que satisfagan las normas de identidad,
actividad, tenor, pureza, eficacia y inocuidad.
Es el comprimido que debe ser disuelto en agua para la
preparacin del colutorio, que es un lquido destinado al Colorantes
enjuague bucal de accin sobre las encas y las mucosas de
la boca y de la garganta. No debe ser tragado. Abreviatura: Son sustancias adicionales a los medicamentos, productos
comp. colu. dietticos, cosmticos, perfumes, productos de higiene y
similares, productos de limpieza y similares, con el efecto
Comprimido para solucin de otorgarles color y, en determinados tipos de cosmticos,
transferirlo para la superficie cutnea y anexos de la piel.
Es el comprimido destinado a ser disuelto en agua antes Para su uso observar la legislacin Federal y las resolucio-
de la administracin. La solucin producida puede ser le- nes editadas por la Anvisa.
vemente lechosa debido a los excipientes utilizados en la
fabricacin de los comprimidos. Abreviatura: comp. sol. Relacionados (relacionados)
Comprimido para suspensin Producto para la salud, tal como equipo, aparato, material,
artculo o sistema de uso o aplicacin mdica, odontolgi-
Es el comprimido que cuando en contacto con un lquido, ca o laboratorial, destinado a la prevencin, diagnstico,
rpidamente produce una dispersin homognea (suspen- tratamiento, rehabilitacin o anticoncepcin y que no utili-
sin). Est destinado a ser disperso antes de la administra- za medio farmacolgico, inmunolgico o metablico para
cin. Abreviatura: comp. susp. realizar su principal funcin en seres humanos pudiendo,
no obstante, ser auxiliado en sus funciones por tales me-
Comprimido revestido dios.
Crema Grageas
Es la forma farmacutica semislida que consiste de una Son comprimidos revestidos con camadas constituidas por
emulsin, formada por una fase lipoflica y una fase hidro- mezclas de sustancias diversas, como resinas, naturales o
flica. Contiene uno o ms principios activos disueltos o sintticas, gomas, gelatinas, materiales inactivos e insolu-
dispersos en una base apropiada y es utilizada, normalmen- bles, azcares, plastificantes, polioles, ceras , colorantes
te, para aplicacin externa en la piel o en las membranas autorizados y, a veces, aromatizantes y principios activos.
mucosas. Abreviatura: grag.
Son constituidos por las fracciones insolubles a fro con- Es la preparacin farmacutica, lquida, lmpida, hidroal-
teniendo principalmente los Factores I (140 a 250 mg ) y cohlica, de sabor dulce, agradable, presentando tenor al-
VIII (70 a 120 UI) de la coagulacin humana por unidad cohlico en la banda de 20% a 50%.
recogida de sangre humana. Otros factores de la coagula-
cin tambin son encontrados en menores concentraciones Los elixires son preparados por disolucin simple y deben
junto al crioprecipitado como el Factor de Von Willebrand ser envasados en frascos de color mbar y mantenidos en
Embalaje
Es la denominacin del frmaco o principio farmacolgi- Es el envoltorio, recipiente o cualquier forma de envasado,
camente activo, aprobada en el rgano federal responsable removible o no, destinada a cubrir, empaquetar, envasar,
de la vigilancia sanitaria. proteger o mantener, especficamente o no, los medica-
mentos, las drogas, los insumos farmacuticos y relaciona-
Denominacin Comn Internacional (DCI) dos, los cosmticos, los desinfectantes y otros productos.
Las condiciones de envasado son descritas en las mono-
Es la denominacin del frmaco o principio farmacolgi- grafas individuales utilizando los trminos relacionados a
camente activo, recomendada en la Organizacin Mundial continuacin.
de Salud.
Embalaje primario
Densidad de masa y densidad relativa
Es el que est en contacto directo con su contenido duran-
Densidad de masa (p) de una sustancia es la razn de su te todo el tiempo. Se considera material de embalaje pri-
masa por su volumen a 20 C. mario: ampolla, tubo, sobre, estuche, frasquito, frasco de
vidrio o de plstico, frasco-ampolla, cartucho, lata, pote,
La densidad relativa usualmente adoptada ( d 20) es defini- bolsa de papel y otros.
da como la relacin entre la masa de una sustancia al aire
a 20 C y la masa de igual volumen de agua en la misma No debe haber cualquier interaccin entre el material de
temperatura. embalaje primario y su contenido capaz de alterar la con-
centracin, la calidad o la pureza del material envasado.
Desinfectantes
Embalaje secundario
Son productos destinados a destruir, indiscriminada o se-
lectivamente, microorganismos, cuando aplicados en obje- Es el que posibilita total proteccin del material envasado
tos inanimados o ambientes. en las condiciones usuales de transporte, almacenamiento
y distribucin. Se considera embalaje secundario: cajas de
Detergentes cartn, cartuchos de cartulina, madera o material plstico o
estuche de cartulina y otros.
Son productos destinados a disolver grasas; a la higiene
de recipientes y vasijas y a aplicaciones de uso domstico. Emplasto
Emulsin Extracto
Es la forma farmacutica lquida de uno o ms principios Es la preparacin de consistencia lquida, slida o inter-
activos que consiste de un sistema de dos fases que en- media, obtenida a partir de material animal o vegetal. El
vuelven por lo menos dos lquidos inmiscibles y en la cual material utilizado en la preparacin de extractos puede
un lquido est disperso en forma de pequeas gotas (fase sufrir tratamiento preliminar, tales como, inactivacin de
interna o dispersa) a travs de otro lquido (fase externa o enzimas, trituracin o desengrasado. Abreviatura: ext.
continua). Normalmente es estabilizada por medio de uno
o ms agentes emulsionantes. Abreviatura: emu. El extracto es preparado por percolacin, maceracin u
otro mtodo adecuado y validado, utilizando como solven-
Emulsin aerosol te alcohol etlico, agua u otro solvente adecuado. Despus
de la extraccin, materiales indeseables pueden ser elimi-
Es la emulsin embalada bajo presin que contiene un gas nados.
propelente e ingredientes teraputicamente activos que son
liberados despus de la activacin de un sistema apropiado Extracto fluido
de vlvulas. Abreviatura: emu. aer.
Es la preparacin lquida obtenida de drogas vegetales o
Emulsin gotas
Son procedimientos destinados a evaluar la potencia de Es la preparacin slida; obtenida por evaporacin del sol-
principios activos contenidos en las materias primas y pre- vente utilizado en su preparacin. Presenta, como mnimo,
paraciones farmacopeicas, utilizando reactivos biolgicos 95% de residuo seco, calculado como porcentaje de masa.
tales como microorganismos, animales, fluidos y rganos Pueden ser aadidos materiales inertes adecuados. Abre-
aislados de animales. viatura: ext. seco
Es el estado final de presentacin de los principios activos Es el granulado destinado a ser disuelto en agua antes de la
farmacuticos despus de una o ms operaciones farma- administracin. La solucin producida puede ser levemen-
cuticas ejecutadas con la adicin o no de excipientes apro- te lechosa debido a los excipientes utilizados en la fabrica-
piados a fin de facilitar su utilizacin y obtener el efecto cin de los granulados. Abreviatura: granu. sol.
teraputico deseado, con caractersticas apropiadas a una
determinada va de administracin. Granulado para suspensin
ger el frmaco del aire o humedad, para frmacos con olor Inmunoglobulina humana contra el antgeno D
y sabor desagradables, para mejorar la apariencia de los
granulados o para alguna otra propiedad que no sea la de Es una preparacin estril; lquida, o liofilizada que contiene
alterar la velocidad o extensin de la liberacin del princi- inmunoglobulinas, principalmente la inmunoglobulina G.
pio activo. Abreviatura: granu. rev.
Inmunoglobulina humana contra el sarampin
Granulado revestido de liberacin prolongada
Es una preparacin estril; lquida, o liofilizada que contie-
Es el granulado que posee una o ms camadas finas de ne inmunoglobulinas, principalmente la inmunoglobulina
revestimiento, normalmente polimricas, destinadas a G.
modificar la velocidad o extensin de la liberacin de los
principios activos. Ver definicin de liberacin prolongada. Inmunoglobulina humana contra el ttanos
Abreviatura: gran. rev. lib. pro.
Es una preparacin estril; lquida, o liofilizada que con-
Granulado revestido de liberacin retardada tiene inmunoglobulinas, principalmente la inmunoglobu-
linaG. Es obtenida a partir del plasma conteniendo anti-
Es el granulado que posee una o ms camadas finas de cuerpos especficos contra la toxina del Clostridium tetani.
revestimiento, normalmente polimricas, destinadas a
modificar la velocidad o extensin de la liberacin de los
principios activos, presentando una liberacin retardada
Inmunoglobulina humana normal 4
del principio activo. Ver definicin general de liberacin Es una preparacin estril; lquida, o liofilizada contenien-
retardada. Abreviatura: granu. rev. lib. ret. do principalmente IgG. Otras protenas, tambin, pueden
estar presentes.
Inmunoglobulina humana contra la hepatitis A
Inmunoglobulina humana normal para administracin
Es una preparacin estril; lquida, o liofilizada que contiene por va intravenosa
inmunoglobulinas, principalmente la inmunoglobulina G.
Es una preparacin estril; lquida, o liofilizada contenien-
Inmunoglobulina humana contra la hepatitis B do inmunoglobulinas, principalmente la inmunoglobuli-
naG (IgG). Pueden estar presentes otras protenas. Contie-
Es una preparacin estril; lquida, o liofilizada que contie- ne anticuerpos IgG de individuos normales.
ne inmunoglobulinas, Inmunoglobulina humana contra la
hepatitis B principalmente la inmunoglobulina G. Indicador biolgico
Inmunoglobulina humana contra la hepatitis B para uso Es una preparacin caracterizada de microorganismo espe-
intravenoso cfico que posee resistencia definida y estable a un determi-
nado proceso de esterilizacin.
Es una preparacin estril; lquida, o liofilizada que contiene
inmunoglobulinas, principalmente la inmunoglobulina G. ndice de refraccin
Inmunoglobulina humana contra la rabia El ndice de refraccin (n) de una sustancia es la relacin
entre la velocidad de la luz en el vaco y su velocidad en el
Es una preparacin estril; lquida, o liofilizada que con- interior de la sustancia.
tiene inmunoglobulinas, principalmente la inmunoglobu-
linaG. Para fines prcticos se mide la refraccin con referencia
al aire y a la sustancia y no con referencia al vaco y a la
Inmunoglobulina humana contra la rubeola sustancia.
Es una preparacin estril; lquida, o liofilizada que contiene Se puede definir el ndice de refraccin como la relacin
inmunoglobulinas, principalmente la inmunoglobulina G. entre el seno del ngulo de incidencia y el seno del ngulo
de refraccin, esto es, n = sen i / sen r.
Inmunoglobulina humana contra la varicela
Inyectable
Es una preparacin estril; lquida, o liofilizada que contiene
inmunoglobulinas, principalmente la inmunoglobulina G. Es la preparacin estril destinada a la administracin pa-
renteral. Se presenta como solucin, suspensin, o emul-
Inmunoglobulina humana contra la varicela para uso sin. Abreviatura: iny.
intravenoso
Es la preparacin lquida acuosa o hidroalcohlica, con vis- Es el medicamento equivalente teraputico de un medica-
cosidad variable, para aplicacin en la piel, incluyendo el mento de referencia, comprobados, esencialmente, los mis-
cuero cabelludo. Puede ser solucin, emulsin o supensin mos efectos de eficacia y seguridad.
conteniendo uno o ms principios activos o adyuvantes.
Medicamento magistral
Lote o partida
Es todo medicamento cuya prescripcin pormenoriza la
Es la cantidad de un medicamento, u otro producto, que composicin, la forma farmacutica y la posologa. Es
se produce en un ciclo de fabricacin y cuya caracterstica preparado en la farmacia, por un profesional farmacutico
esencial es la homogeneidad. habilitado o bajo su supervisin directa.
Se comprende por material de embalaje el recipiente; en- Es el medicamento envasado en frascos mantenidos sobre
voltorio; o cualquier otra forma de proteccin, removible o presin, conteniendo un gas propelente e ingredientes, te-
no, usado para envasar; proteger; mantener; cubrir; o em-
paquetar, especficamente, o no, materias primas; reactivos
y medicamentos. Abreviatura: mat. emb.
raputicamente activo que es liberado despus de la activa-
cin de sistema apropiado de vlvulas. 4
Medicamento similar
Materias primas
Es aquel que contiene el mismo o los mismos principios
Sustancias activas o inactivas que se emplean en la fabrica- activos, presenta la misma concentracin, forma farma-
cin de medicamentos y de otros productos, tanto las que cutica, va de administracin, posologa e indicacin te-
permanecen inalteradas como las posibles de sufrir modi- raputica, y que es equivalente al medicamento registrado
ficaciones. en el rgano federal, responsable de la vigilancia sanitaria,
pudiendo diferir solamente en caractersticas relativas al
Media fill (prueba de llenado de medios) tamao y forma del producto, plazo de validez, embalaje,
etiquetado, excipientes y vehculo, debiendo siempre ser
Es una prueba para simulacin de las operaciones aspticas identificado por nombre comercial o marca.
en que el producto es sustituido por un medio de cultivo y
sirve para asegurar que los procesos utilizados sean capa- Media vida biolgica
ces de producir productos estriles.
Es el tiempo necesario para que un organismo retire, por
Medicamento eliminacin biolgica, mitad de la cantidad de una sustan-
cia administrada.
Es el producto farmacutico, tcnicamente, obtenido, o
elaborado, que contiene uno o ms frmacos y otras sustan- Media vida efectiva
cias, con finalidad profilctica; curativa; paliativa; o para
fines de diagnstico. Es el tiempo necesario para que un radionuclido en un
organismo disminuya su actividad por la mitad como un
Medicamento de referencia resultado combinado de la eliminacin biolgica y de la
decadencia radioactiva. La media vida efectiva es impor-
Es el producto innovador registrado en el rgano federal tante para el clculo de la dosis ptima del radiofrmaco a
Brasileo, responsable de la vigilancia sanitaria y comer- ser administrada y en el monitoreo de la cantidad de expo-
cializado en el pas, cuya eficacia, seguridad y calidad sicin a la radiacin.
fueron comprobadas, cientficamente, en el rgano federal
competente, por ocasin del registro. Mtodos inmunoqumicos
Medicamento genrico Son mtodos que se basan en una conexin selectiva, re-
versible y no covalente entre antgenos y anticuerpos.
Es el medicamento similar a un producto de referencia o
innovador, que pretende ser con ese intercambiable, gene- Mezclas de plasma humano excedente tratado por
ralmente producido despus de la expiracin o renuncia de inactivacin viral
la proteccin de la patente o de otros derechos de exclusivi-
dad, comprobada su eficacia, seguridad y calidad, y desig- Preparacin congelada o liofilizada, estril, apirognica,
nado por la DCB o, en su ausencia, por la DCI. obtenida a partir de plasma humano excedente proveniente
de donantes del mismo grupo sanguneo ABO y Rh(Du).
La preparacin es descongelada o reconstituida antes de su
uso para obtener una solucin inyectable. El plasma huma-
Pastilla gomosa
y rever todas las operaciones de fabricacin e inspeccin
practicadas durante la produccin. Pastilla flexible y suave de mezclas que contiene polmeros
sintticos o naturales. Abreviatura: pas. go.
Nutrimentos
Perfume
Son sustancias constituyentes de los alimentos de valor nu-
tricional, incluyendo protenas, grasas, hidratos de carbo- Es el producto de composicin aromtica obtenida a base
no, agua, elementos minerales y vitaminas. de sustancias naturales o sintticas, que, en concentracio-
nes y vehculos apropiados, tengan como principal finali-
Osmolalidad dad la aromatizacin de personas o ambientes, incluidos los
extractos, las aguas perfumadas, los perfumes cremosos,
Es una forma prctica que da una medida total de la contri- preparados para bao y los aromatizantes de ambientes,
bucin de varios solutos en una solucin por la presin os- presentados en forma lquida, gelatinosa, pastosa o slida.
mtica de la solucin. La unidad de osmolalidad es osmol
por kilogramo (osmol/kg), pero el submltiplo miliosmol Plasma fresco congelado
por kilogramo (mosmol/kg) es normalmente usado.
Es la parte lquida remanente de una unidad de sangre to-
vulo tal obtenida despus de centrifugacin y separacin de sus
fracciones celulares que deber ser totalmente congelado
Es la forma farmacutica slida, de dosis nica, que con- hasta 4 horas despus de la recoleccin de la sangre to-
tiene uno o ms principios activos dispersos o disueltos en tal que le dio origen, asegurando el mantenimiento de la
una base adecuada que tiene varios formatos, usualmente, integridad y concentraciones de los factores lbiles de la
ovoide. Se funden en la temperatura del cuerpo. coagulacin.
De acuerdo con definicin de la OMS, estndares de refe- Es la parte lquida remanente de la sangre total despus de
rencia farmacopeicos (PRef) son productos de uniformidad separacin de las fracciones celulares sanguneas mediante
reconocida, destinados al uso en ensayos donde una o ms el uso de sistemas cerrados apropiados de recoleccin o
de sus propiedades ser(n) comparada(s) con la(s) de la centrifugacin, que contienen los factores lbiles de la coa-
sustancia en examen. Poseen un grado de pureza adecuado gulacin. Contiene solucin anticoagulante, conservadora
al uso al cual se destinan. y preservadora, siendo almacenado a una temperatura de
30 C o inferior. Se destina a la preparacin de hemoderi-
El PRef es establecido y distribuido por autoridades far- vados de acuerdo con las Buenas Prcticas de Fabricacin
macopeicas, cuyo valor atribuido a una o ms de sus pro- de Medicamentos.
piedades es aceptado sin necesitar comparacin con otro
estndar, destinado al uso en ensayos especficos descri- Polvo
tos en las monografas farmacopeicas. Incluyen sustancias
qumicas de referencia, productos biolgicos, extractos y Es la forma farmacutica slida conteniendo uno o ms
polvos vegetales, radiofrmacos, entre otros. La expresin principios activos secos y con tamao de partcula reduci-
relacionada ms usada es: Sustancia Qumica de Referen- do, con o sin excipientes.
cia Farmacopeica.
Es el polvo embalado bajo presin conteniendo un gas pro- Es el polvo estril destinado a la reconstitucin para for-
pelente e ingredientes teraputicamente activos que son li- mar una solucin para uso por infusin. Esa solucin es,
berados despus de la activacin de un sistema apropiado normalmente, isotnica con la sangre y utilizada principal-
de vlvulas. Abreviatura: polvo aer. mente para administracin en gran volumen. Abreviatura:
polvo sol. inf.
Polvo efervescente
Polvo para suspensin
Es el polvo conteniendo, en adicin a los ingredientes ac-
tivos, sustancias cidas y carbonatos o bicarbonatos, los Es el polvo destinado a ser reconstituido para formar una
cuales liberan dixido de carbono cuando el polvo es di- suspensin. Abreviatura: polvo sus.
suelto en agua. Es destinado a ser disuelto o disperso en
agua antes de la administracin. Abreviatura: polvo efev. Polvo para suspensin inyectable
Polvo liofilizado para solucin inyectable Es el polvo estril destinado a la adicin subsiguiente de
lquido para formar una suspensin. Abreviatura: polvo
Es el polvo estril destinado a la adicin subsiguiente de
lquido para formar una solucin. Preparado por liofiliza-
cin, un proceso que envuelve la eliminacin de agua de
sus. iny.
Polvo para solucin inyectable Es aquel proyectado para prevenir la contaminacin de los
componentes estriles por microorganismos viables o ade-
Es el polvo estril destinado a la adicin subsiguiente de ms en la fase intermedia de la produccin.
lquido para formar una solucin. Abreviatura: polvo sol.
iny.
Es el producto para uso externo; antisptico o no; desti- Es aquel que protege su contenido de prdidas y contami-
nado al aseo o a la desinfeccin corporal, comprendiendo nacin por slidos extraos, en las condiciones usuales de
el jabn, shampoo, dentfrico, enjuague bucal, antitrans- manipulacin, almacenamiento, distribucin y transporte.
pirante, desodorante, producto para barbear y despus de
barbear, estptico y otros. Abreviatura: pro. hig. Recipiente hermtico
4 proceso de fabricacin.
Pureza
Recipiente para dosis nica
Son sustancias utilizadas en pruebas, reacciones, ensayos y Es el ensayo que cuantifica la intensidad de la reaccin
dosificaciones farmacopeicas, como tales o en soluciones. qumica entre el agua y los elementos alcalinos existentes
en el vidrio, especialmente sodio y potasio. Esa resistencia gnicos y descartables, pudiendo ser fabricados a partir de
determina la clasificacin del tipo de vidrio. uno o varios polmeros, y conforme los casos, de ciertos
aditivos y son validados por sus respectivos mtodos ana-
Rtulo lticos.
Sueros hiperinmunes para uso humano Es establecida por comparacin con una SQR Farmacopei-
ca, por medio de ensayos farmacopeicos, o debidamente
Los sueros hiperinmunes son preparaciones conteniendo validados, y registrados por el propio laboratorio que ir
inmunoglobulinas purificadas, de origen animal, que neu- a utilizarla. En esa situacin, debern ser mantenidos los
tralizan especficamente toxinas bacterianas, bacterias, vi- registros analticos y realizados controles peridicos, em-
rus o componentes txicos del veneno de una o ms espe- plendose una SQR Farmacopeica.
cies de animales ponzoosos.
4 Sustancia adyuvante
Sustancias insaponificables
Sustancia Qumica de Referencia de la Farmacopea Es la forma farmacutica lquida que contiene partculas
Brasilea (SQR.FB) slidas dispersas en un vehculo lquido, en el cual las par-
tculas no son solubles. Vea definicin de liberacin retar-
Est establecida y dispuesta por la Direccin de la Far- dada. Abreviatura: sus. lib. ret.
macopea Brasilea, siguiendo los principios de la OMS,
y oficializada por la Anvisa, siendo su uso obligatorio en
todo territorio nacional. En la ausencia de una SQR. FB es
Es la suspensin estril. Vea definicin de liberacin pro- Valor D (tiempo de reduccin decimal)
longada. Abreviatura: sus. iny. lib. pro.
Es el tiempo, en minutos, necesario para reducir la pobla-
Suspensin spray cin microbiana en 90% o un ciclo logartmico.
Proteger del polvo significa que la sustancia debe ser man- Determinacin de dosis y determinacin de la potencia
tenida en frasco encorchado y usar capa protectora.
Cuando el resultado de un ensayo o de una determinacin
En la monografa pueden estar definidas las condiciones de dosis est expresado en relacin a la sustancia seca; en
de temperatura en que la sustancia debe ser conservada, relacin a la sustancia; o cualquier otra base especfica, la
utilizndose trminos descritos a continuacin. determinacin de la prdida por secado, del tenor de agua o
de otra propiedad designada es efectuada segn el mtodo
En congelador En temperatura entre -20 C y 0 C. descrito en el respectivo ensayo en la monografa de la sus-
tancia en causa, o segn lo descrito en la etiqueta.
En refrigerador En temperatura entre 2 C y 8 C.
Ensayos de identificacin
Local fresco Ambiente cuya temperatura permanece en-
tre 8 C y 15 C. Los ensayos de identificacin posibilitan verificar, con un
nivel de certeza aceptable, que la identidad del material
Local fro Ambiente cuya temperatura no excede 8 C. bajo examen est de acuerdo con el rtulo de su embalaje.
A pesar de que especficos, ellos no son, necesariamente,
Algunos ensayos de identificacin deben ser considerados Incineracin hasta peso constante
conclusivos como; infrarrojo; espectrofotometra con ab-
sorcin especfica y cromatografa a lquido de alta eficien- Esa expresin significa que la incineracin debe proseguir
cia acoplada a espectrofotometra. Esos ensayos deben ser a 800 25 C, o a otra temperatura indicada en la mo-
realizados en complemento al ensayo del contrain, cuan- nografa, hasta que dos pesadas consecutivas no difieran
do aplicable. en ms de 0,5 mg por gramo de la sustancia en examen,
siendo que la segunda pesada debe ser efectuada despus
Estructura de las monografas de quince minutos de incineracin adicional.
Las monografas de materias primas son identificadas por Interpretacin de la precisin de los dados numricos y
sus denominaciones comunes Brasileas (DCB), grabadas
en caja alta y centralizadas. Adems de eso, son incluidos,
tambin:
lmites de tolerancia
Recipiente bien cerrado Es aquel que protege su conteni- ciones, indica que la solucin debe ser preparada, como
do de prdidas y contaminacin por slidos extraos, en las mximo, 24 horas antes de la realizacin del ensayo.
condiciones usuales de manipulacin; de almacenamiento;
de distribucin y de transporte. Presin reducida
Recipiente perfectamente cerrado Es aquel que protege La expresin presin reducida significa presin menor o
su contenido de prdidas y de contaminacin por slidos, igual a 6,7 kPa (aproximadamente 50 mm de mercurio),
lquidos y vapores extraos, eflorescencia, delicuescencia, a menos que indicado de manera diferente en la mono-
o evaporacin en las condiciones usuales de manipulacin; grafa. Cuando en la monografa est indicada desecacin
almacenamiento; distribucin y transporte. bajo presin reducida sobre agente desecante, la operacin
debe ser hecha bajo presin reducida en desecador u otro
Recipiente hermtico Es aquel impermeable al aire, o aparato adecuado.
cualquier otro gas, en las condiciones usuales de manipu-
lacin; almacenamiento; distribucin y transporte, Procesos de fabricacin
Cilindro de gas Es el recipiente metlico, perfectamente Cualquiera que sea el mtodo utilizado, el producto final
cerrado, de paredes resistentes, destinado a contener gas debe corresponder a las especificaciones incluidas en la
de esos frascos puede ser retirado para administracin en preparadas con agua para inyectables, pueden ser usadas
una nica o en varias dosis. en parte o totalmente al diferencia de solamente agua para
inyectables, a menos que la monografa lo especifique de
Los recipientes para perfusin son frascos con ms de 50 otra forma.
ml de capacidad, pudiendo alcanzar 1000 ml, sellados
con tapa de otro material o no, fabricados de vidrio o de Vehculos no acuosos
plstico. Los medicamentos envasados en esos tipos de re-
cipientes deben ser administrados en una nica vez, con Vehculos no acuosos utilizados parcial o totalmente en la
la utilizacin de equipos estriles, y no pueden contener obtencin de preparaciones inyectables pueden ser misci-
agentes bactericidas o antifngicos. El uso de otros tipos de bles o inmiscibles con agua. Entre los vehculos miscibles
adyuvantes debe ser considerado cuidadosamente. con agua, los ms usados son los alcoholes superiores y los
polmeros del xido de etileno. Entre los inmiscibles con
Solubilidad agua, los ms usados son los aceites fijos de origen vegetal
y los mono y diglicridos de cidos grasos.
La solubilidad indicada no debe ser tomada en el sentido
estricto de constante fsica, sin embargo, complementa y Los aceites fijos son inodoros o casi inodoros y su olor y
corrobora con los dems ensayos, pudiendo tener un valor sabor no deben recordar los de rancio. Deben satisfacer a
definitivo caso la sustancia no presente la solubilidad mni-
ma exigida, principalmente, en el solvente agua.
las exigencias especificadas en las monografas y presentar
las caractersticas descritas a continuacin. 4
Las indicaciones sobre la solubilidad se refieren a las deter- a) prueba de enfriamiento transferir cantidad de leo
minaciones hechas a la temperatura de 25 C. La expresin fijo, previamente desecado a 105 C por dos horas y
solvente se refiere al agua, a menos que indicado de manera enfriado a la temperatura ambiente en desecador conte-
diferente en la monografa individual. niendo gel de slice, para recipiente de vidrio incoloro
cilndrico, con dimetro interno de aproximadamente
La expresin partes se refiere a la disolucin de 1 g de un 25 mm. Cerrar el recipiente y sumergir durante cua-
slido en el nmero de mililitros del solvente establecido tro horas en agua mantenida a 10 C. El lquido debe
en el nmero de partes. permanecer suficientemente lmpido, para que pueda
fcilmente ser vista una lnea negra de 0,5 mm de espe-
Las solubilidades aproximadas constantes en las monogra- sor, cuando mantenida verticalmente atrs del cilindro
fas son designadas por trminos descriptivos cuyos signi- y contra fondo blanco;
ficados estn relacionados en la Tabla 1. b) ndice de saponificacin entre 185 y 200 (5.5.29.8);
c) ndice de yodo entre 79 y 128 (5.5.29.10);
Tabla 1 - Trminos descriptivos de solubilidad y sus significados d) sustancias insaponificables dejar en bao mara 10 ml
del leo con 15 ml de hidrxido de sodio (1:16) y 30 ml
Solvente Trmino descriptivo de alcohol etlico, agitando ocasionalmente hasta que la
Muy soluble Menos de 1 parte mezcla se torne clara. Transferir la mezcla para cpsula
Fcilmente soluble Soluble De 1 a 10 partes de porcelana, evaporar el alcohol etlico en bao mara
Ligeramente soluble De 10 a 30 partes y mezclar el residuo con 100 ml de agua. Debe resultar
Poco soluble De 30 a 100 partes solucin;
Muy poco soluble De 100 a 1000 partes e) cidos grasos libres los cidos grasos libres en 10 g
Prcticamente insoluble o De 1000 a 10 000 partes del leo deben consumir, como mximo, 2 ml de hi-
insoluble Ms de 10 000 partes drxido de sodio 0,02 M.
Unidades de medida Los vehculos no acuosos deben ser seleccionados con es-
pecial cuidado, pues no pueden ser irritantes, txicos o sen-
Son adoptadas en esa Farmacopea las unidades constantes sibilizantes y no deben interferir en la eficacia teraputica
del Sistema Internacional de Unidades (SI), conforme rela- de la preparacin. En casos excepcionales, nombres muy
cionado en el Anexo B. difundidos, sin embargo diferentes de los adoptados por
la Denominacin Comn Brasilea para Frmacos pueden
Vehculos acuosos ser citados como otra denominacin.
5 MTODOS GENERALES
5.1 MTODOS GENERALES valores obtenidos, determinar el peso promedio del conte-
APLICADOS A nido. Se puede tolerar no ms que dos unidades fuera de
los lmites especificados en la Tabla 1, en relacin al peso
MEDICAMENTOS promedio del contenido, sin embargo, ninguna podr estar
arriba o abajo del doble de los porcentuales indicados.
5.1.1 DETERMINACIN DE
Cpsulas blandas
PESO
Proceder como descrito para Cpsulas duras. Para deter-
La prueba se aplica a formas farmacuticas slidas en dosis minar el peso medio del contenido, cortar las cpsulas pre-
unitaria (comprimidos no revestidos, comprimidos reves- viamente pesadas y lavarlas con ter etlico u otro solvente
tidos, pastillas, cpsulas duras y blandas y supositorios),
formas farmacuticas slidas envasadas en recipientes para
dosis unitaria (polvos estriles, polvos liofilizados, polvos
adecuado. Dejar los envoltorios expuestos al aire, en tem-
peratura ambiente, hasta completa evaporacin del solven-
te. Pesar nuevamente.
4
para inyectables y polvos para reconstitucin de uso oral)
y las formas farmacuticas slidas y semislidas envasadas Supositorios y vulos
en recipientes para dosis mltiples (granulados, polvos, ge-
les, cremas, pomadas y polvos para reconstitucin). Pesar, individualmente, 20 supositorios u vulos y deter-
minar el peso promedio. Se puede tolerar no ms que dos
Los pesajes son hechos en balanzas de sensibilidad ade- unidades fuera de los lmites especificados en la Tabla 1,
cuada. en relacin al peso promedio, sin embargo, ninguna podr
estar arriba o abajo del doble de los porcentuales indicados.
PROCEDIMIENTO PARA PRODUCTOS EN DOSIS
UNITARIA Polvos estriles, polvos liofilizados y polvos para
inyectables
Para productos en dosis unitaria, la prueba permite verifi-
car si las unidades de un mismo lote presentan uniformidad Realizar la prueba con 20 unidades. Retirar los lacres me-
de peso. Para realizar la prueba, es necesario determinar, tlicos, en el caso de frascos-ampolla. Retirar rtulos que
previamente, el peso promedio de unidades del lote. puedan sufrir daos durante la prueba. Secar, si es nece-
sario, la superficie externa de los recipientes. Pesar, indi-
Comprimidos no revestidos o revestidos con pelcula vidualmente, las 20 unidades, con las respectivas tapas.
Retirar el contenido y lavar los respectivos recipientes uti-
Pesar, individualmente, 20 comprimidos y determinar el lizando agua y enseguida etanol. Secar en estufa a 105 C,
peso promedio. Se puede tolerar no ms que dos unidades por 1 hora, o en temperaturas inferiores a esa, dependiendo
fuera de los lmites especificados en la Tabla 1, en relacin de la naturaleza del material, hasta peso constante. Enfriar
al peso promedio, sin embargo, ninguna podr estar arriba a la temperatura ambiente, recolocar la tapa y pesar nue-
o abajo del doble de los porcentuales indicados. vamente. La diferencia entre los dos pesajes representa el
peso del contenido. Determinar el peso promedio del con-
Comprimidos con revestimiento azucarado (grageas) tenido de las 20 unidades. Se puede tolerar no ms que dos
unidades fuera de los lmites especificados en la Tabla 1,
Pesar, individualmente, 20 grageas y determinar el peso en relacin al peso promedio, sin embargo, ninguna podr
promedio. Se puede tolerar no ms que cinco unidades fue- estar arriba o abajo del doble de los porcentuales indicados.
ra de los lmites especificados en la Tabla 1, en relacin al
peso promedio, sin embargo, ninguna podr estar arriba o Polvos para reconstitucin (uso oral)
abajo del doble de los porcentuales indicados.
Proceder conforme descrito para Polvos estriles, polvos
Cpsulas duras liofilizados y polvos para inyectables. Se puede tolerar no
ms que dos unidades fuera de los lmites especificados
Pesar, individualmente, 20 unidades, retirar el contenido en la Tabla 1, en relacin al peso promedio, sin embargo,
de cada una, limpiar adecuadamente y pesar nuevamente. ninguna podr estar arriba o abajo del doble de los porcen-
Determinar el peso del contenido de cada cpsula por la tuales indicados.
diferencia de peso entre la cpsula llena y la vaca. Con los
Tabla 2 - Criterios de evaluacin de la determinacin de peso para formas farmacuticas en dosis unitaria.
5
adecuado. Secar, enfriar a la temperatura ambiente y pesar
Para productos acondicionados en recipientes para dosis nuevamente. La diferencia entre las dos pesajes representa
mltiples, la prueba permite verificar la homogeneidad en el peso del contenido.
el envase.
Determinar el peso promedio del contenido de las 10 uni-
Polvos para reconstitucin (uso oral y parenteral) dades. El peso promedio de los contenidos no es inferior
al peso declarado y el peso individual de ninguna de las
Pesar, individualmente, 10 unidades. Retirar el conteni- unidades probadas es inferior al porcentaje indicado en la
do y lavar los respectivos recipientes utilizando solvente Tabla 2, en relacin al peso declarado.
adecuado. Secar, enfriar a la temperatura ambiente y pesar
nuevamente. La diferencia entre los dos pesajes representa Caso no sea cumplida esa exigencia, determinar el peso in-
el peso del contenido. dividual del contenido de 20 unidades adicionales. El peso
promedio del contenido de las 30 unidades no es inferior
Determinar el peso promedio del contenido de las 10 uni- al peso declarado, y el peso individual de no ms que una
dades. Los valores individuales no difieren de 10% en re- unidad en 30 es inferior al porcentaje indicado en la Tabla
lacin al peso promedio. 2, en relacin al peso declarado.
Tabla 3 - Tabla 2 Criterios de evaluacin de la determinacin de peso para formas farmacuticas en dosis mltiples.
5
masa. Lavar los recipientes y las tapas con agua y, en se- exceso volumen, de acuerdo con las caractersticas del pro-
guida, con etanol. Secar en estufa a 105 C, por una hora, ducto, para permitir la administracin del volumen decla-
o en temperatura compatible con el material del recipiente, rado. Los excesos mnimos de volumen recomendados en
hasta peso constante. Enfriar a la temperatura ambiente, la Tabla 1 generalmente son suficientes para permitir la
recolocar la tapa y otras partes correspondientes y pesar retirada y la administracin del volumen declarado.
nuevamente. La diferencia entre los dos pesajes representa
el peso del contenido. Determinar los volmenes indivi- Tabla 1 - Exceso de volumen recomendado
duales correspondientes (V), en ml, utilizando la expresin: para productos lquidos inyectables.
m
V= Exceso mnimo de
p
Volumen declarado volumen recomendado
en que (ml)
mviles / mL viscosos / mL
m = peso del contenido, en g;
p = densidad de masa del producto, en g/ml, determinada a 0,5 0,10 0,12
20 C, conforme descrito en Determinacin de la densidad 1,0 0,10 0,15
de masa y densidad relativa (5.2.5). 2,0 0,15 0,25
3,0 0,20 0,35
A partir de los valores obtenidos, calcular el volumen pro- 4,0 0,25 0,45
medio de las unidades probadas. El volumen promedio no 5,0 0,30 0,50
es inferior al volumen declarado y el volumen individual 10,0 0,50 0,70
de ninguna de las unidades probadas es inferior a 95,0% 20,0 0,60 0,90
del volumen declarado. 30,0 0,80 1,20
50,0 o ms 2% 3%
Productos lquidos en recipientes para dosis mltiples
obtenidos a partir de polvos para reconstitucin (excepto Suspensiones y emulsiones deben ser agitadas antes de la
inyectables) retirada del contenido y antes de la determinacin de la
densidad. Preparaciones oleosas o muy viscosas pueden
Separar 10 unidades. Reconstituir cada unidad conforme ser calentadas, si es necesario, segn las indicaciones del
indicado en el rtulo. Proceder conforme descrito en Pro- rtulo o a 37 C, y agitadas vigorosamente antes de la reti-
ductos lquidos en recipientes para dosis mltiples (excep- rada del contenido. Los contenidos son entonces enfriados
to inyectables). entre 20 C y 25 C antes de la medicin del volumen.
A partir de los valores obtenidos, calcular el volumen pro- Para inyectables en recipientes para dosis nica, probar 6
medio de las unidades probadas. El volumen promedio no unidades si el volumen declarado es igual o superior a 10
es inferior al volumen declarado y el volumen individual ml, 10 unidades si el volumen declarado es superior a 3 ml
de ninguna de las unidades probadas es inferior a 95,0% o e inferior a 10 ml, o 12 unidades si el volumen declarado
superior a 110,0% del volumen declarado. es igual o inferior a 3 ml. Retirar el contenido total de cada
unidad con auxilio de jeringa de capacidad que no exceda 3
veces el volumen a ser medido, provista de aguja nmero 21
con no menos que 2,5 cm de largo. Eliminar burbujas even- 5.1.3.1 PRUEBA DE DUREZA
tualmente existentes en la aguja y en la jeringa y transferir el
contenido de la jeringa, sin vaciar la aguja, para probeta seca La prueba de dureza permite determinar la resistencia del
calibrada de capacidad que no exceda 2,5 veces el volumen comprimido al aplastamiento o a la ruptura bajo presin
a ser medido. Alternativamente, el contenido de la jeringa radial. La dureza de un comprimido es proporcional a la
puede ser transferido para vaso de precipitados seco tarado, fuerza de compresin e inversamente proporcional a su po-
siendo el volumen calculado por el peso del lquido, en gra- rosidad. La prueba se aplica, principalmente, a comprimi-
mos, dividido por su densidad. Para recipientes con volumen dos no revestidos.
declarado de 2 ml o menos, los contenidos de los recipientes
pueden ser reunidos para obtener el volumen necesario para La prueba consiste en someter el comprimido a la accin
la medicin, debindose utilizar jeringas y agujas secas se- de un aparato que mida la fuerza, aplicada diametralmente,
paradas para cada recipiente. El contenido de recipientes con necesaria para aplastarlo. La fuerza es medida en newtons
volumen declarado de 10 ml o ms puede ser determinado (N).
vacindose el contenido de cada recipiente directamente en
probetas calibradas o vasos de precipitados tarados. APARATOS
El volumen de cada recipiente examinado no es inferior al Pueden ser utilizados diferentes tipos de aparatos, los cua-
volumen declarado. En el caso de recipientes con volumen les difieren bsicamente cuanto al mecanismo empleado
declarado de 2 ml o menos, el volumen de los contenidos para ejercer la presin. La fuerza puede ser ejercida ma-
reunidos no es inferior a la suma de los volmenes declara- nualmente o mecnicamente. A medida que la presin au-
dos de los recipientes utilizados en la prueba. menta, un mbolo, una placa o un pistn aplica determi-
nada fuerza sobre el comprimido, apoyado en base fija. El
Para inyectables en recipientes para dosis mltiples rotu- aparato es calibrado con precisin de 1 N.
5
lados para contener un nmero especfico de dosis de un
determinado volumen, seleccionar una unidad y proceder PROCEDIMIENTO
conforme descrito para inyectables en recipientes para do-
sis nica, utilizando nmero de jeringas y agujas separadas La prueba es realizada con 10 comprimidos, eliminando
equivalente al nmero de dosis especificadas en el rtulo. cualquier residuo superficial antes de cada determinacin.
El volumen dispensado por cada jeringa no es inferior al Los comprimidos son probados, individualmente, obede-
volumen declarado por dosis. ciendo siempre a la misma orientacin (considerar la for-
ma, presencia de ranura y grabacin). Expresar el resultado
Para inyectables en cartuchos o jeringas pre-cargadas, pro- como el promedio de los valores obtenidos en las determi-
bar una unidad si el volumen declarado es igual o superior naciones. El resultado de la prueba es informativo.
a 10 ml, 3 unidades si el volumen declarado es superior a 3
ml e inferior a 10 ml o 5 unidades si el volumen declarado 5.1.3.2 PRUEBA DE FRIABILIDAD
es igual o inferior a 3 ml. Ajustar a los recipientes los acce-
sorios necesarios para su utilizacin (aguja, mbolo, cuer- La prueba de friabilidad permite determinar la resistencia
po de jeringa), cuando sea el caso, y transferir el contenido de los comprimidos a la abrasin, cuando sometidos a la
de cada recipiente, sin vaciar la aguja, para vaso de pre- accin mecnica de aparatos especficos. La prueba se apli-
cipitados seco tarado, empujando el mbolo lenta y regu- ca, nicamente, a comprimidos no revestidos.
larmente. Calcular el volumen, en mililitros, dividiendo el
peso del lquido, en gramos, por su densidad. El volumen La prueba consiste en pesar con exactitud un nmero deter-
de cada recipiente no es inferior al volumen declarado. minado de comprimidos, someterlos a la accin del aparato
y retirarlos despus de efectuadas 100 rotaciones. Despus
Para preparaciones inyectables de gran volumen (infusio- de retirar cualquier residuo de polvo de los comprimidos,
nes parenterales), seleccionar dos unidades y transferir el ellos son nuevamente pesados. La diferencia entre el peso
contenido de cada recipiente para probetas secas calibradas inicial y el final representa la friabilidad, medida en fun-
de capacidad que no exceda 2,5 veces el volumen a ser cin de la porcentaje de polvo perdido.
medido. El volumen de cada recipiente no es inferior al
volumen declarado. APARATOS
5
Figura 1 - Aparato para prueba de friabilidad (friabilmetro).
La cesta consiste en seis tubos de vidrio o acrlico transpa- la prueba.Las partes que constituyen la cesta son monta-
rente, abiertos en ambos lados. Las dimensiones de los tubos das y mantenidas firmemente unidas mediante eje metlico
son: largo 77,5 2,5 mm, dimetro interno entre 20,7 mm y central, con dimetro de cerca de 5 mm. La extremidad
23,0 mm y espesor de las paredes aproximadamente 2 mm. superior del eje central debe tener dispositivo para fijar la
cesta al mecanismo que produce el movimiento vertical del
Los tubos son mantenidos verticalmente, adaptndose en sistema.
cada extremidad de la cesta un disco de material transpa-
rente adecuado, con dimetro entre 88,0 mm y 92,0 mm y Cuando indicado, debe ser adicionado en cada tubo de la
espesor entre 5,0 mm y 8,5 mm, poseyendo seis orificios cesta un disco cilndrico de material transparente adecuado,
en los cuales son introducidos los tubos. Los seis orificios con densidad relativa entre 1,18 y 1,20, dimetro de 20,70
equidistan del centro de cada disco, estando igualmente se- 0,15 mm, y espesor de 9,50 0,15 mm. Cada disco posee
parados. En la cara externa del disco inferior se encuentra cinco orificios, cada uno con 2 mm de dimetro, estando un
una tela de alambre (dimetro de 0,635 0,030 mm) de orificio en el eje del cilindro y los otros cuatro equidistan-
acero inoxidable, con abertura entre 1,8 mm y 2,2 mm, pre- tes, dispuestos sobre un crculo de 6 mm de radio relativo al
sa por medio de tres tornillos. centro del disco. La superficie lateral del disco posee cuatro
abolladuras equidistantes, con profundidad de 2,6 0,1 mm,
Para la prueba de desintegracin de cpsulas, una tela de en forma de V, las cuales, en el lado superior del disco, mi-
alambre de acero inoxidable, semejante a aquella adaptada den 9,4 0,2 mm de largura, y en el lado inferior, 1,6 mm.
al disco inferior de la cesta, u otro dispositivo adecuado Todas las superficies del disco son lisas. El diseo y montaje
puede ser adaptado a la cara externa del disco superior de la cesta pueden variar desde que las especificaciones para
para evitar que las cpsulas escapen de los tubos durante los tubos y abertura de las telas sean mantenidas.
vestidos es de 30 minutos, a menos que indicado de manera Comprimidos solubles y comprimidos dispersables
diferente en la monografa individual.
Realizar la prueba conforme descrito para Comprimidos no
Comprimidos con revestimiento azucarado (grageas) o re- revestidos, utilizando agua mantenida entre 15 C y 25 C,
vestidos con pelcula como lquido de inmersin. Despus de 3 minutos, todos
los comprimidos deben estar completamente desintegra-
Utilizar seis comprimidos en la prueba. Colocar un com- dos.
primido en cada uno de los seis tubos de la cesta. Colo-
car un disco en cada tubo y accionar el aparato, utilizando Cpsulas gelatinosas (duras)
agua mantenida a 37 1 C, como lquido de inmersin.
Al final del intervalo de tiempo especificado, parar el mo- Realizar la prueba conforme descrito para Comprimidos no
vimiento de la cesta y observar el material en cada uno revestidos, omitiendo el uso de los discos. Utilizar una tela
de los tubos. Si los comprimidos no estn completamente con abertura de 1,8 mm a 2,2 mm, de alambre de acero
desintegrados, probar otros seis comprimidos, sustituyen- inoxidable adaptada a la tapa de la cesta, conforme descrito
do el agua por cido clorhdrico 0,1 M, mantenido a 37 en el tem Aparatos. Observar las cpsulas despus de 45
1 C, como lquido de inmersin. Al final del intervalo minutos o conforme especificado en la monografa del me-
de tiempo especificado, parar el movimiento de la cesta y dicamento. Todas las cpsulas deben estar completamente
observar el material en cada uno de los tubos. Todos los desintegradas, o restando, en la tela, apenas fragmentos in-
comprimidos deben estar completamente desintegrados. solubles de consistencia blando.
Se los comprimidos no se desintegraron debido a la adhe-
rencia a los discos, repetir la prueba con seis otros compri- Cpsulas blandas
midos, omitiendo los discos. Al final de la prueba, todos los
comprimidos deben estar completamente desintegrados. El Realizar la prueba conforme descrito para Comprimidos
5
lmite de tiempo establecido como criterio general para la no revestidos, utilizando los discos. Observar las cpsulas
desintegracin de comprimidos revestidos con pelcula es despus de 30 minutos o conforme especificado en la mo-
de 30 minutos, y para comprimidos con revestimiento azu- nografa del medicamento. Todas las cpsulas deben estar
carado (grageas) es de 60 minutos, a menos que indicado completamente desintegradas, o restando, en la tela, ape-
de manera diferente en la monografa individual. nas fragmentos insolubles de consistencia blando. Si las
cpsulas no se desintegran debido a la adherencia a los dis-
Comprimidos o cpsulas con revestimiento entrico cos, repetir la prueba con otras seis unidades, omitiendo los
(gastrorresistentes) discos. Al final de la prueba, todas las cpsulas deben estar
completamente desintegradas.
Utilizar seis unidades en la prueba. Colocar una unidad en
cada uno de los seis tubos de la cesta. Accionar el apara- 5.1.4.2 PRUEBA DE DESINTEGRACIN
to, sin aadir los discos, utilizando cido clorhdrico 0,1 DE SUPOSITRIOS, VULOS Y
M mantenido a 37 1 C como lquido de inmersin, por COMPRIMIDOS VAGINALES
60 minutos o el tiempo especificado en la monografa in-
dividual. Parar el movimiento de la cesta y observar los Esta prueba permite verificar la mayor o menor capacidad
comprimidos o cpsulas. Ninguna unidad puede presentar de esas formas farmacuticas de ablandarse o desagregarse
cualquier seal de desintegracin, trizadura o ablanda- en medio lquido, en el espacio de tiempo prescrito.
miento, que posibilite el desborde de su contenido. Colo-
car un disco en cada tubo y accionar el aparato, utilizando Se considera desintegracin completa cuando el suposito-
solucin tampn fosfato pH 6,8 mantenido a 37 1 C rio o vulo presente:
como lquido de inmersin. Pasados 45 minutos o el tiem-
po especificado en la monografa, parar el movimiento de a) disolucin completa;
la cesta y observar el material en cada uno de los tubos. b) separacin completa de sus componentes, acumulndo-
Todos los comprimidos o cpsulas deben estar completa- se sustancias grasas fundidas en la superficie del lqui-
mente desintegrados, pudiendo restar apenas fragmentos do, depositndose los polvos insolubles en el fondo del
de revestimiento insolubles. Si los comprimidos o cpsulas recipiente y disolvindose los componentes solubles de
no se desintegran debido a la adherencia a los discos, repe- la muestra, siendo que la distribucin de los componen-
tir la prueba con seis otras unidades, omitiendo los discos. tes ocurre de uno o ms modos descritos arriba;
Al final de la prueba, todos los comprimidos o cpsulas c) ablandamiento de la muestra que puede ser acompaa-
deben estar completamente desintegrados. La prueba no se do por el cambio de su forma sin que ocurra separacin
aplica a cpsulas no revestidas que contienen preparacin completa de sus componentes; el ablandamiento debe
de liberacin entrica. ser tal que, al presionar la muestra ablandada con bas-
tn de vidrio, no se perciba existencia de camada ms
Comprimidos sublinguales dura en su superficie;
d) ruptura de la cpsula gelatinosa de vulos, permitiendo
Realizar la prueba conforme descrito para Comprimidos no liberacin de sus componentes;m
revestidos, omitiendo el uso de discos. Despus de 5 mi- e) ausencia de residuo sobre el disco perforado o, cuando
nutos, todos los comprimidos deben estar completamente hubiese, tenga la consistencia de masa blanda que no
desintegrados. ofrezca resistencia a la presin de bastn de vidrio.
APARATOS PARA LOS MTODOS 1 Y 2 vidual, mantenindola en los lmites de 4%. La rotacin
no debe producir efectos indeseables en la hidrodinmica
El aparato de disolucin consiste de un sistema de tres del sistema.
componentes, descritos a continuacin.
Las cubas son inmersas en bao de agua termostatizado, de
Recipientes abiertos de forma cilndrica y fondo hemisf- material transparente y tamao adecuado, en que la tem-
rico (cubas), hechos en vidrio boro silicato, plstico u otro peratura sea mantenida a 37 C 0,5 C durante la ejecu-
material transparente e inerte, a los cuales puede ser adap- cin de la prueba. El aparato debe estar exento de cualquier
tada tapa de material inerte, con aberturas adecuadas para fuente de vibracin, inclusive externa, que pueda influir en
el agitador, recogida de muestras e insercin de termme- la hidrodinmica del sistema. De preferencia, el aparato
tro. Las cubas pueden presentar las siguientes dimensiones debe posibilitar la visualizacin de las muestras y de los
y capacidades: 185 25 mm de altura y 102 4 mm de agitadores durante la prueba.
dimetro interno para una capacidad nominal de un litro;
290 10 mm de altura y 102 4 mm de dimetro interno Mtodo 1: Cestas
para una capacidad nominal de dos litros; 290 10 mm de
altura y 150 5 mm de dimetro interno para una capaci- Cuando especificado en la monografa, se utiliza como agi-
dad nominal de cuatro litros. tador una barra de acero inoxidable, en cuya extremidad se
adapta una cesta del mismo material (Figura 1). La tela es-
Barras en acero inoxidable para proveer agitacin del me- tndar utilizada en la confeccin de la cesta posee dimetro
dio, que pueden presentar bajo dos formas: cestas (Mtodo de hilo de 0,25 mm y abertura de malla cuadrada de 0,40
1) o palas (Mtodo 2) (Figuras 1 y 2). La barra debe ser 0,04 mm (mesh 40), salvo especificacin contraria en la
centralizada de tal forma que, al ser accionada, su eje de monografa individual. La muestra debe ser colocada den-
rotacin no se aleje ms de 2 mm en relacin al eje vertical tro de la cesta seca, antes del inicio de la prueba. Durante
5
del recipiente conteniendo el medio de disolucin. su ejecucin, una distancia de 25 2 mm debe ser mante-
nida entre la parte inferior de la cesta y el fondo interno del
Un motor que posibilita ajustar la velocidad de rotacin recipiente que contiene el medio de disolucin.
de la barra a aquella especificada en la monografa indi-
Mtodo 2: Palas entre el extremo inferior de las palas y el fondo interno del
recipiente que contiene el medio de disolucin.
Cuando especificado en la monografa, se utiliza como
agitador una barra de acero inoxidable, revestida o no de Es importante que las muestras no floten en el medio de
material inerte, cuya extremidad presenta la forma de pala disolucin. Se puede recurrir a un dispositivo apropiado,
(Figura 2), capaz de girar suavemente y sin desvi de eje confeccionado en hilo de acero espiralado en pocas vuel-
durante el tiempo y velocidad especificados en la monogra- tas y en dimetro suficiente para aprisionar la cpsula o el
fa correspondiente. La muestra debe ser adicionada, siem- comprimido sin deformarlos ni reducir el rea de contacto
pre que posible, antes del inicio de la prueba. Durante su con el medio.
ejecucin, una distancia de 25 2 mm debe ser mantenida
poseer dispositivo de ajuste de la velocidad de movimiento macin de burbujas que puedan interferir en la velocidad
alternado, de acuerdo con el preconizado en la monografa de disolucin a ser medida. Cuando el medio de disolucin
individual, con variacin mxima de 5%. sea solucin tampn, el pH debe ser ajustado a 0,05 uni-
dades del valor del pH especificado en la monografa del
Preferentemente, el aparato debe posibilitar la visualiza- producto.
cin de los cilindros y de las muestras en anlisis en su
interior. Los frascos poseen tapa adecuada, la cual debe TIEMPO DE DISOLUCIN
permanecer fija durante la realizacin del ensayo. Los
componentes del conjunto poseen las dimensiones presen- Cuando un nico tiempo sea especificado en la monografa
tadas en la Figura 3, a menos que haya alguna especifica- del producto, l representa el tiempo mximo dentro del
cin diferente en la monografa. cual debe ser disuelta la cantidad mnima, en porcentaje,
de sustancia activa en ella establecida. Cuando ms de un
tiempo sea especificado en la monografa, deben ser to-
madas alcuotas, adecuadamente medidas, al final de cada
tiempo indicado.
5
lumen medido del Medio de disolucin especificado en la
monografa del producto, convenientemente desgasifica-
do, caso necesario, al recipiente del aparato de disolucin.
Mantener la temperatura del medio a 37 C 0,5 C, re-
tirando el termmetro antes de iniciar la agitacin. En el
caso del Mtodo 1, colocar la muestra dentro de la cesta
seca. En el caso del Mtodo 2, colocar la muestra dentro
del recipiente de disolucin, como descrito anteriormente.
En ambos casos, al observar formacin de burbujas en la
superficie de las muestras, cuando est en contacto con el
medio de disolucin, verificar su influencia en el resultado.
Iniciar inmediatamente la agitacin, conforme velocidad
prefijada. En intervalo(s) de tiempo especificado(s) en la
monografa del producto, retirar alcuota para anlisis de
la regin intermedia entre la superficie del medio de di-
solucin y la parte superior del cesto o palas, a no menos
que 1 cm de la pared interna del recipiente (Figuras 1 y 2).
Durante la retirada de la alcuota, mantener la agitacin.
Filtrar inmediatamente las muestras, caso no est utilizan-
do filtros acoplados al sistema de muestreo. Los filtros em-
pleados deben ser inertes, no adsorber porcin significativa
del frmaco y poseer porosidad adecuada. De acuerdo con
lo especificado en la monografa del producto, el volumen
de muestra retirado puede o no ser repuesto. Si es necesaria
la reposicin, el mismo medio de disolucin calentado a 37
C debe ser utilizado. En el caso de que la reposicin del
medio de disolucin no sea realizada, corregir el volumen
en los clculos. Despus de filtracin y diluicin (cuando
necesario) de la alcuota, la cuantificacin del frmaco es
efectuada mediante la tcnica indicada en la monografa
del producto. Repetir la prueba con dosis unitarias adicio-
Figura 3 - Mtodo 3 (Cilindros alternados). Las nales, conforme necesario, considerando los Criterios de
dimensiones indicadas son en milmetros. aceptacin.
mximo, 750 000 unidades/ 1000 ml. Para medio de diso- frmaco disuelto, empleando mtodo analtico adecuado.
lucin con pH igual o superior a 6,8, aadir pancreatina de, El tampn pH 6,8 puede ser preparado por la mezcla de 3
como mximo, 1750 unidades de proteasa/ 1000 ml. volmenes de HCl 0,1 M y 1 volumen de solucin de fos-
fato de sodio tribsico 0,20 M, ajustando, si es necesario, el
PROCEDIMIENTO PARA FORMAS FARMACUTI- pH para 6,8 0,05 con HCl 2 M o NaOH 2 M.
CAS DE LIBERACIN RETARDADA
PROCEDIMIENTO PARA El MTODO 3
Emplear el Mtodo A o el Mtodo B o el mtodo indicado
en la monografa individual. Formas farmacuticas de liberacin inmediata: emplean-
do el Mtodo 3, aadir el volumen del Medio de disolucin
Mtodo A especificado en la monografa del producto en cada frasco
del aparato, disponer los frascos en el bao del instrumen-
Etapa cida: utilizar 750 ml de HCl 0,1 M como Medio de tal para climatizar a 37 C 0,5 C y retirar los termme-
disolucin en las cubas cuando empleando los Mtodos 1 tros antes de iniciar la prueba. Colocar una unidad de de-
y 2. Montar el aparato de disolucin conforme descrito en terminacin de dosis de la muestra en cada uno de los seis
Aparatos para los Mtodos 1 y 2 y aadir una unidad de cilindros alternados, evitando la formacin de burbujas de
ensayo en cada cuba o cesta, conforme el caso. Proceder aire en la superficie del material, e, inmediatamente, iniciar
a la prueba con la velocidad especificada en la monografa la operacin del aparato de acuerdo con lo especificado en
por 2 horas. Al final de este tiempo, retirar una alcuota del la monografa individual del producto. Durante el movi-
Medio de disolucin e, inmediatamente, ejecutar la etapa miento ascendente y descendente de los cilindros, la ampli-
tampn pH 6,8. Determinar la cantidad de frmaco disuel- tud en altura debe situarse entre 9,9 y 10,1 cm. En el(los)
to en la alcuota muestreada, empleando mtodo analtico intervalo(s) de tiempo especificado(s) en la monografa
adecuado. individual, levantar los cilindros y muestrear una alcuota
5
del Medio de disolucin de cada frasco, de la regin inter-
Etapa tampn pH 6,8: ejecutar la preparacin de la etapa media entre la superficie del lquido y el fondo del frasco.
tampn y ajuste del pH en 5 minutos. Con el aparato de Despus de filtracin y diluicin (cuando necesario) de la
disolucin operando en la velocidad especificada para el alcuota, realizar anlisis cuantitativo del frmaco disuelto
producto, aadir al Medio de disolucin de la Etapa cida de acuerdo con el preconizado en la monografa individual
250 ml de solucin de fosfato de sodio tribsico 0,20 M del producto. si necesario, repetir la prueba con unidades
previamente climatizado a 37 C 0,5 C. Ajustar, si ne- adicionales del medicamento. Reponer el volumen de me-
cesario, el pH para 6,8 0,05 con HCl 2 M o NaOH 2 M. dio muestreado con igual volumen de Medio de disolucin
Continuar operando el aparato de disolucin por 45 minu- fresco mantenido a 37 C o, en situaciones donde com-
tos, o el tiempo especificado en la monografa. Al final de probadamente no sea necesaria la reposicin del medio,
este tiempo, retirar alcuota del Medio de disolucin de la efectuar la correccin de la alteracin del volumen durante
etapa tampn pH 6,8 y determinar la cantidad de frmaco los clculos. Mantener los frascos cubiertos con sus res-
disuelto, empleando mtodo analtico adecuado. pectivas tapas durante la ejecucin de la prueba y verificar
peridicamente la temperatura del medio. Para el medio y
Mtodo B el tiempo de disolucin seguir las orientaciones generales
indicadas en Medio de disolucin y Tiempo de disolucin.
Etapa cida: utilizar 1000 ml de HCl 0,1 M como Medio
de disolucin en las cubas y montar el aparato de disolu- Formas farmacuticas de liberacin prolongada: em-
cin conforme descrito en Aparatos para los Mtodos 1 pleando el Mtodo 3, ejecutar el procedimiento conforme
y 2. Aadir una unidad de ensayo en cada cuba o cesta, descrito en Formas farmacuticas de liberacin inmedia-
conforme el caso. Proceder a la prueba con la velocidad ta y seguir las orientaciones generales indicadas en Medio
especificada en la monografa por 2 horas. Al final de ese de disolucin y Tiempo de disolucin. Los tiempos estn
tiempo, retirar una alcuota del Medio de disolucin e, in- expresados en horas y normalmente son indicados por lo
mediatamente, ejecutar la etapa tampn pH 6,8. Determi- menos 3 intervalos de tiempo.
nar la cantidad de frmaco disuelto en la alcuota muestrea-
da, empleando mtodo analtico adecuado. Formas farmacuticas de liberacin retardada: emplean-
do el Mtodo 3, tomar como base el procedimiento indica-
Etapa tampn pH 6,8: emplear tampn fosfato pH 6,8 pre- do en Mtodo B para Formas farmacuticas de liberacin
viamente climatizado a 37 C 0,5 C. Drenar el medio retardada, empleando una fila de frascos para la etapa cida
de disolucin de la etapa cida de las cubas y aadir 1000 y la fila sucesiva de frascos para la etapa con solucin tam-
ml de medio de disolucin tampn fosfato pH 6,8. Como pn pH 6,8, adicionando el volumen de medio especificado
alternativa se puede retirar cada cuba con el medio de la en la monografa (usualmente 300 ml). Los tiempos de re-
etapa cida del aparato de disolucin y sustituir por otra coleccin son los especificados en la monografa o los ge-
cuba con el medio de la etapa tampn pH 6,8, transfiriendo nerales indicados en Mtodo B para Formas farmacuticas
cuidadosamente la unidad de ensayo del medicamento a de liberacin retardada.
prueba. Continuar operando el aparato de disolucin por
45 minutos, o el tiempo especificado en la monografa. Al
final de ese tiempo, retirar alcuota del medio de disolu-
cin de la etapa tampn pH 6,8 y determinar la cantidad de
El producto cumple la prueba si los resultados atienden las exigencias descritas en la Tabla 1, salvo especificacin con-
traria en la monografa individual.
Tabla 1 - Tabla 1 Criterios de aceptacin para la prueba de disolucin de formas farmacuticas de liberacin inmediata
Etapas N de muestras probadas criterios de aceptacin
E1 06 Cada unidad presenta resultado mayor o igual a Q + 5%
E2 06 Promedio de 12 unidades (E1 + E2) es igual o mayor que Q y ninguna unidad
presenta resultado inferior a Q 15%.
E3 12 Promedio de 24 unidades (E1 + E2 + E3) es igual o mayor que Q, no ms
que dos unidades presentan resultados inferiores a Q 15% y ninguna
unidad presenta resultado inferior a Q 25%.
5
casos, asegurar un valor de Q (cantidad disuelta en tiem- conformidad con lo especificado. Caso el criterio para la
po infinito) verificando que dos dosificaciones consecuti- Etapa E3 tampoco sea atendido, el producto es considerado
vas no difieren entre s ms de 2% despus de 10 minutos. insatisfactorio.
Tabla 2 - Criterios de aceptacin para la prueba de disolucin (liberacin) realizada para formas farmacuticas de liberacin prolongada
N de unidades
Etapas Criterios de aceptacin
probadas
L 6 Cada resultado individual se encaja en el intervalo establecido (Q1 y Q2) para cada
1 determinado tiempo y ningn resultado individual es inferior al Q del ltimo tiempo.
L 6 El promedio de 12 unidades (E1 + E2) se encaja en el intervalo establecido (Q1 y Q2)
2 para cada determinado tiempo y no es inferior al Q del ltimo tiempo. Ninguna unidad
individual presenta resultado que supera los lmites de Q1 y Q2 en 10% de la cantidad
declarada, para cada determinado tiempo, y ningn resultado individual da un valor
inferior al Q del ltimo tiempo que supera en 10% a cantidad declarada.
L3 12 El promedio de 24 unidades (E1 + E2 + E3) se encaja en el intervalo establecido (Q1
y Q2) para cada determinado tiempo y no es inferior al Q del ltimo tiempo. No ms
que 2 unidades de las 24 probadas presentan resultados que superan los lmites de Q1
y Q2 en 10% de la cantidad declarada, para cada determinado tiempo, y no ms que
2 unidades de las 24 probadas presentan resultados con valor inferior al Q del ltimo
tiempo que superen en 10% la cantidad declarada.
Ninguna unidad individual presenta resultado que supera los lmites de Q1 y Q2 en
20% de la cantidad declarada, para cada determinado tiempo, y ningn resultado
individual da un valor inferior al Q del ltimo tiempo que supera en 20% la cantidad
declarada.
CRITERIOS DE ACEPTACIN PARA FORMAS FAR- el valor de Q indicado en la monografa del producto y,
5
MACUTICAS DE LIBERACIN RETARDADA cuando no especificado, emplear 75% como valor de Q en
la etapa tampn pH 6,8. Los trminos A1 A2 y A3 refieren
El producto cumple la prueba si los resultados atienden a las tres posibles etapas de evaluacin en la etapa cida
las exigencias presentadas en la Tabla 3 en la etapa cida (A) y los trminos B1, B2 y B3 se refieren a las tres posibles
(Mtodos A o B) y, tambin, las exigencias indicadas en etapas de evaluacin en la etapa tampn pH 6,8 (B).
la Tabla 4 en la etapa tampn pH 6,8 (Mtodos A o B),
salvo especificacin contraria en la monografa individual.
Emplear
N de unidades
Etapas Criterios de aceptacin
probadas
A1 6 Ninguna unidad individual presenta cantidad disuelta superior a 10% de lo declarado.
N de unidades
Etapas Criterios de aceptacin
probadas
B1 6 Cada unidad presenta resultado mayor o igual a Q + 5%
B2 6 Promedio de 12 unidades (B1 + B2) es igual o mayor que Q y ninguna unidad presenta
resultado inferior a Q 15%.
B3 12 Promedio de 24 unidades (B1 + B2 + B3) es igual o mayor que Q, no ms que dos
unidades presentan resultados inferiores a Q 15% y ninguna unidad presenta
resultado inferior a Q 25%.
Para asegurar la administracin de dosis correctas, cada La uniformidad de las dosis unitarias de formas farmacu-
unidad del lote de un medicamento debe contener cantidad ticas puede ser evaluada por dos mtodos: Variacin de
del componente activo prximo de la cantidad declarada. peso y Uniformidad de Contenido. La aplicacin de cada
La prueba de uniformidad de dosis unitarias permite eva- mtodo considerando la forma farmacutica, dosis y pro-
luar la cantidad de componente activo en unidades indivi- porcin del frmaco es presentada en la Tabla 1.
5
duales del lote y verificar si esta cantidad es uniforme en
las unidades probadas. Las especificaciones de esta prueba
se aplican a las
El mtodo de Uniformidad de Contenido para preparacio- 1. soluciones envasadas en recipientes para dosis nica y
nes en dosis unitarias se basa en la determinacin de do- en cpsulas blandas;
sis del contenido individual del componente activo de un 2. slidos (incluyendo polvos, grnulos y slidos estri-
nmero de dosis unitarias para determinar si el contenido les) acondicionados en recipientes para dosis nica que
individual est dentro de los lmites especificados. El m- no contienen otras sustancias adicionadas, sean ellas
todo de Uniformidad de Contenido puede ser aplicado en activas o inactivas;
todos los casos. 3. slidos (incluyendo slidos estriles) envasados en re-
cipientes para dosis nica, conteniendo o no sustancias
El mtodo de Variacin de peso puede ser aplicado a las activas o inactivas adicionadas, que tengan sido pre-
siguientes formas farmacuticas: parados a partir de soluciones homogneas liofilizadas
en los recipientes finales, y sean rotulados para indicar
este modo de preparacin;
F = D/E
4. cpsulas duras, comprimidos no revestidos o revestidos
con pelcula, conteniendo 25 mg o ms de la sustancia en que
activa comprendiendo 25% o ms, en peso, de la do-
sis unitaria o, en el caso de cpsulas duras, el conteni- D = cantidad del componente activo por peso medio de la
do de la cpsula, excepto que la uniformidad de otras forma farmacutica obtenida por el procedimiento de de-
sustancias activas presentes en menores proporciones terminacin de dosis;
debe ser demostrada por el mtodo de Uniformidad de E = cantidad del componente activo por peso medio de la
Contenido. forma farmacutica obtenida por el procedimiento espe-
cial. Si (100|D E|)/D fuese superior a 10, no es vlido el
El mtodo de Uniformidad de Contenido es exigido para uso de F.
todas las formas farmacuticas que no atienden a las con- 1. Si F est entre 0,970 y 1,030, no hay necesidad de co-
diciones especificadas para aplicacin del mtodo de Va- rreccin.
riacin de peso.
2. La correccin ser aplicada cuando el valor de F est
UNIFORMIDAD DE CONTENIDO entre 0,900 y 0,970 y entre 1,030 y 1,100 y debe ser
efectuada calculndose la cantidad del frmaco en cada
Para determinar la uniformidad de dosis unitarias por el unidad, multiplicndose las cantidades obtenidas en el
mtodo de uniformidad de contenido separar, como m- procedimiento especial por el factor de correccin F.
nimo, 30 unidades y proceder conforme descrito para las
formas farmacuticas indicadas. Cuando la cantidad de Formas farmacuticas slidas
componente activo de una dosis unitaria sea diferente de lo
especificado en la determinacin de dosis, hacer los ajustes Analizar, individualmente, 10 unidades conforme indicado
de diluicin de las soluciones y/o el volumen de las alcuo- en la monografa individual para la determinacin de dosis,
5
tas para obtener la concentracin del componente activo a menos que un procedimiento especial para uniformidad
en la solucin final semejante a la de la determinacin de de contenido sea descrito en la monografa. Calcular el Va-
dosis. En el caso de determinacin de dosis por titulacin, lor de Aceptacin (VA).
utilizar titulante con concentracin diferente, si necesario,
para consumo de volumen adecuado de titulante. Conside- Formas farmacuticas lquidas
rar cualquier modificacin de las diluiciones para efectuar
los clculos. Analizar, individualmente, 10 unidades conforme indicado
en la monografa individual para la determinacin de dosis,
Cuando hubiere procedimiento especial para la prueba de a menos que un procedimiento especial para uniformidad
uniformidad de contenido en la monografa individual, de contenido sea descrito en la monografa. Conducir la
hacer la correccin necesaria de los resultados obtenidos prueba, individualmente, en cantidad homognea del ma-
conforme descrito a continuacin. terial que es retirada de cada recipiente en condiciones
normales de uso. Expresar el resultado como cantidad dis-
1. Pesar cantidad de unidades del producto suficiente para pensada por unidad. Calcular el Valor de Aceptacin (VA).
efectuar la determinacin de dosis y el procedimiento
especial de la prueba de uniformidad de contenido pre- Valor de Aceptacin para Uniformidad de Contenido
sentados en la monografa individual. Reducir los com-
primidos a polvo fino (o mezclar los contenidos de las Calcular el Valor de Aceptacin (VA) segn la ecuacin:
cpsulas, soluciones, suspensiones, emulsiones, geles
o slidos en recipientes para dosis nica) para obtener
mezcla homognea. Se no es posible obtener mezcla
homognea de esta forma, usar solventes apropiados u Cuyos trminos estn definidos en la Tabla 2.
otros procedimientos para obtener solucin contenien-
do el frmaco. Emplear alcuotas apropiadas de esta VARIACIN DE PESO
solucin para los ensayos especificados.
Para determinar la uniformidad de dosis unitarias por el
2. Analizar, separadamente, porciones de la muestra, me- mtodo de variacin de peso separar, como mnimo, 30
didas con precisin, conforme el procedimiento indica- unidades y proceder conforme descrito para las formas far-
do para la determinacin de dosis (D) y el procedimien- macuticas indicadas. La cantidad de frmaco por unidad
to especial indicado para uniformidad de contenido (E), es estimada a partir del resultado de la determinacin de
descritos en la monografa individual. dosis y de los pesos individuales, asumindose distribucin
homognea del componente activo. Las cantidades indivi-
3. Calcular la cantidad de frmaco por peso medio uti- duales estimadas (x) son calculadas segn la ecuacin:
lizando los resultados obtenidos por el procedimiento
xi = pi x A/P
de determinacin de dosis (D) y por el procedimiento
especial (E). en que
4. Calcular el factor de correccin (F) segn la ecuacin: pt = pesos individuales de las unidades o de los contenidos
de las unidades probadas;
5
les en porcentaje de la cantidad declarada. Calcular el Va- que est indicado de manera diferente en la monografa
lor de Aceptacin (VA). individual.
Pesar, exactamente e individualmente, 10 cpsulas, preser- El producto cumple la prueba de uniformidad de dosis
vando la identidad de cada una. Cortar las cpsulas con unitarias si el Valor de Aceptacin calculado para las 10
lmina y retirar el contenido, lavando los envoltorios con primeras unidades probadas no es mayor que L1. Si el Va-
solvente adecuado. Dejar los envoltorios a temperatura lor de Aceptacin es mayor que L1, probar 20 unidades
ambiente, por 30 minutos, para completa evaporacin del ms y calcular el Valor de Aceptacin. El producto cumple
solvente, tomando precauciones para evitar adicin o pr- la prueba de uniformidad de dosis unitarias si el Valor de
dida de humedad. Pesar las cpsulas vacas y calcular el Aceptacin final calculado para las 30 unidades probadas
peso del contenido de cada cpsula. Estimar la cantidad de no es mayor que L1 y la cantidad de componente activo de
componente activo en cada cpsula a partir del resultado de ninguna unidad individual es menor que (1 L2 x 0,01)M
la determinacin de dosis y del peso del contenido de cada o mayor que (1 + L2 x 0,01)M. A menos que indicado de
cpsula. Calcular el Valor de Aceptacin (VA). manera diferente en la monografa individual, L1 es 15,0
y L2 es 25,0.
Formas farmacuticas slidas (excepto comprimidos y
cpsulas)
(VA = - T + ks
L2 Desvo mximo permitido para cada Ningn resultado individual es L2 = 25,0 a menos que
unidad probada en relacin al valor de menor que especificado de forma diferente
M utilizado en los clculos del valor (1 L2 0,01)M o mayor que en la monografa individual
de aceptacin. (1 + L2 0,01)M
5
de partculas no visibles en las preparaciones inyectables lizado, con excepcin de las membranas filtrantes, con so-
y en las preparaciones para perfusin utilice de preferencia lucin detergente tibio y enjuagar con agua hasta que todo
el mtodo 1. En determinadas preparaciones, no obstante, el detergente sea retirado. Inmediatamente antes del uso,
puede ser necesario realizar ensayos de conteo de partcu- enjuagar el equipo de la parte superior a la inferior, interna
las por bloqueo de la luz en primer lugar y slo despus por y externamente con agua libre de partculas.
microscopa ptica para poder concluir con conformidad
de los resultados obtenidos. Observar que no se introduzcan burbujas de aire en la
muestra a ser analizada, especialmente cuando alcuotas
La investigacin de las partculas no visibles efectuada de muestra estn siendo transferidas para el accesorio de
aplicando uno de estos mtodos, o los dos, no es posible lectura.
para todas las preparaciones inyectables. Cuando el mto-
do 1 no es aplicable, por ejemplo en el caso de las prepa- Para verificar su adecuacin al ambiente, de los elementos
raciones poco lmpidas o muy viscosas, el ensayo es reali- de vidrio y del agua utilizada, efectuar el conteo de part-
zado por el mtodo 2 (es el caso de las emulsiones, de las culas en cinco muestras de 5 ml de agua libre de partculas,
soluciones coloidales y de las preparaciones de liposomas). de acuerdo con el mtodo descrito en este captulo. En el
Del mismo modo, un ensayo de conteo de partculas por caso de que el nmero de partculas mayores que 10 m
microscopa ptica puede igualmente ser exigido en el caso exceda a 25, para el volumen total de 25 ml, el ambiente no
de productos que formen burbujas de aire o de gas cuando presenta condiciones para realizar la prueba.
pasan a travs del detector. Si la viscosidad de la prepara-
cin es tal que el examen por uno u otro de los mtodos es Procedimiento
imposible, puede efectuarse una dilucin cuantitativa con
un diluyente apropiado para reducir la viscosidad hasta el Homogeneizar la muestra por medio de 25 cambios conse-
grado considerado suficiente para permitir el ensayo. cutivos lentos y suaves del recipiente. Eliminar las burbu-
jas dejando la muestra en reposo por 2 minutos. Transfe-
Los resultados obtenidos cuando se examina una unidad o rir cuatro porciones no menores que 5 ml, y determinar el
un grupo de unidades no puede ser extrapolado con confia- nmero de partculas con tamao igual o mayor que 10 y
bilidad a otras unidades que no fueron analizadas. Por con- 25 m. Desconsiderar el resultado obtenido con la primera
secuencia, conviene establecer planes de muestreo estads- alcuota, y calcular el nmero promedio de partculas para
ticamente vlidos si se quiere llegar a conclusiones vlidas, la muestra bajo examen.
a partir de los datos recolectados, para determinar el grado
de contaminacin particular de un gran grupo de unidades. Evaluacin
El agua utilizada en los ensayos es libre de partculas. Emplear la prueba A, prueba B o prueba C, as como, el
Agua libre de partculas puede ser obtenida por filtracin nmero de muestras, conforme indicado en la monografa
en membrana de porosidad de 0,22 m especfica, de la forma farmacutica.
igual o mayor que 10 m, presentes en las unidades pro- membrana filtrante. El microscopio equipado con un mi-
badas no excede 25 partculas por ml y el nmero de part- crmetro ocular calibrado, con un micrmetro de objeto,
culas con tamao iguales o mayores que 25 m no excede una platina de movimientos cruzados capaz de mantener y
a 3 por ml. de atravesar toda la superficie de filtracin de la membrana
filtrante, dos iluminadores apropiados que permiten ilumi-
Prueba B Soluciones para inyectables en recipientes, con nacin episcpica e iluminacin oblicua, ajustado para am-
volumen declarado, igual o menor que 100 ml. La muestra pliacin de 100 10 veces.
cumple la prueba si el nmero medio de partculas, con
tamao igual o mayor que 10 m, presentes en las unida- El micrmetro ocular es un retculo circular y comprende
des probadas no excede 6 000 partculas por recipiente y el un gran crculo dividido en cuadrantes, por lneas cruzadas,
nmero de partculas con tamao iguales o mayores que 25 crculos de referencia negros y transparentes de dimetro
m no excede a 600 partculas por recipiente. de 10 m y de 25 m con un aumento de 100 y una escala
lineal graduada de 10 en 10 m (Figura 1).
Prueba C Polvos para inyectables en recipientes, con vo-
lumen declarado, igual o menor que 100 ml. La muestra El gran crculo es denominado campo de visin del re-
reconstituida con agua o diluyente apropiado libre de par- tculo. Son necesarios dos iluminadores, un iluminador
tculas cumple la prueba si el nmero medio de partculas, episcpico para fondo claro, interno del microscopio, y un
con tamao iguales o mayores que 10 m, presentes en las iluminador auxiliar externo regulable, ajustable para per-
unidades probadas no excede 10 000 partculas por reci- mitir una iluminacin oblicua reflejada segn un ngulo
piente y el nmero de partculas con tamao igual o mayo- de 10-20. El dispositivo de filtracin destinado a retener
res que 25 m no excede a 1000 partculas por recipiente. la contaminacin particular comprende un soporte de filtro
de vidrio u otro material conveniente, una fuente de vaco
MTODO 2 CONTEO DE PARTCULAS POR MI- y una membrana filtrante adecuada. La membrana filtrante,
5
CROSCOPA de dimensiones apropiadas, es de color negra o gris oscura;
est cubierta o no con una rejilla y el tamao de los poros
Equipo es inferior o igual a 1,0 m.
mtodo descrito en este captulo. En el caso que el nmero As, las partculas mantienen su posicin inicial en el in-
de partculas de 10 m o mayores exceda a 20, o si ms terior del campo de visin del retculo y no se superponen
de 5 partculas de 25 m o mayores estuviesen presentes, a los crculos de referencia para fines de comparacin. El
el ambiente no presenta condiciones para realizar la prueba. dimetro interior de los crculos de referencia transparen-
tes del retculo es utilizado para determinar el tamao de
Procedimiento las partculas blancas o transparentes mientras que el tama-
o de las partculas oscuras es determinado con el dimetro
Homogeneizar la muestra por medio de 25 cambios con- exterior de los crculos de referencia negros y opacos del
secutivos lentos y suaves del recipiente. si necesario, retire retculo. Cuando se realice un ensayo de conteo de partcu-
con cuidado el dispositivo de cierre. Lave las superficies las en microscopio no busque medir o enumerar materias
exteriores de la abertura del frasco con un chorro de agua amorfas, semilquidas o morfolgicamente indistintas que
exenta de partculas y retire el cierre evitando cualquier se asemejan a una mancha o zona desteida de la mem-
contaminacin del contenido. brana filtrante. Estos materiales pueden presentar un brillo
suave o nulo y asumir aspecto gelatinoso o la apariencia de
En el caso de las preparaciones parenterales de gran volu- una pelcula. La interpretacin de la evaluacin puede ser
men, efecte el ensayo en unidades separadas. En el caso facilitada realizando un ensayo de conteo de las partculas
de preparaciones parenterales de gran volumen o de peque- por retencin de la luz sobre una muestra de la solucin.
o volumen igual o superior a 25 ml, pueden ser suficientes
para el ensayo menos de 10 embalajes de acuerdo con un Evaluacin
plan de muestreo apropiado. En cuanto a las preparacio-
nes parenterales de pequeo volumen, cuyo volumen sea Emplear los criterios abajo, de acuerdo con el volumen de
inferior a 25 ml rena el contenido de 10 unidades o ms las muestras o conforme indicado en la monografa espec-
en un recipiente limpio para obtener un volumen mnimo fica, de la forma farmacutica.
5
de 25 ml; en casos justificados y autorizados, la solucin
problema puede ser preparada mezclando el contenido de En las preparaciones envasadas en recipientes de conte-
un nmero apropiado de frascos y completando 25 ml con nido nominal superior a 100 ml, la preparacin satisface
agua exenta de partculas R o un solvente apropiado exento al ensayo si el nmero medio de partculas presentes en
de contaminacin particular, cuando el agua exenta de par- las unidades examinadas no es superior a 12 por mililitro
tculas R no sea apropiada. Las preparaciones parenterales para las partculas de tamao superior o igual a 10 m y
de pequeo volumen cuyo volumen sea superior o igual a no excede de 2 partculas por mililitro para las de tamao
25 ml pueden ser examinadas individualmente. superior o igual a 25 m.
En el caso de los polvos para uso parenteral, reconstituya En las preparaciones envasadas en recipientes de contenido
la preparacin con agua exenta de partculas o un solvente nominal igual o inferior a 100 ml, la preparacin satisface
apropiado exento de contaminacin particular, cuando el al ensayo si el nmero medio de partculas presentes en las
agua exenta de partculas no sea apropiada. unidades examinadas no es superior a 3000 por recipiente
para las partculas de tamao superior o igual a 10 m y a
Humedecer el interior del soporte del filtro provisto de la 300 por recipiente para las partculas de tamao superior o
membrana filtrante con algunos mililitros de agua exenta de igual a 25 m.
partculas. Pase para el filtro la totalidad de la muestra (mez-
cla de las tomas de ensayo o la unidad en ensayo) y aplique 5.1.7.2 PARTCULAS VISIBLES
el vaco. si es necesario, junte, poco a poco, porciones de la
solucin hasta que el volumen total sea filtrado. Despus de La contaminacin por partculas de las preparaciones in-
la ltima adicin, comience el lavado de las paredes internas yectables y de las preparaciones inyectables para perfusin
del soporte del filtro utilizando un chorro de agua exenta de es constituida por partculas extraas, no disueltas y m-
partculas. Mantenga el vaco hasta que la superficie de la viles, adems de las burbujas de gas, y que se encuentran
membrana filtrante quede exenta de lquido. involuntariamente en estas soluciones. La finalidad del en-
sayo es suministrar un mtodo simple de evaluacin visual
Coloque el filtro en una placa de Petri y seque al aire dejan- de la calidad de las soluciones en lo que respecta a las par-
do la placa ligeramente abierta. Cuando el filtro est seco, tculas visibles. Pueden utilizarse otros mtodos validados.
coloque la placa de Petri en la platina del microscopio,
efecte la barredura de toda la membrana filtrante sobre la Aparatos
luz reflejada del iluminador y cuente el nmero de partcu-
las de tamao superior o igual a 10 m y el nmero de par- El aparato (Figura 1) es compuesto por un puesto de ob-
tculas de tamao superior o igual a 25 m. Es igualmente servacin, comprendiendo: un panel negro opaco, de di-
posible efectuar conteo parcial y determinar por clculo el mensiones apropiadas, colocado en posicin vertical, un
nmero total de partculas retenidas en el filtro. Calcule el panel blanco antirreflejo de dimensiones apropiadas, colo-
nmero medio de partculas presentes en la muestra. Para cado en posicin vertical al lado del panel negro, una ram-
determinar el tamao de las partculas con auxilio del ret- pa de iluminacin ajustable, con una fuente de luz blanca
culo circular, proceda a la transformacin de la imagen de protegida y un difusor apropiado (un sistema de ilumina-
cada partcula en un crculo y despus comprela con los cin conteniendo 2 lmparas fluorescentes de 13 W, con
crculos de referencia del retculo de 10 m y de 25 m. largo de onda de 525 nm cada una, es apropiado).
Q
qt =
Nt
5
Procedimiento Q = cantidad de frmaco, en mg/ml, determinada en la de-
terminacin de dosis;
Retire eventualmente los rtulos, lave y seque el exterior Nt = nmero de gotas por mililitro calculado para cada uni-
del recipiente. Agite suavemente e invierta cada recipiente dad probada.
con precaucin, evitando la formacin de burbujas de aire
y obsrvelo durante cerca de 5 segundos contra el panel Calcular el porcentaje con relacin a la cantidad declarada,
blanco. Repita este procedimiento, observando el recipien- para cada unidad probada (%Qt o %qt), empleando una de
te contra el panel negro. Anote la presencia de cualquier las ecuaciones abajo:
partcula.
qt qt
%Qt = x 100 o %qt = x 100
5.1.8 PRUEBA DE GOTEO Qd/Nd qd
Si una unidad est fuera de la banda de 85,0% a 115,0% de La balanza no debe estar sobrecargada.
la cantidad declarada, o si el DPR fuese mayor que 6,0%,
o si ambas condiciones fueron observadas, probar 20 uni- Localizacin de la balanza analtica
dades ms.
La balanza analtica debe asentarse nivelada sobre mesa
El producto cumple la prueba si como mximo una unidad o estantera firme y pesada, protegida por amortiguadores
est fuera de la banda de 85,0% a 115,0% de la cantidad de choque, como bases de corcho o lminas de caucho,
declarada, ninguna unidad est fuera de la banda de 75,0% o adems sobre superficie de concreto, apoyada a pilares
a 125,0% y el DPR de las 30 unidades probadas no es ma- que estn fijos en el piso o conectados a los elementos de
yor que 7,8%. la construccin del edificio a fin de impedir vibraciones.
Debe estar en local aislado, que ofrezca seguridad y estabi-
lidad a la medida, en ambiente de atmsfera relativamente
5.2 MTODOS FSICOS Y seca, protegida del ataque de gases y vapores cidos, a la
FSICO-QUMICOS distancia de fuentes de calor (luz solar directa, hornos, es-
tufas, muflas etc.) y de corrientes de aire.
5.2.1 DETERMINACIN DE LA
MASA Conservacin y limpieza 5
El plato y dems partes de la balanza, inclusive su caja de
Para ser efectuada la medicin de la masa, las balanzas de- proteccin, deben permanecer limpios, exentos de polvo
ben presentar capacidad y sensibilidad de acuerdo con el y sustancias que accidentalmente caigan en el plato de la
grado de precisin requerido y certificado de calibracin balanza o en el piso de la caja. Tales materiales deben ser
actualizado. retirados inmediatamente.
Tratndose de actividades que exigen pesajes exactos, en la Los cuerpos a ser pesados no deben ser colocados directa-
determinacin de masas iguales o mayores que 50 mg utilizar mente sobre el plato. Para tanto, se utilizan papeles o reci-
balanza analtica de 100 a 200 g de capacidad y 0,1 mg de sen- pientes adecuados a la masa, como vasos de precipitados,
sibilidad. Para cantidades inferiores a 50 mg utilizar balanza vidrios de relojes, crisoles, cpsulas de porcelana y pesafil-
analtica de 20 g de capacidad y 0,01 mg de sensibilidad. tros con o sin tapa.
5
dida entre la temperatura corregida en la cual la sustancia
comienza a fluidificarse o a formar gotas en la pared del
tubo capilar y la temperatura corregida en la cual est com- Figura 1 - Aparato para determinacin del punto
pletamente fundida, lo que est evidenciado por la desapa- o intervalo de fusin por el mtodo del capilar.
ricin de la fase slida.
El vaso de precipitados debe tener capacidad de 150 ml y
Existen, bsicamente, cuatro mtodos para determinacin contener lquido apropiado para el bao de inmersin de
del punto o intervalo de fusin. acuerdo con la temperatura deseada. Esos lquidos pueden
ser: parafina lquida de alto punto de ebullicin, silicona
MTODO I MTODO DEL CAPILAR fluida de alto punto de ebullicin, cido sulfrico concen-
trado, etilenoglicol o agua.
Generalmente aplicado para sustancias fcilmente trans-
formadas en polvo. El agitador debe mezclar el lquido rpidamente, mante-
niendo homognea la temperatura del medio. El termme-
Aparatos tro, calibrado hasta su marca de inmersin, debe cubrir una
banda de -10 a 360 C, con divisiones de 1 C y colocado a
Consiste del aparato presentado en la Figura 1. 2 cm del fondo del vaso de precipitados.
Procedimiento
temperatura para 1 a 2 C por minuto, dependiendo de la con agitacin constante para que la temperatura aumente
estabilidad de la sustancia bajo ensayo. 2 C por minuto.
Cuando el bao est 10 C abajo de la banda de fusin, in- La temperatura en la cual la sustancia comienza a ascender
troducir el capilar en el bao, de forma que su parte inferior en el capilar es el punto de fusin.
est bien prxima del medio del bulbo del termmetro.
MTODO III MTODO DE LA GOTA
Las temperaturas obtenidas son corregidas mediante adap-
tacin de termmetro auxiliar al dispositivo anterior, de Generalmente aplicado para determinacin del punto de
forma que su bulbo se apoyen en el termmetro del bao, fusin de sustancias grasas de consistencia pastosa.
en la zona media de la columna emergente de mercurio,
cuando la sustancia funde, leyndose en esta altura la tem- Aparatos
peratura t marcada en el termmetro auxiliar.
Se debe emplear aparatos semejante al del Mtodo I, con
El clculo de la correccin a ser adicionada cada una de las las siguientes diferencias:
temperaturas, que definen el punto de fusin, es efectuado
a travs de la expresin termmetro con lectura hasta 100 C graduado en 1 C
no utiliza capilar
0,00015 N(T-t) el lquido de inmersin es agua.
en que Procedimiento
N = nmero de grados correspondientes a la columna Fundir la muestra, agitando hasta alcanzar una temperatura
5
emergente, de 90 a 92 C e inmediatamente dejar la muestra fundida
T = temperatura leda en el termmetro estndar, enfriar hasta una temperatura de 8 a 10 C arriba del punto
t = temperatura lida en el termmetro auxiliar. de fusin esperado. Enfriar el bulbo de un termmetro has-
ta 5 C, secar y, mientras est fro, sumergirlo en la muestra
El equipo debe ser calibrado a travs del empleo de estn- fundida hasta la altura de la mitad del bulbo, aproximada-
dares de punto de fusin entre aquellos reconocidos inter- mente. Retirarlo inmediatamente y mantenerlo en posicin
nacionalmente u otros. vertical hasta que la superficie de la muestra depositada
sobre el bulbo solidifique, mantenindolo en bao de agua
MTODO II MTODO DEL CAPILAR ABIERTO durante aproximadamente 5 minutos a una temperatura no
mayor que 16 C. Adaptar el termmetro con la muestra
Generalmente aplicado para sustancias que no son fcil- dentro de un tubo de ensayo por medio de un tapn de cau-
mente transformadas en polvo. cho o corcho, de modo que su extremo inferior quede cerca
de 15 mm arriba del fondo del tubo de ensayo. Suspender
Aparatos el tubo de ensayo en un bao de agua a una temperatura de
16 C y elevar la temperatura del bao hasta 30 C a una
Se debe emplear aparato semejante al descrito en el Mto- velocidad de 2 C por minuto y despus a una velocidad de
do del Capilar, con las siguientes modificaciones: 1 C por minuto, hasta que la primera gota se desprenda del
termmetro. La temperatura en la cual esto ocurre repre-
el bao de calentamiento debe ser con agua; senta el punto de fusin.
el termmetro debe ser graduado en 0,2 C, cubriendo
banda de -10 a 100 C; y Para cada determinacin emplear una porcin recin fun-
el tubo capilar. semejante a aquel empleado en el Mto- dida de la muestra. Si la variacin de tres determinaciones
do del Capilar, debe ser abierto en ambas extremidades. es menor que 1 C, calcular el promedio. Si la variacin
fuese mayor que 1 C realizar dos determinaciones ms y
Procedimiento determinar el promedio de las cinco lecturas.
Fundir la sustancia rpidamente a temperatura no superior MTODO IV MTODO DEL BLOQUE METLICO
a 10 C arriba del punto de fusin completo. Agitar y, si CALENTADO
necesario, filtrar a travs de filtro de papel seco.
De aplicacin generalizada en la determinacin del punto o
Insertar la sustancia fundida en la extremidad del capilar intervalo de fusin de sustancias.
hasta formar columna de 8 a 12 mm de altura. Enfriar el
capilar conteniendo la muestra a la temperatura de 15 C, Aparatos
mantenindola, en el mnimo, por 16 horas. Sujetar el tubo
capilar en el termmetro de forma tal que la columna de Consiste de bloque metlico de elevada conductividad tr-
sustancia se localice en la parte media del bulbo de mer- mica, resistente a las sustancias bajo anlisis y de superficie
curio. Colocar el sistema en bao de agua a 15 C, a la plana y pulida, como bronce, acero inoxidable y similares.
profundidad de 3 cm de la superficie del agua. Calentar
Calentar el bloque rpidamente hasta temperatura de 10 C Banda de destilacin es el intervalo de temperatura corre-
abajo del punto de fusin previsto y, entonces, ajustar el gida para la presin de 101,3 kPa (760 mm de Hg), en el
calentamiento para incrementos de temperatura de la orden cual el lquido, o fraccin especfica del lquido, destila to-
de C por minuto. talmente.
5
locar nuevamente algunas partculas de la muestra, a inter- adaptado al baln de forma que el sensor de temperatura se
valos regulares, en el mismo local del bloque, limpiando la encuentre en el centro del cuello y a cerca de 5 mm abajo
superficie despus de cada ensayo. Anotar la temperatura del nivel del tubo lateral. El calentamiento (a gas, elctrico
(t2) en la cual la sustancia solidifica instantneamente al o a travs de bao) debe ser seleccionado de acuerdo con la
contacto con el metal. naturaleza de la sustancia.
Figura 1 - Aparato para determinacin de la banda de destilacin (dimensiones en mm). A, baln de destilacin; B, condensador; C, adaptador.
Donde:
t1 = t2 + k (101,3 b)
El tubo interior es fechado con tapn para contener barra
agitadora y termmetro con divisiones de 0,2 C. El sensor
5
de temperatura del termmetro debe estar fijo a aproxima-
tj = temperatura corregida; damente 15 mm del fondo del tubo. El agitador es un bas-
t2 = temperatura observada a presin atmosfrica b; tn de vidrio adaptado con anillo en su extremidad inferior
k = factor de conversin (Tabla 1), a menos que ese factor (Figura 1).
no sea considerado;
b = presin atmosfrica, expresada en kilopascal, durante
la destilacin.
es constante. Esa relacin equivale al ndice de refraccin La unidad dinmica, Sistema CGS, de viscosidad es el poi-
(n). se. El Sistema CGS de unidades es un sistema de unidades
de medidas fsicas, o sistema dimensional, de tipologa
LMT (longitud, masa tiempo), cuyas unidades base son el
centmetro para la longitud, el gramo para la masa y el se-
Para fines prcticos se mide la refraccin con referencia gundo para el tiempo.
al aire y a la sustancia y no con referencia al vaco y a la
sustancia, por lo tanto las diferencias entre los valores ob- La unidad dinmica anloga en el Sistema Internacional de
tenidos con ambas medidas no son significativos para fines Unidades (SI) es el pascal segundo. El poise es frecuente-
farmacopeicos. mente utilizado con el prefijo centi; un centipoise (cP) es
un milipascal segundo (mPa-s) en unidades SI.
En sustancias isotrpicas, el ndice de refraccin es carac-
terstica constante en determinado largo de onda, tempe- Sistema CGS poise (P)
ratura y presin. Por esta razn, ese ndice es til no slo
1 P = 1 g cm1 s1
para identificar la sustancia, sino, tambin, para detectar
la presencia de impurezas. Es empleado para caracterizar Por definicin, poise es la fuerza, en dinas, necesaria al
principalmente grasas, aceites grasos, ceras, azcares y desplazamiento de camada plana de lquido, con rea de
solventes orgnicos, as como para identificar ciertos fr- 1 cm2, sobre otra camada idntica, paralela y distanciada
macos. Es igualmente usado para determinar la pureza de de la primera en 1 cm, a la velocidad de 1 cm/s. El poi-
aceites voltiles. se es, por lo tanto, demasiado grande para la mayora de
las aplicaciones, por lo que se recurre de ah al centipoise,
Generalmente se determina el ndice de refraccin en fun- cP, correspondiente a un centsimo de poise. A veces es
cin de la luz de sodio en el largo de onda 589,3 nm (raya conveniente que se utilice la viscosidad cinemtica, que
5
D) y a 20 0,5 C. De ah expresarse el valor del ndice de consiste en la relacin entre la viscosidad dinmica y la
20
refraccin como n D . densidad. En ese caso, en el sistema CGS, la unidad es el
stoke. A ejemplo de lo que ocurre con viscosidad absoluta
REFRACTMETROS (medida en poise), es ms conveniente expresar viscosidad
cinemtica en centistokes (100 centistokes = 1 stoke) para
Los refractmetros utilizados normalmente en anlisis far- caracterizar la mayora de los lquidos usuales en Farmacia
macopeica usan luz blanca, pero son calibrados para sumi- y Qumica.
nistrar el ndice de refraccin en trminos de largo de onda
correspondiente al de la luz de la raya D de sodio. Sistema Internacional de Unidades pascal segundo(Pas)
La calibracin del aparato es realizada con estndar sumi- Tabla 1 - Viscosidad de algunos lquidos.
nistrado por el fabricante. Para control de la temperatura y
limpieza del equipo se debe determinar el ndice de refrac- Viscosidad Viscosidad Viscosidad
cin del agua destilada cuyos valores son 1,3330 a 20 C y Lquido (P)a Unidades Nsm cP = mPa.s
1,3325 a 25 C. CGS Unidades SI
Agua 0,0101 (298 K) 0,00101 0,890
5.2.7 DETERMINACIN DE LA Acetona 0,00316 0,000316 0,306
VISCOSIDAD Etanol 0,01200
Glicerina 14,9
0,001200
1,49
1,074
934
Viscosmetros que tienen como principio de funcionamiento Tabla 2 - Valores de viscosidad, de acuerdo
la determinacin del tiempo de cada libre de esferas a travs con la temperatura del ensayo
de tubos conteniendo el lquido bajo ensayo (Hoppler) o la
velocidad de rotacin de ejes metlicos inmersos en el lquido Temperatura (oC) (cP)
(Brookfield, entre otros) son igualmente empleados. 15 1,140
16 1,110
Diversas metodologas que pueden ser empleadas: 17 1,082
18 1,055
resistencia de lquidos al drenaje, tiempo de caudal 19 1,029
de un lquido a travs de un capilar (viscosmetro de
20 1,004
Oswald, Ubbelohde, Baum y Engler);
21 0,980
medida del tiempo de cada de una esfera a travs de
22 0,957
tubos conteniendo el lquido bajo ensayo (Hoppler);
midiendo la resistencia al movimiento de rotacin de 23 0,936
ejes metlicos cuando inmersos en el lquido (remetro 24 0,915
de Brookfield). 25 0,895
A pesar de que sea posible la determinacin de viscosidad ab- Para lquidos mucho viscosos (glicerina y aceites en gene-
soluta, con base en las dimensiones exactas del viscosmetro ral), se puede determinar la viscosidad relativa por el mto-
empleado, es ms frecuente la prctica de la calibracin pre- do de la velocidad de la queda de bolas a travs del lquido,
via del aparato con lquido de viscosidad conocida, permitien- usando el viscosmetro de Hoppler. Ese mtodo, tambin,
do, por comparacin, evaluacin relativa de la viscosidad del es apropiado para determinar la viscosidad absoluta de l-
lquido bajo ensayo. As, emplendose viscosmetro de Os- quidos, aplicndose la ecuacin:
5
twald o similar, se determinan los tiempos de drenaje t1 y t2 de
= t(ds dL)K
volmenes iguales de los lquidos de referencia y muestra, de
densidad d1 y d2, respectivamente. Siendo h2 la viscosidad del Donde:
lquido de referencia, la viscosidad absoluta (cP) del, lquido
muestra, puede ser calculada por la ecuacin: t = tiempo de cada de la bola (seg).
K = cte especfica de la bola (mPcm3),provista por el fa-
1 t1d1
= bricante.
2 t2d2 dS = densidad de la bola (g/cm3).
dL = densidad del lquido (g/cm3).
o mejor
t1d1
1 = 2 La densidad del lquido (dL), para una cierta temperatura,
t2d2 puede ser obtenida en libros de referencia (como hand-
books), o determinada experimentalmente.
El cociente n2/t2.d2 posee valor constante, k, para cada l-
quido de referencia, en el mismo viscosmetro. As, cono- La viscosidad relativa en el mtodo de Hoppler puede ser
cido ese valor (generalmente, encontrado en el manual del determinada aplicndose la ecuacin:
aparato), se simplifica la ecuacin:
1 (ds d1)t1
= k.t.d. =
2 (ds d2)t2
El valor de k puede, tambin, ser determinado, experimen-
talmente, midindose el tiempo de drenaje de lquido es- donde n, d y t son, respectivamente, el coeficiente de visco-
tndar, puro, y aplicndose la ecuacin: sidad dinmica, la masa especfica y el tiempo de drenaje
de igual volumen de los lquidos 1 y 2.
k=
t.d. VISCOSMETRO DE OSTWALD
Emplendose agua como estndar, usual para determina- El principio operacional del viscosmetro de Stokes se basa en
cin de lquidos de baja viscosidad, se adoptan los valores la determinacin de la velocidad de cada libre de una esfera a
de viscosidad registrados en la Tabla 2, conforme la tem- travs del fluido del cual se desea obtener la viscosidad.
peratura del ensayo:
El viscosmetro de Ostwald es el ms simple y popular
entre los aparatos disponibles. Consta de tubo doblado en
U (Figura 1), con uno de los ramos provisto de ampolla
terminada en capilar. Hay dos trazos de referencia, uno
inmediatamente arriba de la ampolla y el otro sobre el ca-
pilar. El otro ramo es suficientemente ancho para permitir
su llenado con el lquido en ensayo hasta la altura de cerca
de 5 mm abajo del trazo de referencia inferior. Para posi-
bilitar mayor variedad de viscosidades, posibles de deter-
minacin, se emplean colecciones de viscosmetros, con con precisin. Entre sus aplicaciones figuran la investiga-
diferentes calibres. El aparato indicado para determinada cin, el control de procesos y el control de calidad, utiliza-
evaluacin es lo que posibilita drenaje de la muestra en do principalmente para sustancias de baja viscosidad, entre
perodo no inferior a 60 segundos. 0,6 y 100 000 mPa.s.
Para la determinacin propiamente dicha, transferir para el El Viscosmetro de Hoppler es compuesto por un tubo de
viscosmetro escogido, lavado y seco, cantidad suficiente vidrio con dos marcas (A y B) separadas por 10 mm entre s
de lquido para alcanzar nivel de 5 mm abajo del trazo de en la columna, las cuales definen la distancia de medicin.
referencia inferior. Fijar el aparato en termostato (20 C), Una bola (de vidrio, aleacin de nquel y hierro o acero),
despus de aguardar que el lquido en el interior del aparato con dimetro compatible con el calibre del tubo de vidrio
adquiera la temperatura controlada, aspirar el lquido por el es instalada en el tope de su contenido lquido. El tubo est
tubo capilar/ampolla (por medio de tubo de caucho fijado envuelto por un cilindro de vidrio lleno con agua en circu-
en la extremidad) hasta que el nivel del lquido exceda li- lacin, bajo temperatura controlada. Todo el conjunto se en-
geramente el trazo de referencia superior. Soltar entonces cuentra dispuesto en posicin ligeramente inclinada (10%
el tubo y, en el instante en que el menisco alcance el trazo en vertical), pudiendo ser girado 180o en torno de un eje
de referencia superior, accionar cronmetro de precisin, perpendicular a ambos los tubos, para posibilitar la repeti-
retrabndolo cuando el menisco pase por el trazo de refe- cin de las determinaciones y el retorno de la bola a la po-
rencia inferior. Registrar el tiempo transcurrido y repetir sicin inicial. La tcnica consiste, en cronometrar el tiempo
el ensayo diversas veces con intervalos de algunos minu- (de cada) que una esfera (con densidad y dimetro variables
tos hasta que tiempos sucesivos no difieran en ms de 0,5 con la respectiva constitucin estructural) lleva para recorrer
segundos Determinar la densidad del lquido bajo ensayo el espacio entre aquellas dos marcas (A y B) existentes en las
(5.2.5), corrigiendo el valor para la densidad relativa al extremidades del tubo de vidrio. Cuanto mayor sea la visco-
agua, a 20 C, y calcular la viscosidad del lquido muestra sidad mayor ser el tiempo que a bola llevar para recorrer
5
por la frmula indicada, empleando la constante k suminis- aquel espacio. El tipo de esfera a ser utilizada es escogida en
trada o determinada por procedimiento similar. funcin del valor presumible de la viscosidad del lquido en
observacin. En el caso de la sangre son utilizadas esferas
de vidrio. Los resultados de la viscosidad, de los lquidos
newtonianos son expresos en unidades absolutas estndares
internacionales (milipascal. segundo, mPa.s).
VISCOSMETRO BROOKFIELD
La muestra debe ser, perfectamente, homogeneizada. En Histricamente, la polarimetra fue realizada utilizando un
el momento del ensayo, el viscosmetro y el material a instrumento en que el poder rotatorio es estimado por la
ser probado deben estar a 25 0,1 C. Cerrar el orificio visualizacin de la intensidad de campos divididos. Por esa
con lmina de vidrio plana y llenar el vaso con muestra razn, la lnea-D de la lmpara de sodio en el largo de onda
hasta el nivel ms elevado. Verter la muestra, lentamente, visible a 589 nm fue el ms frecuentemente utilizado. El
evitando la formacin de burbujas. Nivelar la muestra en poder rotatorio especfico determinado en la lnea D est
el vaso utilizando placa de vidrio plana. Retirar la lmina expresado, la mayora de las veces, por el smbolo:
del orificio. La muestra quedar retenida dentro del vaso.
Retire la placa de vidrio plana y accione el cronmetro 25 20
[a] ou[a]
cuando la muestra comience a drenar por el orificio. D D
Cuando ocurra la primera interrupcin del flujo de drena-
je, parar el cronmetro y anotar el tiempo transcurrido en El uso de largos de onda ms bajos como los disponibles
segundos. Realizar el ensayo, en el mnimo, en triplica- con las lneas de lmpara de mercurio aislados por medio
do. La viscosidad ser la media de los valores obtenidos, de filtros de transmitancia mxima a cerca de 578, 546,
5
expresada en mm2/s o Centistokes, siendo permitido un 436, 405 y 365 nm en un polarmetro fotoelctrico mos-
desvo estndar mximo 3%. La conversin de segundos traron mayor sensibilidad; consecuentemente hubo una re-
para mm2/s o Centistokes est dada de acuerdo con el duccin en la concentracin de la sustancia en ensayo. En
manual del equipo utilizado. general, el poder rotatorio observado en 436 nm es apro-
ximadamente el doble y en 365 nm es cerca de tres veces
5.2.8 DETERMINACIN mayor que en 589 nm.
DEL PODER ROTATORIO Poder rotatorio y poder rotatorio especifico
Y DEL PODER ROTATORIO
La ecuacin general usada en polarimetra es:
ESPECFICO
t 100a
[a] =
Muchas sustancias farmacuticas son pticamente activas, lc
luego desvan la luz plano-polarizada de modo que la luz
transmitida es desviada en un determinado ngulo con re- En que [] es el poder rotatorio especfico en el largo de
lacin al incidente. onda 1 y en la temperatura t, a es el poder rotatorio obser-
vado en grados (), l es el camino ptico en decmetros y
Sustancias con la misma estructura conteniendo uno o ms c es la concentracin de la sustancia en g por 100 ml. As,
centros quirales las cuales son imgenes especulares no su- [] es 100 veces para una solucin conteniendo 1 g en
perponibles una de la otra son denominadas enantimeros. 100 ml en una clula con un camino ptico de 1,0 decme-
tro bajo condiciones definidas del largo de onda de la luz
Uno de los enantimeros desva la luz plano-polarizada incidente y de la temperatura.
para la derecha (+) y es llamado de dextrgiro, o d; el ant-
poda desva para la izquierda (-) y es conocido como lev- Procedimiento
giro o l. El ngulo de ese desvi es igual en mdulo para
los enantimeros, sin embargo con seales opuestas. El poder rotatorio especfico de un frmaco es un valor de re-
ferencia y debe ser calculado a partir del poder rotatorio obser-
Las propiedades fsico-qumicas de los enantimeros vado para la solucin de la muestra o para el lquido conforme
como densidad, ndice de refraccin, momento dipolo-di- especificado en la monografa. Las medidas del poder rotato-
polo, puntos de ebullicin y fusin son idnticas ya que el rio son realizadas a 589 nm a 20 C excepto cuando especifi-
ambiente qumico en el cual est insertado cada tomo es cado. Siempre que un polarmetro fotoelctrico es usado, una
igual para los enantimeros. nica medida corregida por el blanco es realizada. Para un po-
larmetro visual es empleada la media de por lo menos cinco
La polarimetra, eso es, la medicin del poder rotatorio de determinaciones corregidas por el blanco. En ambos casos, el
una sustancia con polarmetro es uno de los mtodos ms solvente utilizado para el preparado de la solucin de la mues-
prcticos para distinguir los enantimeros y, por tanto, es tra debe ser utilizado como blanco o el tubo vaco en el caso
un importante criterio de identificacin, caracterizacin y de lquidos. La temperatura experimental debe ser mantenida
de determinacin de pureza enantiomrica de los frmacos. en 0,5 C en relacin al valor especificado. Usar el mismo
tubo del polarmetro en la misma orientacin angular para la
5
agua (5.2.20).
Proceder conforme descrito en Anlisis Trmico (5.2.27).
Para los dems casos, el procedimiento adoptado es el des-
crito abajo, siendo el mtodo a ser adoptado especificado 5.2.10 DETERMINACIN
en las monografas.
DE CENIZAS SULFATADAS
PROCEDIMIENTO (RESIDUO POR INCINERACIN)
Mtodo Gravimtrico Cenizas sulfatadas comprenden el residuo no voltil a la
incineracin en la presencia de cido sulfrico, conforme
Reducir la sustancia a polvo fino, caso se presente en la la tcnica especificada. En general, el ensayo espera deter-
forma de cristales voluminosos. Pesar, exactamente, cerca minar el tenor de constituyentes o impurezas inorgnicas
de 1 a 2 g y transferir para pesafiltro chato previamente de- contenidos en sustancias orgnicas. Tambin se destina a
secado durante 30 minutos en las mismas condiciones a ser la determinacin de componentes inorgnicos en mezclas
empleadas en la determinacin. Despus de enfriamiento y de la cantidad de impurezas contenidas en sustancias in-
en desecador, pesar el pesafiltro, tapado, conteniendo la orgnicas termolbiles.
muestra. Agitar el pesafiltro suavemente para distribuir la
muestra de la manera ms uniforme posible, a una altura PROCEDIMIENTO
ideal de 5 mm. Colocar el pesafiltro en la estufa, retirar
la tapa, dejndola tambin en la estufa. Secar la muestra Pesar exactamente de 1 a 2 g (o la cantidad especificada
(generalmente a 105 C) y por un determinado plazo (ge- en la monografa) de sustancia pulverizada, transferir para
neralmente 2 horas) especificado en la monografa. Enfriar crisol (como ejemplo: platino, porcelana, slice, cuarzo)
hasta temperatura ambiente en desecador. Pesar. Repetir la previamente calcinado, enfriado en desecador y tarado, y
operacin hasta peso constante. aadir cerca de 1 ml de cido sulfrico. Calentar suave-
mente hasta carbonizacin en temperatura no superior a
Observacin: En el caso de la sustancia fundir a una tempe- 600 C 50 C. Enfriar y aadir lentamente cerca de 1 ml
ratura ms baja que la especificada para la determinacin, de cido sulfrico para humedecer el residuo, carbonizar e
mantener el pesafiltro con su contenido por 1 a 2 horas a la incinerar con calentamiento gradual hasta 600 C 50 C.
temperatura de 5 a 10 C abajo del punto de fusin, antes Enfriar, pesar nuevamente e incinerar por 30 minutos ms.
de secarla a la temperatura especificada. Cuando la sustan- Repita este procedimiento hasta que la diferencia entre dos
cia se descompone a temperatura de 105 C, ella debe ser pesajes sucesivos no sea mayor que 0,5 mg. Un equipo ca-
desecada en una temperatura ms baja. En ambos casos, se librado, por ejemplo mufla, debe ser utilizado para el con-
puede realizar el secado a presin reducida, en desecador. trol de la temperatura. Calcular el porcentaje de cenizas
sulfatadas con relacin a la sustancia en ensayo, utilizando
El porcentaje de prdida por desecacin est dado por la el siguiente clculo:
ecuacin
Cenizas sulfatadas
en que:
P1 = Peso del crisol despus de la calcinacin y enfriamien- para el tamiz superior, distribuyendo uniformemente el
to (tara del crisol); polvo. Tapar el conjunto.
P2 = Peso del crisol con muestra despus de la calcinacin
y enfriamiento en desecador; Accionar el aparato, por cerca de 15 minutos, con vibra-
P3 = Peso de la muestra inicial cin adecuada. Despus del trmino de este tiempo, utili-
100 = Factor de porcentaje. zando un pincel adecuado, retirar toda la muestra retenida
en la superficie superior de cada malla para un papel imper-
5.2.11 DETERMINACIN DE meable, y pesar el polvo. Pesar tambin el polvo retenido
en el colector.
LA GRANULOMETRA DE LOS
POLVOS Calcular el porcentual retenido en cada tamiz, utilizando el
siguiente clculo:
El grado de divisin o la granulometra de polvos est expre-
sado por la referencia a la abertura nominal de la malla del
tamiz utilizado. Los tamices empleados son de acero inoxida-
ble, latn, no siendo permitido el revestimiento de los hilos. donde:
En la descripcin de los polvos son utilizados los trminos P1 = Peso de la muestra retenida en cada tamiz (en gramos);
abajo: P2 = Suma de los pesos retenidos en cada tamiz y en el
colector (en gramos);
Polvo grueso aquel cuyas partculas pasan en su totalidad 100 = Factor de porcentaje.
por el tamiz con abertura nominal de malla de 1,70 mm y,
como mximo, 40% por el tamiz con abertura nominal de Tabla 1 - Abertura de malla de los tamices.
5
malla de 355m.
Nmero del tamiz
Orificio del tamiz
Polvo moderadamente grueso aquel cuyas partculas pa- (ABNT/ ASTM)
san en su totalidad por el tamiz con abertura nominal de 2 9,5 mm
malla de 710 m y, como mximo, 40% por el tamiz con 3,5 5,6 mm
abertura nominal de malla de 250 m. 4 4,75 mm
8 2,36 mm
Polvo semifino aquel cuyas partculas pasan en su totali- 10 2 mm
dad por el tamiz de abertura nominal de malla de 355 m 20 850 m
y, como mximo, 40% por el tamiz con abertura nominal 30 600 m
de malla de 180 m. 40 425 m
50 300 m
Polvo fino aquel cuyas partculas pasan en su totalidad 60 250 m
por el tamiz con abertura nominal de malla de 180 m. 70 212 m
80 180 m
Polvo finsimo aquel cuyas partculas pasan en su totali- 100 150 m
dad por el tamiz con abertura nominal de malla de 125 m. 120 125 m
200 75 m
La determinacin de la granulometra de polvos es hecha
230 63 m
por el proceso descrito abajo, con el auxilio de tamices, cu-
270 53 m
yas caractersticas estn estandarizadas en la tabla anexa.
325 45 m
PROCEDIMIENTO 400 38 m
500 25 m
La granulometra es determinada con el auxilio de tamices 635 20 m
operados por dispositivo mecnico. Este tipo de dispositivo _____________
reproduce los movimientos horizontales y verticales de la * El nmero del tamiz corresponde a la clasificacin de la Asociacin
Brasilea de Normas Tcnicas ABNT (1984), ISO 33101:2000.
operacin manual, a travs de la accin mecnica uniforme.
Para utilizar este dispositivo, proceda de la siguiente forma:
5.2.12 COLOR DE LQUIDOS
Separar, por lo menos, 4 tamices que estn descritos en la
Tabla 1, de acuerdo con las caractersticas de la muestra. La evaluacin del color de lquidos es ejecutada por com-
Montar el conjunto con el tamiz de mayor abertura sobre paracin de la solucin bajo anlisis preparada confor-
el de abertura menor. Colocar el conjunto sobre el receptor me instrucciones de la monografa y soluciones estndar
de tamices. de color (SC). Tales soluciones encuentran empleo como
referencia para algunos frmacos y en pruebas de carbo-
Pesar cerca de 25 g de la muestra (dependiendo de la natu- nizacin con cido sulfrico especificado en diversas mo-
raleza del material, densidad del polvo o grnulo y del di- nografas.
metro de los tamices a ser utilizados). Transferir la muestra
El proceso comparativo, salvo especificacin contraria, de tiosulfato de sodio 0,1 M SV equivale a 24,97 mg de Cu-
debe ser ejecutado en tubos de ensayo de vidrio transpa- SO4.5H2O. Ajustar el volumen de la solucin adicionando
rente y fondo chato, con dimetro de 16 mm, del tipo em- cantidad suficiente de mezcla de cido clorhdrico y agua
pleado en ensayo lmite de impurezas. Los tubos deben ser para obtener solucin conteniendo exactamente 62,4 mg de
los ms uniformes posibles. CuSO4.5H2O por ml de solucin.
Para la evaluacin, utilizar volmenes de 10 ml tanto para Solucin base de cloruro frrico
la preparacin muestra como para la preparacin estndar,
asegurando altura aproximada de 50 mm para los lquidos Preparar solucin de 25 ml de cido clorhdrico y 975 ml
en los tubos. Observar los tubos transversalmente contra de agua. Disolver cerca de 55 g de cloruro frrico (Fe-
fondo blanco, bajo luz difusa. Es importante comparar las Cl3.6H2O) en aproximadamente 900 ml de esa solucin y
soluciones en las mismas condiciones, inclusive de tempe- completar el volumen para 1000 ml con la misma solucin.
ratura (25 C). Transferir, utilizando pipeta, 10 ml de esa solucin para
frasco de yodo de 250 ml, aadir 15 ml de agua, 3 g de
La preparacin muestra es preparada para presentar colo- yoduro de potasio y 5 ml de cido clorhdrico. Dejar en
racin semejante a la de la preparacin de referencia espe- reposo durante 15 minutos. Completar el volumen de la
cificada. solucin para 100 ml con agua y titular el yodo liberado
con tiosulfato de sodio 0,1 M SV, juntando 3 ml de almidn
ESTNDARES BSICOS SI como indicador. Corregir el volumen de titulante consu-
mido por determinacin en blanco. Cada ml de tiosulfato
Las soluciones de referencia de color (SC) son obtenidas de sodio 0.1 M SV equivale a 27,03 mg de FeCl3 6H2O.
a partir de tres soluciones bsicas, a ser preparadas y al- Ajustar el volumen de la solucin adicionando cantidad
macenadas en frascos hermticos. De esas con base en suficiente de solucin de cido clorhdrico y agua para ob-
5
la Tabla 1, conteniendo indicaciones de volmenes para tener solucin conteniendo exactamente 45,0 mg de FeCI3
la preparacin de 20 soluciones estndar de color (SC) de- 6H2O por ml de solucin.
signadas con las letras del alfabeto, de A a T preparar la
solucin o soluciones especificadas para la comparacin. Tabla 2 - Tabla 1 Composicin de las
Transferir los volmenes indicados (dejar el agua por l- soluciones-estndar de color (SC).
timo) y homogeneizar, directamente, en los tubos de com-
paracin. Partes de
Solucin Solucin Solucin
Solucin base de cloruro de cobalto II Agua,
SC base de base de base de
para
cloruro de cloruro sulfato
Preparar solucin de 25 ml de cido clorhdrico y 975 ml completar
cobalto II, frrico, en cprico,
de agua. Disolver 65 g de cloruro de cobalto (II) en aproxi- 10 ml.
en ml ml en ml
madamente 900 ml de esa solucin y completar el volumen
para 1000 ml con el mismo solvente. Transferir, usando A 0,1 0,4 0,1 4,4
pipeta, 5 ml de esa solucin para frasco de yodo de 250 ml, B 0,3 0,9 0,3 8,5
juntar 5 ml de perxido de hidrgeno SR y 15 ml de hi- C 0,1 0,6 0,1 4,2
drxido de sodio 5 M. Hervir durante diez minutos, enfriar D 0,3 0,6 0,4 3,7
y aadir 2 g de yoduro de potasio y 20 ml de cido sulfrico Y 0,4 1,2 0,3 3,1
0,26 M. Titular con tiosulfato de sodio 0,1 M SV, juntando F 0,3 1,2 0,0 3,5
3 ml de almidn SI como indicador. Corregir el volumen G 0,5 1,2 0,2 3,1
de titulante consumido por determinacin en blanco. Cada H 0,2 1,5 0,0 3,3
ml de tiosulfato de sodio 0,1 M SV equivale a 23,79 mg de I 0,4 2,2 0,1 2,3
CoCl2.6H2O. Ajustar el volumen de la solucin adicionan- J 0,4 3,5 0,1 1,0
do cantidad suficiente de solucin de cido clorhdrico y K 0,5 4,5 0,0 0,0
agua para obtener solucin conteniendo exactamente 59,5 L 0,8 3,8 0,1 0,3
mg de CoCl2.6H2O por ml de solucin. M 0,1 2,0 0,1 2,8
N 0,0 4,9 0,1 0,0
Solucin base de sulfato cprico El 0,1 4,8 0,1 0,0
P 0,2 0,4 0,1 4,3
Preparar solucin de 25 ml de cido clorhdrico y 975 ml
Q 0,2 0,3 0,1 4,4
de agua. Disolver 65 g de sulfato cprico (CuSO4.5H2O)
R 0,3 0,4 0,2 4,1
en 900 ml de esa solucin y completar el volumen para
S 0,2 0,1 0,0 4,7
1000 ml con la misma solucin. Transferir, usando pipe-
ta, 10 ml de esa solucin para frasco de yodo de 250 ml, T 0,5 0,5 0,4 3,6
juntar 40 ml de agua, 4 ml de cido actico glacial, 3 g de
yoduro de potasio y 5 ml de cido clorhdrico. Titular el
yodo liberado con tiosulfato de sodio 0,1 M SV, juntando 3
ml de almidn SI como indicador. Corregir el volumen de
titulante consumido por determinacin en blanco. Cada ml
5
cide bajo el vapor atmico conteniendo tomos libres de soluciones conteniendo cantidades crecientes del analito.
ese elemento en el estado fundamental. La atenuacin de Completar el volumen de cada baln con agua. Despus de
la radiacin es proporcional a la concentracin del analito calibrar el espectrmetro con agua, registrar tres veces las
segn la ley de Lambert-Beer. lecturas de cada solucin. Trazar la curva analtica para el
promedio de las absorbancias de las tres lecturas para cada
La instrumentacin para absorcin atmica consiste, bsi- solucin frente a la respectiva cantidad del analito adicio-
camente, de fuente de radiacin, atomizador, monocroma- nada a la solucin. Registrar la cantidad del analito en m-
dor, detector y sistema de procesamiento de datos. Como dulo en la muestra por extrapolacin de la curva analtica
fuentes de luz se utilizan lmparas de ctodo hueco y lm- en el eje de las abscisas.
paras de descarga sin electrodo que emiten radiacin inten-
sa de mismo largo de onda que la adsorbida por el elemen- 5.2.13.1.1 Espectrometra de absorcin atmica
to a ser determinado. El atomizador puede ser constituido con llama
de una llama o un horno de grafito. El monocromador es
responsable de la separacin del largo de onda deseado. La El sistema consiste de una cmara de pre-mezcla en la
radiacin incide en el monocromador por una ranura es- cual el combustible y el oxidante son mezclados y del
trecha; en seguida, es separada en sus diferentes largos de quemador que recibe la mezcla combustible-oxidante.
onda en una red de difraccin y, posteriormente, dirigida al La solucin es introducida a travs de un nebulizador
detector. El detector, generalmente, es un fotomultiplica- neumtico, en el cual es generado un fino aerosol que
dor, que transforma la energa luminosa en corriente elc- es conducido hasta la llama. La cantidad de energa que
trica, la cual es amplificada y, posteriormente, interpretada puede ser suministrada por la llama para la disociacin
por un sistema de lectura. y atomizacin de la muestra es proporcional a la tempe-
ratura. Si una llama de baja temperatura es utilizada, la
PROCEDIMIENTO solucin puede no ser convertida en tomos neutros. Por
otro lado, si una llama con temperatura muy elevada es
Para operar los espectrmetros de absorcin atmica, se empleada podr ocurrir la formacin de gran cantidad de
recomienda seguir las instrucciones del fabricante. Las de- iones que no absorben radiacin de la fuente. A travs de
terminaciones son hechas por comparacin con soluciones la modificacin de la proporcin de oxidante y combus-
de referencia conteniendo concentraciones conocidas del tible utilizados para cada tipo de llama, es posible alterar
analito. Las determinaciones pueden ser efectuadas por el significativamente su temperatura. Las llamas ms popu-
Mtodo de calibracin directa (Mtodo I) o por el Mtodo larmente utilizadas son las producidas por aire acetileno
de adicin estndar (Mtodo II). Se recomienda el Mtodo (2100 2400 C) y acetileno xido nitroso (2650 2850
I, salvo cuando especificado. C). La mezcla aire acetileno es utilizada para elementos
con temperaturas de atomizacin inferiores como Na, K,
Mtodo de calibracin directa (Mtodo I): preparar como Mg, Cd, Zn, Cu, Mn, Co, etc. La llama generada por ace-
mnimo cuatro soluciones de referencia del elemento a ser tileno xido nitroso es aplicada a elementos refractarios
determinado utilizando la banda de concentracin reco- como Al, V, Ti, Si, U, entre otros.
mendada por el fabricante del equipo para el analito. Todos
los reactivos empleados en el preparado de la muestra de-
ben ser igualmente incluidos, en las mismas concentracio-
5
tomos en el estado fundamental. Eso puede ser resuelto Cu2+ y Ni2+, si estn presentes en elevadas concentracio-
por el aumento de la temperatura de la llama lo que resulta nes, son reducidos formando precipitados que pueden ad-
en la disociacin de estos compuestos. Otra posibilidad es sorber los hidruros voltiles.
la utilizacin de un agente supresor o libertador que
posee mayor afinidad por el oxgeno en relacin al analito 5.2.13.1.3 Espectrometra de absorcin atmica
evitando la formacin de los xidos. La solucin conte- con generacin de vapor fro
niendo cloruro de cesio y cloruro de lantano, Solucin de
Schinkel, es la ms comnmente empleada. La espectrometra de absorcin atmica con generacin
de vapor fro es utilizada para la determinacin de mercu-
Interferencias espectrales: ocurren por medio de la absor- rio. El equipo y los reactivos son los mismos utilizados en
cin o esparcimiento de la radiacin seleccionada para el el sistema de generacin de hidruros, sin embargo la cel-
analito. Las interferencias espectrales causadas por tomos da de cuarzo no precisa ser calentada, pues el mercurio es
son poco comunes y pueden ser resueltas alterando la lnea reducido a mercurio metlico que es voltil a temperatura
espectral utilizada. Las interferencias causadas por espe- ambiente. Sin embargo, vapor de agua puede ser transpor-
cies moleculares son ms graves pero, normalmente, son tado por el gas de arrastre e interferir en la determinacin.
contornadas a travs de la correccin de fondo. Para solucionar ese problema, se utiliza una lmpara de
infrarrojo para calentar la celda de cuarzo, previniendo
5.2.13.1.2 Espectrometra de absorcin atmica la condensacin de vapor de agua. En ese caso, normal-
con generacin de hidruros mente no es necesario efectuar la purga, pues el largo de
onda utilizado para la determinacin de Hg es 253,7 nm
La espectrometra de absorcin atmica con generacin en el cual es rara la absorcin de radiacin por gases de
de hidruros es una tcnica utilizada para la determina- la atmsfera.
cin de elementos formadores de hidruros voltiles ms
comnmente para As, Se, Sb, Bi, Ge, Sn, Pb y Te. El pro- 5.2.13.1.4 Espectrometra de absorcin atmica
ceso es constituido de tres etapas principales: generacin, con horno de grafito
transporte y atomizacin de los hidruros. El sistema pue-
de ser construido en discontinuo o en flujo. La genera- La espectrometra de absorcin atmica con horno de gra-
cin de los hidruros consiste de la reaccin del analito, fito es una tcnica amplia que posee elevada sensibilidad.
normalmente en medio cido, con un reductor (NaBH4). El horno consiste de un tubo de grafito de 3 a 5 cm de largo
El transporte de los hidruros del frasco de reaccin hasta y de 3 a 8 mm de dimetro revestido con grafito piroltico.
la celda de cuarzo est hecho a travs de un gas inerte de La cantidad de muestra inyectada en el horno vara de 5
arrastre tal como argn o nitrgeno. Para elementos que L a 50 L y es generalmente introducida por un sistema
absorben en largo de onda inferior a 200 nm, antes de automatizado. El horno es calentado elctricamente a tra-
la etapa de generacin de los hidruros, se debe efectuar vs del paso de corriente elctrica de modo longitudinal o
una purga para eliminacin de los gases atmosfricos a transversal. Flujos de gases inertes como argn son man-
fin de evitar que esos gases absorban la radiacin de la tenidos externamente e internamente para evitar la com-
fuente. La atomizacin est hecha en una celda de cuar- bustin del horno. Adems de eso, el flujo interno expulsa
zo calentada elctricamente o con un quemador tpico de el aire atmosfrico del horno y tambin los vapores gene-
sistemas de atomizacin con llama; la temperatura interna rados durante las etapas de secado y pirlisis. Un horno
5
permite determinar la temperatura mnima de atomizacin
del analito con adecuada sensibilidad. Se recomienda que INTERFERENCIAS
las curvas de pirlisis y atomizacin sean hechas siempre
que una muestra desconocida sea analizada. Las interferencias que ocurren en la Fotometra de llama
son muy semejantes a las observadas en la Espectrome-
El proceso de atomizacin en un horno de grafito es com- tra de absorcin atmica (5.2.13.1). Sin embargo, pueden
plejo y depende de varios factores como el material del ocurrir interferencias espectrales causadas por la emisin
horno y de la plataforma, la atmsfera dentro del tubo, la de bandas de rotacin vibracin molecular, tales como OH
velocidad de calentamiento, la temperatura y la naturaleza (310-330 nm), NH (en torno de 340 nm), N2+ (en torno de
de las sustancias. Para la obtencin de mejores resultados 390 nm), C2 (en torno de 450 nm), etc.
se recomienda el uso de la plataforma de LVov en el inte-
rior del tubo y calentamiento transversal. La seal obtenida SOLVENTES
es del tipo transitoria; son necesarios, como mximo, 12
segundos para la integracin de la seal. El solvente debe ser seleccionado con cautela. Si hubie-
re diferencia significativa de tensin superficial o visco-
INTERFERENCIAS sidad entre muestra y solucin de referencia ocurrirn
variaciones en las tasas de aspiracin y nebulizacin y,
Interferencias espectrales: interferencias causadas por so- en consecuencia, diferencias significativas en las seales
breposiciones de lneas entre tomos son poco comunes. producidas. As, el solvente empleado en el preparado de
La atenuacin del haz de radiacin por especies generadas las muestras y de las referencias debe ser el ms similar
durante el proceso de atomizacin derivados de la matriz posible.
es ms frecuente. Para solucionar tal problema se debe eli-
minar eficientemente la matriz. El uso de un modificador PROCEDIMIENTO
de matriz y de un corrector de fondo son esenciales para la
confiabilidad de los resultados. El equipo debe ser operado de acuerdo con las instruccio-
nes del fabricante y en el largo de onda especificado. Ajus-
Formacin de sustancias voltiles: en muestras con eleva- tar el cero con el solvente. En seguida, inyectar la solucin
dos contenidos de halgenos (especialmente Cl) existe la de referencia ms concentrada y ajustar la sensibilidad de-
posibilidad de formacin de sustancias voltiles del analito seada. Las determinaciones son hechas por comparacin
que podrn ser perdidas en temperaturas bajas ocasionando con soluciones de referencia conteniendo concentraciones
un error en el anlisis. En ese caso, el uso de un modifi- conocidas del analito. Las determinaciones pueden ser
cador qumico capaz de formar complejos trmicamente realizadas por el Mtodo de calibracin directa (Mtodo
estables con el analito minimiza la formacin de sustancias I) o por el Mtodo de adicin estndar (Mtodo II) con-
voltiles. Adems de eso, cuando el modificador qumico forme descrito en Espectrometra de absorcin atmica
es combinado con la plataforma de Lvov, los efectos de (5.2.13.1).
interferencia de matriz son bastante reducidos. Es impor-
tante resaltar que un determinado modificador qumico
puede ser muy eficaz para algunos elementos, sin embargo
ineficiente para otros.
5.2.13.2.2 Espectrometra de emisin ptica con tiempo, luego es necesario el uso de un sistema de detec-
plasma inductivamente acoplado cin multielementar. Los espectrmetros pueden ser simul-
tneos o secuenciales. Para a espectrometra de emisin
La espectrometra de emisin ptica con plasma inductiva- ptica con plasma inductivamente acoplado, tanto los
mente acoplado es una tcnica bastante amplia que posee espectrmetros secuenciales cuanto los simultneos son
elevada sensibilidad y con caracterstica multielementar. ampliamente utilizados. A configuracin ms comn para
De manera general, en la espectrometra con plasma induc- espectrmetros secuenciales es a Czerny-Turner. Ya los es-
tivamente acoplado, el aerosol de la muestra es introducido pectrmetros simultneos son encontrados, bsicamente,
en una fuente de plasma, donde es evaporado y disociado con las configuraciones Echelle y Paschen-Runge.
en tomos y iones libres que son excitados. El plasma con-
siste de un gas parcialmente ionizado de elevada tempera- INTERFERENCIAS
tura (6000 a 10 000 C), elctricamente neutro y con buena
conductividad elctrica. Debido a la alta temperatura del La sobreposicin de las lneas de emisin es una de las
plasma es generada una radiacin policromtica derivada principales interferencias para espectrometra de emisin
de la emisin de varios elementos e iones presentes en la ptica con plasma inductivamente acoplado. Este tipo de
muestra. Por tanto, es necesario el uso de un monocroma- interferencia puede ser eliminada con el uso de espectr-
dor con elevada capacidad de resolucin para separacin metros de alta resolucin y procedimientos de correccin
de los largos de onda caractersticos para cada elemento. de fondo. Muchas interferencias espectrales son observa-
La deteccin de la radiacin generada por largos de onda das en la banda de 200 a 400 nm, en la cual ms de 200
especficos puede ser aplicada para anlisis cualitativo y 000 lneas de emisin atmica y bandas moleculares son
las intensidades de estos largos de onda pueden ser usadas observadas.
para anlisis cuantitativo.
Las interferencias fsicas son semejantes a aquellas en Es-
5
INSTRUMENTACIN pectrometra de absorcin atmica con llama (5.2.13.1.1).
5
lentes inicas, que consiste de un cilindro (o una serie de El equipo debe ser operado de acuerdo con las instruc-
cilindros o placas perforadas) metlico hueco sometido a ciones del fabricante y con el istopo adecuado para cada
una diferencia de potencial (normalmente en la banda de elemento. Ajustar el cero con el solvente inyectado en el
2 a 15 V de corriente continua). Gran parte de los espec- equipo. Las determinaciones son hechas por comparacin
trmetros de masas con plasma inductivamente acoplado con soluciones de referencia, conteniendo concentraciones
comercializados actualmente utiliza el cuadrupolo como conocidas de los analitos. Las determinaciones pueden ser
separador de masas. El cuadrupolo consiste en cuatro ba- hechas por el Mtodo de Calibracin Directa (Mtodo I),
rras metlicas cilndricas o hiperblicas de mismo largo y por el Mtodo de Adicin Estndar (Mtodo II) o por el
dimetro. Por la aplicacin combinada de corriente conti- Mtodo de Estndar Interno (Mtodo III).
nua (cc) y de corriente alternada (ca) a los electrodos (cua-
drupolo), solamente los iones con una determinada razn Mtodo de Calibracin Directa (Mtodo I). Preparar al
masa/carga (m/z) son conducidos a travs del cuadrupolo. menos cuatro soluciones de referencia de los analitos, cu-
Los dems iones chocan con los electrodos o son retirados briendo la banda de concentraciones recomendada por el
del interior del cuadrupolo. De esta forma, los iones son fabricante del equipo para los elementos en anlisis. To-
secuencialmente separados por el cuadrupolo. Varios tipos dos los reactivos empleados en el preparado de la solucin
de detectores pueden ser utilizados para recoger los iones muestra deben ser igualmente incluidos, en las mismas
en la salida del cuadrupolo y convertir en seal elctrico, concentraciones, a las soluciones de referencia. Despus de
pero los ms populares son los de dinodos discretos, vaso la calibracin del equipo con solvente, inyectar, tres veces,
de Faraday (Faraday Cup) y Chaneltron. cada una de las soluciones de referencia y, despus de la es-
tabilizacin de la lectura, registrar el resultado, lavando el
INTERFERENCIAS sistema con el solvente despus de cada inyeccin. Trazar
la curva analtica, trazando el promedio de las lecturas de
As como en otras tcnicas espectromtricas, la espectro- cada grupo de tres, con la respectiva concentracin. Prepa-
metra de masas con plasma inductivamente acoplado po- rar la solucin de la sustancia a ser determinada conforme
see interferencias espectrales y no espectrales. Las interfe- indicado en la monografa, ajustando su concentracin para
rencias espectrales son dependientes de la especie presente que esta quede dentro de la banda de las concentraciones
y pueden ser divididas en cuatro tipos principales: poliat- de las soluciones de referencia. Introducir la muestra en el
micas, isobricas, iones de carga doble y iones de xidos equipo, registrar la lectura y lavar el sistema con solvente.
refractarios. Este tipo de interferencia puede ser corregida Repetir esta secuencia dos veces y, adoptando el promedio
por la simulacin de la composicin de la matriz, por la de tres mediciones, determinar la concentracin del analito
eleccin de otro istopo (cuando posible) o por el uso de por la curva analtica.
celda de reaccin y/o colisin. En algunos casos, las inter-
ferencias espectrales pueden ser corregidas con el uso de Mtodo de Adicin Estndar (Mtodo II). Aadir a cada
un programa de computadora apropiado. uno de, al menos, cuatro balones volumtricos similares,
volmenes iguales de solucin de la sustancia a ser deter-
Las interferencias no espectrales pueden surgir por varios minada, preparada conforme indicado en la monografa.
motivos: deposicin sobre los conos de la interfaz, presen- Juntar todos los balones, con excepcin de uno, volme-
cia de otro elemento fcilmente ionizable, efecto espacio nes medidos de la solucin de referencia especificada, para
carga, entre otros. Sin embargo, la mayora de las inter- obtener una serie de soluciones conteniendo cantidades
crecientes de los analitos. Diluir convenientemente el vo- Tabla 1 - Bandas de largo de onda de
lumen de cada baln con agua. Despus de calibrar el es- inters para la espectrofotometra.
pectrmetro con agua, como indicado arriba, registrar tres
veces las lecturas de cada solucin. Regin Banda de largo de onda
Ultravioleta (UV) 190-380 nm
Mtodo de Estndar Interno (Mtodo III). Preparar al Visible (VIS) 380-780 nm
menos cuatro soluciones de referencia de los analitos, cu- Infrarrojo prximo (NIR) 780-2500 nm (12800-4000 cm-1)
briendo la banda de concentraciones recomendada por el Infrarrojo medio (MIR) 4-25m (2500-400 cm-1)
fabricante del equipo para los analitos. Todos los reactivos Infrarrojo distante 25-300 m (400-33 cm-1)
empleados en el preparado de la solucin muestra deben
ser igualmente incluidos, en las mismas concentraciones, INTERACCIN ENERGA-MATERIA
a las soluciones de referencia. El estndar interno debe ser
adicionado en todas las soluciones (solvente, soluciones La energa total de la molcula envuelve la energa derivada
de referencia y muestras), con concentracin fija y en el de la vibracin (energa vibracional, debida al movimiento
mismo orden de grandeza de los analitos. Despus de la relativo de tomos o grupos de tomos constituyentes de la
calibracin del equipo con solvente, inyectar, tres veces, molcula); de la rotacin (energa rotacional, debida a la
cada una de las soluciones de referencia y, despus de la es- rotacin de la molcula en torno de un eje) y, normalmente,
tabilizacin de la lectura, registrar el resultado, lavando el de la energa electrnica, generada por la configuracin de
sistema con el solvente despus de cada inyeccin. Trazar electrones en la molcula.
la curva analtica, trazando un grfico de la razn entre el
promedio de las intensidades de las lecturas de cada grupo Las molculas al absorber energa sufren una transicin
de tres y la intensidad del estndar interno, con la respecti- para un estado de mayor energa o estado excitado. El paso
va concentracin. Preparar la solucin de la sustancia a ser al estado excitado no es de naturaleza continua realizndo-
5
determinada conforme indicado en la monografa, ajustan- se, generalmente, en etapas llamadas de transiciones. En la
do su concentracin para que esta quede dentro de la ban- regin del ultravioleta y visible las transiciones son elec-
da de las concentraciones de las soluciones de referencia. trnicas y ocurren en porciones de la molcula llamadas de
Inyectar la muestra en el equipo, registrar la lectura y lavar cromforos. Estas transiciones comprenden promociones
el sistema con solvente. Repetir esta secuencia dos veces de electrones de orbitales moleculares ocupados, general-
y, adoptando el promedio de tres mediciones, determinar la mente, y alenates y no aleantes, para los orbitales de
concentracin del analito por la curva analtica. energa inmediatamente superiores, antialeantes * y *.
de la espectrofotometra NIR y MIR los espectros pueden analito. La mayora de los equipos utiliza un monocroma-
ser adquiridos utilizando el modo transmisin y reflexin. dor o filtro para aislar la banda de largo de onda deseada
Esta ltima se subdivide en reflexin difusa y reflexin to- de forma que solamente la banda de inters sea detectada y
tal atenuada. Hay adems la posibilidad de la combinacin medida. Los monocromadores, generalmente, poseen una
de los modos de transmisin y reflexin, llamada de trans- red de difraccin, mientras que los filtros pueden ser de in-
reflexin. terferencia o de absorcin. Los fotmetros o colormetros
son instrumentos ms simples que utilizan un filtro para
Transmisin: es la medida de la disminucin de la intensi- seleccin del largo de onda y son utilizados, generalmente,
dad de la radiacin en determinados largos de onda cuando en la regin del visible. Los espectrofotmetros, a su vez,
la radiacin pasa a travs de la muestra. La muestra est utilizan monocromadores para seleccin del largo de onda
dispuesta en el haz ptico entre la fuente y el detector. La y son utilizados en las regiones del UV/VIS.
transmisin (T) puede ser calculada por la frmula abajo:
I Los compartimientos utilizados para recibir la muestra son
T=
I0 denominados de cubetas que deben presentar ventanas que
sean transparentes en la regin espectral de inters. Para la
I0 = intensidad de la radiacin incidente regin del UV son necesarias cubetas de cuarzo mientras
I = intensidad de la radiacin transmitida. que, para la regin del VIS, se puede emplear cubetas de
vidrio o acrlico.
Los espectros en transmisin pueden ser convertidos para
absorbancia: Los principales tipos de detectores son los fototubos, los
arreglos de fotodiodos y los dispositivos de transferencia
de carga. Los fototubos son los detectores ms simples y su
respuesta est basada en el efecto fotoelctrico. El detector
5
de arreglo de diodos permite que todos los largos de onda
Reflexin difusa: es la medida de la razn de la intensidad puedan ser monitoreados simultneamente. Los dispositi-
de la luz reflejada por la muestra y la luz reflejada por una vos de transferencia de carga han sido empleados en nme-
superficie reflexiva de referencia. La radiacin no adsorbi- ro creciente en instrumentos espectroscpicos.
da es reflejada en direccin al detector.
Los espectrofotmetros pueden ser encontrados en la con-
Reflexin total atenuada: la radiacin infrarroja se propa- figuracin de haz nico, haz doble y multicanal. Los ins-
ga en el interior de un elemento de reflexin interna (alto trumentos de haz doble presentan la ventaja de compensar
ndice de refraccin) a travs de reflexiones en las paredes cualquier fluctuacin en la potencia radiante de la fuente,
de este elemento. La muestra es colocada en contacto con cuando comparados con los instrumentos de haz simples.
la pared de este elemento de reflexin donde interacta con Ya los instrumentos multicanal son ms recientes, utilizan
la radiacin infrarroja (onda evanescente). detectores del tipo arreglo de diodo y dispositivos de trans-
ferencia de carga y permiten la obtencin del espectro total
Transreflexin: este modo es la combinacin de los modos de una muestra en menos de un segundo. En estos instru-
de transmisin y reflexin. En la medida por transreflexin mentos el sistema dispersivo es un espectrgrafo de red
un espejo o una superficie reflexiva es usado para reflejar colocado despus de la clula de la muestra.
la radiacin transmitida a travs de la muestra, incidien-
do una segunda vez en la misma para, entonces, doblar el Espectrofotmetros pueden disponer de registradores gr-
camino ptico. La radiacin no adsorbida y reflejada en ficos que permiten la obtencin de espectros de absorcin.
direccin al detector. Tal recurso es importante para fines de caracterizacin de
la sustancia a partir de la obtencin de los largos de onda
INSTRUMENTACIN UTILIZADA EN EL donde se obtienen las mayores absorbancias (mximo ).
ULTRAVIOLETA (UV) Y VISIBLE (VIS)
Actualmente, la mayor parte de los espectrofotmetros
Espectrofotmetros utilizados en la regin del ultravioleta presenta conexin a una microcomputadora y programa
y visible son dotados, fundamentalmente, de fuente de ra- apropiado, que permiten la obtencin de los espectros de
diacin; selector de largo de onda; celdas de absorcin (cu- absorcin de las sustancias en medio digital.
betas), para insercin de soluciones de muestras en el haz
de luz monocromtica; detector de radiacin y una unidad INSTRUMENTACIN UTILIZADA EN EL
de lectura y de procesamiento de seal. INFRARROJO MEDIO (MIR) E INFRARROJO
PRXIMO (NIR)
Las lmparas ms empleadas como fuente de radiacin en
la espectrofotometra en la regin del ultravioleta y visible Los espectrofotmetros utilizados para adquisicin de es-
son de deuterio y tungsteno, que proporcionan radiacin pectros en el infrarrojo medio y prximo consisten de una
comprendida entre 160 a 380 nm y 320 a 2500 nm, respec- fuente de luz, monocromador o interfermetro y detector,
tivamente. Los instrumentos para las regiones del UV/VIS y permiten la obtencin de espectros en la regin compren-
son, generalmente, equipados con uno o ms dispositivos dida entre 750 a 2500 nm (13300 a 400 cm-1).
para restringir la radiacin que est siendo medida dentro
de una banda estrecha que es adsorbida o emitida por el
Actualmente, los espectrofotmetros en el infrarrojo me- dida entre 4000 a 400 cm-1 (infrarrojo medio) es la ms
dio (4000 a 400 cm-1) utilizan el interfermetro en lugar de empleada para fines de identificacin.
usar el monocromador y la radiacin policromtica incide
bajo la muestra y los espectros son obtenidos en el dominio Los espectros de transmisin de muestras slidas son obte-
de la frecuencia con auxilio de la transformada de Fourier. nidos a partir de su dispersin en aceite mineral o mediante
la preparacin de pastillas de haluros de potasio y sodio.
Clulas de transmisin, accesorios para reflexin difusa y Dispersiones de la muestra son preparadas triturndose
reflexin total atenuada son los accesorios ms comunes cerca de 5 mg de la sustancia en una gota de aceite mineral
para la adquisicin de los espectros. de grado espectroscpico. La pasta obtenida es esparcida
entre dos ventanas de bromuro de potasio o cloruro de so-
La espectrofotometra en el infrarrojo prximo (NIR) es dio. Para el preparado de las pastillas cerca de 1 mg de
una tcnica que permite la obtencin de espectros en la re- la muestra es triturada con aproximadamente 300 mg de
gin comprendida entre 13300 a 4000 cm-1 (750 a 2500 bromuro de potasio de grado espectroscpico.
nm). Los espectrofotmetros en la regin del NIR son
constituidos de fuente de radiacin apropiada, monocro- Para muestras slidas en polvo opacas la transmisin de
mador o interfermetro y detector. Cubetas convenciona- la radiacin infrarroja, el espectro puede ser, tambin, ad-
les, fibras pticas, clulas de transmisin y accesorios para quirido mediante la utilizacin de accesorio para reflexin
reflexin difusa son los accesorios ms comunes para ad- difusa. En este accesorio la radiacin infrarroja incide di-
quisicin de los espectros. rectamente en la muestra en polvo. Parte de la radiacin es
adsorbida y enseguida reflejada de forma difusa en direc-
IDENTIFICACIN POR ESPECTROFOTOMETRA cin al detector. En este caso la muestra en la forma de pol-
vo es mezclada con bromuro de potasio, aproximadamen-
La identificacin de diversas sustancias farmacuticas pue- te, 5% (p/p) y dispuesta en el accesorio de reflexin difusa.
5
de ser hecha utilizando las regiones ultravioleta, visible,
infrarrojo medio e infrarrojo prximo. De manera general, Por fin, el espectro de muestras slidas en polvo y pastosas,
la espectrofotometra en las regiones UV/VIS requiere so- puede ser obtenido utilizando accesorio para reflexin total
luciones con concentracin de 10 g ml-1 de la sustancia atenuada. La muestra en la forma de polvo est dispuesta
mientras que para el MIR y NIR son necesarias concentra- bajo el cristal de alto ndice de refraccin donde entra en
ciones en la orden de 100 mg ml-1. A pesar de ms sensible contacto con la radiacin infrarroja no exigiendo prepara-
los espectros obtenidos en las regiones del UV/VIS presen- do previo de la muestra.
tan menor especificidad cuando comparados con los espec-
tros en la regin del MIR. En el caso del MIR las medidas UTILIZACIN CUANTITATIVA DE LA
realizadas utilizando los modos de reflexin (difusa y total ESPECTROFOTOMETRA
atenuada) proporcionan informacin espectral equivalente
a aquella obtenida por el modo de transmisin. Cuando po- Espectrofotometra en el UV/VIS
sible debe ser hecha la comparacin del espectro obtenido
frente al espectro de la sustancia qumica de referencia. El anlisis espectrofotomtrico cuantitativo por absorcin
tiene como principio la relacin directa existente entre la
Ultravioleta (UV) y visible (VIS) cantidad de luz adsorbida y la concentracin de la sustan-
cia, tambin conocida como ley de Beer.
Diversas monografas incluyen espectros de absorcin en
el ultravioleta como prueba de identificacin. En estos ca- Cuando la concentracin (c) est expresada en mol. L-1 y
sos, habr especificacin de la extensin de la barredura, el camino ptico (b) en centmetro, la ecuacin se torna:
solvente, concentracin de la solucin y espesor de la cu-
beta. Algunos frmacos requieren el uso de estndares de A=ebc
referencia. Las lecturas de estndar y muestra son efectua-
das simultneamente y en condiciones idnticas cuanto a en que
largo de onda, tamao de cubeta, etc.
A = absorbancia, logaritmo del inverso de la transmitancia
Para la caracterizacin utilizando la espectrofotometra (A = log T)
UV/ VIS, el frmaco es disuelto utilizando solvente apro- e = absortividad molar.
piado. Muchos solventes son apropiados incluyendo agua, T = transmitancia
alcoholes, teres y soluciones cidas y alcalinas diluidas.
Se debe observar para que los solventes no absorban en la Sabindose que la transmitancia es el cociente entre la in-
regin espectral que est siendo utilizada. tensidad de la radiacin transmitida por la solucin (I0) y a
intensidad de la radiacin incidente (I), se tiene:
Infrarrojo medio (MIR)
log10 (I0/I) = A = e b c
La espectrofotometra en el MIR es un ensayo de identifi-
cacin por excelencia siendo capaz de diferenciar sustan- La intensidad de la absorcin de la luz ultravioleta por sus-
cias con diferencias estructurales. De las tres regiones del tancias cromforas est, en general, expresada como ab-
infrarrojo (prximo, medio y distante) la regin compren- sortividad molar, en las condiciones de mxima absorcin.
Si la masa molar de la sustancia no es conocida, es posible modelada por la ecuacin. La mejor manera de demostrar
expresar la intensidad de absorcin por la ecuacin de la la linealidad de los mtodos NIR es a travs de la evalua-
absortividad especfica A (1%, 1 cm): cin estadstica de los valores de la inclinacin e intercepto
obtenidos para el conjunto de validacin.
A (1%, 1 cm) = A / b c
La banda de trabajo de los valores de referencia del analito
en que A(1%, 1 cm) corresponde a la absorbancia de la so- del conjunto de validacin define la banda de trabajo del
lucin a 1% (p/v) de la sustancia cuando el camino ptico mtodo NIR. Controles deben ser establecidos para garan-
es 1 cm. tizar que los resultados fuera de la banda de trabajo no sean
aceptados. La validacin de un mtodo NIR debe generar
Para evitar posibles desvos en la ley de Beer se debe pro- un valor anmalo cuando una muestra conteniendo analito
curar trabajar con soluciones diluidas (de la orden de 0,01 fuera de la banda de trabajo sea analizada.
M), evitando asociaciones entre las molculas, y con radia-
ciones monocromticas. La exactitud de un mtodo NIR est demostrada por la co-
rrelacin de los resultados NIR con los datos de la tcnica
Espectrofotometra en el Infrarrojo prximo de referencia. Adems de eso, la exactitud puede ser verifi-
cada a partir de la proximidad del error estndar de predic-
La cuantificacin a travs de la espectrofotometra en el cin (SEP) con el error del mtodo de referencia. El error
NIR puede ser realizada utilizando datos obtenidos de un del mtodo de referencia debe ser conocido con base en los
mtodo de referencia o a partir de un conjunto de calibra- valores histricos. Diferentes mtodos estadsticos pueden
cin con muestras de composicin conocida. Los espectros ser utilizados para verificar diferencias estadsticas entre
pueden ser obtenidos utilizando los modos de transmisin los resultados obtenidos por el mtodo NIR y el mtodo
y reflexin con el auxilio de accesorios adecuados. En un de referencia.
5
primer momento los datos espectrales son tratados a travs
de transformaciones matemticas con el objetivo de reducir La precisin de un mtodo NIR expresa la concordancia
fuentes de variaciones indeseadas antes de la etapa de cali- entre una serie de medidas obtenidas bajo condiciones pre-
bracin. El proceso de calibracin consiste en la construc- determinadas. Hay dos niveles de precisin que pueden ser
cin de un modelo matemtico que relaciona la respuesta del considerados: la repetitividad y la precisin intermediaria.
espectrofotmetro a una propiedad de la muestra. Existe una La precisin de un mtodo NIR es tpicamente expresada
serie de algoritmos quimiomtricos que pueden ser utiliza- como coeficiente de variacin.
dos en la calibracin. Generalmente, estos algoritmos estn
disponibles en softwares y dispuestos junto con el espectro- La robustez del mtodo NIR puede ser verificada a travs
fotmetro. Los principales algoritmos de calibracin son: re- de cambios de parmetros del mtodo como: condiciones
gresin lineal mltiple (del ingls, multiple lineal regression ambientales, temperatura de la muestra, caractersticas de
MLR), mnimos cuadrados parciales (del ingls, partial la muestra y cambios instrumentales.
least squares PLS) y regresin de componentes principales
(del ingls, principal component regression PCR). 5.2.15 ESPECTROFOTOMETRA
La validacin de una metodologa que emplea la espec- DE FLUORESCENCIA
trofotometra NIR es semejante a aquella requerida para
cualquier procedimiento analtico y, generalmente, es esta- Algunas sustancias pueden ser analizadas con mayor sensi-
blecida a partir de herramientas quimiomtricas. Los prin- bilidad y especificidad por medio de mtodos fluorimtri-
cipales parmetros a ser evaluados son: especificidad, li- cos del que por otras tcnicas espectrofotomtricas. La es-
nealidad, banda de trabajo, exactitud, precisin y robustez. pectrofotometra de fluorescencia, o espectrofluorimetra,
comprende la medida de la fluorescencia emitida cuando
La extensin de la especificidad es dependiente del proce- estas sustancias dichas fluorescentes son expuestas a la
dimiento utilizado. La demostracin de la especificidad de radiacin ultravioleta, visible u otras tambin de naturaleza
los mtodos NIR puede ser hecha a travs de las siguientes electromagntica. Tales radiaciones promueven la excita-
formas: (i) los largos de onda utilizados en los modelos cin de electrones de la molcula para niveles energticos
de calibracin deben corresponder a bandas del analito de ms elevados. Despus de corta permanencia en el estado
inters; (ii) para calibracin utilizando PLS los coeficien- excitado cerca de 10-8 a 10-4 segundos los electrones
tes deben ser trazados y las regiones de mayor coeficiente retornan al estado fundamental por medio de proceso no
comparadas con el espectro del analito; (iii) variaciones en radioactivo, denominado desactivacin por colisin, aliado
la matriz de la muestra no deben afectar de forma signifi- a proceso radioactivo llamado luminescencia (fluorescen-
cativa a cuantificacin del analito. cia o fosforescencia), al contrario de lo que ocurre con la
mayora de las sustancias en que el retorno al estado me-
La validacin de la linealidad del mtodo NIR envuelve nos energtico no comprende emisin de luz. En la desac-
la demostracin de la respuesta lineal de la tcnica para tivacin por colisin, la energa se pierde como calor en
muestras distribuidas a travs de una banda definida de ca- los choques entre las molculas. En el proceso radiante,
libracin. El coeficiente de correlacin, r, no es una herra- el exceso de energa es remitido con intensidad mxima
mienta adecuada para verificacin de linealidad, pero es la en largo de onda mayor (en cerca de 20 a 30 nm) que el
medida de la variacin de los datos que es adecuadamente de la radiacin excitatoria adsorbida, debido a la prdida
energtica que acontece en el proceso. Siendo de naturale- En su mayora, los detectores de fluormetros de filtro son
za fluorescente, la radiacin emitida por la sustancia cesa equipados con vlvulas fotomultiplicadoras, habiendo,
cuando la fuente de energa es retirada y esta caracterstica sin embargo, diferencias entre tipos de equipos cuanto a
la distingue de la fosforescencia, que prosigue por algn la regin espectral de mxima sensibilidad. Amplificada
tiempo despus del trmino de la excitacin. la corriente elctrica generada en el fotomultiplicador, se
obtiene lectura correspondiente en instrumento analgico
La intensidad de la luz emitida por una solucin fluores- o digital.
cente es, en determinadas condiciones, proporcional a la
concentracin del soluto y, en consecuencia, utilizada para Espectrofotmetros de fluorescencia, por su vez, se diferen-
fines analticos. La medida de la intensidad de fluorescen- cian de fluormetros por no disponer de filtros y si de mono-
cia no puede ser usada directamente para la determinacin cromadores de prisma o de rejilla de difraccin, proporcio-
de la concentracin del analito. Por eso, la determinacin nando mayor selectividad de largo de onda y flexibilidad.
est hecha a travs de la comparacin de la intensidad de
fluorescencia obtenida para una solucin muestra con so- Tanto fluormetros como espectrofotmetros de fluores-
luciones estndar, cuyas concentraciones son conocidas. El cencia permiten empleo de diversas fuentes de luz. Lmpa-
fundamento de la espectro fluorescencia consiste, pues, en ras de mercurio o tungsteno, a pesar de que comunes, son
excitar la sustancia con radiacin en el largo de onda de sustituidas con ventaja por la lmpara de arco de xenn a
mxima absorcin y medir comparativamente la intensidad la alta presin, pues esta proporciona, al contrario de las
de la luz fluorescente emitida frente a un estndar. dems, espectro continuo desde el ultravioleta hasta el in-
frarrojo. De cualquier forma, la radiacin es muy intensa
DEFINICIONES y no debe jams ser observada con los ojos desprotegidos,
bajo riesgo de lesiones permanentes.
Intensidad de fluorescencia: Expresin emprica de la acti-
5
vidad fluorescente, en unidades arbitrarias proporcionales Los monocromadores, a su vez, disponen de ajuste de an-
a la respuesta del detector. cho de hendidura. Ranuras estrechas proporcionan mayor
resolucin y menor ruido espectral mientras ranuras an-
Espectro de excitacin de fluorescencia: Representacin chas aseguran mayor intensidad de luz en detrimento de
grfica del espectro de activacin, presentando la intensi- estas caractersticas. El ancho de hendidura a ser adoptada
dad de la radiacin emitida por sustancia activada (ordena- es funcin de la diferencia entre los largos de onda de la
da) y el largo de onda de la radiacin incidente excitatoria luz incidente y emitida, as como del nivel de sensibilidad
(abscisa). necesario al anlisis.
Espectro de emisin de fluorescencia: Representacin La cmara de muestra generalmente permite uso de tubos
grfica de la distribucin espectral de la radiacin emiti- redondos y cubetas cuadradas, semejantes a las empleadas
da por sustancia activada, presentando la intensidad de la en espectrofotometra de absorcin, salvo por la necesidad
radiacin emitida como ordenada y el largo de onda como de que las cuatro paredes verticales estn pulidas. Vol-
abscisa. menes de muestra de la orden de 2 a 3 ml son adecuados a
pesar de que algunos instrumentos puedan estar dotados de
EQUIPO cubetas pequeas, con capacidad para 0,1 a 0,3 ml o tam-
bin de soportes para capilares que requieren volmenes
La determinacin de la intensidad de fluorescencia puede tambin menores.
ser efectuada en simple fluormetro de filtro (fluormetro),
en espectrofotmetros de absorcin adaptados o en espec- Calibracin del equipo
trofotmetro de fluorescencia (espectrofluormetro).
Fluormetros y espectrofluormetros deben ser calibrados
El fluormetro de filtro comprende fuente de luz, filtro pri- con sustancias fluorforas, estables, para asegurar resulta-
mario, cmara de muestra, filtro secundario y sistema de dos reproducibles. Las variaciones son, en general, debidas
deteccin. En los fluormetros de este tipo, el detector se a alteraciones en la intensidad de las lmparas o en la sensi-
encuentra dispuesto a 90o con relacin a la luz incidente. bilidad del tubo fotomultiplicador. El fluorforo puede ser
Tal disposicin en ngulo recto permite que la luz inciden- la muestra pura de la sustancia a ser analizada o cualquier
te atraviese la solucin de la muestra sin interferir con la otra sustancia fluorescente de fcil purificacin, cuyos lar-
seal fluorescente captada por el detector. Tal mecanismo gos de onda de absorcin y fluorescencia sean semejantes
no impide que parte de la luz difusa alcance el detector de- a los de la sustancia en anlisis. Por ejemplo, quinina en
bido a las propiedades difusoras inherentes a las soluciones cido sulfrico 0,05 M es un estndar adecuado para fluo-
o en funcin de la presencia de partculas slidas suspendi- rescencia azul. Por otro lado, fluorescena en hidrxido de
das. Esta dispersin residual es controlada con empleo de sodio 0,1 M es apropiada para fluorescencia verde y roda-
filtros. El filtro primario selecciona la radiacin de largo mina es fluorforo de eleccin en la fluorescencia roja. La
de onda apropiado a la excitacin de la muestra mientras escala de largos de onda del espectrofotmetro de fluores-
el filtro secundario selecciona la radiacin fluorescente de cencia tambin requiere calibracin peridica.
largo de onda mayor, bloqueando el acceso de la radiacin
dispersa al detector.
5
pleo de soluciones de concentraciones de 10-5 a 10-7 M. medida de la intensidad de luz difundida (reflejada) por las
partculas en suspensin, en ngulo recto al haz de luz inci-
Debido a los lmites de concentracin usualmente estre- dente. Una vez ms, adems de nefelmetros, es posible el
chos en los cuales la fluorescencia es proporcional a la empleo de colormetros y espectrofotmetros en la medida
concentracin de la sustancia, se tiene como regla la obe- nefelomtrica. Para tanto, cabe modificarlos para permitir
diencia a la relacin (c-d)/(a-b) = 0,40 a 2,50. En este caso, la captacin perpendicular al ngulo de la luz incidente, por
a es la intensidad de fluorescencia de la solucin de refe- transferencia de la fuente de luz, o por alteracin de posi-
rencia, b es la intensidad del blanco correspondiente, c es la cin del detector. Fluormetros, a ejemplo de nefelmetros,
intensidad de la solucin- muestra y d es la intensidad del se destinan a la medida de luz dispersa (posicionamiento
blanco correspondiente. del detector en ngulo de 90 con relacin a la luz inciden-
te) siendo, por tanto, compatibles con la nefelometra.
Las determinaciones de fluorescencia son sensibles a la
presencia de partculas slidas en las soluciones. Tales im- Turbidez
purezas reducen la intensidad del haz incidente, producien-
do falsas lecturas elevadas debido a reflexiones mltiples Turbidez (S) en analoga a la transmitancia (T), definida en
en la cubeta. Es, por tanto, necesario eliminar estos slidos Espectrofotometra de absorcin en el ultravioleta, visible
por centrifugacin o filtracin antes de la lectura, llevando e infrarrojo (5.2.14) es la expresin oficial de dispersin
en consideracin, sin embargo, que algunos papeles de fil- de la luz producida por partculas suspendidas. Y determi-
tro pueden contener impurezas fluorescentes. nable por turbidimetra o nefelometra, correspondiendo a
la ecuacin
La presencia de oxgeno disuelto en el solvente ejerce
efecto atenuador sobre la intensidad de la fluorescencia y
cabe eliminarlo usando, por ejemplo, paso de corriente de
nitrgeno, helio o cualquier gas inerte en la solucin, pre-
viamente a la lectura. en que
5
Las slicas comerciales poseen tamaos de poros variables
Las etapas del procedimiento comprenden, en resumen: entre 40 a 150 Angstrom. Los tamaos de partculas varan
(1) ajustar el instrumento en el largo de onda especificado de 5 a 40 m, con promedio de 10 a 15 m, dependiendo
en la monografa (para colormetros, a falta de especifica- del fabricante.
cin, emplear filtro que proporcione luz en la banda azul);
(2) llenar la cubeta con la suspensin ms concentrada y Reduciendo el tamao de la partcula, se aumenta la efi-
ajustar la lectura de transmitancia para 100% (transmitan- ciencia de la slice. Partculas de tamao de 5 a 6 m son
cia ofrece ms linealidad que absorbancia); (3) medir la utilizadas para preparar CCDAE (Cromatografa en cama-
transmitancia de las dems suspensiones-estndar y trazar da delgada de alta eficiencia). Los tamaos de poros afec-
recta de calibracin (con empleo del mtodo de los mni- tan la selectividad y, por tanto, pueden ser utilizados para
mos cuadrados) y (4) medir la transmitancia de la muestra las tasas de migracin y resolucin de los componentes de
determinando su concentracin por la recta de calibracin. las muestras.
Kieselguhr Es a Tierra de Diatomeas trmicamente tra- estacionaria). La fase mvil puede ser un solvente puro o
tada de granulacin de 5 a 40 m. Su principal constitu- una mezcla de solventes.
yente es SiO2. Una variedad de otros compuestos inorgni-
cos tambin estn presentes. Los tamaos de los poros son En el papel cromatogrfico, el adsorbente es una camada
muy variables, sus caractersticas la tornan adecuada para de papel de textura y espesor adecuados. La separacin
la separacin de azcares, aminocidos y otras sustancias cromatogrfica procede a travs de la accin de la fase
polares similares. mvil lquida semejante al proceso de la adsorcin en cro-
matografa en columna. Debido al contenido de agua in-
Celulosa La celulosa es un polisacrido altamente po- trnseco del papel, o inhibicin selectiva del componente
limerizado por monmeros de celobiosa. La presencia de hidroflico de la fase lquida por las fibras de papel, que
gran nmero de grupos hidroxilo libre permite la conexin puede ser considerado como fase estacionaria, un mecanis-
de hidrgeno con lquidos de bajo peso molecular como mo de particin puede contribuir significativamente para
agua y alcoholes. Celulosa es, por tanto, adecuada para la la separacin.
separacin de sustancias hidroflicas, tales como carbohi-
dratos y aminocidos. El cromatograma es desarrollado por el paso lento de la
fase mvil sobre la camada. El desarrollo puede ser ascen-
Poliamida En contraste con la celulosa, la poliamida es dente, en el caso de solvente acarreado para arriba a travs
una resina sinttica. Dos tipos de poliamida son utilizadas: de fuerzas capilares, o descendente, en el caso en que el
poliamida 6 y poliamida 11. La poliamida 6 viene de la flujo del solvente es auxiliado por fuerza de la gravedad.
aminopolicaprolactama, mientras a poliamida 11 es prepa-
rada a partir del cido poliaminoundecanico. Poliamidas La forma ms simple de la cromatografa en papel es la
son utilizadas para la separacin de compuestos polares cromatografa ascendente que utiliza una tira de papel de
que son capaces de interactuar con el grupo amida por ancho y largura variables, en funcin de la cuba cromato-
5
aleaciones de hidrgeno debido a su estructura molecular. grfica a ser utilizada.
Entre ellas estn aminocidos y derivados, benzodiazep-
nicos, cidos carboxlicos, ciclodextrinas, cidos grasos, Este mtodo es muy til para separar sustancias muy pola-
flavonoides, conservantes, plaguicidas. res, como azcares y aminocidos. Posee el inconveniente
de poder aplicarse poca cantidad de sustancia por vez. Se
Silicato de magnesio ideal para separacin de azcares, debe procurar trabajar en las condiciones ms prximas
antraquinonas, flavonas, glucsidos, esteroides, lpidos, posibles, de calidad y cantidad, entre estndar y muestra,
residuos de plaguicidas, vitaminas, carbazol, acetato de usndose el mismo papel, fase mvil, temperatura, etc.
hidrocortisona.
EQUIPO Y PROCEDIMIENTOS
Reveladores y mtodos de deteccin
Consiste en cmara o cuba cromatogrfica de vidrio, pro-
Despus del desarrollo de la cromatografa y la evapora- vista de bordes y tapa esmerilados y de dimensiones ade-
cin de los solventes, se pasa al mtodo de revelacin de cuadas para contener el papel cromatogrfico, que puede ser
las manchas. Este por su vez, puede ser fsico o qumico. adaptado para cromatografa ascendente o descendente. Es
Los mtodos fsicos comprenden: luz ultravioleta (lm- importante que no deje escapar los vapores de la fase mvil.
paras con emisin de radiacin entre 254 a 366 nm), en
el caso de sustancias que se tornan fluorescentes, cuando Utilizar papel de filtro especial para cromatografa, cortado
excitadas por luz UV o visible. Los mtodos qumicos en el sentido de las fibras en tiras de largo variable y ancho
comprenden utilizacin de reactivos cromgenos. Hay no inferior a 2,5 cm. Existen varios tipos de papel para cro-
una amplia lista de reveladores apropiados para cada gru- matografa con finalidades diferentes para separacin de
po de compuestos. sustancias hidrfilas o hidrofbica, orgnicas o inorgni-
cas, anfteras o con muchas hidrxilas, entre otras.
Identificacin
Para cromatografa descendente, utilizar cuba con tapa
La posicin final de cada mancha es designada por el Rf. provista de orificio central, cerrado por tapn de vidrio u
Despus de la revelacin de la cromatoplaca, se mide la otro material inerte. En la parte superior de la cuba, hay
distancia alcanzada por cada mancha a partir del origen. una cubeta suspendida, que contiene dispositivo para su-
Esa distancia es una fraccin de la distancia total recorrida jetar el papel (generalmente barra o bastn de vidrio). De
por el solvente en la fase estacionaria. cada lado de la cubeta hay guas de vidrio, que sustentan el
papel, para no tocar en las paredes de la cuba cromatogr-
Rf = (distancia alcanzada por la mancha a partir del origen) fica. El ancho del papel cromatogrfico no puede ser supe-
/ (distancia recorrida por el solvente desde el origen) rior al de la cubeta suspendida y la altura debe ser aproxi-
madamente igual a la altura de la cmara cromatogrfica.
5.2.17.2 CROMATOGRAFA EN PAPEL
Para cromatografa ascendente, en la parte superior de la
Utiliza para la separacin e identificacin de las sustancias cuba hay dispositivo que permite sustentar el papel croma-
o componentes de la mezcla la migracin diferencial sobre togrfico y que puede bajar sin abrir la cmara cromato-
la superficie de un papel de filtro de calidad especial (fase grfica. Se manipula el papel con cuidado y por las puntas,
y se cortan tiras en tamaos que puedan ser contenidos en Aplicar las soluciones en la forma de manchas circulares
las cubas. Es importante cortar el papel siguiendo el eje de (se utilizan tubos capilares o micropipetas), conteniendo
las fibras, pues la celulosa est orientada en este sentido, lo de 1 a 20 g de la muestra, siendo que cada mancha debe
que facilitar el paso de la fase mvil. La tira de papel no producir una anchura entre 6 a 10 mm sobre la lnea tra-
debe tocar las paredes de la cuba. zada con lpiz. Dependiendo del ancho del papel, puede
colocarse apenas una alcuota del estndar o de la muestra,
Al aadir el papel en la cuba (no se debe demorar a colocar centralizndose esta aplicacin en la lnea de partida. En el
el papel para no haber prdida de saturacin), cuidar para caso de la posibilidad de colocarse ms de una alcuota en
que la muestra no entre en contacto directo con el eluyente, el punto de partida, se dejan 2 cm de distancia de los bordes
dejando que ascienda o descienda por la superficie del pa- laterales y un intervalo entre los puntos de aplicacin de 3
pel, apenas por capilaridad. cm. Si cada mancha producida es mayor que 6 a 10 mm,
aplicar la muestra en porciones, dejndose evaporar el sol-
Cuando la tcnica utilizada sea la de cromatografa ascen- vente antes de aplicar la porcin siguiente.
dente, trazar lnea fina con lpiz a 3 cm del borde inferior
del papel; si la cromatografa es descendiente, trazar lnea a El nivel de la fase mvil debe quedar abajo del punto de
la distancia, tal que la misma quede pocos centmetros aba- partida de la sustancia, debiendo, siempre, haber un buen
jo de la varilla que sujeta el papel en la cubeta del eluyente. sellado de la cuba cromatogrfica para que no se pierda el
Se debe marcar tambin la lnea de llegada de la fase mvil vapor de esta fase. Al final de la corrida, esperar secar el
(o frente del solvente), generalmente con una distancia de papel y someterlo a algn proceso de revelacin.
10 cm del punto de partida.
Figura 1 - Diferentes tipos de cromatografa en papel de acuerdo con las tcnicas de desarrollo.
___________
FM: Fase Mvil; PP: Punto de Partida; LC: Lnea de Llegada; dr1 y dr2: distancias recorridas por las sustancias; dm: distancia de migracin de la fase
mvil
CROMATOGRAFA DESCENDENTE CROMATOGRAFA ASCENDENTE
En la cromatografa descendente, la fase mvil posee un El flujo ascendente de la fase mvil sobre el papel cromato-
flujo orientado para abajo y cuenta con la accin de la gra- grfico es permitido por la accin de la capilaridad.
vedad.
Colocar en el fondo de la cmara recipiente conteniendo el
Introducir en la cmara una camada de eluyente especi- eluyente, cerrar la cuba y dejarla en reposo por 24 horas.
ficado en la monografa, tapar y dejar en reposo por 24 Aplicar la muestra en el papel introducindolo en la cuba
horas. Aplicar la muestra en el papel, colocndolo ade- y dejar en reposo por 1 hora y media. Sin abrir la cmara,
cuadamente sobre las guas de manera que la extremidad bajar el papel para colocar su extremidad inferior en con-
superior permanezca dentro de la cubeta suspendida y tacto con el eluyente y desarrollar el cromatograma hasta
sujetarlo con la varilla de vidrio. Cerrar la cuba y dejar la distancia o tiempo prescritos. Retirar el papel, marcar
en reposo por 1 hora y media. En seguida, a travs del el recorrido del eluyente, secar y visualizar de la manera
orificio en la tapa introducir el eluyente en la cubeta. prescrita en la monografa.
Desarrollar el cromatograma hasta la distancia o tiempo
prescritos, protegiendo el papel de la incidencia de luz 5.2.17.3 CROMATOGRAFA EN COLUMNA
directa. Retirar el papel, marcar el recorrido de la fase
mvil, secar y visualizar de la manera prescrita en la Cromatografa preparativa en columna es un mtodo de
monografa. separacin que desempea un papel importante en la puri-
5
columnas tienen dimensiones variables, sin embargo, en radas son repartidas entre dos lquidos inmiscibles, uno de
anlisis farmacutico, las bandas ms comnmente utiliza- los cuales, la fase fija, es adsorbido en un soporte slido,
das son de 10 a 30 mm de dimetro a lo largo del tubo y de presentando as un rea de superficie bastante amplia para
3 a 6 mm en su parte inferior, donde el grifo se encuentra el solvente circulante o fase mvil. El elevado nmero de
acoplado. El largo del tubo es usualmente de 150 a 400 sucesivos contactos entre lquido-lquido permite una se-
mm. En la parte superior de la columna podr haber una di- paracin efectiva, la cual no ocurre a travs de la extrac-
latacin de forma esfrica, destinada a contener un mayor cin lquido-lquido habitual.
volumen de solvente seguido de una conexin esmerilada,
cilndrica tamponada por un tapn cilndrico de plstico, El soporte slido generalmente es polar, mientras la fase fija
de vidrio, acero inoxidable, aluminio (u otro material espe- adsorbente es ms polar que la fase mvil. El soporte slido
cificado en monografa individual) firmemente fijada a la ms utilizado consiste en tierra silicosa cromatogrfica cuyo
vena. La vena de la barra es sustancialmente menor que el tamao de partcula es satisfactorio para el caudal apropiado
dimetro de la columna y posee, como mnimo, 5 cm ms del eluyente. En la cromatografa de particin de fase rever-
en relacin al efectivo largo de la columna. El tapn tiene sa, la fase adsorbida fija es menos polar que la fase mvil, y
un dimetro menor en aproximadamente 1 mm en relacin el adsorbente slido, se torna apolar por tratamiento con un
al dimetro interno de la columna. agente silanizante (ej.: diclorodimetilsilano; parafinas), para
producir una arena cromatogrfica silanizada.
PROCEDIMIENTO
La muestra a ser cromatografada generalmente es insertada
Cromatografa en columna por adsorcin en un sistema cromatogrfico de dos maneras: (a) una solu-
cin de la muestra en un pequeo volumen de la fase mvil
Iniciar el preparado de la columna, si necesario, tamponando en el tope de la columna; o (b) una solucin de la muestra
la parte inferior, prxima al grifo, con un pedazo de algodn en un pequeo volumen de la fase fija es mezclada con el
o lana de vidrio en la base del tubo a fin de impedir el paso soporte slido y transferida para la columna formando una
del material adsorbente y la entrada de aire (evitando forma- camada transversal sobre el material adsorbente.
cin de burbujas). Llenar entonces uniformemente el tubo
(conforme altura especificada) con ese material adsorbente El desarrollo y la elucin son alcanzados a travs de la co-
(tal como almina activada o gel de slice, slice diatomeas rrida del solvente circulante. El solvente (fase mvil) gene-
o slice calcinada) previamente suspendida en la fase mvil ralmente es saturado con el solvente (fase fija) antes del uso.
(sistema de solventes), realizando retirada del exceso de elu-
yente. Despus de sedimentacin del material adsorbente, En el caso de cromatografa de particin lquido-lquido
aplicar la mezcla de sustancias previamente solubilizada en convencional, el grado de particin de un determinado com-
una pequea cantidad de solvente en el tope de la columna puesto entre las dos fases lquidas est expresado a travs
hasta que penetre en el material adsorbente. Una cierta can- de su coeficiente de particin o distribucin. En el caso de
tidad de solvente puede ser adicionada al tope para ayudar compuestos que se disocian, se puede controlar la distribu-
en la adsorcin de las sustancias en el material adsorbente, cin al modificar el pH, constante dielctrica, fuerza inica,
dejndose, en seguida, sedimentar por accin de la gravedad y otras propiedades de las dos fases. La elucin selectiva de
o por la aplicacin de presin positiva de aire quedando la los componentes de la mezcla puede ser alcanzada con el
mezcla adsorbida en una estrecha banda horizontal en el tope cambio exitoso de la fase mvil para una que proporcione un
coeficiente de particin ms favorable, o alterando el pH de permitiendo que cada una sea completamente retirada an-
la fase fija in situ con una fase fija constituida de la solucin tes de aadir la fase mvil almacenada.
de un cido o una base apropiados en un solvente orgnico.
Cromatografa en columna por cambio inico
Salvo disposicin contraria de la monografa individual,
ensayos y pruebas empleando cromatografa de particin Utilizar como fase estacionaria resina de cambio inico.
en columna son realizados en consonancia con los mtodos El cambio de iones consiste en intercambio reversible de
convencionales descritos a continuacin. iones presentes en la solucin con iones del polmero re-
sinoso (celulosa modificada o soporte de gel de slice). La
Soporte slido Utilizar arena de slice purificada. Para eleccin de la resina, fuerte o suave, aninica o catinica,
fase reversa de cromatografa de particin, utilizar arena depender en gran parte del pH en el cual deber ocurrir
de slice cromatogrfica. el cambio inico y de la naturaleza de los iones (aniones o
cationes) a ser cambiados. Las resinas fuertemente cidas
Fase estacionaria -- Utilizar el solvente o solucin espe- y fuertemente bsicas son convenientes para la mayora
cificada en la monografa individual. Se es utilizada una de las aplicaciones analticas. Se emplea, en la prctica,
mezcla de lquidos en la fase estacionaria, mezclar antes de gran exceso (200 300%) de resina sobre la cantidad de la
introducir el soporte slido. muestra estequiomtricamente calculada; la capacidad de
las resinas vara de 2 a 5 mM/g (peso seco).
Fase mvil -- Utilizar el solvente o solucin especificados
en la monografa individual. Equilibrar con agua, si la fase Tratamiento de la resina y preparado de la columna Sus-
estacionaria es una solucin acuosa; si la fase estacionaria pender la resina de cambio inico en agua y dejar en reposo
es un fluido polar orgnico, equilibrar con este fluido. por 24 horas. Introducirla en columna adecuada y, tratn-
dose de resina aninica, convertirla en bsica pasando a
5
Preparacin de una Columna Cromatogrfica El tubo travs de la columna, solucin de hidrxido de sodio SR, a
cromatogrfico mide cerca de 22 mm de dimetro interno la velocidad de 3 ml/ min., hasta que el eluato proporcio-
y de 200 a 300 mm de largo, sin disco de vidrio poroso, en ne reaccin negativa para cloruro. Pasar, en seguida, agua
el cual es acoplado un tubo de distribucin, sin grifo, con exenta de dixido de carbono. En caso de resina catinica,
cerca de 4 mm de dimetro interno y aproximadamente 50 la conversin para la forma cida se da por el paso de cido
mm de largo. Introducir un tampn delgado de lana de vi- clorhdrico SR a travs de la columna, seguida de lavado
drio en la base del tubo. Aadir la cantidad especificada de con agua exenta de dixido de carbono hasta que el eluato
soporte slido en un vaso de precipitados (probeta) de 100- proporcione reaccin neutra.
250 ml y mezclar hasta producir una pasta homognea.
Transferir la mezcla para el tubo cromatogrfico, tapar, Se desarrolla columna de cambio inico de manera an-
presionndolo levemente, hasta obtener una masa unifor- loga a la descrita para cromatografa de adsorcin. Ter-
me. Si la cantidad de soporte slido especificada fuese ms minada la operacin, se regenera la resina lavndola con
de 3 g, transferir la mezcla para la columna en porciones hidrxido de sodio SR (columnas aninicas) o con cido
de aproximadamente 2 g, tapando cada porcin. Si el en- clorhdrico SR (columnas catinicas) y, en seguida, con
sayo o prueba solicita una columna multisegmentada, con agua exenta de dixido de carbono hasta que proporcione
una fase estacionaria diferente para cada segmento, tapar reaccin neutra.
despus de la adicin de cada segmento, y aadir cada seg-
mento siguiente directamente al anterior. Si una solucin 5.2.17.4 CROMATOGRAFA A LQUIDO
del analito fuese incorporada en la fase estacionaria, com- DE ALTA EFICIENCIA
pletar la transferencia cuantitativa para el tubo cromatogr-
fico a travs del lavado del vaso de precipitados utilizado La cromatografa a lquido de alta eficiencia (CLAE) es
para la preparacin de la mezcla de ensayo con una mezcla una tcnica de separacin fundamentada en la distribu-
de aproximadamente 1 g de soporte slido y varias gotas cin de los componentes de una mezcla entre dos fases
del solvente utilizado para preparar la solucin de ensayo. inmiscibles, la fase mvil, lquida, y la fase estacionaria
Introduzca un tampn delgado de lana de vidrio encima slida, contenida en una columna cilndrica. Las separa-
de la columna de llenado completa. La fase mvil fluye a ciones son alcanzadas por particin, adsorcin, cambio
travs de una columna adecuadamente llenada como una inico, exclusin por tamao o interacciones estereoqu-
corriente moderada o, si fuese utilizada la cromatografa de micas, dependiendo del tipo de fase estacionaria utilizada.
fase reversa, lentamente, gota a gota. La CLAE presenta ventajas sobre la cromatografa a gas
para los anlisis de combinaciones orgnicas. Muestras no
Transferir la fase mvil para el espacio de la columna sobre voltiles y termolbiles son, preferencialmente, analizadas
la columna de llenado, y djela fluir a travs de la columna por CLAE. La mayora de los anlisis farmacuticos estn
bajo accin de la gravedad. Humedecer la punta de la co- basados en el mtodo de separacin por particin y deben
lumna cromatogrfica con cerca de 1 ml de la fase mvil ocurrir en tiempo corto de anlisis. Varios factores qumi-
antes de cada cambio de composicin de la fase mvil y cos y fsico qumicos influencian en la separacin croma-
despus de completar la elucin. Si el analito fuese intro- togrfica, los cuales dependen de la naturaleza qumica de
ducido en la columna como una solucin de la fase mvil, las sustancias a ser separadas, de la composicin y caudal
djelo pasar completamente por la columna de llenado, en- de la fase mvil, de la composicin y rea superficial de la
tonces adicione la fase mvil en varias porciones menores, fase estacionaria.
5
son utilizadas en temperatura ambiente.
Despus de disolver la muestra en la fase mvil o en otro
solvente adecuado, la solucin es inyectada en el sistema Los detectores ms frecuentemente utilizados en cromato-
cromatogrfico, de forma manual, utilizando jeringa apro- grafa a lquido de alta eficiencia son los espectrofotom-
piada, o por medio de un inyector o muestreador autom- tricos (UV/Vis). Los detectores espectrofotomtricos son
tico. Este consiste en una bandeja, capaz de acomodar utilizados para detectar compuestos con agrupamiento cro-
diversos frascos conteniendo las muestras. Algunos mues- mforo. Tales detectores consisten de una clula de flujo
treadores automticos pueden ser programados para inyec- localizada en el trmino de la columna cromatogrfica. La
tar diferentes volmenes de muestra, diversas cantidades radiacin ultravioleta atraviesa, constantemente, por la clu-
de inyecciones, controlar el intervalo entre inyecciones y la de flujo y es recibida en el detector. Con el sistema en fun-
otras variables operacionales. cionamiento, las sustancias son eluidas de la columna, pasan
por la clula de detector y absorben la radiacin, resultan-
Cuando se trabaja a altas presiones, una vlvula de inyec- do en alteraciones mensurables en el nivel de energa. Esos
cin es esencial. Esta presenta un sistema calibrado, con detectores pueden presentar largo de onda fijo, variable o
volumen definido, denominado anillo de inyeccin o ansa mltiple. Detectores de largo de onda fijo operan en un nico
de muestreo, que ser llenado con la solucin a ser analiza- valor, tpicamente 254 nm, emitido por una lmpara de mer-
da y, posteriormente, transferida a la columna. curio de baja presin. Aquellos con largo de onda variable
contienen una fuente continua de emisin, como una lmpa-
Para la mayora de los anlisis farmacuticos, la separacin ra de deuterio o xenn de alta presin, y un monocromador
es alcanzada por particin de los componentes, presentes o un filtro de interferencia, para generar radiacin monocro-
en la solucin a ser analizada, entre las fases mvil y esta- mtica a un valor seleccionado por el operador, pudiendo,
cionaria. Sistemas que consisten de fases estacionarias po- adems, ser programados para alterar el largo de onda du-
lares y fases mviles apolares son definidos como croma- rante el desarrollo del anlisis. Los detectores de largo de
tografa en fase normal, mientras el opuesto, fases mviles onda mltiple miden, simultneamente, la absorbancia en
polares y fases estacionarias apolares, son denominados de dos o ms largos de onda, siendo denominados de detectores
cromatografa en fase reversa. La afinidad de una sustan- de arreglo de diodos (DAD). En estos, la radiacin ultravio-
cia por la fase estacionaria y, consecuentemente, su tiempo leta es transmitida a travs de la clula de flujo, adsorbida
de retencin en la columna, es controlada por la polaridad por la muestra y entonces separada en sus componentes ori-
de la fase mvil. ginales, que son detectados, individualmente, por el detector
de fotodiodos, registrando datos de absorbancia en toda la
Las fases estacionarias utilizadas en cromatografa en fase banda del espectro ultravioleta y visible y, adicionalmente,
reversa consisten, tpicamente, de una molcula orgnica los espectros de cada pico registrado en el cromatograma.
qumicamente ligada a las partculas de slice u otros so-
portes, como grafito poroso. El dimetro de las partculas Los detectores de ndice de refraccin miden la diferencia
es de, normalmente, 3 m a 10 m. Cuanto menor es el entre el ndice de refraccin de la fase mvil pura y de la
dimetro de la partcula y la pelcula que recubre el sopor- fase mvil conteniendo la sustancia a ser analizada. Son
te, ms rpida y eficiente ser la transferencia de las sustan- utilizados para detectar sustancias que no absorben en el
cias entre las fases estacionarias y mviles. La polaridad de ultravioleta o visible, no obstante son menos sensibles que
la columna depende de los grupos funcionales presentes, los detectores espectrofotomtricos. Los detectores de n-
dice de refraccin presentan la desventaja de ser sensibles La composicin de la fase mvil tiene influencia significa-
a pequeos cambios de la composicin de los solventes de tiva en el rendimiento cromatogrfico y en la separacin de
la fase mvil, tasa de flujo y temperatura. las sustancias presentes en la solucin a ser analizada. Para
un anlisis cuantitativo precisa, reactivos de alto grado de
Los detectores fluorimtricos son utilizados para detectar pureza o solventes orgnicos de pureza cromatogrfica
compuestos con agrupamiento fluorforo o que pueden ser deben ser utilizados. El agua, de calidad adecuada, debe
convertidos en derivados fluorescentes, por transformacin presentar baja conductividad y absorcin en la banda del
qumica o adicionando reactivos fluorescentes a grupos ultravioleta. En la cromatografa de particin, el coeficien-
funcionales especficos. Si la reaccin qumica es reque- te de particin y, consecuentemente, la separacin pueden
rida, se puede realizar en el momento de la preparacin de ser modificados por la adicin de otro solvente a la fase
la muestra o, alternativamente, el reactivo puede ser intro- mvil. En la cromatografa de cambio inico, la retencin
ducido en la fase mvil, con la reaccin ocurriendo antes de las sustancias es afectada por el pH, por la fuerza inica
de la deteccin. y por otras modificaciones en la composicin de la fase
mvil. La tcnica de modificar continuamente la composi-
Los detectores potenciomtricos, voltamtricos o electro- cin de los solventes de la fase mvil durante el recorrido
qumicos son tiles para cuantificacin de sustancias que cromatogrfico es denominada de elucin gradiente, y es
pueden ser oxidadas o reducidas en un electrodo. Esos aplicada para separar mezclas complejas de sustancias con
detectores son altamente selectivos, sensibles y seguros, diferentes factores de capacidad. No obstante, detectores
pero requieren fases mviles libres de oxgeno y iones de que son sensibles a modificaciones en la composicin de
metales reductibles. Una bomba de flujo continuo debe la fase mvil, como los refractmetros, tiene su utilizacin
ser utilizada, asegurando que el pH, la fuerza inica, y la limitada con la tcnica de elucin gradiente.
temperatura de la fase mvil permanezcan constantes. De-
tectores electroqumicos con electrodos especficos de car- El detector debe presentar una amplia banda de actuacin
5
bono pueden ser utilizados, ventajosamente, para cuantifi- y las sustancias a ser analizadas deben estar separadas de
car nanogramos de sustancias fcilmente oxidables, como cualquier interferente. La banda lineal para una sustancia
fenoles y catecol. es aquella en la cual la respuesta del detector es directa-
mente proporcional a su concentracin.
Los detectores de espectrometra de masas tienen la ca-
pacidad de medir la masa molar de una sustancia, combi- Los sistemas de CLAE son calibrados comparando las res-
nados con la cromatografa lquida proporcionan una alta puestas de los picos obtenidos con las respectivas concen-
selectividad una vez que picos no resueltos pueden ser ais- traciones de sustancias qumicas de referencia (SQR). Re-
lados monitoreando un valor de masa seleccionado. Esos sultados cuantitativos confiables son obtenidos por medio
detectores pueden ser de cuadrupolo simple denominados de calibracin con estndar externo, cuando inyectores o
(MS) o (MS/MS), cuando asociados, para ejemplificar al- muestreadores automticos son preferencialmente utiliza-
gunos de los modelos utilizados. Las fuentes de ionizacin dos. Ese mtodo envuelve la comparacin directa de las
ms comunes son las del tipo ionizacin por electrospray respuestas obtenidas con los picos, separadamente anali-
y la ionizacin qumica a presin atmosfrica. zados, de las soluciones estndar y muestra. En los casos
en que la estandarizacin externa es utilizada, los clculos
Los detectores de conductividad tienen aplicacin en la pueden ser realizados segn la ecuacin:
cromatografa de cambio inico y miden la conductividad
de la fase mvil continuamente que es modificada con la Ca = Cp (Ra / Rp)
presencia de analitos en la clula.
en que,
Actualmente, sistemas de recoleccin de datos modernos Ca = concentracin de la solucin muestra;
estn disponibles con las funciones de recibir y almace- Cp = concentracin de la solucin estndar;
nar las seales provenientes del detector y, posteriormente, Ra = respuesta (rea o altura) del pico de la solucin mues-
proporcionar el manejo de esas informaciones, generando tra;
los cromatogramas con los datos de rea y altura del pico, Rp = respuesta (rea o altura) del pico de la solucin es-
identificacin de la muestra y mtodos. Las informaciones tndar.
tambin pueden ser recopiladas en sistemas simples de gra-
bacin de datos, como registradores, para la garanta de la Si la inyeccin es realizada por medio de jeringa, mejores
integridad de los datos generados. resultados cuantitativos son obtenidos por medio de cali-
bracin con estndar interno, adicionndose una cantidad
PROCEDIMIENTO conocida de una sustancia qumica de referencia no interfe-
rente a las soluciones estndar y muestra. La relacin de las
El largo y el dimetro interno de la columna, el tipo y el respuestas obtenidas con la sustancia a ser analizada y con
tamao de las partculas de la fase estacionaria, la tempera- el estndar interno es utilizada para expresar el resultado
tura de la operacin, la composicin y el caudal de la fase cuantitativo. En los casos en que la estandarizacin inter-
mvil y el tipo de deteccin son descritos en las monogra- na es utilizada, los clculos pueden ser realizados segn la
fas individuales. ecuacin:
Tiempo de retencin (t), Factor de retencin (k) y Tiempo retencin relativo de 1. Todas las otras sustancias tendrn
de retencin relativo sus tiempos de retencin relacionados con el tiempo de re-
tencin de la sustancia principal.
El tiempo de retencin en cromatografa es caracterstico de
la sustancia analizada, no obstante no es exclusivo. La com- Nmero de bandejas tericas(N)
paracin entre los tiempos de retencin de la muestra y de la
sustancia qumica de referencia puede ser utilizada como in- El nmero de bandejas tericas, N, es indicativo de la efi-
dicativo de la identidad de la sustancia, sin embargo es insu- ciencia de la columna. Puede estar expresado en nmeros
ficiente para garantizar la total caracterizacin de la muestra. de bandejas tericas por columna o nmero de bandejas
El tiempo de retencin absoluto puede variar entre equipos tericas por metro. Para picos con formato gaussiano, el
y conforme el uso de solventes y reactivos diferentes. En ese nmero de bandejas tericas por columna es calculado se-
sentido, las comparaciones son hechas en trminos de factor gn las expresiones:
de retencin, k, calculado segn la expresin:
(t-t0)
k=
t0
ADECUABILIDAD DEL SISTEMA El factor de cola, T, que indica la simetra del pico, es igual
a 1 para picos perfectamente simtricos y mayor que 1 para
Las pruebas de adecuabilidad del sistema son parte in- picos que presentan asimetra. En algunos casos, valores
tegrante de los mtodos de cromatografa lquida. Son menores que 1 pueden ser observados.
aplicadas con la finalidad de verificar si la resolucin y la
reproductibilidad del sistema cromatogrfico estn adecua- Estas pruebas son realizadas despus de recoger los resul-
das para los anlisis a ser realizados. Los principales par- tados de rplicas de inyecciones de la solucin estndar
metros necesarios para la verificacin de la adecuabilidad u otra solucin especificada en la monografa individual.
del sistema son descritos a continuacin. La especificacin de esos parmetros cromatogrficos, en
una monografa, no impide la modificacin de las condi-
La resolucin, R, es funcin de la eficiencia de la columna, ciones de anlisis. Ajustes en las condiciones de trabajo,
N, y es especificada para garantizar que sustancias eluidas para alcanzar los parmetros de adecuabilidad del siste-
prximamente, presenten separacin satisfactoria sin inter- ma, pueden ser necesarios. A menos que especificado en
ferencias mutuas. la monografa individual, los parmetros de adecuabilidad
del sistema son determinados a partir de los datos obteni-
Rplicas de inyecciones de la solucin estndar son traba- dos con el pico de la sustancia de inters. La precisin del
jadas, estadsticamente, para verificar si los requisitos para sistema, demostrada por medio de rplicas de la solucin
la precisin del anlisis fueron alcanzados. A menos que estndar, debe ser alcanzada antes de las inyecciones de las
especificado en la monografa individual, son utilizados soluciones muestras. La adecuabilidad del sistema debe ser
los datos de cinco rplicas de inyecciones para calcular el verificada durante todo el anlisis cromatogrfico, por in-
desvo estndar relativo (DPR), si la especificacin fuese yeccin de solucin estndar en intervalos de tiempo apro-
igual o inferior a 2,0%. Si el desvo estndar relativo es- piados. Cuando hubiere cambio significativo en el equipo
pecificado fuese superior a 2,0%, los datos de seis rplicas o en un reactivo, las pruebas de adecuabilidad del sistema
deben ser utilizados. deben ser realizadas antes de las inyecciones de la muestra.
El anlisis no ser vlido a menos que los requisitos de la Un equipo de cromatografa de iones consiste, bsicamen-
prueba de adecuabilidad del sistema sean alcanzados. te, en el mismo sistema utilizado para CLAE. Este sistema
consiste de una bomba de alta propulsin, una vlvula de
5.2.17.4.1 Cromatografa de iones inyeccin con ansa de muestreo adecuada, columna de se-
paracin (para la separacin de aniones debe ser utilizada
La cromatografa de iones se refiere al mtodo de separa- una columna de cambio aninico), una post-columna, caso
cin y determinacin de iones utilizando cromatografa a necesario, para conversin de los iones del eluyente en es-
lquido de alta eficiencia (CLAE). Esta tcnica est basa- pecies con menor conductividad y un detector de conduc-
da en un proceso de separacin de los componentes de la tividad.
muestra entre dos fases: fase mvil y fase estacionaria. El
proceso de separacin es resultante de interacciones espe- PROCEDIMIENTO
cficas entre las especies presentes en la muestra en ambas
las fases. El mecanismo de interaccin con la fase estacio- Para operar el cromatgrafo de iones, se recomienda seguir
naria es a cambio inico, donde las columnas utilizadas son las instrucciones del fabricante. Las determinaciones son
constituidas por un grupo funcional cargado, generalmente hechas por comparacin con soluciones de referencia, con-
SO3-, COO-, NH3+, NR3+ ligado a una matriz polimrica, teniendo concentraciones conocidas del analito.
como slice o copolmero del tipo poliestireno-divinil-
benceno. La fase mvil tambin contiene especies inicas Fase mvil: preparar la fase mvil de acuerdo con las espe-
ocurriendo, de esta forma, una competicin entre la distri- cificaciones recomendadas por el fabricante de la columna
bucin de las especies presentes en la muestra entre a fase de cambio aninico utilizada. Se recomienda la utilizacin
mvil y la fase estacionaria. Para cada ion, el proceso de de fase mvil compuesta por una mezcla de carbonato y bi-
cambio est caracterizado por el equilibrio de distribucin carbonato de sodio (Na2CO3/NaHCO3), en la banda de con-
entre la fase mvil y la fase estacionaria. centracin de 1,0 a 4 mmol/L, dependiendo de la columna
5
utilizada. Utilizar el caudal de la fase mvil recomendada
Los intercambiadores utilizados pueden ser clasificados en por el fabricante del equipo y de acuerdo con la columna
fuertes, medios y suaves, dependiendo del grupo funcional de cambio inico utilizada. Durante los anlisis utilizando
ligado a la matriz polimrica. Los intercambiadores ini- la deteccin por conductividad, regenerar la columna de
cos fuertes son aquellos que se ionizan completamente en supresin qumica, conforme recomendacin del fabrican-
una amplia banda de pH, como grupo sulfnico y amonio te. Se recomienda la utilizacin de H2SO4 0,005 mol/L y
cuaternario. El grado de disociacin de los intercambiado- posterior lavado con agua purificada.
res inicos suaves y medios es dependiente del pH y, de
esta forma, la capacidad de estos intercambiadores vara Calibracin: preparar al menos cuatro soluciones de refe-
en funcin del pH. Se puede citar como ejemplo, el grupo rencia del elemento a ser determinado, cubriendo la banda
carboxlico y poliamina. de concentracin recomendada por el fabricante del equi-
po para el analito en anlisis e inyectar, separadamente,
Esta tcnica permite que la conductividad elctrica sea cada solucin de referencia en el equipo, utilizando ansa
usada para la deteccin y determinacin cuantitativa de de muestreo adecuada. Se recomienda el uso de ansa de
los iones en solucin, despus de la separacin. General- muestreo de 20 a 100 L. Registrar los cromatogramas e
mente, la cromatografa de iones con columna de cambio integrar las seales en rea o en altura de pico. Despus de
aninica y detector por conductividad puede ser utilizada la calibracin, trazar la curva de calibracin. Preparar la
para la determinacin de los iones F-, Cl-, Br-, SO/42- solucin de la muestra conforme indicado en la monogra-
, PO43-, I-, entre otros. En virtud de la conductividad fa, ajustando su concentracin para que esta quede situada
elctrica ser una propiedad comn a todas las especies dentro de la banda de concentracin de las soluciones de
inicas en solucin, el detector por conductividad tiene referencia. Inyectar la muestra en el cromatgrafo, regis-
la capacidad de monitorear todas las especies inicas. El trar la lectura y repetir esta secuencia tres veces, adoptando
problema que ocurre en la utilizacin de la conductivi- el promedio de las tres lecturas. Determinar la concentra-
dad elctrica para cuantificar las especies inicas eluidas cin del elemento por la curva de calibracin. En el caso
puede ser causado por la alta conductividad de los iones que sea hecha la determinacin simultnea de varios anio-
presentes en la fase mvil, principalmente debido al ion nes, pueden ser hechas soluciones de referencia contenien-
sodio, imposibilitando la cuantificacin de otros iones. do todos los analitos.
Este problema es superado con el uso de un supresor del
eluyente, posicionado despus de la columna de separa- 5.2.17.5 CROMATOGRAFA A GAS
cin, donde ocurre la conversin de los iones del eluyente
en especies que contribuyen para una condutancia baja o Cromatografa a gas (CG) es una tcnica de separacin
nula. El cido carbnico, resultante del cambio catinico, cromatogrfica basada en la diferencia de distribucin de
es levemente disociado, poseyendo una baja conductivi- especies de una mezcla entre dos fases no miscibles, en la
dad (seal de conductividad de la lnea base es menos cual la fase mvil es un gas de arrastre que se mueve a tra-
significativa). De esta forma, la sensibilidad, para la de- vs de la fase estacionaria contenida en una columna. CG
terminacin de aniones, puede ser aumentada significati- est basada en el mecanismo de adsorcin, distribucin de
vamente, en un factor de 10 veces o superior, cuando son masa o exclusin por tamao. Es aplicada a sustancias y
utilizados supresores. sus derivados que se volatilizan bajo las temperaturas em-
pleadas, y es utilizada para identificacin, prueba de pureza en la cabeza de la columna utilizando una jeringa o una
y determinacin cuantitativa. vlvula de inyeccin, o en una cmara de vaporizacin que
puede estar equipada con un divisor de flujo. La cantidad
Cuando un constituyente vaporizado es conducido por el de muestra que puede ser inyectada en una columna capilar
gas de arrastre para dentro de la columna, l es particiona- sin saturar es menor cuando comparada a la cantidad que
do entre la fase mvil gaseosa y la fase estacionaria por un puede ser inyectada en columnas empaquetadas. Columnas
proceso de distribucin contracorriente dinmico, presen- capilares, sin embargo, frecuentemente son utilizadas con
tando una retencin mayor o menor debido a fenmenos de inyectores capaces de dividir la muestra en dos fracciones
sorcin y desorcin sobre a fase estacionaria. (modo split), una menor que entra en la columna y otra
mayor que es descartada. Esos inyectores pueden ser utili-
EQUIPO zados sin divisor de muestra (modo splitless) para anlisis
de componentes en menor cantidad o en trazos.
El equipo consiste en una fuente de gas de arrastre y un
controlador de flujo, una cmara de inyeccin, una colum- Las inyecciones de la fase de vapor pueden ser efectuadas
na cromatogrfica contenida en un horno, un detector y un por sistema de inyeccin en espacio confinado (headspace)
sistema de adquisicin de datos (o un integrador o registra- esttico o dinmico.
dor). El gas de arrastre circula por la columna con flujo y
presin controlados y sigue directamente para el detector. Sistema de inyeccin en espacio confinado (headspace)
esttico (purge y trap) incluye un dispositivo de concen-
El inyector, la columna y el detector presentan temperatura tracin, por donde las sustancias voltiles de la solucin
controlada. La cromatografa se realiza a temperatura cons- son arrastradas hasta una columna adsorbente, mantenida
tante o utilizando un programa de temperatura adecuado. a baja temperatura donde son adsorbidas. Las sustancias
Los compuestos que harn la cromatografa, tanto en solu- retenidas son entonces desorbidas en una fase mvil por
5
cin como gases, son inyectados, entrando en contacto con calentamiento rpido de la columna adsorbente.
el gas de arrastre en la cmara de inyeccin. Dependiendo
de la configuracin del equipo, la mezcla a ser analizada Sistema de inyeccin en espacio confinado (headspace) di-
debe ser inyectada directamente en la columna o debe ser nmico incluye una cmara de calentamiento de las mues-
vaporizada en la cmara de inyeccin y mezclada en el gas tras, termostticamente controlada, en la cual se colocan
de arrastre antes de entrar en la columna. frascos (viales) cerrados donde muestras slidas o lquidas
son colocadas por un perodo de tiempo determinado, para
Una vez en la columna, los constituyentes de la mezcla son permitir que los componentes voltiles de las muestras al-
separados en funcin de sus diferentes ndices de retencin cancen el equilibrio entre la fase no gaseosa y la fase de
lineal, los cuales son dependientes de la presin de vapor vapor. Despus de establecido el equilibrio, una cantidad
y del grado de interaccin con la fase estacionaria. El n- pre- determinada del espacio confinado del frasco es inyec-
dice de retencin, que define la resolucin, el tiempo de tada en el cromatgrafo.
retencin y la eficiencia de la columna con relacin a los
componentes de la mezcla, tambin es dependiente de la Fases estacionarias
temperatura. El uso de programas de temperatura para el
horno donde est la columna presenta una ventaja en la efi- Las fases estacionarias estn contenidas en columnas que
ciencia de separacin de los compuestos que se comportan pueden ser:
diferentemente en la presin de vapor.
Una columna capilar de slice fundida cuya pared est
Los compuestos salen separados de la columna, pasando revestida con la fase estacionaria;
por un detector, que responde a cantidad de cada compues- Una columna empaquetada con partculas inertes im-
to presente. El tipo de detector a ser utilizado depende de pregnadas con la fase estacionaria;
la naturaleza de los compuestos a ser analizados y es espe- Una columna empaquetada con la fase estacionaria s-
cificado en cada monografa. Los detectores son calentados lida. Las columnas capilares, usualmente hechas de s-
para evitar la condensacin de los compuestos eluidos. La lice fundida, presentan un dimetro interno () de 0,10
salida del detector est dada en funcin del tiempo de re- a 0,53 mm y un largo de 5 a 60 m. La fase lquida o
tencin, generando un cromatograma, que consiste de una estacionaria que puede estar qumicamente ligada a la
serie de picos en el eje del tiempo. Cada pico representa un superficie interna, es una pelcula de 0,1 a 5,0 ^m de
compuesto de la mezcla vaporizada, a pesar de que algunos espesor, a pesar de que fases estacionarias no polares
picos puedan salir superpuestos. El tiempo de elucin es puedan alcanzar 5 m de espesor.
caracterstico de un compuesto individual y la respuesta
del instrumento, medido como el rea del pico o la altura Las columnas empaquetadas, de vidrio o metlicas, pre-
del pico, es en funcin de la cantidad presente. sentan largo de 1a 3 m con un dimetro interno () de 2 a
4 mm. Las fases estacionarias consisten, generalmente, en
Inyectores polmeros porosos o soportes slidos impregnados con la
fase lquida llegando a, aproximadamente, 5% (p/p). Co-
Inyecciones directas de soluciones es el modo usual de in- lumnas de alta capacidad, con la fase lquida llegando a,
yeccin, a menos que sea indicado diferentemente en la aproximadamente, 20% (p/p), son utilizadas para una am-
monografa. La inyeccin puede realizarse directamente plia banda de compuestos y para determinacin de com-
puestos con bajo peso molecular como el agua. La capa- transformada de Fourier, entre otros. Para anlisis cuan-
cidad requerida influencia la eleccin del soporte slido. titativos, los detectores deben presentar una amplia varia-
cin dinmica lineal: la respuesta debe ser directamente
Los soportes para anlisis de compuestos polares en co- proporcional a la cantidad de compuesto presente en el
lumnas empaquetadas con una fase estacionaria de baja detector en una amplia banda de concentraciones. Detec-
polaridad y baja capacidad deben ser inertes para evitar tores por ionizacin de llama presentan una amplia banda
una excesivo prolongacin de los picos. La reactividad de lineal y son sensibles a la mayora de los compuestos. La
los materiales de soporte puede ser reducida por silaniza- respuesta de los detectores depende de la estructura y de la
cin antes del llenado con la fase lquida. Generalmente se concentracin del compuesto y del promedio de flujo de
utiliza tierra de diatomeas lavada con cido y calcinada. la combustin, del aire y del gas de arrastre. A menos que
Los materiales estn disponibles en diversos tamaos de especificado diferentemente en la monografa, detectores
partcula, siendo las partculas ms comnmente utilizadas por ionizacin de llama operan tanto con helio cuanto con
de 150 a 180 m (80 a 100 mesh) y de 125 a 150 m (100 nitrgeno como gas de arrastre para columnas empaqueta-
a 120 mesh). das, y con helio o hidrgeno para columnas capilares.
5
de la calidad del gas de arrastre; el tiempo de retencin sin considerar su estructura; no obstante, son considerados
es directamente proporcional al largo de la columna y la menos sensibles que el detector por ionizacin de llama.
resolucin es proporcional a la raz cuadrada del largo de
la columna. Para columnas empaquetadas, el promedio de Detectores por ionizacin de llama alcalina, tambin lla-
flujo del gas acarreador est usualmente expresado en mi- mado NP o detector nitrgeno-fsforo, contienen una fuen-
lilitros por minuto, a la presin atmosfrica y temperatura te terminica, con una sal metal lcali o un elemento de
ambiente. El flujo medio es medido en la salida del detec- vidrio conteniendo rubidio u otro metal, que resulta en una
tor, o con un dispositivo mecnico calibrado o con un tubo eficiente ionizacin de nitrgeno orgnico y compuestos
de burbujeo, mientras la columna est con temperatura conteniendo fsforo. Es un detector selectivo que presenta
de funcionamiento. La velocidad lineal del gas de arrastre baja respuesta para hidrocarburos.
a travs de la columna empaquetada es inversamente pro-
porcional a la raz cuadrada del dimetro interno de la co- Detectores por captura de electrones contienen una fuente
lumna para un dado volumen de flujo. Flujos de 60 ml/min radioactiva de radiacin ionizante. Exhiben una respuesta
en una columna de 2 mm de dimetro interno y 15 ml/min extremamente alta a compuestos halogenados y grupo ni-
en una columna de 2 mm de dimetro interno, proporcio- tro, pero poca respuesta a hidrocarburos. La sensibilidad
nan velocidades lineares idnticas y, con eso, tiempos de aumenta con el nmero y el peso atmico de tomos de
retencin similares. A menos que especificado en la mono- halgeno.
grafa, el promedio de flujo para columnas empaquetadas
es de, aproximadamente, 30 a 60 ml/min. Para columnas Dispositivos para tratamiento de datos
capilares, la velocidad del flujo lineal es usualmente utili-
zada en lugar del promedio de flujo. Esto es determinado a Estaciones de tratamiento de datos conectados en la salida
partir del largo de la columna y del tiempo de retencin de de los detectores calculan el rea y la altura de los picos, y
una muestra de metano diluida, utilizando un detector por presentan los cromatogramas completos conteniendo los pa-
ionizacin de llama. Operando a altas temperaturas, exis- rmetros de la corrida y los datos de los picos. Los datos de
te presin de vapor suficiente para que ocurra una gradual los cromatogramas pueden ser almacenados y reprocesados
prdida de la fase lquida, un proceso llamado sangrado. por integracin electrnica u otro tipo de clculo que sea ne-
cesario. Esas estaciones de tratamiento de datos son utiliza-
Helio o nitrgeno son, generalmente, empleados como ga- das tambin para programar los recorridos cromatogrficos.
ses de arrastre para columnas empaquetadas, mientras que
los gases de arrastre utilizados para columnas capilares son PROCEDIMIENTO
nitrgeno, helio e hidrgeno.
Columnas empaquetadas y capilares deben ser condiciona-
Detectores das antes del uso hasta que la lnea de base est estable. Eso
debe ser realizado operando a una temperatura arriba de
Detectores por ionizacin de llama son los ms utilizados la especificada por el mtodo o por repetidas inyecciones
pero, dependiendo de la finalidad de la anlisis, otros de- del compuesto o de la mezcla a realizar la cromatografa.
tectores pueden ser empleados, incluyendo: conductividad El fabricante de la columna generalmente da instrucciones
trmica, captura de electrones, nitrgeno-fsforo, espec- para el adecuado procedimiento de condicionamiento de la
trometra de masas, espectrometra en el infrarrojo con columna. En caso de polisiloxanos metil y fenil sustituidos
trmicamente estables, una secuencia especial aumenta la La muestra es dejada en esta temperatura por tiempo sufi-
eficiencia y la inactividad: mantener la columna a la tem- ciente para permitir que se establezca el equilibrio entre la
peratura de 250 C por 1 hora, con flujo de gas helio, para fase slida y la fase gaseosa. El gas de arrastre es introducido
retirar el oxgeno y solvente. Para el flujo de helio, calentar en el frasco y, despus de determinado tiempo, una vlvula
hasta 340 C por 4 horas, y entonces reducir el calenta- es abierta para permitir que el gas se expanda hasta la colum-
miento hasta temperatura de 250 C, y condicionar con flu- na cromatogrfica, arrastrando los componentes voltiles.
jo de helio hasta la estabilidad de la lnea de base.
En lugar de utilizar un cromatgrafo especialmente adapta-
Despus del procedimiento de condicionamiento, equili- do para la introduccin de las muestras, tambin se pueden
brar la columna, el inyector y el detector a las temperaturas utilizar jeringas hermticas y un cromatgrafo convencio-
y flujo de los gases especificados en la monografa hasta nal. En este caso, el equilibrio entre las dos fases es condu-
la obtencin de una lnea de base estable. Preparar la(s) cido en una cmara separada y la fase de vapor es transfe-
solucin(es) muestra y de referencia como descrito. Las rida para la columna, tomando las precauciones necesarias
soluciones deben estar exentas de partculas slidas. para evitar cualquier modificacin del equilibrio.
5
mente cuando inyecciones manuales son realizadas con el Introducir separadamente, en frascos idnticos, la prepara-
auxilio de una jeringa. Los efectos de variabilidad pueden cin a examinar y cada una de las soluciones de referencia,
ser minimizados por la adicin de un estndar interno, un segn las condiciones descritas en la monografa y evitan-
compuesto no interferente adicionado en la misma concen- do el contacto entre la muestra y el dispositivo de inyec-
tracin en las soluciones muestra y estndar. El promedio cin. Cerrar hermticamente los frascos e introducirlos en
de las respuestas del pico del analito en relacin al estndar la cmara termostatizada a temperatura y presin descritas
interno es comparado entre los cromatogramas de la muestra en la monografa. Despus de alcanzar el equilibrio, proce-
y del estndar. Cuando el estndar interno es qumicamen- der a anlisis cromatogrfico en las condiciones descritas.
te similar a la sustancia a ser analizada, existe tambin una
compensacin para variaciones menores en la columna y en Adicin de estndar
las caractersticas del detector. En algunos casos, el estndar
interno puede ser conducido a travs de la preparacin de Aadir, a una serie de frascos idnticos, volmenes iguales
la muestra antes del anlisis cromatogrfico para controlar de la solucin a examinar. Aadir a todos los frascos, ex-
otros aspectos cuantitativos del ensayo. Inyectores autom- cepto a uno de ellos, cantidades crecientes de una solucin
ticos aumentan la reproductibilidad de las inyecciones de las de referencia, de concentracin conocida de la sustancia a
muestras y reducen la necesidad de estndares internos. examinar. De este modo, se obtiene una serie de prepara-
ciones conteniendo cantidades crecientes de determinada
5.2.17.5.1 Cromatografa a gas en espacio sustancia. Cerrar hermticamente los frascos e introducir-
confinado (headspace) los en la cmara termostatizada, segn condiciones de tem-
peratura y presin descritas en la monografa. Despus de
La cromatografa a gas en espacio confinado (headspace) alcanzar el equilibrio, proceder al anlisis cromatogrfico
es una tcnica particularmente adecuada para la separa- en las condiciones descritas.
cin y determinacin de compuestos voltiles presentes en
muestras slidas y lquidas. Este mtodo est basado en Calcular la ecuacin de la recta por regresin lineal, utili-
el anlisis de una fase de vapor en equilibrio con una fase zando el mtodo de los mnimos cuadrados y, a partir de
slida o lquida. ella, obtener la concentracin de la sustancia en examen en
la preparacin de la muestra, indicada por el intercepto de
EQUIPO la ecuacin.
sin aplicada al sistema. El grfico de esta evolucin de la que las molculas electroactivas de la muestra alcancen el
corriente con relacin a la tensin el polarograma da microelectrodo por migracin elctrica y asegura, por eso,
informaciones cuali y cuantitativas sobre constituyentes que la corriente lmite sea efectivamente regulada apenas
electro reductibles o electro oxidables de la muestra. por difusin.
5
de la muestra (el mtodo tiene sensibilidad para concentra-
ciones de especie electroactiva en la banda de 10-2 a 10-4
M) en electrolito de soporte, responsable del mantenimien-
to de pequea corriente residual, pero que se muestra inerte
en la banda de potencial de transformacin de la muestra
(ventana de potencial). Inicialmente, sin aplicacin de ten-
sin en la fuente, (potenciostato de precisin), la tensin
suministrada al microelectrodo es nula y no habr indi-
cacin de corriente en el microampermetro. El creciente
aumento de tensin har con que un pequeo potencial al-
cance los electrodos. Bajo esta tensin, adems reducida,
eventuales impurezas del electrolito soporte y pequeas
concentraciones de oxgeno pueden sufrir reduccin en el
EMG (ctodo, en este caso), reducindose y provocando la
indicacin de pequeo paso de corriente. La elevacin pro-
gresiva de la tensin aplicada acentuar el proceso de re-
duccin y el aumento casi proporcional de la corriente. Se
alcanza, finalmente, el potencial necesario a la reduccin
del analito en la solucin de la muestra, lo que se refleja en
elevacin acentuada de la corriente leda en el microam-
permetro (galvanmetro) y registrada en el polarograma.
Hay, sin embargo, lmite para la proporcionalidad de la ele-
vacin tensin-corriente. Mientras la corriente se eleva (y Figura 1 - Polarograma de especie electrorreducible.
la reduccin se procesa), ocurre disminucin progresiva de
la concentracin de la especie electroactiva original junto POLAROGRAMA
a la superficie del electrodo. En dado momento la veloci-
dad de la electrlisis siendo constante tal concentracin Es ilustrado en la Figura 1 un polarograma tpico (EMG),
alcanza nivel insuficiente para permitir elevacin adicional caracterizado por 4 fases distintas. El segmento A es debi-
de la corriente y esta ltima pasa a ser limitada por la di- do a la corriente capacitiva, ic, incorporada a la corriente
fusin con la cual la especie electroactiva consigue difun- fardica, ip resultante de la oxidacin o reduccin de im-
dirse en el seno (interior) de la solucin electroltica para purezas del electrolito soporte, o de la muestra y pequeas
la superficie del EMG. Surge el nivel observado en el po- concentraciones de oxgeno, cuando este no es retirado por
larograma (Figura 1), siendo la corriente medida enton- completo de la solucin. El conjunto de estas corrientes se
ces denominada corriente de difusin un parmetro pro- denomina corriente residual, ir (ir = ic + if). En el segmento
porcional a la concentracin de especie electroactiva en la B del polarograma ocurre la corriente fardica, if debido
muestra (aspecto cuantitativo de la polarografa). Superado a la conversin de la sustancia en ensayo. La electrodes-
determinado nivel de tensin, la corriente vuelve a elevar- composicin lleva a la escasez de esta sustancia junto al
se. Ese aumento es causado por la reaccin del electrolito microelectrodo, verificndose el nivel (segmento C) donde
soporte. Su presencia, en elevadas concentraciones, impide aparece la corriente lmite, il. Esta comprende la suma de
las corrientes residual y de difusin (i= ir + id) en que la centgrado aumentado, tornando necesario que la clula
corriente de difusin proporcional a la concentracin de polarogrfica tenga su temperatura controlada con toleran-
la especie electroactiva en la muestra tiene su valor de- cia de 0,5 C Los parmetros m y t, relacionados con di-
terminado por: mensin y velocidad de renovacin de la gota de mercurio,
dependen de la geometra del capilar, siendo la corriente
id = il + ir de difusin proporcional a la raz cuadrada de la altura de
la columna de mercurio. Alturas adecuadas midindose
Dos otras corrientes indeseables la de migracin y la de la extremidad del capilar hasta el nivel de mercurio en
de conveccin pueden incorporar la corriente lmite. La el depsito se encuentran entre 40 y 80 cm. El dimetro
primera es suprimida por el empleo de electrolito soporte interno del capilar en este caso es de 0,04 mm para largos
inerte en la banda de potencial empleada, en concentracio- entre 6 y 15 cm. La altura exacta del capilar es ajustada
nes, en el mnimo, 100 veces mayores que las de la especie para permitir la formacin de una gota cada 3-5 segundos,
electroactiva. con circuito abierto y capilar inmerso en el electrolito bajo
ensayo.
La corriente de conveccin, a su vez, es eliminada por la no
agitacin de la solucin. As, si durante un ensayo en particular todos los parme-
tros a excepcin de la concentracin de la especie elec-
Finalmente, el segmento D del polarograma, en el cual troactiva fueren mantenidos constantes, la ecuacin de
ocurre reversin de la proporcionalidad tensin-corriente, Ilkovic puede ser escrita como
corresponde a la reduccin de otras especies electroactivas,
cuando presentes, o, ms frecuentemente, a la electrlisis id = KC
del soporte.
en que K representa el conjunto de variables mantenidas
5
Ecuacin de Ilkovic constantes.
A ecuacin de Ilkovic establece relaciones entre variables Esta relacin directa entre corriente de difusin y concen-
comprendidas en la medida polarogrfica y la corriente de tracin es usualmente adoptada mediante la determinacin
difusin en el EMG: previa de la corriente de difusin de solucin estndar de
referencia, de concentracin conocida. En seguida, bajo
condiciones idnticas, se determina la corriente de difusin
de la muestra y, finalmente, su concentracin:
en que
id = corriente de difusin, en A
708 = constante dependiente de diversos parmetros, inclu-
yendo la unidad adoptada para las variables, dimensin de
la gota de mercurio e instante de la medida de id, en que P y A corresponden, respectivamente, a estndar y
n = nmero de electrones necesarios a la reduccin u oxi- muestra.
dacin de una molcula o ion de sustancia electroactiva,
D = coeficiente de difusin, en cm2/s, Una vez que polargrafos, en su mayora, son dotados de
C = concentracin de sustancia electroactiva, en milimo- registradores automticos, es ms fcil determinar grfica-
les/L, m = masa del flujo de mercurio, en mg/s, mente corrientes de difusin por la medida de la altura de
t = tiempo de vida de la gota, en s. la onda polarogrfica (ver Figura 1). Los valores anotados,
en cm, pueden ser directamente aplicados a la frmula, sin
La constante 708 englobando constante natural y el valor necesidad de su conversin en unidades de corriente elc-
del faraday es establecida para operacin a 25 C y es trica:
aplicable a la polarografa de corriente continua muestrea-
AP CP
da, en la cual, en vez del registro continuo de corriente, se =
efecta apenas la lectura de la corriente al trmino de la AA CA
vida de la gota de mercurio, permitiendo obtencin de po-
larograma lineal. No obstante, al emplearse instrumentos en que AP y AA corresponden a las alturas de las ondas po-
dotados de amortiguador de diente de sierra en el regis- larogrficas del estndar y de la muestra, respectivamente.
trador, se considera la corriente media de los pulsos. La
corriente de difusin obtenida segn la ecuacin de Ilkovic Potencial de media onda
pasa a ser a media para toda la vida de la gota de mercurio.
En este caso la constante adquiere el valor 607. La medida de la altura de la onda polarogrfica para fines
de anlisis cuantitativo debe ser efectuada trazndose lneas
Las variables comprendidas en la ecuacin de Ilkovic de- rectas junto a los picos de las oscilaciones de la corriente
ben ser controladas para que la corriente de difusin sea residual y de la corriente lmite y unindose, por medio de
efectivamente proporcional a la concentracin de especie tercera recta paralela al eje de las abscisas, las prolongacio-
electroactiva en la muestra analizada. Algunos iones y mo- nes de las dos primeras. La recta vertical es trazada pasando
lculas orgnicas en solucin acuosa modifican su coefi- por el punto de inflexin de la onda polarogrfica, corres-
ciente de difusin a la razn de 1 a 2% para cada grado pondiendo a la mitad de la distancia entre la corriente resi-
5
previamente a la determinacin. La mejor forma consiste
en burbujear nitrgeno exento de oxgeno a travs de la
solucin durante un perodo de 10 a 15 minutos inmediata-
mente antes del ensayo, tomando la precaucin de previa-
mente saturar el nitrgeno (para evitar alteraciones en la
solucin electroltica debidas a la evaporacin) burbujen-
dolo a travs de pequeo volumen de solucin electroltica
en recipiente separado.
Mximo polarogrfico
tencial creciente al EMG, coincidentes con el perodo final la solucin. El agua es un electrolito extremamente suave,
de vida de las gotas de mercurio, cada pulso presentando cuya autoionizacin produce ion hidronio (hidrgeno hi-
potencial ligeramente superior al anterior. La corriente, por dratado) e ion hidrxido:
su vez, es muestreada en el instante final de duracin del
pulso de potencial, perodo en el cual la corriente capaci- H2O + H2O <> H3O+ + OH-
tiva adquiere valor prcticamente nulo y la corriente resi-
dual se compone casi que exclusivamente de la corriente Las concentraciones del ion hidronio en las soluciones
de difusin. acuosas pueden variar entre lmites amplios, que experi-
mentalmente
5
clula :
Tabla 2 - Polarograma obtenido en la
polarografa de pulso diferencial. pH = pHt = (E -Et)/ K,
DETERMINACIN POTENCIOMTRICA DEL pH Son empleadas buscando la medicin del aparato, permi-
tiendo linealidad en las respuestas con relacin a las altera-
El valor de pH es definido como la medida de la actividad ciones de potencial observadas. Las ms importantes son:
del ion hidrgeno de una solucin. Convencionalmente es tetraoxalato de potasio 0,05 M, fosfato equimolar 0,05 M,
usada la escala de la concentracin de ion hidrgeno de
tetraborato de sodio 0,01 M, carbonato de sodio y hidrxi- volumtrico y aadir agua hasta 1000 ml. Agitar bien y
do de calcio saturado a 25 C. mantener en temperatura de 25 C 2oC, para adecua-
da saturacin (aproximadamente 0.02 M). Decantar a
Las soluciones tampn son preparadas de la siguiente ma- 25C antes de usar. Proteger para evitar absorcin de
nera: dixido de carbono.
Tetraoxalato de potasio, 0,05M Reducir el te- Carbonato de sodio Desecar el carbonato de sodio
traoxalato de potasio a polvo fino y desecar en deseca- en desecador con slice gel hasta peso constante. Pesar
dor con slice. Disolver exactamente 12,71g de KH3(- exactamente 2,10 g. Desecar en estufa de 300 a 500
C2O4)-2H2O en agua para alcanzar 1000 ml. C hasta peso constante. Pesar 2,65 g. Disolver ambas
Biftalato de potasio, 0,05M Reducir el biftalato de muestras en agua hasta 1000 ml.
potasio a polvo fino y desecar a 110 C hasta peso cons-
tante. Disolver exactamente 10,21g de KHC8H4O4, pre- Tales soluciones deben ser recin preparadas con agua exen-
viamente desecado a 100 C durante 1 hora, en agua, ta de dixido de carbono y empleadas en plazo de tres me-
para alcanzar 1000 ml. ses, tomndose cautela para evitar el crecimiento de hongos
Fosfato equimolar, 0,05M Reducir el Na2HPO4 y y bacterias. Se acepta el empleo de conservantes desde que
KH2PO4 a polvo fino y desecar a 110 C hasta peso no interfiera en la medicin potenciomtrica del pH.
constante. Disolver 3,55g de Na2HPO4 y 3,40g de
KH2PO4, en agua, para alcanzar 1000 ml. El agua utilizada en el preparado de las soluciones debe ser
Tetraborato de sodio, 0,01M Desecar el tetraborato recientemente destilada, calentada a ebullicin por, como
de sodio en desecador conteniendo solucin acuosa de mnimo, 15 minutos, enfriada y mantenida en recipiente
bromato de sodio hasta peso constante. Disolver 3,81g impermeable al dixido de carbono. Preparar, individual-
de Na2B4O7-10H2O, en agua, para alcanzar 1000 ml. mente, las seis soluciones estndar y almacenarlas en fras-
Evitar absorcin de dixido de carbono. cos de vidrio o de polietileno adecuados. Observar el plazo
5
Hidrxido de calcio, saturado a 25C Reducir el hi- de validez de las soluciones, una vez que el pH sufre alte-
drxido de calcio a polvo fino y desecar con slice en raciones con el pasar del tiempo.
desecador hasta peso constante. Transferir 5 g a baln
Tabla 1 - Relacin entre las temperaturas y los valores de pH de las soluciones-tampn para calibracin del medidor de pH
Tetraoxalato Tetraborato Hidrxido de
Temperatura Biftalato de Fosfato Carbonato
de potasio de sodio calcio saturado a
(C) potasio 0,05M equimolar de sodio
0,05M 0,01M 25C
10 1,67 4,00 6,92 9,33 13,00 10,18
15 1,67 4,00 6,90 9,27 12,81 10,12
20 1,68 4,00 6,88 9,22 12,63 10,07
25 1,68 4,01 6,86 9,18 12,45 10,02
30 1,68 4,01 6,85 9,14 12,30 9,97
35 1,69 4,02 6,84 9,10 12,14 9,93
40 1,70 4,03 6,84 9,07 11,99 -
Lavar el electrodo con chorros de agua destilada y secar Determinacin del pH en la solucin muestra
con papel filtro;
Despus de la afericin conveniente, lavar el electrodo con
Sumergir el electrodo en solucin tampn de referencia, agua (o soluciones propias) y con varias porciones de la
verificndose la temperatura en que se va a operar; solucin muestra. Para diluicin de las muestras, usar agua
destilada exenta de dixido de carbono;
Ajustar el valor de pH hasta el valor de la tabla, mediante
el valor de calibracin; La primera determinacin da un valor variable, habiendo
necesidad de proceder a nuevas lecturas. Los valores en-
Lavar el electrodo con varias porciones de la segunda solu- contrados posteriormente no debern variar ms que 0,05
cin tampn de referencia, sumergir el electrodo y verificar de unidad en tres lecturas sucesivas;
el valor de pH registrado. El valor de pH no debe presentar
variaciones que superen 0,07 del valor de la tabla para la Para determinaciones que exijan alta precisin, las tempe-
segunda solucin estndar. Hay aparatos que poseen fras- raturas de las soluciones tampn y muestra, de los electro-
5
valores, ms o menos amplia, conforme el indicador em-
pleado. La determinacin es llevada a cabo adicionndose En la solucin volumtrica, original, conocida como Re-
gotas de la solucin indicadora a la solucin en examen activo de Karl Fischer, el dixido de azufre y el yodo son
o humedecindose papeles indicadores con la solucin en disueltos en piridina y metanol. La muestra puede tanto ser
examen y observndose el cambio de coloracin. Los colo- titulada directamente (mtodo directo) como por retorno
res desarrollados por los indicadores en diversas bandas de (mtodo indirecto).
pH estn relacionados en Indicadores (14.1)
Aparatos
ACIDEZ Y ALCALINIDAD: ENSAYOS RPIDOS
Se admite el empleo de cualquier equipo que permita la
Una solucin es considerada neutra cuando no modifica el exclusin adecuada de la humedad atmosfrica y la deter-
color de los papeles azul y rojo de tornasol, o cuando el minacin del punto final de la titulacin. Para sustancias
papel indicador universal adquiere los colores de la escala incoloras, es posible detectarse el punto de equivalencia
neutra, o cuando 1 ml de la misma solucin toma color ver- por el cambio de color del reactivo, de amarillo canario
de con una gota de azul de bromotimol SI (pH 7,0). para mbar. Lo inverso es observado al adoptarse la titu-
lacin por retorno. Todava, es ms frecuente y preciso
Es considerada cida cuando toma color rojo el papel azul determinarse el final de la titulacin electromtricamente.
de tornasol o 1 ml toma color amarillo por una gota de rojo Comprende el uso de dispositivo elctrico capaz de generar
de fenol SI (pH 1,0 a 6,6). diferencia de potencial de 200 mV entre dos electrodos de
platino inmersos en la solucin a ser titulada. Al ser alcan-
Es considerada levemente cida cuando toma color leve- zado el punto de equivalencia, ligero exceso de reactivo
mente rojo el papel azul de tornasol o 1 ml toma color ana- provoca elevacin brusca del flujo de corriente entre 50 a
ranjado por una gota de rojo de metilo SI (pH 4,0 a 6,6). 150 A, durante 30 segundos a 30 minutos, dependiendo de
la naturaleza de la muestra (el perodo es menor cuando la
Es considerada fuertemente cida cuando toma color azul el sustancia es soluble en el reactivo).
papel de rojo de congo o 1 ml toma color de rojo por la adi-
cin de una gota de anaranjado de metilo SI (pH 1,0 a 4,0). Algunos tituladores automticos poseen mecanismo para
cierre inmediato de la vlvula que controla la entrada del
Es considerada alcalina cuando toma color azul el papel titulante, as que detecta el cambio de potencial. Los apara-
rojo de tornasol o 1 ml toma color azul por una gota de azul tos comercialmente disponibles poseen un sistema cerrado
de bromotimol SI (pH 7,6 a 13,0). que consiste de una o dos buretas automticas, vaso de ti-
tulacin, agitador magntico y electrodo especifico. El aire
Es considerada levemente alcalina cuando toma color de en el sistema es mantenido seco, con el uso de desecantes
azul el papel rojo de tornasol o 1 ml toma color de rosa por adecuados.
una gota de rojo de cresol SI (PH 7,6 a 8,8).
Reactivo de Karl Fischer
Es considerada fuertemente alcalina cuando toma color de
azul por una gota de timolftalena SI (pH 9,3 a 10,5) o de Aadir 125 g de yodo a una solucin conteniendo 670 ml
rojo por una gota de fenolftalena SI (pH 10,0 a 13,0). de metanol y 170 ml de piridina. Dejar enfriar. Transfe-
Colocar cantidad suficiente de metanol u otro solvente Sigue el mismo principio del mtodo directo, sin embargo,
apropiado en el frasco de titulacin para cubrir los electro- en ese caso, se incorpora exceso de reactivo a la muestra
dos y aadir cantidad suficiente de reactivo para suminis- y, despus de aguardarse el tiempo necesario a la reaccin
trar el color caracterstico de la orientacin o la indicacin cuantitativa, se titula el exceso de reactivo con solucin
de (100 50) microamperes de corriente continua en oca- estndar de agua en metanol. Esa tcnica, de uso irrestricto,
sin de la aplicacin de 200 mV entre los electrodos. es especialmente recomendada para sustancias que liberan,
lentamente, su contenido de agua.
Para la determinacin de trazos de agua (menos de 1%), es
preferible usar reactivos con un factor de equivalencia de Aparatos y reactivo
agua inferior a 2,0, como el tartrato de sodio dihidratado
(C4H4Na2O6.2H2O), previamente desecado a 150 C, por 3 Utilizar los mismos descritos en el mtodo directo.
horas. Pesar, rpidamente, de 150 a 350 mg de sal, exac-
tamente pesados, por diferencia, en el frasco de titulacin Estandarizacin de solucin estndar de agua (mtodo
y titular hasta el punto de equivalencia. El ttulo del reac- indirecto)
tivo, en mg de agua/ml de reactivo, es suministrado por la
ecuacin: Preparar solucin estndar de agua diluyendo 2 ml de agua
en cantidad suficiente de metanol, u otro solvente adecua-
do, para completar 1000 ml. Estandarizar esa solucin con-
forme el procedimiento anterior, utilizando alcuotas de 25
ml. Calcular el contenido de agua, en mg/ ml de solucin,
por la ecuacin
en que
18,02 = peso molecular del agua
230,08 = peso molecular del tartrato de sodio di-hidratado
p = masa, en mg, de la porcin de ensayo de sal,
v = volumen, en ml, de reactivo consumido en la titulacin. en que
v = volumen, en ml, de reactivo consumido,
Para a determinacin precisa de cantidad significativa de T = ttulo del reactivo, en mg/ml.
agua (ms de 1%), utilizar agua como referencia. Transfe-
rir de 25 a 250 mg de agua, exactamente pesados, por di- Procedimiento Cuando en la monografa as especifique,
ferencia, para el frasco de titulacin y titular hasta el punto transferir 35 a 40 ml de metanol, u otro solvente apropia-
de equivalencia. Calcular el ttulo del reactivo, T, en mg de do, para el recipiente de titulacin y titular con el reactivo
agua/ml de reactivo, por la ecuacin estandarizado hasta cambio visual o electromtrico, a fin
de eliminar toda la humedad que pueda estar presente (des-
considerar el volumen consumido, pues l no entra en los
clculos). Rpidamente, aadir al recipiente de titulacin,
cantidad, exactamente pesada de la muestra, que contenga analtico y posibilita la visualizacin de los resultados. No
10 a 250 mg de agua y un volumen en exceso, exactamente es necesario proceder a la calibracin previa del equipo, ya
medido, del reactivo. Dejar en reposo por el tiempo nece- que la corriente consumida puede ser medida en la forma
sario para que la reaccin se complete y titular el reactivo absoluta.
no consumido con solucin estndar de agua, hasta cambio
visual o electromtrico. Calcular el contenido, en mg, de Reactivo
agua en la porcin de ensayo por la ecuacin:
Utilizar el mismo descrito en el mtodo directo.
Preparacin de la muestra
en que
T = ttulo del reactivo, Si la muestra es soluble, disolver cantidad adecuada, exac-
v = volumen, en ml, del reactivo adicionado en exceso tamente pesada, en metanol anhidro o en otro solvente ade-
despus de la incorporacin de la porcin de ensayo, cuado. Si la muestra es insoluble, puede extraerse el agua
v = volumen, en ml, de solucin estndar de agua, nece- utilizndose un solvente anhidro que puede ser inyectado,
sario en cantidad adecuada, exactamente pesada, en la solucin
la neutralizacin del exceso de reactivo, del analito. Alternativamente, puede utilizarse tcnica de
vr = volumen, en ml, de reactivo por ml de solucin estn- evaporacin, en que el agua liberada es colectada en un
dar de agua, determinado en la estandarizacin de esa. tubo de aire corriente de gas inerte y anhidro.
5
MTODO CULOMBIMTRICO viamente preparada conforme descrito en Preparacin de
la muestra, medido con exactitud y con un contenido de
Para determinacin culombimtrica del agua se utiliza el agua estimado de 0,5 mg a 5 mg, o de acuerdo con las ins-
reactivo de Karl Fischer. El yodo, sin embargo, no es uti- trucciones del fabricante del equipo. Mezclar y cuantificar
lizado como solucin volumtrica, pero obtenido por oxi- por culombimetra, determinando el punto final electrom-
dacin andica de una solucin conteniendo yoduro. La tricamente. Determinar el contenido de agua en la muestra
clula de reaccin es constituida de un amplio comparti- directamente en la planilla del equipo y calcular el porcen-
miento andico y de un restricto compartimiento catdico; taje presente de la sustancia. Realizar la determinacin en
separados, entre s, por un diafragma. Tambin, pueden ser blanco y proceder las correcciones necesarias.
utilizados otros tipos adecuados de clulas de reaccin,
como por ejemplo, sin el diafragma. Cada compartimiento 5.2.20.2 MTODO DE LA DESTILACIN
tiene un electrodo de platino que conduce la corriente a AZEOTRPICA
travs de la clula. El yodo, que se produce en el electrodo
andico, reacciona, inmediatamente, con el agua que est A semejanza del mtodo volumtrico, el azeotrpico po-
en el compartimiento. Cuando toda el agua es consumida, sibilita la determinacin de agua contenida en muestras
se produce un exceso de yodo que normalmente se detecta, de naturaleza mltiple. El agua presente es destilada con
electromtricamente, indicando el punto final. No es nece- tolueno, solvente en el cual es prcticamente inmisci-
sario cambiar el reactivo de Karl Fischer despus de cada ble, y separada en tubo receptor apropiado despus de
determinacin. Un requisito necesario para ese mtodo es enfriamiento. Conviene, sin embargo, emplear tolueno
que cada componente de la muestra sea compatible con los previamente saturado con agua para evitar resultados ba-
dems componentes y que no produzcan reacciones secun- jos debido a la disolucin de agua residual en el solvente
darias. Normalmente las muestras son transferidas al reci- anhidro.
piente de titulacin, en la forma de soluciones, mediante la
inyeccin a travs de un septo. Los gases pueden ser intro- APARATO
ducidos en la clula utilizando un tubo de entrada adecua-
do. La precisin del mtodo depende, fundamentalmente, Utilizar baln de fondo redondo (A) con capacidad para
de la eliminacin de la humedad en el sistema. El control 500 ml, conectado por un tubo cilndrico (D) al tubo recep-
del sistema puede ser monitoreado por la lnea de base. Ese tor (B) (Figura 1). Las dimensiones crticas de las piezas
mtodo es, especialmente adecuado, para sustancias qu- del aparato son: tubo cilndrico de 9 a 11 mm de dimetro
micas inertes como hidrocarburos, alcoholes y teres. En interno; tubo receptor con capacidad de 5 ml, y porcin
comparacin con el mtodo volumtrico de Karl Fischer, la cilndrica, con 146 156 mm de largo, graduada en sub-
culombimetra es un mtodo de microtitulacin. divisiones de 0,1 ml, de modo que el error de lectura no
sea superior a 0,05 ml para cualquier volumen indicado,
Aparatos pudiendo, opcionalmente, ser provisto de grifo. La parte
superior del tubo cilndrico se liga, siempre, por medio de
Se admite el empleo de cualquier equipo disponible co- juntas esmeriladas, al condensador de reflujo vertical (C)
mercialmente que posea un sistema totalmente hermtico, de, aproximadamente, 400 mm de largo, por lo menos, por
equipado con electrodos especficos y agitador magntico. 8 mm de dimetro interno.
El microprocesador del equipo controla el procedimiento
Partes del baln y del tubo cilndrico pueden ser guarneci- ebullicin, aadir arena lavada y seca en cantidad sufi-
das con tejido de amianto para mayor aislamiento trmico. ciente para cubrir el fondo del baln o tubos capilares de
El calor para la destilacin debe ser, preferentemente, su- vidrio, del tipo empleado para determinacin de punto de
ministrado por calentador elctrico dotado de control por fusin, vedados en una de las extremidades. Aadir 200 ml
regulador o bao de aceite. de tolueno, encender el equipo y calentar, moderadamente,
durante 15 minutos. Cuando el tolueno comience a hervir,
Limpiar el tubo receptor y condensador con mezcla sulfo- regular el calentamiento para que destile 2 gotas por se-
crmica, enjuagar con agua y secar en estufa. Introducir en gundo. Destilada prcticamente toda el agua, acelerar la
el baln seco 200 ml de tolueno y aproximadamente 2 ml velocidad de destilacin para 4 gotas por segundo. Con-
de agua y destilar durante 2 horas. Enfriar y, despus de cluida la destilacin del agua, verter cerca de 10 a 15 ml de
cerca de media hora, medir el volumen de agua acumulado tolueno por la boca del condensador de reflujo y proseguir
en el tubo graduado. la destilacin por ms 5 minutos. Retirar la fuente de calor,
aguardar el enfriamiento del tubo receptor a temperatura
PROCEDIMIENTO ambiente y desplazar eventuales gotas de agua retenidas
en la pared del tubo receptor con el auxilio de alambre de
Aadir al baln cantidad de muestra, exactamente pesada, cobre con extremidad envuelta en caucho (ltex). Una vez
que contenga de 2 a 4 ml de agua. Si la sustancia es de na- concluida la separacin de las fases, leer el volumen de
turaleza pastosa, envolverla en hoja de aluminio de modo agua depositado en el tubo receptor (descontando el volu-
que la dimensin del paquete sea suficiente solamente para men inicial) y calcular el porcentaje de agua en la porcin
su paso por el cuello del frasco. Si la sustancia induce a de ensayo.
5.2.20.3 DETERMINACIN DEL AGUA una bureta y de un tubo de admisin de aire protegido por
POR EL MTODO SEMIMICRO un agente de secado. La porcin de ensayo es introducida
por un tubo lateral provisto de un tapn esmerilado. Duran-
La determinacin del agua por el mtodo semimicro es rea- te la titulacin, la agitacin debe ser asegurada mediante el
lizada en un aparato de titulacin de capacidad de 60 ml, auxilio de un agitador mecnico o a travs del burbujeo de
provisto de 2 electrodos de platino, de un tubo de admisin nitrgeno seco.
para el nitrgeno, de un tapn adaptado a la extremidad de
5
ponibles presentan (o pueden presentar) una composicin corresponde a la unidad). En el punto B la muestra satura
que difiere de la solucin de yodo sulfuroso SR por susti- la solucin y adiciones subsiguientes no implican aumento
tucin de la piridina por diversos compuestos bsicos. El en su concentracin. La inclinacin del segmento de recta
empleo de esas soluciones reactivas debe ser precedido de BC es, por tanto, nula y la interseccin de la prolongacin
evaluacin que permita, en cada caso, verificar estequio- de esa recta con el eje de las Y da el valor de la solubilidad
metra y ausencia de incompatibilidad entre la sustancia a de la sustancia.
ser ensayada y el reactivo. Salvo indicacin contraria, el
Mtodo A debe ser utilizado.
APARATOS
5
La inclinacin, i, es obtenida por la frmula (Y2-Y1) / (X2- La ampolla con capacidad para 15 ml al lado del llama-
X1), en queY1Y2 y X1, X2 corresponden, respectivamente, a do frasco de solubilidad tambin empleado en los ensayos,
proyecciones de puntos del segmento de recta BC sobre la est ilustrada en la Figura 3. Recipientes de especificacin
ordenada (composicin de la solucin) y la abscisa (com- diferente son admisibles desde que hermticos y apropia-
posicin del sistema). La extrapolacin del segmento BC dos a la tcnica descrita.
da el lmite de solubilidad, S1 en mg de soluto por g de
solvente, del primer componente, mientras la prolongacin
de la recta del segmento CD hasta el eje de las Y lleva a la
suma de las solubilidades de los dos componentes, S1 + S2.
ELECCIN DE SOLVENTE
Pesar con exactitud un mnimo de 7 ampollas de 15 ml Trazar diagrama de fases con base en los valores obtenidos
rigurosamente limpias. Transferir cantidades crecientes y determinar la pureza porcentual de la muestra en funcin
exactamente pesadas de muestra para cada ampolla, de de la inclinacin del segmento de recta.
modo que la primera contenga cantidad apenas ligera-
mente menor que la solubilizable en 5 ml de solvente y APLICACIN DEL ANLISIS DE SOLUBILIDAD
la ltima contenga ligero exceso de muestra. Despus de POR FASES EN LA PURIFICACIN DE SUSTANCIAS
transferir 5,0 ml de solvente para cada ampolla, enfriarlas
en mezcla de hielo seco y acetona y sellarlas con soplete Mientras las soluciones obtenidas en el proceso analtico
aire/gas, tomando la precaucin de guardar fragmentos de descrito contienen esencialmente todas las impurezas pre-
vidrio resultantes del proceso. sentes en la muestra en proporcin aumentada con relacin
a la muestra original, prestndose despus de evapora-
Permitir que las ampollas alcancen la temperatura ambiente cin del solvente a la determinacin cualitativa de las
y pesarlas, conjuntamente con sus respectivos fragmentos impurezas, la fase es adecuada, por la elevada pureza, al
de vidrio. Calcular la composicin del sistema, en mg/g, preparado de estndares de referencia para otros ensayos
para cada ampolla, por la frmula: 1000(M2-M1)/(M3-M2), analticos.
en que M2 corresponde a la masa de la ampolla conteniendo
muestra; M1 es a masa de la ampolla vaca y M3 es la masa Procedimiento
de la ampolla conteniendo muestra, solvente y eventuales
fragmentos de vidrio. Pesar cantidad apropiada de muestra y suspenderla en sol-
5
vente adecuado para alcanzado el equilibrio disolver
Equilibrio solamente 10% del material. Cerrar el frasco y aguardar es-
tablecimiento del equilibrio a la temperatura ambiente (en
El perodo necesario al establecimiento de equilibrio en los general, 24 horas son suficientes). En seguida, recolectar la
sistemas contenidos en las ampollas es variable de acuerdo solucin sobrenadante lmpida y evaporar, a temperatura
con la naturaleza de la muestra, mtodo de agitacin (ro- ambiente o prxima de esta, hasta sequedad. Por el hecho
tacin o vibracin) y temperatura. La experiencia indica de que la solucin contenga las impurezas de la muestra
plazo medio de 1 a 7 das para agitacin por vibracin y original, se obtiene, por este procedimiento, material en
7 a 14 das para el proceso rotacional. Para confirmar la que la proporcin de impurezas se encuentra aumentada,
promocin de equilibrio, calentar la penltima ampolla de siendo la relacin de enriquecimiento aproximadamente
la serie a 40 C con el objetivo de obtener supersaturacin. igual a la razn de la masa de la muestra por la masa de
El resultado es positivo si el punto correspondiente a esta slidos disueltos en el volumen de solvente empleado. Pu-
ampolla fuese coherente con los dems en el diagrama de rificar el residuo no disuelto por lavado y secado (estndar
fases. Todava, resultado diverso no significa necesaria- de referencia).
mente no haber sido alcanzado el equilibrio. Hay sustan-
cias con tendencia a permanecer en solucin supersaturada 5.2.22 ELECTROFORESIS
y, siendo este el caso, cabe la ejecucin de serie de anlisis,
varindose el perodo de espera con el fin de asegurar la PRINCIPIOS GENERALES
coherencia de los puntos de la curva de solubilidad.
Por accin de un campo elctrico, las partculas cargadas
Composicin de la solucin disueltas o dispersas en una solucin electroltica migran
en direccin al electrodo de polaridad opuesta. En la elec-
Alcanzado el equilibrio, colocar las ampollas en soporte troforesis en gel, el desplazamiento de las partculas es re-
apropiado para que permanezcan en posicin vertical, con tardado por las interacciones con el gel de la matriz que
los cuellos arriba del nivel del agua del bao termostatiza- constituye el medio de migracin y se comporta como un
do. Aguardar la decantacin de los slidos en las ampollas, tamiz molecular.
abrirlas y recoger 2,0 ml de cada una por medio de pipeta
provista de copo de algodn o de otro material capaz de Las interacciones de oposicin de la fuerza elctrica y de
actuar como filtro. Retirar el material filtrante de la pipeta la tamizacin molecular resultan en la tasa de diferencial
y transferir el lquido lmpido para frasco de solubilidad de migracin de acuerdo con el tamao, forma y carga de
(Figura 3) tarado y debidamente identificado, pesando partculas. Debido a sus propiedades fsico-qumicas di-
cada frasco despus de la operacin. Enfriar los frascos ferentes, las diversas molculas contenidas en una mezcla
en bao de hielo seco y acetona y, en seguida, evaporar el migrarn a velocidades diferentes durante la electrofore-
solvente bajo presin reducida. Aumentar gradualmente la sis, quedando as separadas en fracciones bien definidas.
temperatura de evaporacin, tomando la precaucin de no Las separaciones electroforticas pueden ser conducidas
exceder el lmite compatible con la estabilidad de la mues- en sistemas sin fase de soporte (por ejemplo, separacin
tra y desecar el residuo hasta peso constante. Calcular la en solucin libre en la electroforesis capilar), y o en me-
composicin de la solucin en cada frasco, en mg/g, por la dios estabilizados como placas de camada fina, pelculas
frmula 1000 (P3 P1)/(P2 -P3), en que P3 corresponde a la o geles.
ELECTROFORESIS DE FRONTERA, O DIVISIN, O debe estar equipada con una tapa hermtica, permitien-
LMITE LIBRE, O EN MOVIMIENTO do mantener en su interior una atmsfera saturada de
unidad y atenuar as, la evaporacin del solvente du-
Ese mtodo es principalmente utilizado en la determina- rante la migracin. Se utiliza un dispositivo de seguri-
cin de movilidades, siendo las caractersticas experimen- dad que corte la corriente, cuando se retira la tapa de la
tales directamente mensurables y reproducibles. Se aplica, cuba. Si la medida de corriente elctrica excede a 10 W
sobretodo, a sustancias de masa moleculares relativamente es preferible enfriar el soporte;
elevadas, poco difusibles. Las divisiones son, inicialmente, un dispositivo de soporte:
marcadas por un proceso fsico como la refractometra o
la conductimetra. Despus de la aplicacin de un campo Electroforesis en tiras. En la electroforesis las tiras en el
elctrico definido, durante un tiempo determinado, se ob- soporte, son previamente impregnadas con la misma solu-
tienen nuevas divisiones y sus respectivas posiciones son cin conductora y cada extremidad sumergida en el com-
observadas. Las condiciones operacionales posibilitan la partimiento del electrodo. Las tiras quedan bien extendidas,
determinacin de las divisiones y de los constituyentes. fijadas sobre un soporte apropiado para evitar la difusin
de la solucin conductora como, por ejemplo, una moldu-
ELECTROFORESIS EN SOPORTE, O ra horizontal, un soporte en V invertido, o una superficie
ELECTROFORESIS DE ZONA uniforme, con puntos de contacto en intervalos adecuados.
Ese mtodo es usado apenas para muestras reducidas. La Electroforesis en gel. En la electroforesis en gel, el dispo-
naturaleza del soporte, como papel, gel de agarosa, acetato sitivo consiste en una placa de vidrio, como, por ejemplo,
de celulosa, almidn, agarosa, metacrilamida o gel mixto, una simple lmina de microscopio, en la cual se deposi-
introduce un nmero de factores adicionales que modifican ta una camada de gel adherente y de espesor uniforme en
la movilidad: toda la superficie de la lmina. El contacto entre el gel y la
5
solucin conductora vara en funcin del tipo del aparato
a) debido a la sinuosidad de la canalizacin del soporte, a utilizado. Se evita cualquier condensacin de humedad o
la distancia aparentemente recorrida que es menor que secado de la camada slida;
la distancia real;
b) ciertos soportes no son eltricamente neutros y, como el un dispositivo de medicin o medios de deteccin.
medio constituye una fase estacionaria, puede algunas
veces originar una considerable corriente electroendos- Procedimiento. Colocar la solucin de electrolito en los
mtica importante; compartimientos de los electrodos. Colocar el soporte,
c) el calentamiento debido al efecto de Joule puede pro- convenientemente embebido con la solucin del electrolito
ducir cierta evaporacin del lquido del soporte, lo que en la cuba, de acuerdo con el tipo de aparato utilizado. Tra-
conduce, por capilaridad, a un desplazamiento de la so- zar la lnea de partida y aplicar la muestra de ensayo. Dejar
lucin de las extremidades para el centro; as, la fuerza pasar la corriente durante el tiempo indicado; enseguida
inica tiende a aumentar progresivamente. desconectar la corriente, retirar el soporte de la cuba, secar
y revelar.
La velocidad de migracin depende de cuatro factores
principales: movilidad de la partcula, corriente de elec- ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA
troendosmtica, corriente de evaporacin e intensidad del EN TUBO CILNDRICO
campo. Por esas razones es necesario proceder en condi-
ciones experimentales bien determinadas y utilizar, si posi- En la electroforesis en gel de poliacrilamida, cilndrico (en
ble, estndares de referencia. tubo) la fase estacionaria es constituida por un gel prepara-
do a partir de acrilamida y de N,N-metilenobisacrilamida.
Aparatos Los geles son preparados en tubos, generalmente con 7,5
cm de largo y 0,5 cm de dimetro interno (gel cilndrico);
Un aparato de electroforesis consta de: una nica muestra es aplicada en cada tubo.
un generador de corriente continua de tensin controla- Aparatos. El aparato es constituido de dos depsitos des-
ble y de preferencia estabilizada; tinados a recibir las soluciones tampn y construidos con
una cuba de electroforesis. Generalmente rectangular, un material apropiado, tal como el polimetacrilato de me-
de vidrio o de material plstico rgido, con dos compar- tilo. Estn dispuestos, verticalmente, uno arriba del otro, y
timientos separados, andico y catdico, que contienen son provistos, cada uno, de un electrodo de platino. Esos
la solucin tampn conductora. En cada compartimien- dos electrodos son ligados a una fuente de corriente posi-
to sumerge un electrodo, de platino o de grafito, esos bilitando operar con intensidad y tensin constantes. Para
estn conectados por medio de un circuito debidamente geles cilndricos, el aparato tiene en la base superior del de-
aislado de la fuente de alimentacin del terminal co- psito un nmero de juntas de elastmero situadas a igual
rrespondiente para formar, respectivamente, el nodo distancia del electrodo.
y ctodo, conectados por un circuito convenientemente
aislado al poste correspondiente del generador. El nivel Procedimiento. De un modo general, se recomienda desga-
del lquido en los dos compartimientos es igual para sificar las soluciones antes de la polimerizacin y utilizar
evitar el efecto de sifonaje. La cuba de electroforesis el gel inmediatamente despus de su preparacin. Preparar
el gel segn las indicaciones de la monografa. Colocar la N,N,N,N- tetrametiletilendiamina (TEMED). El tamao
mezcla de gel en los tubos de vidrio apropiados, cerrados real de los poros de un gel es tan menor cuanto ms elevada
en la extremidad inferior con un tapn, hasta una altura sea su concentracin en acrilamida. Como la concentracin
igual en todos ellos, a la distancia de cerca de 1 cm del de acrilamida del gel aumenta, su porosidad efectiva dis-
borde superior del tubo. Evitar la introduccin de burbujas minuye.
de aire en los tubos. Cubra la mezcla con una camada de
agua a fin de impedir el contacto con el aire y dejar en La porosidad real de un gel es definida de modo operacio-
reposo. La formacin del gel requiere, generalmente, cerca nal por sus propiedades de tamiz molecular, eso es, la resis-
de 30 minutos y est completa cuando aparece una delimi- tencia que l opone a la migracin de las macromolculas.
tacin ntida entre el gel y la camada acuosa. Eliminar la Existen lmites para las concentraciones de acrilamida que
camada acuosa. Llenar el depsito inferior con la solucin pueden ser utilizadas. En concentraciones muy elevadas
tampn, prescrita y retirar los tapones de los tubos. Encajar los geles se deshacen ms fcilmente y se tornan difciles
los tubos en las juntas del depsito superior de modo que de manipular. Cuando el tamao de los poros de un gel
su parte inferior se sumerja en la solucin tampn del de- disminuye, la velocidad de migracin de una protena en
psito inferior y ajuste de forma que el fondo de los tubos ese gel disminuye, tambin. Ajustando la porosidad de un
est inmerso en la solucin tampn del depsito inferior. gel, alterando la concentracin en acrilamida, es posible
Delicadamente llenar los tubos en la solucin del dep- optimizar la resolucin del mtodo para un determinado
sito inferior. Preparar las soluciones problema y estndar producto proteico. de ese modo, las caractersticas fsicas
conteniendo el colorante indicado prescrito. Llenar, cui- de un gel dependen, por tanto, de su tenor en acrilamida
dadosamente, los tubos con la solucin tampn indicada. y en bisacrilamida. Adems de la composicin del gel, el
Aplicar las soluciones, cuya densidad fue aumentada, por estado de la protena constituye otro factor importante para
adicin de sacarosa, por ejemplo, a la superficie del gel, su movilidad electrofortica.
utilizando un tubo diferente para cada solucin. Colocar la
5
misma solucin tampn en el depsito superior. Conectar En el caso de las protenas, la movilidad electrofortica de-
los electrodos a la fuente de corriente y proceder a la elec- pende del pK de los grupos con carga elctrica y del tamao
troforesis, utilizando la corriente de intensidad o de tensin de la molcula. Es igualmente afectada por la naturaleza,
constante y a la temperatura prescrita en la monografa. In- concentracin y pH del tampn, por la temperatura, inten-
terrumpa la corriente cuando el indicador coloreado alcan- sidad del campo elctrico y por la naturaleza del soporte.
ce el depsito inferior. Retirar, inmediatamente, los tubos y
proceder a la extrusin del gel. Localizar la posicin de las ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA
bandas en los electroforetogramas segn el procedimiento EN CONDICIONES DESNATURALIZANTES
indicado.
El mtodo descrito a ttulo de ejemplo es aplicable al an-
ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA lisis de los polipptidos monmeros de masa molecular
CON DODECILSULFATO DE SODIO (DSS-EGPA) comprendida entre 14 000 y 100 000 Dalton. Es posible
ampliar ese intervalo por diferentes tcnicas (por ejemplo,
Campo de aplicacin. La electroforesis en gel de poliacri- por los empleos de geles en gradiente o de sistemas tam-
lamida es utilizada para la caracterizacin cualitativa de pn especiales), pero tales tcnicas no forman parte de este
las protenas contenidas en preparaciones biolgicas, para texto. La electroforesis en gel de poliacrilamida en condi-
controles de pureza y determinaciones cuantitativas. ciones desnaturalizantes usando el dodecilsulfato de sodio
(DSS-EGPA) es la tcnica de electroforesis ms utilizada
Finalidad. El anlisis por electroforesis en gel es un pro- para evaluar la calidad farmacutica de los productos pro-
ceso adaptado a la identificacin y al control de la homo- teicos y es sobre todo el foco de este texto. De modo gene-
geneidad de las protenas contenidas en preparaciones far- ral, la electroforesis analtica de las protenas es realizada
macuticas. Es utilizada como rutina para evaluar la masa en gel de poliacrilamida en condiciones que favorecen la
molecular de las subunidades proteicas y determinar las disociacin de las protenas en sus subunidades polipep-
subunidades que componen las protenas purificadas. En tdicas y que limitan el fenmeno de agregacin. Se utili-
el mercado existe una gran variedad de geles y reactivos za frecuentemente ese efecto del dodecilsulfato de sodio
listos para ser utilizados en vez de los que se describen (DSS) un detergente fuertemente aninico, para disociar
a continuacin, siempre que los resultados obtenidos sean las protenas antes de su aplicacin en el gel, en combina-
equivalentes y que puedan ser satisfechas las condiciones cin con el calor. Los polipptidos desnaturalizados se co-
de validez descritas en Validacin del ensayo. nectan al DSS, adquieren cargas negativas y se caracteriza
por una relacin carga/masa constante cualquiera que sea
Caractersticas de los geles de poliacrilamida el tipo de protena considerada. Siendo la cantidad de DSS
ligada casi siempre proporcional a masa molecular del po-
Las propiedades de tamiz de los geles de poliacrilamida lipptido e independiente de su secuencia, los complejos
estn relacionadas con su estructura particular que es la de DSS-polipptido migran en los geles de poliacrilamida con
una red tridimensional de fibras y poros resultantes de la movilidades que son funcin del tamao del polipptido.
formacin de ligaciones cruzadas entre la bisacrilamida bi-
funcional y las cadenas adyacentes de poliacrilamida. La La movilidad electrofortica de los complejos detergente-
polimerizacin es catalizada por un generador de radica- polipptidos resultantes presenta siempre la misma rela-
les libres compuesto de persulfato de amonaco (PSA) y cin funcional con la masa molecular. La migracin de los
complejos DSS es, como sera de preverse, en direccin damenta en el empleo de un sistema tampn discontinuo
al anodo a la velocidad ms elevada para los complejos que incluye dos geles continuos, pero distintos: un gel (in-
de baja masa molecular del que para los de alta. Es, as, ferior) de separacin o de resolucin y un gel (superior)
posible determinar la masa molecular de una protena a de concentracin. Esos dos geles son de porosidad, pH
partir de su movilidad relativa, despus de comparacin y fuerza inica diferentes. Adems de eso, los diferentes
con soluciones estndar de valor de masa molecular co- iones mviles son usados en los geles y en los tampones
nocida y la observacin de una banda nica constituye un del electrodo. La discontinuidad del sistema tampn con-
criterio de pureza. Todava, las modificaciones eventuales duce a una concentracin de gran volumen de las muestras
en la constitucin del polipptido, por ejemplo, una N- o en el gel de concentracin y, por tanto, a una mejora de
una O-glicosilacin, tienen un impacto significante no ne- la resolucin. Cuando el campo elctrico es aplicado, un
gligenciable sobre la masa molecular aparente de una pro- gradiente de tensin negativo se instaura a travs de la so-
tena, no se liga a una molcula de carbohidratos de forma lucin de la muestra y arrastra las protenas del gel de con-
semejante a un polipptido. Con efecto, el DSS no se co- centracin para el gel de apilamiento. Los iones glicinato
necta de la misma manera a los agrupamientos glucdicos o contenidos en el tampn del electrodo siguen las protenas
a los agrupamientos peptdicos, de modo que la constancia en el gel de apilamiento. Se forma, rpidamente, una zona
de la relacin carga/masa deja de ser verificada. La masa de divisin mvil cuya frente es constituida por los iones
molecular aparente de las protenas que sufrieron modifi- cloruro de alta movilidad y la parte de atrs por los iones
caciones polvos-traslacionales no refleja realmente la masa glicinato ms lentos. Un gradiente de alta tensin localiza-
de la cadena polipeptdica. do se instaura entre las frentes inicas de la cabeza y de la
cola y lleva los complejos DSS-protena a concentrarse en
Condiciones reductoras una banda mucho estrecha que migra entre las fracciones
cloruro y glicinato.
La asociacin de las subunidades polipeptdicas y la es-
5
tructura tridimensional de las protenas se basan, muchas En amplia escala, independientemente del volumen de la
veces, en la existencia de puentes disulfuro. Uno de los ob- muestra aplicada, el conjunto de los complejos DSS-pro-
jetivos a alcanzar en el anlisis DSS- EGPA en condiciones tena sufre un efecto de condensacin y penetra en el gel
reductoras es romper esa estructura por reduccin de los de separacin en la forma de una banda estrecha, bien de-
puentes disulfuro. La desnaturacin y la disociacin com- finida, de alta densidad proteica. El gel de apilamiento, de
pletas de las protenas por tratamiento con 2-mercaptoeta- poros anchos, no retarda, generalmente, la migracin de
nol o con ditiotreitol (DTT) provocan un desdoblamiento las protenas, pero desempea, principalmente, el papel de
de la cadena polipeptdica seguida de una complejacin medio anticonvecitivo. En la interfaz de los geles de api-
con el DSS. En esas condiciones, la masa molecular de las lamiento y de separacin, las protenas son confrontadas
subunidades polipeptdicas puede ser calculada por regre- con un brusco aumento del efecto de ralentizacin debido
sin lineal con la ayuda de estndares de masa molecular al pequeo dimetro de los poros del gel de separacin.
apropiada. Cuando penetran en el gel de separacin, esa ralentizacin
prosigue debido al efecto de tamiz molecular ejercido por
Condiciones no reductoras la matriz. Los iones glicinato pasan a las protenas cuya
migracin prosigue, entonces, en un medio de pH uniforme
Para ciertos anlisis, la disociacin completa de la protena constituido por la solucin tampn de trometamina (TRIS)
en subunidades peptdicas no es deseable. En la ausencia y por la glicina. El efecto de tamiz molecular conduce a
de tratamiento por los agentes reductores, como el 2-mer- una separacin de los complejos DSS-polipptido con base
captoetanol o el DTT, los puentes disulfuro covalentes en su respectiva masa molecular.
permanecen intactas y la conformacin oligomrica de la
protena es preservada. Los complejos DSS- oligmero mi- PREPARACIN DE GELES DE POLIACRILAMIDA
gran ms lentamente que las subunidades DSS-peptdicas. DSS VERTICALES DE TAMPN DISCONTINUO
Adems de eso, las protenas no reducidas pueden no ser,
totalmente, saturadas en DSS y, por consecuencia, no se Montaje del molde
conectan al detergente en una relacin de masa constante.
Esa circunstancia torna la determinacin de la masa mole- Con un detergente suave, limpiar las dos placas de vidrio
cular de esas molculas por el DSS- EGPA ms difcil que (por ejemplo de tamao 10 cm x 8 cm), el peine de polite-
el anlisis de polipptidos totalmente desnaturalizados, trafluoroetileno, los dos separadores y el tubo de caucho de
pues, para que la comparacin sea posible es necesario que silicona (por ejemplo, dimetro de 0,6 mm x 350 mm), y
los estndares y las protenas desconocidas tengan confi- enjuagar, abundantemente, con agua. Secar todos los ele-
guraciones semejantes. No obstante, la obtencin en el gel mentos con servilleta de papel o tela. Lubricar los separa-
de una nica banda coloreada permanece como criterio de dores y el tubo con lubricante que no sea a la base de silico-
pureza. na. Colocar los separadores a 2 mm del borde a lo largo de
los dos lados cortos y de uno de los lados largos de la placa
CARACTERSTICAS DE LA ELECTROFORESIS DE de vidrio. Ese ltimo corresponder al fondo del gel. Co-
GEL EN SISTEMA TAMPN DISCONTINUO menzar a instalar el tubo sobre la placa de vidrio utilizando
un de los separadores como gua. Alcanzada la extremidad
El mtodo electrofortico ms divulgado para la carac- del separador, doblar el tubo con precaucin para hacerlo
terizacin de las mezclas complejas de protenas se fun- seguir el lado largo de la placa de vidrio. Mantenga el tubo
en su lugar con uno de los dedos, dblelo de nuevo para el gel de concentracin (altura de un diente del peine ms
hacerlo seguir el segundo lado corto de la placa, utilizar el 1 cm). Usando una pipeta de vidrio afilada, recubra, con
separador como gua. Colocar la segunda placa en el lugar, precaucin, la solucin con alcohol isobutlico saturado de
alinendola, perfectamente, sobre la primera, y mantenga agua. Dejar polimerizar el gel en posicin vertical, a tem-
el conjunto por presin manual. Colocar dos pinzas en cada peratura ambiente.
uno de los lados cortos del molde y despus, con precau-
cin, cuatro otras pinzas en el lado largo que constituir la Preparacin del gel de apilamiento. Cuando la polimeriza-
base del molde. Verificar si el tubo sigue el borde de las cin termine (cerca de 30 minutos), agotar el alcohol iso-
placas y no se desplaz despus de la colocacin de las pin- butlico y lavar varias veces la superficie del gel con agua
zas. El molde est listo y el gel puede ser colocado en el. para eliminar completamente el alcohol isobutlico y, si ne-
cesario, la acrilamida no polimerizada. Dejar el mnimo de
Preparacin de los geles lquido en la superficie del gel y, eventualmente, absorba
el agua residual con la punta de una servilleta de papel. En
Para los geles del sistema tampn discontinuo, se reco- un matraz, preparar un volumen apropiado de una solucin
mienda colocar primero el gel de separacin y dejarlo po- de acrilamida de concentracin deseada usando los valores
limerizar antes de colocar el gel de concentracin, porque registrados en la
el tenor en acrilamida-bisacrilamida en los dos geles, en el
tampn y del pH es diferente. Antes de juntar la solucin de PSA y de TEMED, filtrar si
necesario, por succin por una membrana de acetato de ce-
Preparacin del gel de separacin. En un matraz prepa- lulosa (dimetro de los poros: 0,45 mantenga bajo succin
rar el volumen apropiado de una solucin de acrilamida de agitando la unidad de filtracin hasta no formar ms bur-
concentracin deseada, usando los valores indicados en la bujas en la solucin. Aadir las cantidades apropiadas de
Tabla 1. Mezclar los componentes por la orden indicada. soluciones de persulfato de amonaco y de TEMED (Tabla
5
Antes de aadir la solucin de persulfato de amonaco y la 2), agitar y aadir, inmediatamente, sobre el gel de sepa-
de tetrametiletilendiamina (TEMED), filtrar, si necesario, racin. Colocar, inmediatamente, en el lugar un peine de
por succin usando una membrana de acetato de celulosa politetrafluoroetileno limpio en la solucin del gel de con-
(dimetro de los poros; 0,45 m); mantenga bajo succin centracin, tomando la precaucin de evitar la formacin
agitando la unidad de filtracin hasta no formar ms bur- de burbujas de aire. Aadir solucin para el gel de con-
bujas en la solucin. Aadir las cantidades apropiadas de centracin para llenar totalmente los intersticios del peine.
solucin de PSA y de TEMED (Tabla 1), agitar e introdu- Dejar polimerizar el gel en posicin vertical, a temperatura
cir, inmediatamente, en el espacio que separa las dos placas ambiente.
de vidrio del molde. Dejar una altura libre suficiente para
Volumen de los componentes en ml por volumen del molde del gel de:
Componentes de la solucin
5 ml 10 ml 15 ml 20 ml 25 ml 30 ml 40 ml 50 ml
6% de Acrilamida
Agua 2,6 5,3 7,9 10,6 13,2 15,9 21,2 16,5
Solucin de acrilamida(1) 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 8,0 10,0
Tris 1,5 M pH 8,8 (2) 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5
(DSS) 100 g/L de Dodecil Sulfato de Sodio(3) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5
(PSA) 100 g/L de Persulfato de Amonaco(4) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5
(TEMED) Tetrametiletilendiamina(5) 0,004 0,008 0,012 0,016 0,02 0,024 0,032 0,04
8% de Acrilamida
Agua 2,3 4,6 6,9 9,3 11,5 13,9 18,5 23,2
Solucin de acrilamida(1) 1,3 2,7 4,0 5,3 6,7 8,0 10,7 13,3
Tris 1,5 M pH 8,8 (2) 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5
(DSS) 100 g/L de Dodecil Sulfato de Sodio(3) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5
(PSA) 100 g/L de Persulfato de Amonaco(4) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5
(TEMED) Tetrametiletilendiamina(5) 0,003 0,006 0,009 0,002 0,005 0,008 0,024 0,03
10% de Acrilamida
Agua 1,9 4,0 5,9 7,9 9,9 11,9 15,9 19,8
Solucin de acrilamida(1) 1,7 3,3 5,0 6,7 8,3 10,0 13,3 16,7
Tris 1,5 M pH 8,8(2) 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5
(DSS) 100 g/L de Dodecil Sulfato de Sodio(3) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5
5
(PSA) 100 g/L de Persulfato de Amonaco(4) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5
(TEMED) Tetrametiletilendiamina(5) 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,002 0,016 0,02
12% de Acrilamida
Agua 1,6 3,3 4,9 6,6 8,2 9,9 13,2 16,5
Solucin de acrilamida(1) 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 16,0 20,0
Tris 1,5 M pH 8,8(2) 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5
(DSS) 100 g/L de Dodecil Sulfato de Sodio(3) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5
(PSA) 100 g/L de Persulfato de Amonaco(4) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5
(TEMED) Tetrametiletilendiamina(5) 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,016 0,02
14% de Acrilamida
Agua 1,4 2,7 3,9 5,3 6,6 8,0 10,6 13,8
Solucin de acrilamida(1) 2,3 4,6 7,0 9,3 11,6 13,9 18,6 23,2
Tris 1,5 M pH 8,8 (2) 1,2 2,5 3,6 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5
(DSS) 100 g/L de Dodecil Sulfato de Sodio(3) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5
(PSA) 100 g/L de Persulfato de Amonaco(4) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5
(TEMED) Tetrametiletilendiamina(5) 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,016 0,02
15% de Acrilamida
Agua 1,1 2,3 3,4 4,6 5,7 6,9 9,2 11,5
Solucin de acrilamida(1) 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 20,0 25,0
Tris 1,5 M pH 8,8 (2) 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5
(DSS) 100 g/L de Dodecil Sulfato de Sodio(3) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5
(PSA) 100 g/L de Persulfato de Amonaco(4) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5
(TEMED) Tetrametiletilendiamina(5) 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,016 0,02
______________
(1) Solucin de acrilamida: acrilamida/bisacrilamida (29:1) a 30% (p/v) SR
(2) Tris 1,5 M pH 8,8: tampn de trisclorhidrato 1,5 M pH 8,8.
(3) DSS 100 g/L: solucin de dodecilsulfato de sodio a 10% (p/v).
(4) PSA 100 g/L: solucin de persulfato de amonio a 10% (p/v). El persulfato de amonio da los radicales libres que inducen la polimerizacin de la
acrilamida y de la bisacrilamida. La solucin de persulfato de amonaco se descompone, lentamente, y es renovada toda semana.
(5) TEMED: N,N,N,N-tetrametiletilendiamina.
Componentes de la solucin 1 ml 2 ml 3 ml 4 ml 5 ml 6 ml 8 ml 10 ml
Agua 0,68 1,4 2,1 2,7 3,4 4,1 5,5 6,8
Solucin de acrilamida(1) 0,17 0,33 0,5 0,67 0,83 1,0 1,3 1,7
Tris M pH 6,8(2) 0,13 0,25 0,38 0,5 0,63 0,75 1,0 1,25
(DSS) 100 g/L de Dodecil Sulfato de Sodio(3) 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,08 0,1
(PSA) 100 g/L de Persulfato de Amonaco(4) 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,08 0,1
(TEMED) Tetrametiletilendiamina(5) 0,001 0,002 0,003 0,004 0,005 0,006 0,008 0,01
______________
(1) Solucin de acrilamida: acrilamida/bisacrilamida (29:1) a 30% (p/v) SR
(2) Tris M pH 6,8: tampn de trisclorhidrato M de pH 6,8.
(3) DSS 100 g/L: solucin de dodecilsulfato de sodio a 10% (p/v).
(4) PSA 100 g/L: solucin de persulfato de amonaco a 10% (p/v). El persulfato de amonaco da los radicales libres que inducen la polimerizacin de la
acrilamida y de la bisacrilamida. La solucin de persulfato de amonaco se descompone, lentamente, y es renovada toda semana.
(5) TEMED: N,N,N,N-tetrametiletilendiamina.
Montaje del gel en el aparato de electroforesis y deteccin de bandas con 10 ng a 100 ng de protena. Todas
separacin electrofortica las etapas de la coloracin de los geles son realizadas a
temperatura ambiente; con agitacin moderada y con mo-
Cuando la polimerizacin termine (cerca de 30 minutos), vimiento orbital en un equipo apropiado. Es necesario el
retirar el peine con precaucin. Lavar los pozos inmedia- uso de guantes para evitar depositar en el gel impresiones
tamente con agua o tampn de electroforesis DSS- EGPA digitales que tambin quedaran coloreadas.
para eliminar la acrilamida eventualmente no polimerizada.
si necesario, enderezar los dientes del gel de apilamiento, Coloracin con azul de Coomassie. Sumergir el gel du-
5
con una aguja hipodrmica, de punta partida, anexada a una rante, por lo menos, una hora en un gran exceso de azul de
jeringa, de uno de los lados cortos de la placa, retirar con Coomassie SR. Eliminar la solucin de coloracin. Sumer-
precaucin el tubo y recolocar las pinzas. Proceda del mis- gir el gel en un gran exceso de solucin de descoloracin
mo modo del otro lado corto y despus en la base del molde. (consiste en una mezcla de 1 volumen de cido actico gla-
cial y 4 volmenes de metanol y 5 volmenes de agua). Re-
Introducir el gel en el aparato de electroforesis. Introducir novar varias veces la solucin de descoloracin hasta que
los tampones de electroforesis en los depsitos superior e las bandas proteicas aparezcan, ntidamente, sobre fondo
inferior. Eliminar las burbujas, eventualmente aprisiona- claro. Cuanto ms fuerte sea la descoloracin del gel, tanto
das, en la base del gel entre las placas de vidrio. Es re- menores cantidades de protenas son detectables por ese
comendable emplear para ese fin una aguja hipodrmica mtodo. Es posible acelerar la descoloracin incorporando
doblada fijada en una jeringa. Nunca establezca tensin en la solucin de descoloracin algunos gramos de resina
elctrica en el gel sin las muestras porque puede destruir de cambio inico o una esponja.
la discontinuidad del sistema tampn. Antes de depositar
la muestra, lave o rellene los pozos con precaucin con Nota: las soluciones cido-alcohlicas utilizadas en ese
tampn de electroforesis DSS-EGPA. Preparar las solucio- mtodo no fijan totalmente las protenas del gel. Puede, por
nes problema y estndar utilizando el tampn para muestra tanto, haber prdida de ciertas protenas de masa molecular
recomendada y tratar como se especifica en la monografa baja durante las operaciones de coloracin y descoloracin
de la sustancia a ser analizada. Aplicar en los pozos del gel de los geles finos. Puede ser conseguida una fijacin per-
de concentracin el volumen apropiado de las diferentes manente colocando el gel durante 1 hora en una mezcla de
soluciones. Proceda a la electroforesis en las condiciones 1 volumen de cido tricloroactico, 4 volmenes de meta-
recomendadas por el fabricante del aparato. Ciertos fabri- nol y 5 volmenes de agua, antes de sumergirse en azul de
cantes de aparatos para DSS- EGPA proveen geles de di- Coomassie SR.
versas superficies y espesores. Para obtener una separacin
ptima, puede ser necesario hacer variar la duracin de la Coloracin con nitrato de plata. Sumergir el gel durante 1
electroforesis y los parmetros elctricos como indicado hora en un gran volumen de solucin de fijacin (consiste
por el fabricante. Verificar que la frente de coloracin se en aadir 0,27 ml de formaldehido en 250 ml de metanol
desplaza en el gel de separacin, ella alcanza la base del y diluir para 500 ml con agua). Eliminar y renovar la solu-
gel, parar la electroforesis. Retirar el molde del aparato y cin de fijacin y dejar incubar durante, por los menos, 1
separar las dos placas de vidrio. Retirar los separadores, hora, o durante toda la noche, se as es ms prctico. Eli-
separar y rechazar el gel de apilamiento y proceder, inme- minar la solucin de fijacin y colocar el gel en un volu-
diatamente, a la coloracin. men en exceso de agua durante 1 hora y, en seguida, su-
mergir durante 15 minutos en solucin de glutaraldehido
DETECCIN DE LAS PROTENAS EN LOS GELES a 1% (v/v). Lavar el gel colocndolo por dos veces en un
volumen excesivo de agua durante 15 minutos y, en se-
La coloracin con azul de Coomassie es el mtodo ms guida, sumergirlo durante 15 minutos, al abrigo de la luz,
corrientemente utilizado para las protenas, con un nivel en nitrato de plata SR1 recientemente preparado. Lavar el
de deteccin de 1 g a 10 g de protena por banda. La gel colocndolo por tres veces en un volumen excesivo de
coloracin con nitrato de plata es el mtodo ms sensible agua durante 15 minutos y, en seguida, sumergirlo durante
para la visualizacin de las protenas en geles; posibilita la cerca de 1 minuto en solucin de desarrollo (consiste en
5
estufa o dejar secar a temperatura ambiente. (adems de la banda principal) que sea ms intensa que la
banda principal del electroforetograma obtenido con la so-
DETERMINACIN DE LA MASA MOLECULAR lucin estndar. Desde que se opere en condiciones valida-
das, es posible cuantificar las impurezas por normalizacin
La masa molecular de las protenas es determinada por con relacin a la banda principal, utilizando un densitme-
comparacin de su movilidad con la movilidad de varios tro integrador. En ese caso, es verificada la linealidad de
marcadores proteicos de peso molecular conocidos. Exis- las respuestas.
ten, para la estandarizacin de los geles, mezclas de prote-
nas de masa molecular exactamente conocida que posibi- 5.2.22.1 ELECTROFORESIS CAPILAR
litan obtener una coloracin uniforme. Tales mezclas estn
disponibles para diferentes bandas de masa molecular. Las Electroforesis capilar (EC) es un mtodo fsico de anlisis
soluciones madre concentradas de las protenas de masa basado en la migracin, dentro de un capilar, de solutos
molecular conocida son diluidas en tampn para muestreo cargados, disueltos en una solucin electroltica, bajo la
apropiada y depositadas en el mismo gel que la muestra influencia de una corriente elctrica. Actualmente, la EC
proteica a ser examinada. Inmediatamente despus de la comprende una familia de tcnicas de separacin electro-
electroforesis, determinar la posicin exacta del colorante cinticas que separan compuestos basada, sobretodo, en la
de marcacin (azul de bromofenol) para identificar el fren- diferencia de movilidad electrofortica, separacin entre
te de migracin de los iones. Para ese efecto, puede cor- fases, punto isoelctrico, tamao molecular, o adems, en
tarse una pequea porcin del borde del gel, o sumergir en la combinacin de una o ms de estas propiedades.
el interior del gel, en el nivel de la frente de migracin del
colorante, una aguja mojada en tinta China. Despus de la PRINCIPIOS GENERALES
coloracin del gel, determinar la distancia de migracin de
cada banda proteica (marcadores y bandas desconocidas) En EC, la separacin es gobernada por dos factores. El
a partir del borde superior del gel de separacin y dividir primero corresponde al movimiento de los solutos en el
cada una de esas distancias de migracin por la distancia capilar debido al campo elctrico (E), tambin denominado
recorrida por el colorante de marcacin. Las distancias de de velocidad electrofortica. El segundo ocurre en funcin
migracin, as, obtenidas son llamadas movilidades relati- del flujo del electrolito debido a la superficie cargada en la
vas de las protenas (en referencia a la frente de coloracin) pared del capilar, siendo llamado de flujo electrosmtico.
y, convencionalmente, representadas por Rf. Construir un La movilidad electrofortica de un soluto (ep) est relacio-
grfico usando los logaritmos de la masa molecular rela- nada a caractersticas especficas como tamao molecular,
tiva (Mr) de los estndares proteicos en funcin de los Rf forma y carga elctrica as como propiedades inherentes al
correspondientes. Los grficos obtenidos son ligeramente electrolito en el cual la migracin ocurre (fuerza inica del
sigmoides. El clculo de las masas moleculares descono- electrolito, pH, viscosidad y presencia de aditivos). Bajo la
cidas puede ser calculado por regresin lineal, o por in- influencia de tensin, los solutos cargados migran a travs
terpolacin a partir de la curva de variacin de log (Mr) del electrolito con una determinada velocidad, Vep, dada en
en funcin del Rf desde que los valores obtenidos para las cm/s, y calculada por la ecuacin:
muestras desconocidas se siten en la parte lineal del gr-
fico.
V = Vep Veo
5
de flujo electrosmtico (FEO) y posee papel importante en donde:
los diversos tipos de EC. l = distancia del terminal de inyeccin del capilar hasta la
ventana de deteccin del capilar (largo efectivo del capi-
El FEO tiene su origen a partir de la ionizacin de los lar);
grupos silanoles en la pared interna del capilar, que son Vep = velocidad electrofortica;
transformados en grupos silanoato (Si-O-), en pH arriba Veo = velocidad del flujo electrosmtico.
de tres. Estos grupos con carga negativa atraen los cationes
del electrolito, formando una camada interna en la pared La reproductibilidad en la velocidad de migracin de los
del capilar. La doble camada formada prxima a la super- solutos est directamente relacionada al mantenimiento de
ficie del capilar es esencialmente esttica. La camada ms un valor constante del flujo electrosmtico entre diferentes
difusa, prxima a la doble camada es mvil y, bajo accin corridas electroforticas. Para algunas aplicaciones espe-
de una tensin elctrica, migra en direccin al ctodo aca- cficas, puede ser necesario reducir el mismo suprimir el
rreando conjuntamente el agua de hidratacin. Entre las flujo electrosmtico a travs de modificaciones en la pared
dos camadas existe un plano de rozamiento y el desequi- del capilar o en la concentracin, composicin y/o pH de la
librio elctrico generado corresponde a la diferencia de solucin electroltica.
potencial que atraviesa las dos camadas, denominada de
potencial zeta (). Despus de introduccin de la muestra en el capilar, cada
soluto de la muestra migra junto al electrolito como una
La velocidad del flujo electrosmtico es dependiente de banda independiente, conforme su movilidad intrnseca.
la movilidad electrosmtica (eo) que, por su vez, est di- Bajo condiciones ideales el nico factor que puede con-
rectamente relacionada a la densidad de carga de la pared tribuir para la ampliacin de la banda es oriundo de la di-
interna del capilar y a las caractersticas del electrolito. La fusin molecular del soluto a lo largo del capilar (difusin
velocidad del flujo electrosmtico (Veo) puede ser calculada longitudinal). En este caso, la eficiencia de la banda est
por la ecuacin: expresada como nmero de bandejas tericas(N) de acuer-
do con la ecuacin:
(ep eo).(VL)
N=
donde 2DL
= constante dielctrica del electrolito;
= potencial zeta de la superficie del capilar; donde:
h = viscosidad del electrolito; D = coeficiente de difusin molecular del soluto en el elec-
V = voltaje aplicada al sistema; trolito;
L = largo total del capilar.
Los dems trminos fueron abordados anteriormente.
Las movilidades electrofortica y electrosmtica de un so-
luto pueden actuar en la misma direccin o en direcciones La separacin entre dos bandas puede ser alcanzada por la
opuestas, dependiendo de la carga (positiva o negativa) del modificacin de la movilidad electrofortica de los solutos,
soluto y de la velocidad del soluto (v), conforme a ecua- por el flujo electrosmtico y por el aumento de la eficien-
cin abajo:
cia de las bandas de cada soluto en anlisis. La resolucin lavado del capilar entre cada corrida a fin de permitir tiem-
puede ser calculada a travs de la ecuacin: pos de migracin reproducibles de los solutos en anlisis.
donde: PRINCIPIO
epb y epa = movilidades electroforticas de dos solutos a
ser separados; En esta tcnica los solutos son separados en un capilar con-
eo = movilidad del flujo electrosmtico teniendo apenas electrolito sin cualquier medio anticon-
ep =movilidad electrofortica media de los solutos (ep- vectivo. El mecanismo de separacin est basado en las
b
+epa)/2 diferencias presentadas por la razn carga / masa de las es-
pecies analizadas que migran como bandas las velocidades
EQUIPO diferenciadas. Los solutos son separados por la combinacin
entre la movilidad electrofortica intrnseca y la magnitud
Un equipo de electroforesis capilar est compuesto por: del flujo electrosmtico en el capilar. Capilares recubiertos
una fuente de alto voltaje; internamente, con reducido flujo electrosmtico, pueden ser
dos depsitos de electrolitos, mantenidos en el mismo utilizados para aumentar la capacidad de separacin de los
nivel, conteniendo soluciones andica y catdica; solutos que adsorben en la superficie del capilar.
dos electrodos (ctodo y anodo), inmersos en los de-
psitos de los electrolitos y conectados a la fuente de La tcnica en solucin libre es adecuada para anlisis de
alto voltaje; solutos de pequea masa molecular (PM < 2000) y elevada
un capilar de slice fundido provisto de ventana de masa molecular (2000 < PM < 100 000). Debido a la alta
deteccin para alineamiento a determinados tipos de eficiencia del sistema, molculas con diferencias mnimas
5
detectores. Los terminales del capilar son inmersos en en su razn masa / carga pueden ser discriminadas. La tc-
los depsitos conteniendo las soluciones electrolticas. nica tambin permite separacin de solutos quirales a tra-
El capilar debe ser llenado con la solucin electroltica vs de la adicin de selectores quirales en el electrolito de
prescrita en la monografa; separacin. La optimizacin de la separacin requiere la
sistema de inyeccin de la muestra de soluto(s) por ac- evaluacin de diferentes parmetros instrumentales y rela-
cin hidrodinmica o electrocintica. La eleccin del cionados a la solucin electroltica.
proceso de inyeccin y su automacin son imprescin-
dibles en el anlisis cuantitativo por electroforesis ca- PARMETROS INSTRUMENTALES
pilar. La introduccin de la muestra por el modo elec-
trocintico debe llevar en consideracin la movilidad Voltaje el tiempo de separacin es proporcional al voltaje
electrofortica intrnseca de cada soluto, permitiendo aplicado. Todava, un aumento en el voltaje usado puede
adecuada discriminacin de los diferentes componen- causar produccin de calor excesivo (efecto Joule), deter-
tes de la muestra; minando elevacin de la temperatura y gradientes de vis-
detector capaz de monitorear la cantidad de solutos que cosidad en el electrolito dentro del capilar, los cuales son
pasan a travs del segmento de deteccin del capilar responsables de la ampliacin de la banda y reduccin en
en intervalo especfico de tiempo. Los detectores ms la resolucin de los solutos en anlisis;
usuales estn basados en espectrofotometra de absor-
cin (UV y UV-VIS) o fluorimetra. Anlisis tambin Polaridad la polaridad del electrodo puede ser normal
pueden ser realizados utilizando detectores electroqu- (anodo en la admisin y ctodo en la salida). En este caso
micos o a travs de la espectrometra de masas; el flujo electrosmtico se mueve en direccin al ctodo. Si
sistema de control de temperatura capaz de mantener- la polaridad del electrodo es revertida, la direccin del flujo
la constante en el interior del capilar. Alteraciones de electrosmtico es contraria a la salida y apenas solutos car-
temperatura implican la falta de reproductibilidad en la gados con movilidad electrofortica superior a la del flujo
separacin de solutos; electrosmtico migran en direccin a la salida;
sistema computadorizado para registro e integracin de
los electroferogramas. Temperatura el principal efecto de la temperatura es ob-
servado en la viscosidad y conductividad elctrica del elec-
La monografa de cada sustancia debe detallar el tipo de trolito. Alteraciones en estas dos propiedades del electro-
capilar, las soluciones electrolticas, el mtodo de pre- con- lito determinan diferencias en la velocidad de migracin;
dicionamiento, las condiciones de la muestra y de la migra-
cin electrofortica. Capilar el largo y dimetro interno influencian parme-
tros analticos como tiempo de migracin total de los so-
La solucin electroltica debe ser filtrada (filtro de 0,45 lutos, eficiencia de las separaciones y capacidad de carga.
m) para retirar partculas y desairada para evitar la for- Bajo voltaje constante, el aumento del largo total y efectivo
macin de burbujas que puedan interferir en el sistema de del capilar puede disminuir la corriente elctrica que, por
deteccin o interrumpir el contacto elctrico en el capilar su vez, determina el aumento en el tiempo de migracin de
durante la migracin electrofortica. Los mtodos electro- los analitos. Capilares con menor dimetro interno poseen
forticos deben establecer un detallado procedimiento de mejor capacidad de disipacin del calor generado por la co-
rriente elctrica (efecto Joule), permitiendo la elevacin de
el voltaje aplicada y reduccin en el tiempo de anlisis. El empleados para esta finalidad. La discriminacin enantiom-
lmite de deteccin del mtodo tambin puede ser influen- rico est regida por diferentes interacciones entre el selector
ciado por el dimetro interno, dependiendo del volumen de quiral y cada uno de los enantimeros del soluto en anlisis.
muestra inyectado y del sistema de deteccin utilizado. La As, la eleccin correcta del selector influencia directamente
eficiencia de las separaciones tambin puede ser aumenta- la resolucin enantiomrico obtenida para solutos quirales.
da por la reduccin del dimetro interno del capilar. Durante el desarrollo de un mtodo para separacin enan-
tiomrico, es recomendable probar ciclodextrinas de diferen-
La adsorcin de componentes de la muestra en la pared tes tamaos de cavidad, (, , ), ciclodextrinas modificadas
interna del capilar puede limitar la eficiencia. Por esta ra- con agrupamientos neutros (metil, etil, hidroxialquil, etc.),
zn, estrategias para evitar estas interacciones deben ser o con agrupamientos ionizables (aminometil, carboximetil,
consideradas en el desarrollo de un mtodo de separacin sulfobutil eter, etc.). La resolucin de separaciones quirales
por electroforesis capilar. Este es un factor crtico, por es igualmente controlada por la concentracin del selector
ejemplo, en muestras conteniendo protenas. Una de estas quiral, de la composicin y pH del electrolito y de la tempe-
estrategias (uso de pH(s) extremos y adsorcin de electro- ratura de anlisis. Aditivos orgnicos como metanol y Urea
litos cargados con carga positiva) requiere la modificacin pueden ser empleados para modificar la resolucin obtenida.
de la composicin del electrolito para prevenir la adsorcin
de las protenas. Alternativamente, es posible recubrir la 5.2.22.1.2 Cromatografa Electrocintica
pared interna del capilar con un polmero a travs de liga- Micelar (CIEN)
ciones covalentes, previniendo la interaccin de protenas
con la superficie de la slice cargada negativamente. Para PRINCIPIO
esta propuesta, capilares con la pared interna previamente
recubierta con polmeros de naturaleza neutro-hidroflica, En la Cromatografa Electrocintica Micelar, la separacin
catinica y aninica son disponibles comercialmente. ocurre en una solucin electroltica que contiene un tensoac-
5
tivo a una concentracin arriba de la concentracin micelar
PARMETROS DE LA SOLUCIN ELECTROLTICA crtica (cmc). Las molculas del soluto son distribuidas entre
el electrolito y la fase pseudoestacionaria compuesta de mi-
Naturaleza del tampn y concentracin Los electrolitos celas, de acuerdo con el coeficiente de particin del soluto.
para electroforesis capilar deben presentar capacidad tampo- Es una tcnica que puede ser usada para separacin de solu-
nante adecuada en la banda de pH escogido y baja movilidad tos neutros e/o ionizados, manteniendo la eficiencia, veloci-
a fin de minimizar la generacin de corriente elctrica. Para dad y adecuabilidad instrumental de la electroforesis capilar.
disminuir la distorsin del pico electrofortico es importante El tensoactivo aninico dodecil sulfato de sodio (DSS) es
combinar la movilidad del ion del electrolito a la movilidad uno de los tensoactivos ms usados en la CEM, a pesar de
del soluto. La eleccin del solvente de la muestra es impor- otros tambin ser utilizados, como, por ejemplo, tensoacti-
tante para alcanzar una uniformidad del soluto el cual per- vos catinicos (sales de cetiltrimetilamonio).
mite el aumento de la eficiencia de separacin y mejora la
deteccin. Adems de eso, un aumento en la concentracin En pH neutro o alcalino, un fuerte flujo electrosmtico es
del electrolito en un pH especfico determina la disminucin generado moviendo los iones del electrolito de separacin
del flujo electrosmtico y de la velocidad del soluto. en la direccin del ctodo. Si DSS fuese utilizado como ten-
soactivo, la migracin electrofortica de la micela aninica
pH del electrolito El pH del electrolito puede afectar la ser en la direccin opuesta, en direccin al anodo. Como
separacin a travs de la modificacin de la carga del so- resultado, la velocidad de migracin micelar total es reduci-
luto o de otros aditivos, as como de la alteracin del flujo da, en comparacin al flujo de la solucin electroltica. En el
electrosmtico. El cambio en el valor del pH del electrolito caso de solutos neutros, una vez que el analito puede estar
arriba o abajo del punto isoelctrico de protenas y ppti- distribuido entre la micela y el electrolito, y no hay movi-
dos influencia la separacin de estos solutos, a travs de la lidad electrofortica, la velocidad de migracin del analito
modificacin de la carga lquida de carcter negativo para depender solamente del coeficiente de separacin entre la
positivo. En general, un aumento en el pH del electrolito micela y el electrolito. En el electroferograma, los picos co-
ocasiona elevacin del flujo electrosmtico. rrespondientes cada soluto neutro estn siempre localizados
entre el marcador de flujo electrosmtico y el de la micela
Solventes orgnicos Solventes orgnicos como metanol, (el tiempo transcurrido entre estos dos picos es llamado de
acetonitrilo entre otros pueden ser aadidos al electrolito ventana de separacin). Para solutos ionizados, la velocidad
acuoso para aumentar la solubilidad del soluto y/o de otros de migracin depende del coeficiente de particin del soluto
aditivos presentes en el electrolito, o adems, influenciar entre la micela y electrolito y de la movilidad electrofortica
el grado de ionizacin de los solutos de la muestra. La adi- del soluto en la ausencia de la micela.
cin de estos solventes en el electrolito generalmente pro-
voca la reduccin del flujo electrosmtico. En la CEM el mecanismo de solutos neutros y levemente
ionizados es esencialmente cromatogrfica. As, la migra-
Aditivos para separaciones quirales Las separaciones cin del soluto y la resolucin pueden ser representadas
enantiomricas deben ser realizadas a travs de la adicin en trminos de factor de retencin del soluto (k), tambin
de selectores quirales al electrolito de corrida. Los selectores denominada de razn de distribucin de masa (Dm), que es
quirales ms utilizados son las ciclodextrinas. Sin embargo, la relacin entre nmero de moles del soluto en el interior
teres corona, polisacridos y protenas tambin pueden ser
de la micela y en la fase mvil. Para una sustancia neutra, k Capilar Las dimensiones del capilar (largo y dimetro
puede ser calculado a travs de la siguiente ecuacin: interno) contribuyen en el tiempo de anlisis y en la efi-
ciencia de las separaciones. Un aumento del largo total y
efectivo del capilar puede disminuir la corriente elctrica
(bajo voltaje constante), aumenta el tiempo de migracin y
mejora la eficiencia de separacin. El dimetro interno del
donde capilar controla la disipacin del calor (en un dado electro-
tR = tiempo de migracin del soluto; lito y corriente elctrica) y consecuentemente la amplia-
t0=tiempo de migracin de un soluto no retenido (determi- cin de las bandas de los solutos.
nado por la inyeccin de un marcador de flujo electrosm-
tico que no se liga a la micela, por ejemplo, metanol); Parmetros de la solucin electroltica
tmc = tiempo de migracin de la micela (determinado por
la inyeccin de un marcador de micela, como Sudan III, el Naturaleza del tensoactivo y concentracin La naturale-
cual migra continuamente asociado a la micela a lo largo za del tensoactivo, de forma anloga a la fase estacionaria
de la migracin electrofortica); en cromatografa, afecta la resolucin, pues modifica la se-
K = coeficiente de particin del soluto; lectividad de la separacin. El log k de una sustancia neutra
VS = volumen de la fase micelar; aumenta linealmente con la concentracin del tensoactivo
VM = volumen de la fase mvil; en la fase mvil. dado que la resolucin en CEM alcanza
un mximo cuando k presenta valor prximo a la
Igualmente, la resolucin entre 2 picos adyacentes (Rs) est
dada por: tmc/t0
5
en la fase mvil determinan alteraciones en la resolucin
de las bandas.
De forma similar, sin embargo no idntica, las ecuaciones Solventes orgnicos solventes orgnicos (metanol, propa-
dan los valores de k y Rs para solutos con carga. nol, acetonitrilo) pueden ser aadidos a la solucin electro-
ltica para mejorar la separacin de solutos hidrofbicos. En
OPTIMIZACIN general, la adicin de estos modificadores reduce el tiempo
de migracin y la selectividad de la separacin. El porcen-
El desarrollo de mtodos por CEM envuelve parmetros tual de solvente orgnico adicionado debe llevar en consi-
instrumentales y de la solucin electroltica: deracin la concentracin micelar crtica del tensoactivo,
teniendo en vista que valores excesivos pueden afectar, o
Parmetros instrumentales tambin, inhibir el proceso de formacin de las micelas y,
por consiguiente, la ausencia del fenmeno de particin. La
Voltaje El tiempo de separacin es inversamente propor- disociacin de micelas en la presencia de porcentuales ele-
cional al voltaje aplicado. Todava, un aumento en el volta- vados de modificador no significa necesariamente mejores
je puede causar produccin excesiva de calor, elevando los resultados en la separacin. En determinadas situaciones, la
gradientes de temperatura y viscosidad del electrolito en la interaccin hidrofbica entre el monmero del tensoactivo
seccin transversal del capilar. Este efecto puede presentar y solutos neutros forman complejos solvofbicos que puede
impacto relevante en electrolitos que presenten mayor con- ser separados electroforticamente.
ductividad como aquellos que contienen sistemas micela-
res. Los sistemas que presentan menor capacidad de disi- Modificadores para separaciones quirales la separacin de
pacin del calor determinan la ampliacin de las bandas y enantimeros en CEM puede ser obtenida a travs de la inclu-
menor resolucin entre los picos. sin de selectores quirales al sistema micelar, ligados covalen-
temente al tensoactivo o aadidos al electrolito de separacin.
Temperatura Alteraciones en la temperatura del capi- Micelas que poseen ligaciones con propiedades de discrimi-
lar afectan el coeficiente de particin del soluto entre el nacin quiral incluyen sales de N-dodecanoyl- L aminoci-
electrolito y las micelas, la concentracin micelar crtica dos, sales biliares, entre otros. La resolucin quiral tambin
y la viscosidad del electrolito. Estos parmetros influen- puede ser obtenida a travs de selectores quirales, tales como
cian directamente en el tiempo de migracin de los solutos las cidodextrinas, adicionadas directamente a las soluciones
durante la separacin electrofortica. La utilizacin de un electrolticas que contienen tensoactivos no quirales.
adecuado sistema de refrigeracin aumenta la reproducti-
bilidad del tiempo de migracin de los solutos.
Otros aditivos La selectividad puede ser modificada a tR = Tiempo de migracin o distancia de lnea de base a
travs de varias estrategias, por adicin de sustancias qu- partir del punto de inyeccin hasta la lnea perpendicular
micas al electrolito. La adicin de diversos tipos de ciclo- del punto mximo del pico correspondiente al componente.
dextrinas al electrolito tambin puede ser utilizada para Wh = Ancho del pico a media altura
reducir interaccin de solutos hidrofbicos con la micela,
aumentando as la selectividad para este tipo de soluto. Resolucin
La adicin de sustancias capaces de modificar las interac- A resolucin (Rs) entre picos de alturas similares de 2 com-
ciones soluto-micela por adsorcin en esta ltima ha sido ponentes puede ser calculada usando a expresin:
usada para aumentar la selectividad de las separaciones en
CEM. Estos aditivos pueden ser un segundo tensoactivo
(inico o no inico) que origina mezcla de micelas o catio-
nes metlicos que disuelven la micela formando complejos
de coordinacin con los solutos. donde:
tR1 y tR2 = tiempos de migracin o distancias de la lnea de
CUANTIFICACIN base a partir del punto de inyeccin hasta a lnea perpendi-
cular del punto mximo de dos picos adyacentes
Las reas de los picos deben ser divididas por el tiempo de wh1 y wh2 = largura de los picos a la media altura
migracin correspondiente para suministrar el rea correc-
ta con el objetivo de: Cuando apropiado, la resolucin puede ser calculada a tra-
vs de la medida de la altura del valle (Hv) entre 2 picos par-
compensar el desplazamiento en el tiempo de migra- cialmente resueltos en una preparacin estndar y la altura
cin entre corridas, reduciendo as la variacin de la del pico menor (Hp), calculando la razn pico/valle (p/v):
5
respuesta;
compensar las diferentes respuestas de los componen- p Hp
=
tes de la muestra con diferentes tiempos de migracin. v Hv
Factor de simetra
Cuando un estndar interno es utilizado, se debe verificar
si ningn pico de soluto a ser analizado presenta sobrepo- El factor de simetra (Las) de un pico puede ser calculado
sicin al pico del estndar interno. usando a expresin:
CLCULOS w0,05
As =
2d
El tenor del componente (o componentes) en anlisis debe donde:
ser calculado a partir de los valores obtenidos. Cuando w0 05 = largura del pico determinada a 5% del valor de la
prescritos, el tenor porcentual de uno o ms componentes altura; d = distancia entre la lnea perpendicular del pico
de la muestra a ser analizada es calculado por la determi- mximo y la tangente del pico a 5% de la altura del pico.
nacin del rea corregida (s) del pico (s) como un porcen-
taje del total de las reas corregidas de todos los picos, Pruebas para repetibilidad de rea (desvo estndar de las
excluyendo aquellos resultantes de solventes o reactivos reas o de la razn rea / tiempo de migracin) y para re-
aadidos (proceso de normalizacin). Es recomendable la petibilidad del tiempo de migracin (desvo estndar del
utilizacin de un sistema de integracin automtica (inte- tiempo de migracin) son introducidos como parmetros
grador o sistema de adquisicin y procesamiento de datos). de adecuabilidad. La repetibilidad del tiempo de migracin
da una prueba para adecuabilidad de procedimientos de
ADECUABILIDAD DEL SISTEMA lavado del capilar. Una prctica alternativa para evitar la
falta de repetibilidad del tiempo de migracin es usar el
Los parmetros de adecuabilidad del sistema son emplea- tiempo de migracin relativo a un estndar interno.
dos para verificar el comportamiento del mtodo por elec-
troforesis capilar. La eleccin de estos parmetros depende Un prueba para verificar la razn seal/ruido de una pre-
del tipo de Electroforesis Capilar utilizado. Los factores paracin estndar (o la determinacin del lmite de cuan-
son: factor de retencin (k) (apenas para cromatografa tificacin) tambin puede ser til para determinacin de
electrocintica micelar), nmero aparente de bandejas sustancias relacionadas.
tericas(N), factor de simetra (As) y resolucin (Rs). Las
ecuaciones que permiten calcular los valores de N y Rs a Proporcin seal: ruido
travs de los electroferogramas son suministradas abajo.
Los lmites de deteccin y cuantificacin corresponden a la
Nmero aparente de bandejas tericas razn seal : ruido de 3 y 10, respectivamente.
5
principales objetivos moleculares como protenas, cidos diferentes velocidades y/o constantes de reaccin para los
nucleicos y polisacridos son quirales. Por ejemplo, los enantimeros ya que los estados de transicin reacionales
enantimeros del ter metlico del levorfanol, el dextrome- son diastereoisomricos lo que puede resultar en proporcin
torfano y el levometorfano, son utilizados diferentemente diferente de la composicin enantiomrico inicial.
en la teraputica. Mientras el dextrometorfano es indicado
como antitusivo, el levometorfano es indicado como anal- En el mtodo directo, la mezcla de enantimeros a ser re-
gsico. suelta es inyectada directamente en el cromatgrafo. Para
la separacin de los enantimeros se puede utilizar una
Debido al reconocimiento de la importancia del uso clnico FEQ, o un solvente quiral, o una fase mvil con aditivo
de frmacos enantiomricamente puros en el tratamiento quiral. La resolucin ocurre debido a la formacin de com-
de diversas enfermedades, las industrias farmacuticas son plejos diastereoisomricos entre la mezcla enantiomrica
incentivadas constantemente a disponer frmacos resueltos y el selector quiral utilizado para la resolucin. El uso de
en cantidades industriales. FEQ es hoy el mtodo ms empleado para resolucin por
CLAE.
Para garantizar la seguridad y la eficiencia de los frmacos
disponibles y en desarrollo, es necesario resolver los enan- En las tablas a continuacin (Tablas 1, 2, 3, 4 y 5) son pre-
timeros y examinar cada uno cuanto a las actividades far- sentadas las principales clases de fases estacionarias utili-
macolgicas y toxicolgicas. Despus de la identificacin zadas para la resolucin de mezclas racmicas y algunos
del enantimero ms activo (eutmero) se debe evaluar el ejemplos de selectores quirales en cada clase. Consultar el
exceso enantiomrico del eutmero desde la sntesis hasta fabricante para la indicacin del uso de cada selector.
el consumo para garantizar la calidad del medicamento.
Tabla 1 - Fases estacionarias quirales del tipo Pirkle.
SEPARACIN Y DETERMINACIN ENANTIOMRI-
CO DE FRMACOS Discriminador quiral*
(R)-DNB-fenilglicina
La separacin, o resolucin, de enantimeros por croma- (S)-DNB-fenilglicina
tografa a lquido de alta eficiencia (CLAE) comenz a ser (R)-DNB-leucina
aplicada desde los aos sesenta. En los aos setenta, con el (S)-DNB-leucina
aparecimiento de las columnas de pequeas partculas para Fosfonato de dimetilo de DNB-a-amino-2,2-dimetil-4-
cromatografa a lquido, se incluy el desarrollo de las fases pentenila
estacionarias quirales para resolucin de frmacos racmicos. DNB-tetraidrofenantreno
Naftiletilamida
La CLAE es considerada una de las tcnicas ms eficientes ______________
para separacin, deteccin y cuantificacin de frmacos. El La mayora das columnas do tipo Pirkle son disponibles en las dos formas
enantiomricas.
Tabla 2 - Fases estacionarias quirales del tipo protena. Las conductividades combinadas de los iones intrnsecos
secos y de los iones externos varan en funcin del pH y
Discriminador quiral son la base para las especificaciones de la conductividad
a1-Glicoprotena cida descritas en la tabla 3 y empleadas cuando realizada la eta-
Albumina srica bovina pa 3 de la prueba. Dos etapas preliminares son incluidas en
Albumina srica humana esta prueba. Si las condiciones de la prueba y los lmites de
Celobioidrolase I conductividad son atendidos en cualquiera de estas etapas
Pepsina preliminares (Etapas 1 y 2), el agua satisface las exigencias
Ovomucoid de esta prueba y no es necesaria la aplicacin de la Etapa
3. Solamente en el caso de que la muestra no obedezca a
Tabla 3 - Fases estacionarias quirales del tipo cavidad o inclusin. las exigencias de la Etapa 3, el agua es juzgada como no
conforme con los requisitos de la prueba de conductividad.
Discriminador quiral
-Ciclodextrina INSTRUMENTACIN Y PARMETROS OPERACIO-
b-Ciclodextrina NALES
g-Ciclodextrina
O-(S)-2-Hidroxipropil-b-ciclodextrina La conductividad del agua debe ser medida usando instru-
O-(R/S) 2-Hidroxipropil-b-ciclodextrina mentos calibrados con resolucin de 0,1 S/cm. El term-
O-(S)-Naftiletilcarbamoil-b-ciclodextrina metro debe tener divisiones de 0,1 C y cubrir la banda de
23 a 27 C. Los electrodos deben ser mantenidos conforme
Tabla 4 - Fases estacionarias quirales del tipo carbohidratos. la recomendacin del fabricante del aparato.
Discriminador quiral La constante de conductividad de la clula es un factor
5
Tris (dimetilfenilcarbamoil) celulosa usado como multiplicador para los valores de la escala del
Tris (4-metilbenzoato) celulosa conductivmetro.
Tris (fenilcarbamoil) celulosa
Triacetato de celulosa Constante de la clula: el valor debe ser conocido en 2%.
Tribenzoato de celulosa Generalmente clulas de conductividad presentan constan-
ter tribenzlico de celulosa te de 0,1 cm-1, 1 cm-1 y 2 cm-1. La mayora de los equi-
Tricinamato de celulosa pos presenta la constante de la clula definida. Es necesario
comprobar esa constante con solucin de KCl de referencia
Tabla 5 - Fases estacionarias quirales del descrita en la Tabla 1. Normalmente la verificacin es rea-
tipo antibiticos macrocclicos. lizada utilizando solamente una solucin de referencia; en
ese caso utilizar la solucin de referencia de menor con-
Discriminador quiral ductividad. Sin embargo, es recomendable medir peridi-
Vancomicina camente la conductividad de los dems estndares y obser-
Teicoplanina var la concordancia entre la lectura del conductivmetro y
Ristocetina el valor nominal de cada solucin de referencia.
Solucin Y (0,0001 M): pipetear 5 ml de la Solucin A para las exigencias para la conductividad. Sin embargo, si el
baln volumtrico de 500 ml y completar con agua. valor medido es mayor que el de la tabla, proceder a la
determinacin de acuerdo con la Etapa 2.
Nota 1: para el preparado de las soluciones arriba utilizar
siempre agua exenta de dixido de carbono, o sea, con con- Tabla 2 - Valores lmites para conductividadde
ductividad inferior a 0,10 S.cm-1. acuerdo con la temperatura (solamente para valores de
conductividad sin compensacin de temperatura).
Nota 2: no utilizar compensacin de temperatura y mante-
ner las soluciones de referencia a 25 C durante la lectura. Temperatura (C) Conductividad (pS/cm)
0 0,6
Tabla 1 - Conductividad de las soluciones 5 0,8
de cloruro de potasio (25C). 10 0,9
15 1,0
Concentracin Conductividad
Solucin 20 1,1
(mol/L) S/cm
30 1,3
A 0,01 1412 35 1,4
B 0,005 717,5 40 1,5
C 0,001 146,9 45 1,7
D 0,0005 73,9 50 1,8
E 0,0001 14,9 55 1,9
60 2,1
PROCEDIMIENTO
65 2,2
70 2,4
5
El procedimiento escrito a continuacin es establecido
para medidas de agua purificada y agua para inyectables. 75 2,5
80 2,7
Alternativamente la Etapa 1 puede ser realizada (con modi- 85 2,7
ficaciones) apropiadas de acuerdo en el tem 1 de la Etapa 90 2,7
1) usando instrumentos de tipo en lnea que hayan sido 95 2,9
calibrados apropiadamente, cuyas constantes de clula ha- 100 3,1
yan sido exactamente determinadas y cuyas funciones de
compensacin de termperatura hayan sido desabilitadas. Etapa 2
La adecuabilidad de tales instrumentos en lnea para 1. Transferir cantidad suficiente de agua (100 ml o ms)
prueba de control de calidad es tambin dependiente de la para recipiente apropiado y agitar a muestra. Ajustar a
localizacin en el sistema de agua. Evidentemente, el posi- (25 1) C y agitar la muestra vigorosamente obser-
cionamiento del instrumento precisa reflejar la calidad del vando peridicamente la lectura del conductivmetro.
agua que ser usada. Cuando el cambio en la conductividad debido a la ab-
sorcin de dixido de carbono atmosfrico es menor
Etapa 1 que 0,1 S/cm por 5 minutos, registrar la conductivi-
dad.
1. Enjuagar la clula por lo menos con tres porciones de
la muestra. 2. Si la conductividad no es mayor que 2,1 S/cm, el agua
obedece a las exigencias para la prueba de conductivi-
2. La determinacin debe ser realizada en recipiente apro- dad. Si la conductividad es mayor que 2,1 S/cm, pro-
piado o como determinacin en lnea. El valor obte- ceder conforme la Etapa 3.
nido debe ser inferior a 1,3 S/cm, en la temperatura de
25,0 C + 0,1 C. Etapa 3
3. En la tabla 2, localizar el valor de la temperatura ms Realizar este prueba como mximo 5 minutos despus de
prxima y menor que la temperatura en la cual la con- la Etapa 2 con la misma muestra mantenindola a tempera-
ductividad fue medida. El valor de conductividad co- tura de (25 1) C. Aadir solucin saturada de cloruro de
rrespondiente a esa temperatura es el lmite. (No inter- potasio (0,3 ml para 100 ml de muestra) y determinar el pH
polar) con precisin de 0,1 unidad de acuerdo con Determinacin
del pH (5.2.19). Utilizando la Tabla 3 determinar el valor
4. Si el valor de conductividad medido no es mayor que lmite para la conductividad de acuerdo con el pH.
el valor correspondiente en la Tabla 2, el agua atiende a
Tabla 3 - Valores lmites de conductividad de acuerdo Si el valor de conductividad medido no es mayor que el
con el pH (solamente para muestras mantenidas valor correspondiente en la Tabla 4, el agua ultrapurificada
en atmsfera y temperatura equilibradas). atiende a las exigencias para la conductividad.
pH Conductividad (pS/cm) Tabla 4 - Valores lmites para conductividad de
5,0 4,7 acuerdo con la temperatura (solamente para valores de
5,1 4,1 conductividad sin compensacin de temperatura).
5,2 3,6
Temperatura (C) Conductividad (pS/cm)
5,3 3,3
5,4 3,0 0 0,012
5,5 2,8 5 0,017
5,6 2,6 10 0,023
5,7 2,5 15 0,031
5,8 2,4 20 0,042
5,9 2,4 25 0,055
6,0 2,4 30 0,071
6,1 2,4 35 0,090
6,2 2,5 40 0,113
6,3 2,4 45 0,140
6,4 2,3 50 0,171
6,5 2,2 55 0,207
6,6 2,1 60 0,247
65 0,294
5
6,7 2,6
6,8 3,1 70 0,345
6,9 3,8 75 0,403
7,0 4,6 80 0,467
85 0,537
Despus de determinado el pH y establecido el lmite de 90 0,614
acuerdo con la Tabla 3, el agua atiende la prueba si la con- 95 0,696
ductividad medida en la Etapa 2 no es mayor que ese lmi- 100 0,785
te. Si la conductividad fuese mayor o el valor del pH est
fuera de la banda de 5 a 7, el agua no atiende la prueba para 5.2.25 LIMPIDEZ DE LQUIDOS
conductividad.
PROCEDIMIENTO
AGUA ULTRAPURIFICADA
Utilizar tubos de vidrio neutro, incoloro y transparente, con
Para el agua ultrapurificada, en general los conductivmetros fondo chato y de 15 a 25 mm de dimetro interno, a me-
o resistivmetros instalados en los equipos de purificacin de nos que indicado de manera diferente en la monografa.
agua poseen un circuito de compensacin de la temperatura Introducir, en tubos separados, el lquido en examen y la
para 25,0 C y dan la lectura directa. Esos equipos deben ser suspensin de referencia indicada en la monografa, pre-
calibrados peridicamente. La conductividad del agua ultra- parndola por ocasin del uso, conforme especificado en
purificada debe ser 0,055 S/cm a 25,0 C (resistividad > la Tabla 1. El lquido en examen y la suspensin de refe-
18,0 M.cm) para una aplicacin especfica. rencia deben alcanzar, en los tubos, una altura de 40 mm.
Cinco minutos despus del preparado de la suspensin de
Alternativamente, caso el equipo no proporcione la lectura referencia, comparar el contenido de los tubos, observn-
directa de la conductividad, proceder conforme a continua- dolos, verticalmente, bajo luz visible difusa y contra fondo
cin: negro. La difusin de la luz debe ser tal que la suspensin
1. Enjuagar la clula con por lo menos tres porciones de de referencia I sea fcilmente distinguida del agua y de la
la muestra. suspensin de referencia II.
2. Determinar simultneamente la temperatura y la con- Un lquido es considerado lmpido cuando, al ser examina-
ductividad del agua sin compensacin automtica de do en las condiciones anteriormente descritas, su transpa-
la temperatura. La determinacin debe ser realizada en rencia corresponde a la del agua o a la del solvente utiliza-
recipiente apropiado o como determinacin en lnea. do, o cuando su opalescencia no es ms pronunciada que la
El valor obtenido debe ser inferior a 0,055 S/cm, en la de la suspensin de referencia I.
temperatura de 25,0 C + 0,1C.
Estndar de opalescencia
3. En la Tabla 4, localizar el valor de temperatura ms
prximo y menor que la temperatura en la cual la con- Disolver 1 g de sulfato de hidracina en agua y completar el
ductividad fue medida. El valor de conductividad corres- volumen para 100 ml con el mismo solvente. Dejar en repo-
pondiente a esa temperatura es el lmite. (No interpolar) so por 4 a 6 horas. Aadir 25 ml de esa solucin a una so-
5
El ttulo alcohomtrico volumtrico de una mezcla de agua ciertos casos, el aparato puede ser asociado a un sistema
y alcohol est expresado por el nmero de volmenes de que posibilita detectar y analizar los productos voltiles.
etanol a 20 C contenido en 100 volmenes de esa mezcla
a misma temperatura. Est expresado en % (v/v). Calibracin y/o comprobacin de la termobalanza. Transfe-
rir una cantidad adecuada de oxalato de calcio monohidrata-
El ttulo alcohomtrico ponderal est expresado por la re- do SQR en el porta muestra. La termobalanza indicar con
lacin entre la masa de etanol contenida en una mezcla de gran precisin y exactitud su masa. Emplear la razn de ca-
agua y etanol y la masa total de esta. Est expresado en % lentamiento de 10 C/min y calentar la muestra hasta 900 C.
(m/m). Al finalizar el proceso trmico registrar: i) la curva termo-
gravimtrica (TG) marcando la temperatura en el eje de las
El alcohol etlico contiene, como mnimo, 95,1% (v/v) co- abscisas (valores crecientes de la izquierda para la derecha)
rrespondiendo a 92,55% (m/m) y, como mximo, 96,9% y la masa porcentual de la muestra en el eje de las ordenadas
(v/v) correspondiendo a 95,16% (m/m) de C2H6O a 20 C. (valores crecientes de abajo para arriba); ii) la curva termo-
El alcohol etlico absoluto contiene, como mnimo, 99,5% gravimtrica derivada (DTG), derivada primera de la curva
(v/v) correspondiendo a 99,18% (m/m) de C2H6O a 20 C. TG, que posibilita definir mejor donde se inici y finaliz la
Esos valores pueden ser observados en la tabla alcohom- prdida de masa. Determine en el grfico la distancia entre
trica (Anexo D). los estndares inicial y final de la curva masa- temperatura,
distancia que representa la prdida de masa de la muestra en
DETERMINACIN DEL GRADO ALCOHLICO O el dado intervalo de temperatura. Las prdidas de masas de-
TTULO ALCOHOMTRICO claradas del oxalato de calcio monohidratado SQR son cal-
culadas, estequiomtricamente, a partir de las tres etapas de
El alcohmetro centesimal se destina a la determinacin del prdidas de masas debido a las sucesivas liberaciones de: a)
grado alcohlico de las mezclas de agua y alcohol indicando H2O; b) CO; c) CO2. La verificacin de la escala de la tem-
solamente la concentracin del alcohol en volumen y expre- peratura puede ser realizada utilizando la tcnica del gancho
sado por su unidad de medida, grado Gay-Lussac (G.L.). metlico fundible (In, Pb, Zn, Al, Ag y Au) de acuerdo con
las indicaciones del fabricante.
Las determinaciones del alcohmetro son exactas sola-
mente para la mezcla de agua y alcohol a 20 C, en la cual Procedimiento
el instrumento fue graduado. Si la temperatura durante el
ensayo fuese inferior o superior a 20 C se torna necesario Utilizar el mismo mtodo descrito para calibracin y/
corregir la temperatura del alcohol para 20 C. o comprobacin adicionando una cantidad adecuada de
muestra. Las curvas TG y DTG ilustradas en la Figura 1
La determinacin del grado alcohlico de las mezclas de indican una etapa de prdida de masa de la muestra. En la
agua en volumen es realizada por el alcohmetro. curva DTG, se observa que entre los puntos ab se sita el
nivel inicial. La prdida de masa se inicia en el punto b y se
Para la determinacin del grado alcohlico de las mezclas de finaliza en el punto c. Entre los puntos cd se sita el nivel
agua y alcohol en masa, puede ser utilizado el mtodo de la final. El intervalo bc corresponde al intervalo reaccional.
densidad relativa o verificada a graduacin en la tabla alco- Para calcular la prdida de masa de la muestra en la curva
homtrica despus de la determinacin por el alcohmetro. TG, se utiliza la comparacin con la curva DTG para ma-
yor precisin en la localizacin de los puntos b y c. Trazar nes de entalpa; las cambios de calor especfico y la tem-
las prolongaciones de los estndares inicial y final de la peratura de eventos endo y exotrmicos. De acuerdo con
curva TG en el eje de las ordenadas utilizando los puntos b el mtodo de medicin utilizado, hay dos modalidades: el
y c. La distancia medida corresponde a la prdida de masa DSC con compensacin de potencia y el DSC con flujo de
(m) de la muestra. Las proyecciones de los puntos b y c calor.
en el eje de abscisas corresponden, respectivamente, a la
temperatura inicial (Ti) y final (Tf) de la prdida de masa. APARATOS
Registrar el resultado en porcentaje de la relacin m/m.
El DSC con compensacin de potencia es constituido por
Nota 1: es necesaria la obtencin de una curva del ensayo una clula calorimtrica que contiene dos hornos, uno para
en blanco (calentamiento en las mismas condiciones el material de referencia y el otro para la muestra. El DSC
experimentales emplendose el porta muestra vaco) antes con flujo de calor se constituye por una clula calorimtri-
del ensayo de la muestra para sustraccin de lnea base. ca conteniendo un nico horno que dispone de un sensor
calorimtrico para la referencia y muestra. Los equipos
Nota 2: en el caso de la utilizacin frecuente del aparato, comportan un dispositivo de programacin controlada de
realizar, regularmente, la verificacin y/o calibracin. En la temperatura, uno o varios detectores trmicos y un sis-
caso contrario, realizar esas operaciones antes de cada tema de registro que puede ser asociado a un sistema de
determinacin. tratamiento de datos. Las determinaciones son efectuadas
bajo atmsfera especificada.
5
rial certificado apropiado de acuerdo con las indicaciones
del fabricante. Para el ajuste de la linealidad, se utiliza una
combinacin de dos metales como el indio y el zinc para la
comprobacin del eje de temperatura.
PROCEDIMIENTO
(To Tm) Hf
X2 =
RTo2 (Ecuacin 1)
5
cin de la temperatura de transicin vtrea; evaluacin de
polimorfismo, construccin de diagrama de fases, determi- Sustituyendo los valores experimentales obtenidos para To
nacin de la pureza (excepto las sustancias amorfas, los Tm, AHf y To en la ecuacin 1 es posible calcular la frac-
polimorfos inestables en la banda de la temperatura expe- cin molar de las impurezas en la muestra.
rimental, los compuestos que funden con descomposicin
trmica y las sustancias que poseen pureza inferior a 95%). 5.2.28 DETERMINACIN DE LA
Determinacin de pureza OSMOLALIDAD
El mtodo es basado en el hecho de que la presencia de pe- Osmolalidad es una forma prctica que da una medida total
queas cantidades de impurezas en un dato material dismi- de la contribucin de varios solutos presentes en la solu-
nuye su punto de fusin y alarga su banda global de fusin. cin por la presin osmtica de la solucin. Una aceptable
La Figura 3 ilustra ese comportamiento para tres muestras aproximacin de la osmolalidad en solucin acuosa est
hipotticas, una de ellas es la estndar y las otras dos con- dada por: m = vm , si el soluto no es ionizado, v= 1; sin
tienen pequeas cantidades de impurezas. embargo v es el nmero total de iones siempre presente
o formado por la lisis de la solucin de una molcula de
soluto; m = molaridad de la solucin, que es el nmero
de moles del soluto por kilogramo de solvente; = coe-
ficiente osmtico molar el cual es cuantificado de la inte-
raccin entre iones de la carga opuesta de la solucin. Es
dependiente del valor de m. Si la complejidad de la solu-
cin aumenta, comienza a ser difcil de medir. La unidad
de osmolalidad es osmol por kilogramo (osmol/ kg), pero
el submltiplo miliosmol por kilogramo (mosmol/ kg) es
normalmente usado.
la disminucin de la temperatura o directamente en la os- 50 a 250 L de la muestra a ser analizada; transferir para
molalidad; y debe ser incluido un recurso para homogenei- la clula de medicin e iniciar el sistema de enfriamiento.
zar la solucin. Normalmente, un dispositivo de homogeneizar es progra-
mado para operar la temperatura abajo de la esperada de la
PROCEDIMIENTO disminucin crioscpica para prevenir sper enfriamiento.
Un dispositivo indica cuando el equilibrio es alcanzado.
Preparar la solucin referencia conforme descrito en la Antes de cada medicin limpiar la clula de medicin con
Tabla 1. Determinar el cero del equipo usando Agua. Ca- la solucin a ser examinada.
librar el equipo usando la solucin de referencia: pipetear
Tabla 1 - Informaciones para preparar la solucin de referencia para la calibracin del Osmmetro.
Masa en g de la
Osmolaridad real Osmolaridad ideal Coeficiente Disminucin
solucin de Cloruro de
(mosmol/kg) (mosmol/kg) osmtico molal crioscpica (C)
sodio por kg de agua
3,087 100 105,67 0,9463 0,186
6,260 200 214,20 0,9337 0,372
9,463 300 323,83 0,9264 0,558
12,684 400 434,07 0,9215 0,744
15,916 500 544,66 0,9180 0,930
19,147 600 655,24 0,9157 1,116
22,380 700 765,86 0,9140 1,302
5
Realizar la misma operacin con la muestra prueba. Leer 5.2.29.3 DETERMINACIN DE LA
directamente la osmolalidad o calcular por la medicin de TEMPERATURA DE SOLIDIFICACIN
la disminucin del punto de congelamiento. La prueba es
considerada vlida cuando el valor encontrado est entre SEPARACIN DE LOS CIDOS GRASOS
dos valores de la escala de calibracin.
Transferir 75 ml de solucin de hidrxido de potasio en
5.2.29 ENSAYOS FSICOS glicerol (25 g de hidrxido de potasio en 100 ml de glice-
rol) para vaso de precipitados de 1000 ml y calentar a 150
Y FSICO QUMICOS PARA C. Aadir 50 ml de muestra tratada conforme indicado
GRASAS Y ACEITES en la monografa especfica y proseguir el calentamiento
bajo agitacin. La temperatura no debe ultrapasar 150 C.
5.2.29.1 DETERMINACIN DE LA La saponificacin es dada por concluida cuando la mezcla
DENSIDAD RELATIVA presenta homogeneidad, sin vestigios de material particu-
lado. Transferir la mezcla para otro vaso de precipitados de
Proceder conforme descrito en Determinacin de la densi- 1000 ml, conteniendo 500 ml de agua casi hirviendo. Jun-
dad de masa y densidad relativa (5.2.5). tar, lentamente, 50 ml de solucin de cido sulfrico 25%
(v/v) y calentar, bajo agitacin, hasta separacin definida
5.2.29.2 DETERMINACIN DE LA de fase lmpida (cidos grasos). Lavar la fase grasa con
TEMPERATURA DE FUSIN agua hirviendo a fin de eximirla de cido sulfrico y man-
tenerla, en vaso de precipitados pequeo, en bao mara
Proceder conforme descrito en Determinacin de la tem- hirviendo hasta decantacin del agua, dejando lmpida la
peratura y banda de fusin, Mtodo III (5.2.2). fase oleosa. Filtrar y recolectar la mezcla de cidos grasos
todava caliente en vaso de precipitados seco y desecarla a
150 C durante 20 minutos. Transferir la mezcla caliente
para frasco apropiado y mantenerla en bao de hielo hasta
solidificacin.
Para evaluar el grado de pureza de los cidos grasos sepa- 5.2.29.6 DETERMINACIN DE AGUA
rados por el procedimiento anterior, transferir, previamen-
te al congelamiento, 3 ml de la solucin de cidos grasos Proceder conforme descrito en Mtodo volumtrico
desecados para tubo de ensayo y aadir 15 ml de etanol. (5.2.20.1).
Calentar la solucin hasta que hierva y juntar 15 ml de hi-
drxido de amonio 6 M. La preparacin resultante debe ser 5.2.29.7 NDICE DE ACIDEZ
lmpida.
El ndice de acidez, IA, expresa, en miligramos, la cantidad
PROCEDIMIENTO necesaria de hidrxido de potasio para la neutralizacin de
los cidos grasos libres en 1 g de muestra.
Proceder conforme descrito en Determinacin temperatura
de congelamiento (5.2.4). ndices elevados de acidez son sugestivos de hidrlisis
acentuada de los steres constituyentes de la materia grasa.
5.2.29.4 DETERMINACIN DEL NDICE Las causas de la degradacin incluyen tratamientos qumi-
DE REFRACCIN cos integrantes de los procesos industriales de extraccin y
purificacin, actividad bacteriana, accin cataltica (calor,
El ndice de refraccin nt de un medio referido al aire es luz), almacenamiento inadecuado y presencia de impure-
igual a la relacin entre el seno del ngulo de incidencia de zas como la humedad, entre otros.
un radio luminoso en el aire y el seno del ngulo de refrac-
cin del radio refractado en el medio considerado. Salvo Pesar, colocada en matraz de 250 ml, cerca de 10,0 g o
indicacin contraria, el ndice de refraccin es determinado exactamente la cantidad prescrita (en g) de la sustancia
a 20 C 0,5 C y en largo de onda 589,3 nm, correspon- prueba. Aadir 50 ml de una mezcla de etanol 96% y ter
diente al de la luz de la raya D del sodio. En ese caso, el etlico (1:1) v/v. Excepto cuando hubiere indicacin con-
5
smbolo que representa el ndice de refraccin es n20/D. traria en la monografa especfica, la mezcla de solventes
debe ser previamente neutralizada con hidrxido de pota-
En los refractmetros corrientes hay determinacin del n- sio 0,1 M, o hidrxido de sodio 0,1 M, en presencia de 0,5
gulo lmite. En algunos aparatos, la parte esencial es un ml de solucin de fenolftalena. Calentar la muestra hasta
prisma de ndice de refraccin conocido, en contacto con 90 C si es necesario para la disolucin de la misma. Des-
el lquido en ensayo. pus de solubilizacin completa; titular con hidrxido de
potasio 0,1 M hasta observacin del color rosa plido per-
Para calibracin del aparato, utilizar los lquidos de refe- sistente por, como mnimo, 15 segundos. Proceder al ensa-
rencia mencionados en la Tabla 1. El valor del ndice de yo en blanco y corregir el volumen de titulante consumido.
refraccin de cada lquido de referencia est indicado en
su rtulo. Calcular el IA de acuerdo con la ecuacin:
5,610n
Tabla 1 Lquidos de referencia en la Ia =
m
determinacin del ndice de refraccin.
En que
n/t (coeficiente de n = volumen (en ml) de hidrxido de potasio 0,1 M gastado
Lquido de referencia
temperatura) en la titulacin
Trimetilpentano 0,00049 m = masa de muestra en gramos.
Tolueno 0,00056
Metilnaftaleno 0,0048 5.2.29.8 DETERMINACIN DEL NDICE
DE SAPONIFICACIN
Se es utilizada luz blanca para la determinacin del ndice
de refraccin, el refractmetro posee un sistema de com- El ndice de saponificacin IS exprime, en miligramos, la
pensacin. El aparato deber suministrar lecturas exactas cantidad de hidrxido de potasio necesaria para neutralizar
hasta la tercera casa decimal, en el mnimo, y poseer un los cidos libres y saponificar los steres existentes en 1 g
dispositivo que posibilite operar a la temperatura prescrita: de sustancia.
el termmetro posibilita la lectura con la aproximacin de,
por lo menos, 0,5 C. El IS da indicios de adulteraciones de la materia grasa con
sustancias insaponificables (aceite mineral, por ejemplo).
5.2.29.5 DETERMINACIN DEL PODER Salvo indicacin en la monografa especfica, utilizar la
ROTATORIO cantidad de muestra indicada en la Tabla 1.
Tabla 1 - Cantidad de muestra para medida cuantitativa del grado de insaturaciones de los ci-
determinar el ndice de saponificacin. dos grasos, esterificados y libres, en la muestra. El Iy valor
encontrado en la determinacin es sugestivo del grado de
Cantidad de pureza del material ensayado as como de la presencia de
Valor esperado de Is
muestra (g) adulterantes. La sustitucin del Mtodo A por el Mtodo B
3 10 12-15 debe ser objeto de una validacin.
10 40 8-12
40 60 5-8 MTODO A
60 100 3-5
100 200 2,5-3 Salvo indicacin en la monografa especfica, utilizar la
200 300 1-2 cantidad de muestra indicada en la Tabla 1.
300 400 0,5-1
Tabla 1 - Cantidad de muestra para
Pesar, colocada en baln de 250 ml, la cantidad de muestra determinacin del ndice de yodo.
indicada (m), aadir 25,0 ml de solucin metanlica de hi-
drxido de potasio 0,5 M y algunas piedras de ebullicin. ndice esperado I Cantidad de muestra
Adaptar el condensador de reflujo vertical. Calentar en Inferior a 20 1,0
bao mara durante 30 min, salvo en indicacin especfica. 20 60 0,5 0,25
Aadir 1 ml de solucin de fenolftalena y titular, inmedia- 60 100 0,25 0,15
tamente, el exceso de hidrxido de potasio con solucin de Superior a 100 0,15 0,10
cido clorhdrico 0,5 M (ml). Efectuar ensayo en blanco en
las mismas condiciones y corregir el volumen del titulante En recipiente de 250 ml, provisto de tapn esmerilado,
(n2 ml). seco, o lavado con cido actico glacial, introducir la
5
muestra (m g) y disolverla en 15 ml de cloroformo, salvo
Calcular el ndice de saponificacin (LS), utilizando la ex- en indicaciones especificadas en la respectiva monografa.
presin: Aadir 25,0 ml de solucin de bromato de yodo. Tapar el
recipiente y conservarlo bajo proteccin de la luz durante
28,05 (n1 n2) 30 min, agitndolo, frecuentemente. Despus de adicin de
Is =
m 10 ml de solucin de yoduro de potasio a 100 g/L y 100
ml de agua, titular con tiosulfato de sodio 0,1 M agitando,
5.2.29.9 DETERMINACIN DEL INDICE enrgicamente, hasta que la coloracin amarilla casi haya
DE STERES desaparecido. Juntar 5 ml de solucin de almidn y conti-
nuar la titulacin, adicionando el tiosulfato de sodio 0,1 M,
El ndice de steres, IE, expresa la cantidad de hidrxido de gota a gota, agitando, hasta la desaparicin del coloracin
potasio, en miligramos, necesaria para la saponificacin de (n2 ml). La prueba en blanco debe ser realizada en las mis-
los steres presentes en 1 g de muestra. El IE es calculado a mas condiciones y sin la muestra (n1 ml).
partir del ndice de saponificacin IS y del ndice de acidez
IA, conforme la ecuacin: Calcular el ndice de yodo por la expresin:
El ndice de yodo Iy, expresa, en gramos, la cantidad de Salvo indicacin contraria, utilizar la cantidad de muestra
yodo susceptible a complejacin en 100 g de sustancia indicada en la Tabla 2.
bajo las condiciones descritas a continuacin. Constituye
En recipiente de 250 ml con tapn esmerilado, previamen- tamente, y aadir 30 ml de agua. Titular con tiosulfato de
te lavado con cido actico glacial o seco, introducir la sodio 0,01 M, adicionando, lentamente, sin parar la agita-
5
cantidad de muestra (m g) y disolverla en 15 ml de una cin enrgica hasta que la coloracin amarilla haya casi
mezcla de volmenes iguales de ciclohexano y cido acti- desaparecido. Aadir 5 ml de solucin de almidn. Conti-
co glacial, salvo en indicacin contraria. si necesario, fun- nuar la titulacin agitando enrgicamente, hasta desapari-
dir previamente la sustancia (punto de fusin superior a 50 cin de la coloracin (n1 ml de tiosulfato de sodio 0,01 M).
C). Aadir, lentamente, el volumen de solucin de cloruro Realizar un ensayo en blanco en las mismas condiciones
de yodo indicado en la Tabla 2. Tapar el recipiente y agitar, (n2 ml de tiosulfato de sodio 0,01 M). El ensayo en blanco
al abrigo de la luz, durante 30 min, salvo indicacin con- no consume ms de 0,1 ml de tiosulfato de sodio 0,1 M.
traria. Aadir 10 ml de solucin de yoduro de potasio a 100
g/L y 100 ml de agua. Titular con tiosulfato de sodio 0,1 M, Calcular el ndice de perxidos por la expresin:
agitando, enrgicamente, hasta que la coloracin amarilla
casi desaparezca. Aadir 5 ml de solucin de almidn y 10 (n1 n2)
Ip =
continuar la titulacin adicionando, gota a gota, el tiosul- m
fato de sodio 0,1 M hasta desaparicin de la coloracin (n1
ml de tiosulfato de sodio 0,1 M). Realizar un ensayo en MTODO B
blanco en las mismas condiciones (n2 ml de tiosulfato de
sodio 0,1 M). Nota: operar al abrigo de la luz.
Calcular el ndice de yodo utilizando a siguiente expresin: En un matraz, con tapn esmerilado, introducir 50 ml de
una mezcla v/v de cido actico glacial con trimetilpentano
(3:2). Cerrar y agitar hasta disolucin de la muestra (Tabla
1). Aadir 0,5 ml de solucin saturada de yoduro de pota-
5.2.29.11 DETERMINACIN DEL NDICE sio, cerrar nuevamente y dejar la solucin en reposo duran-
DE PERXIDOS te 60 1s. En ese tiempo de reposo, agitar, por lo menos,
tres veces y, en seguida, aadir 30 ml de agua. Titular con
El ndice de perxido Ip es el nmero que expresa, en mi- solucin de tiosulfato de sodio 0,01 M (v1 ml), adicionado
liequivalentes de oxgeno activo, la cantidad de perxido lentamente, con agitacin enrgica y constante, hasta des-
en 1000 g de sustancia. aparicin casi total de la coloracin amarilla dada por la
presencia del yodo. Aadir cerca de 0,5 ml de solucin de
Si la monografa no indica el mtodo a ser utilizado, ejecu- almidn SI y continuar la titulacin, sin parar la agitacin,
tar el Mtodo A. La sustitucin del Mtodo A por el Mtodo en especial cuando est prximo del punto de equivalencia,
B es siempre objeto de validacin. para garantizar la liberacin del yodo del solvente. Aadir,
gota a gota, la solucin de tiosulfato de sodio hasta que el
MTODO A color azul comience a desaparecer. Si en la titulacin fue-
se gastado menos de 0,5 ml de tiosulfato de sodio 0,1 M,
Pesar 5,00 g de la muestra, colocada en matraz de 250 ml repetir el procedimiento utilizando tiosulfato de sodio 0,01
con tapn esmerilado. Aadir 30 ml de una mezcla v/v de M (v1 ml) bajo agitacin constante y enrgica.
cido actico glacial y cloroformo (proporcin 3:2). Agitar
hasta disolucin de la muestra y juntar 0,5 ml de solucin En el caso de que el ndice de perxido sea igual o superior
saturada de yoduro de potasio. Agitar durante1 min, exac- a 70, y habiendo retraso en el cambio de color del indica-
5
Tabla 1 - Cantidad de muestra para nuevamente el baln en bao de agua durante 10 min. Re-
determinacin del ndice de perxido tirar el baln y dejarlo enfriar. Lavar el condensador y las
paredes del baln con 5 ml de alcohol, previamente neu-
Valor esperado de Ip Valor esperado de Ip tralizado en presencia de solucin de fenolftalena. Titular
0-12 0-12 con solucin alcohlica de hidrxido de potasio 0,5 M, en
12-20 12-20 presencia de 0,2 ml de solucin de fenolftalena SI (n1 ml).
20-30 20-30 Realizar un ensayo en blanco, en las mismas condiciones
30-50 30-50 (n2 ml).
50-90 50-90
Calcular el ndice de hidroxilo utilizando la expresin:
5.2.29.12 DETERMINACIN DEL NDICE
DE HIDROXILO
El ndice de hidroxilo IOH es el nmero que expresa, en en que
miligramos, la cantidad de hidrxido de potasio necesaria IA = ndice de acidez
para la neutralizacin de cido que se combina, por acila-
cin, con 1 g de sustancia. MTODO B
Por la posibilidad de haber presencia de agua, determinar Si la monografa especfica no indica el procedimiento,
el tenor de humedad (y por ciento) en la muestra segn el utilizar el Mtodo I. Utilice material de vidrio con boca
mtodo especfico. El ndice de hidroxilo es obtenido por esmerilado y desengrasado.
la ecuacin:
MTODO I
I OH= (ndice encontrado) 31,1y
Aadir 2,0 2,5 g de la muestra en baln de 250 ml. Aadir
5.2.29.13 DETERMINACIN DEL NDICE 25 ml de hidrxido de potasio etanlico 0,5 M. Acoplar
DE ACETILO un condensador de reflujo al baln y hervir en bao ma-
ra por 1 hora, bajo agitacin. Transferir el contenido del
El ndice de acetilo es la cantidad de lcali, en mg de hi- baln para embudo de separacin, usando 50 ml de agua
drxido de potasio, necesaria para la neutralizacin del y, mientras el lquido todava est tibio, extraer, mediante
cido actico liberado por la hidrlisis de 1 g de sustancia agitacin vigorosa, con tres cantidades de 50 ml de ter
acetilada. Es usado para establecer el grado de presencia exento de perxidos. Lavar el baln con la primera al-
de alcoholes libres en sustancias grasas. Es calculado con cuota de ter. Mezclar las soluciones etreas en embudo
5
base en la diferencia entre los ndices de saponificacin de de separacin conteniendo 20 ml de agua. (Si las solucio-
la sustancia acetilada por la tcnica descrita a continuacin nes etreas contienen slidos en suspensin, filtrar para el
y de la sustancia no acetilada. embudo de separacin a travs de un filtro de papel libre
de grasa. Lavar el filtro con ter libre de perxido). Agi-
PROCEDIMIENTO tar, cuidadosamente, y descartar la fase acuosa. Lavar la
fraccin orgnica, con dos porciones de 20 ml de agua. En
Transferir 10 g de sustancia y 20 ml de anhdrido acti- seguida, aadir tres cantidades de 20 ml de hidrxido de
co para baln Kjeldahl de 200 ml de capacidad. Adaptar potasio 0,5 M y agitar, vigorosamente, en cada una de las
el condensador de reflujo. Apoyar el frasco sobre tela de adiciones. Despus de cada tratamiento debe ser realizado
amianto en cuyo centro haya sido cortado un orificio de el lavado con 20 ml de agua. Finalmente, lave con canti-
cerca de 4 cm de dimetro y calentar sobre llama de que- dades sucesivas de 20 ml de agua hasta que la fase acuosa
mador de gas con altura mxima de 25 mm (evitando que no muestre reaccin alcalina en presencia de fenolftalena.
la llama alcance la base del baln). Mantener en ebullicin Transferir la fraccin orgnica para un baln previamente
regular durante 2 horas, enfriar y transferir el contenido del tarado, lavando el embudo de separacin con ter exento
baln para vaso de precipitados de 1000 ml conteniendo de perxidos. Eliminar el ter y aadir 3 ml de acetona al
600 ml de agua. Aadir 0,2 g de polvo de piedra pmez y baln. Eliminar el solvente por completo hasta constante
hervir durante 30 minutos. Enfriar y transferir la mezcla la temperatura no superior a 80 C. Disolver el contenido
para embudo de separacin, rechazando la camada acuosa del baln en 10 ml de etanol recientemente hervido (96%)
inferior. Lavar la sustancia acetilada con tres o ms por- y previamente neutralizado. Titular con hidrxido de sodio
ciones de 50 ml de solucin saturada caliente de cloruro etanlico 0,1 M y solucin de fenolftalena como indica-
de sodio, hasta que la solucin de lavado no proporcione dor. Si el volumen de solucin titulante gastado no excede
ms reaccin cida al papel de tornasol. Aadir, adems, 0,1 ml, la cantidad de residuos pesados, debe ser tomada
20 ml de agua caliente al embudo y agitar, removiendo, como materia insaponificable. Calcular la materia insapo-
en seguida, lo ms completamente posible, la fase acuosa. nificable como un porcentaje de la sustancia a ser exami-
Transferir la sustancia para cpsula de porcelana, aadir 1 nada. Si el volumen de titulante gastado excede 0,1 ml, la
cantidad de residuos pesados no pueden ser tomadas como
g de sulfato de sodio pulverizado y filtrar a travs de papel la materia insaponificable y de la prueba debe ser repetido.
de filtro plegado. Determinar el ndice de saponificacin
de la sustancia original, no acetilada, y de la sustancia ace- MTODO II
tilada por el procedimiento descrito y calcular el ndice de
acetilo por la frmula: En un baln de 250 ml, acoplado en sistema de condensa-
cin por reflujo, introducir la cantidad prescrita (m g) de la
(b a).1335 muestra. Juntar 50 ml de solucin alcohlica de hidrxido
IAC =
1335 a de potasio 2 M y calentar en bao mara, durante 1 h bajo
agitacin. Despus de enfriar la temperatura inferior a 25
en que C, transfirir el contenido del baln para embudo de se-
a = ndice de saponificacin de la sustancia original, paracin. Aadir 100 ml de agua. Aadir 100 ml de ter
b = ndice de saponificacin de la sustancia acetilada. exento de perxidos y agitar cautelosamente. Repetir la
operacin dos veces ms con 100 ml de ter etlico. Re-
5
tenido no puede ser considerado insaponificable. El ensayo 5.2.29.15.2 Impurezas alcalinas
debe ser repetido.
Introducir 10 ml de acetona recientemente destilada, 0,3 ml
5.2.29.15 IDENTIFICACIN DE ACEITES de agua y 0,05 ml de solucin alcohlica de azul de bromo-
FIJOS fenol a 0,4 g/L en tubo de ensayo. Neutralizar, si necesario,
con cido clorhdrico 0,01 M o hidrxido de sodio 0,01
5.2.29.15.1 Identificacin de los aceites M. Aadir 10 ml de la muestra, agitar y dejar en reposo.
vegetales por cromatografa en camada delgada El punto de cambio es indicado por el desarrollo de color
amarillo en la camada superior. No es necesario volumen
Fase fija: gel de slice octadecilsilanizada (RP-18). superior a 1,1 ml de cido clorhdrico 0,01 M
Solucin muestra. Salvo indicacin en monografa espec- 5.2.29.15.3 Aceites extraos en aceites vegetales
fica, disolver cerca de 20 mg (1 gota) de la muestra en 3 ml por cromatografa en camada delgada
de diclorometano.
Proceder por cromatografa en camada delgada (5.2.17.1),
Solucin estndar. Disolver cerca de 20 mg (1 gota) de utilizando placa (kieselguhr G). Impregnar la placa, colo-
aceite de maz en 3 ml de diclorometano. cndola en una cmara cerrada conteniendo la cantidad
necesaria de la mezcla de ter etlico y parafina lquida
Procedimiento. Aplicar, separadamente, 1 L de cada so- (90:10; v/v) para que la superficie del lquido alcance cerca
lucin en la placa. Desarrollar dos veces en la distancia de de 5 mm de la camada de adsorbente. Cuando la mezcla
0,5 cm con ter. En seguida, desarrollar dos veces la distan- de impregnacin haya recorrido, por lo menos, 12 cm de
cias de 8 cm con mezcla de diclorometano, cido actico la camada, retirar la placa de la cmara y dejar evaporar el
glacial con acetona (2:4:5). Dejar la placa secar al aire y solvente durante 5 min. Desarrollar en la misma direccin
nebulizar con solucin de cido fosfomolbdico a 100 g/L de la impregnacin.
en alcohol. Calentar la placa a 120 C durante cerca de 3
min. Examinar a la luz del da. Preparacin de la mezcla de cidos grasos. Calentar bajo
reflujo, durante 45 min, 2 g de la muestra con 30 ml de
El cromatograma presenta manchas comparables a las re- solucin alcohlica de hidrxido de potasio 0,5 M. Jun-
producidas en la Figura 1. tar 50 ml de agua, dejar enfriar. Transferir para embudo
de separacin. Agitar tres veces con 50 ml de ter etlico
de cada vez. Rechazar las soluciones etreas. Acidificar la
fase acuosa con cido clorhdrico y agitar tres veces con 50
ml de ter etlico de cada vez. Rena las soluciones etreas
y lvelas tres veces con 10 ml de agua de cada vez. Recha-
zar las aguas de lavado. Aadir sulfato de sodio anhidro a
la fraccin etrea y filtrar. Evaporar el ter en temperatura
inferior a 50 C. Utilizar el residuo para preparar la solu-
cin problema.
Los cidos grasos pueden, tambin, ser obtenidos a partir de 50 ml/min hasta eliminacin del aire. Agitar y calentar
de la solucin saponificada resultante de la reaccin de de- hasta la ebullicin. Cuando la preparacin quede lmpida
terminacin de insaponificables. (normalmente cerca de 10 min despus), calentar por ms 5
min. Enfriar en agua corriente y transfirir para un embudo
Solucin muestra. Disolver 40 mg de la mezcla de cidos de separacin. Lavar el baln con 5 ml de heptano, aadir
grasos obtenidos de la muestra en 4 ml de cloroformo. al contenido del embudo de separacin y agitar. Aadir 10
ml de solucin de cloruro de sodio a 200 g/L y agitar vigo-
Solucin estndar. Disolver, en 4 ml de cloroformo, 40 mg rosamente. Dejar separar las fases y transfirir la fase org-
de la mezcla de cidos grasos obtenidos a partir de una nica para un baln conteniendo sulfato de sodio anhidro.
mezcla de 19 volmenes de aceite de maz y 1 volumen de Dejar en reposo y filtrar.
aceite de canola.
Solucin estndar (a). Preparar 0,50 g de mezcla de sus-
Procedimiento. Aplicar, separadamente, en la placa, 3 L tancias de referencia, conforme prescrito en la monografa
de cada solucin. Desarrollar el cromatograma con mez- especfica. Si la monografa no indica la solucin estndar,
cla de cido actico glacial: agua (90:10 v/v) por recorrido utilice una de las que son descritas en la Tabla 1. Disolver
de 8 cm. Secar la placa a 110 C durante 10 min. Dejar en heptano y diluir a 50,0 ml con el mismo solvente. Ob-
enfriar. Introducir la placa, salvo indicacin contraria, en servacin: Para cromatografa en columna capilar y razn
cuba de cromatografa saturada de vapores de yodo. Para de split es recomendado que el componente con cadena
tal, coloque yodo en cristalizador, de forma baja, en el fon- larga de la mezcla en anlisis sea adicionado a la mezcla
do de la cuba. Despus de cierto tiempo, aparecen manchas de calibracin, cuando el anlisis cuantitativo sea realizado
castaas o amarillas castaas. Retirar la placa de la cuba y por curva de calibracin.
aguardar algunos minutos. Cuando la coloracin de fondo,
castaa de la camada desaparezca, pulverizar con solucin Solucin estndar (b). Diluir 1,0 ml de la solucin estndar
5
de almidn; aparecen, entonces, manchas azules que, cuan- (a) y completar para 10,0 ml con heptano.
do se secan, pueden pasar a castaas y vuelven de nuevo a
azul despus de pulverizacin con agua. El cromatograma Solucin estndar (c). Preparar 0,50 g de una mezcla de
obtenido con la Solucin muestra presenta siempre man- metil steres de cidos grasos conforme indicado en la mo-
chas correspondientes a las manchas del cromatograma ob- nografa de la sustancia en anlisis. Disolver en heptano
tenido con la Solucin estndar: una con Rf prxima de 0,5 y diluir hasta 50 ml en baln volumtrico con el mismo
(cido oleico) y otra con Rf prxima de 0,65 (cido linolei- solvente. Mezclas comerciales de metil steres de cidos
co). En ciertos aceites puede aparecer una mancha con Rf grasos, tambin, pueden ser utilizadas.
prxima de 0,75 (cido linolnico). Por comparacin con
el cromatograma obtenido con la Solucin estndar, verifi- Condiciones cromatogrficas
que la ausencia de la mancha con Rf 0,25 (cido ercico) en
el cromatograma obtenido con la solucin problema. Columna:
material: slice fundida, vidrio o cuarzo;
5.2.29.15.4 Aceites extraos en aceites fijos por tamao: 10 a 30 m de largo y 0,2 a 0,8 mm de dimetro
cromatografa a gas interno;
fase estacionaria: poli(cianopropil) metilfenilmetilsi-
Cuando no hubiere cualquier indicacin en la monografa loxano o de macrogol
especfica, utilice el Mtodo A. La investigacin de aceites 20 000 (espesor del pelcula de 0,1 a 0,5 m) u otra fase
extraos es efectuada sobre los steres metlicos de los ci- estacionaria apropiada;
dos grasos del aceite en anlisis, utilizando cromatografa Gas de arrastre: helio o hidrgeno para cromatografa;
a gas (5.2.17.5). Flujo del gas de arrastre: 1,3 ml/min (para columnas de
0,32 mm de dimetro interno);
MTODO A Razn de split: 1:100 o menor, de acuerdo con el di-
metro interno de la columna en uso (1:50 cuando el di-
Ese mtodo no se aplica a los aceites que contienen gli- metro sea de 0,32 mm);
cridos de cidos grasos con grupos epoxi, hidro epoxi, Detector: ionizacin de llama;
ciclopropil o ciclopropenilo, ni a los que contienen gran
cantidad de cidos grasos con nmero de tomos de car- Temperatura:
bono en la cadena inferior a 8, ni aquellos cuyo ndice de
cido sea superior a 2,0. columna: 160 200 C, de acuerdo con la fase esta-
cionaria y largo (200 C para una columna de 30 m de
Solucin muestra. Si la monografa indica, seque la mues- largo, revestida internamente con macrogol 20 000). si
tra antes de iniciar el ensayo. Pesar 1,0 g de la muestra, en necesario o indicado en la monografa de la sustancia
baln de boca esmerilada de 25 ml. Acoplar condensador en anlisis, elevar la temperatura de la columna de 170
de reflujo y un dispositivo que posibilite hacer pasar una a 230 C con rampa de calentamiento de 3 C por mi-
corriente de nitrgeno en el interior del baln. Aadir 10 nuto (columna con macrogol 20 000).
ml de metanol anhidro y 0,2 ml de solucin de hidrxido inyector: 250 C;
de potasio a 60 g/L en metanol. Adaptar el condensador y detector: 250 C;
hacer pasar una corriente de nitrgeno con flujo de cerca
Adecuacin del sistema cuando fuesen utilizadas las Log (tR) = f (nmero de carbonos de la cadena equivalente)
mezclas de sustancias referencia (Tabla 2).
b) los logaritmos de los tiempos de retencin reducidos
Observacin. Para cromatografa en columna capilar y ra- de los cidos insaturados son puntos de la recta con
zn de split es recomendado que el componente con cade- valores no enteros de tomos de carbono denominados
na larga de la mezcla en anlisis sea adicionado a la mezcla de largo equivalente de cadena. El largo equivalen-
de calibracin, cuando el anlisis cuantitativo sea realizado te de cadena corresponde al nmero terico de tomos
por curva de calibracin. de carbonos de cidos grasos saturados que tendran
el mismo tR. Por ejemplo, el cido linoleico posee tR
resolucin: como mnimo, de 4 entre los picos de ca- como cido graso tericamente saturado con 18,8 to-
prilato de metilo y caprato de metilo, calculados en el mos de carbono. Identificar los picos del cromatograma
cromatograma obtenido con la Solucin estndar (a); obtenido con la solucin prueba por curva de calibra-
razn seal/ruido: como mnimo, 5 para el pico referen- cin y por el tiempo de retencin reducido. Largos de
te al caprato de metilo, observado en el cromatograma cadena estn registrados en la Tabla 4.
obtenido por el anlisis de la Solucin estndar (b);
nmero de bandejas tericas: mnimo de 15000, calcu- Anlisis cuantitativo
lado para el pico correspondiente al caproato de metilo.
5
Generalmente, la cuantificacin es realizada usando el m-
Adecuacin del sistema cuando fuesen utilizadas las todo de normalizacin, en el cual la suma de las reas bajo
mezclas de sustancias referencia listadas en las Tablas 1, los picos del cromatograma, con excepcin del pico del
o 3: solvente, es considerada como siendo igual a 100%. Utili-
zar, preferencialmente, un integrador electrnico.
Observacin. Para cromatografa en columna capilar y ra-
zn de split es recomendado que el componente con cadena El tenor porcentual de cada componente es calculado deter-
longa de la mezcla en anlisis sea adicionado a la mezcla minando el rea bajo el pico correspondiente con relacin a
de calibracin, cuando el anlisis cuantitativo sea realizado la suma de las reas bajo todos los picos. No considerar los
por curva de calibracin. picos cuya rea sea inferior a 0,05 por ciento del rea total.
resolucin: como mnimo, de 1,8 entre los picos de En determinados casos, cuando la cadena de cidos grasos
oleato de metilo y estearato de metilo, calculados en el es inferior o igual a doce tomos de carbono, pueden ser
cromatograma obtenido con la Solucin estndar (a); indicados factores de correccin en las monografas indi-
razn seal/ruido: como mnimo, 5 para el pico referen- viduales para convertir el rea bajo los picos en porcentaje
te al miristato de metilo observado en el cromatograma m/m.
obtenido por el anlisis de la Solucin estndar (b);
nmero de bandejas tericas: mnimo de 30 000, calcu- Tabla 1 - Mezcla de sustancias para calibracin.
lado para el pico correspondiente al estearato de metilo.
Mezcla de sustancias Composicin (%m/m)
Evaluacin del cromatograma. Evite condiciones de an- Laurato de metilo 5
lisis que posibiliten el surgimiento de picos enmascara- Miristato de metilo 5
dos (presencia de constituyentes con tiempos de retencin Palmitato de metilo 10
prximos como, por ejemplo, los cidos linolnico y ara- Estearato de metilo 20
qudico). Araquidato de metilo 40
Oleato de metilo 20
Anlisis cualitativo
Tabla 2 - Mezcla de sustancias para calibracin.
Identificar los picos del cromatograma obtenido con la So-
lucin estndar (c) (en condiciones isotrmicas de opera- Mezcla de sustancias Composicin (%m/m)
cin o con programacin lineal de temperatura). Caproato de metilo 10
Caprilato de metilo 10
Cuando fuesen utilizadas condiciones isotrmicas de ope- Caprato de metilo 20
racin, los picos pueden ser identificados por comparacin Laurato de metilo 20
con el cromatograma obtenido de la Solucin estndar (a) Miristato de metilo 40
e informaciones registradas en las Tablas 1, 2, o 3:
Tabla 3 - Mezcla de sustancias para calibracin. Soluciones estndar y evaluacin de los cromatogramas.
En la ausencia de indicacin especfica en la monografa
Mezcla de sustancias Composicin (% m/m) individual, proceda conforme descrito en Mtodo A.
Miristato de metilo 5
Palmitato de metilo 10 Condiciones cromatogrficas. La cromatografa puede ser
Estearato de metilo 15 realizada, utilizando:
Araquidato de metilo 20
columna de slice fundida de 30 m de largo y 0,25 mm de
Oleato de metilo 20
dimetro interno, recubierta con macrogol 20 000 (espesor
Eicosanoato de metilo 10
de la pelcula: 0,25 ^m);
Behenato de metilo 10
Lignocerato de metilo 10 gas de arrastre: helio para cromatografa, con flujo 0,9 ml/
min;
Tabla 4 - Largo equivalente de cadena (valores calculados a partir
de curva de calibracin y anlisis con columna de macrogol 20000). detector de ionizacin de llama;
5
Tiempo Temperatura
Acido palmtico 16,0
(minutos) (grados Cent)
Acido palmitoleico 16,3
Acido margrico 17,0 Columna 0-15 100
Acido esterico 18,0 15-36 100-225
Acido oleico 18,3 36-61 225
Acido linoleico 18,8 Inyector 250
Acido gama-linolnico 19,0 Detector 250
Acido alfa-linolnico 19,2 MTODO C
Acido araqudico 0,0
Acido eicosanoico 20,2 Ese mtodo no se aplica a los aceites que contengan gli-
Acido araquidnico 21,2 cridos de cido grasos con grupos epoxi, hidroperoxi, al-
Acido behnico 22,0 dehdo, cetona, ciclopropil y ciclopropenilo, as como, a
Acido ercico 22,2 los aceites con grupos poliinsaturados conjugados o con
Acido 12-oxoesterico 22,7 grupos acetilnicos por causa de la destruicin parcial o
Acido ricinolico 23,9 total de esos grupos.
Acido 12-hidroxiesterico 23,9
Lignocerato de metilo 24,0 Solucin problema. En frasco cnico de 25 ml, disolver
Acido nervnico 24,2 0,10 g de la muestra en 2 ml de solucin de hidrxido de
sodio a 20 g/L en metanol. Adaptar el frasco al condensa-
MTODO B dor de reflujo vertical y calentar durante 30 min. A travs
del condensador, aadir 2,0 ml de solucin metanlica de
Este mtodo no se aplica a los aceites que contengan glic- trifluoruro de boro y calentar durante 30 min. A travs del
ridos de cidos grasos con grupos epoxi, hidroepoxi, ciclo- condensador, aadir 4 ml de heptano y calentar durante 5
propilo o ciclopropenilo, ni a los aceites cuyo ndice cido min. Enfriar la mezcla y aadir 10,0 ml de solucin satu-
sea superior a 2,0. rada de cloruro de sodio. Agitar durante 15 s y aadir una
cantidad de solucin saturada de cloruro de sodio suficien-
Solucin problema. Introducir 0,100 g de la muestra en te para hacer la fase superior llegar al cuello del frasco re-
tubo de centrfuga de 10 ml con tapn esmerilado. Disol- cipiente. Retirar alcuota de 2 ml de la fase superior. Lavar
ver con 1 ml de heptano y 1 ml de dimetilcarbonato. Agitar tres veces con 2 ml de agua de cada vez y secar con sulfato
enrgicamente, calentando a calor suave (50 60 C). Aa- de sodio anhidro.
dir 1 ml de solucin de sodio a 12 g/L en metanol anhidro a
la solucin todava caliente. Agitar enrgicamente, durante Soluciones estndar, condiciones cromatogrficas y eva-
cerca de 5 min. Aadir 3 ml de agua destilada y agitar enr- luacin de los cromatogramas. En la ausencia de indica-
gicamente, durante cerca de 30 s. Centrifugar durante 15 cin en la monografa especfica, proceder conforme des-
min a 1500 g. Inyectar 1 L de la fase orgnica. crito en Mtodo A.
5
h, bajo agitacin. Enfriar hasta temperatura inferior a 25 Solucin muestra. A los esteroles separados a partir de la
C y transferir el contenido del baln para un embudo de muestra por cromatografa en camada delgada, aadir 0,02
separacin, con el auxilio de 100 ml de agua. Agitar, con ml de la mezcla, recientemente preparada, de clorotrimetil-
precaucin, tres veces con 100 ml de ter etlico exento de silano: hexametildisilazano: piridina anhidra (1:3:9; v/v/v)
perxidos. Reunir las fracciones etreas en otro embudo de por miligramo de residuo. Agitar, cuidadosamente, hasta
separacin con el auxilio de 40 ml de agua destilada. Agitar disolucin completa de los esteroles. Dejar en reposo en
suavemente durante algunos minutos. Dejar separar las fa- desecador con pentxido de difsforo durante 30 min.
ses por decantacin y rechazar la fase acuosa. Lavar la fase Centrifugar, si necesario, y utilizar el sobrenadante.
orgnica varias veces con 40 ml de agua (por vez) hasta
que la fase acuosa no presente reaccin alcalina a fenolfta- Solucin estndar (a). A nueve partes de los esteroles se-
lena. Transferir la fraccin orgnica para un baln, tarado parados del aceite de canola por cromatografa en camada
y lavar el embudo de separacin con ter etlico. Evaporar delgada, juntar una parte de colesterol. Aadir 0,02 ml de
el ter. Aadir al residuo 6 ml de acetona. Eliminar, cuida- la mezcla, recientemente preparada, de clorotrimetilsilano:
dosamente, el solvente con corriente de nitrgeno. Secar hexametildisilazano: piridina anhidra (1:3:9; v/v/v) por
en estufa a 100 105 C hasta masa constante. Disolver el miligramo de residuo. Agitar, cuidadosamente, hasta diso-
residuo con volumen mnimo de diclorometano. lucin completa de los esteroles. Dejar en reposo en dese-
cador con pentxido de difsforo durante 30 min. Centri-
Solucin muestra (b). Someter 5,00 g de aceite de canola fugar, si necesario, y utilizar el sobrenadante.
al mismo procedimiento descrito para la Solucin muestra
(a) a partir de Aadir 50 ml de hidrxido de potasio alco- Solucin estndar (b). A los esteroles separados del acei-
hlico 2 M.... te de girasol por cromatografa en camada delgada, juntar
0,02 ml de la mezcla, recientemente preparada, de clorotri-
Solucin problema (c). Someter 5,00 g de aceite de girasol metilsilano: hexametildisilazano: piridina anhidra (1:3:9;
al mismo procedimiento descrito para la Solucin proble- v/v/v) por miligramo de residuo. Agitar, cuidadosamente,
ma (a) a partir de Aadir 50 ml de hidrxido de potasio hasta disolucin completa de los esteroles. Dejar en reposo
alcohlico 2 M.... en desecador con pentxido de difsforo durante 30 min.
Centrifugar, si necesario, y utilizar el sobrenadante.
Solucin estndar. Disolver 25 mg de colesterol y 10 mg
de betulina en 1 ml de diclorometano. Utilizar una placa Condiciones cromatogrficas
diferente para cada solucin problema.
columna de slice fundida de 20 a 30 m de largo y 0,25-
Aplicar, separadamente, 20 L de la Solucin estndar en 0,32 mm de dimetro interno, recubierta por pelcula de
forma de banda de 20 mm por 3 mm y 0,4 ml de la solucin poli[metil(95)fenil(5)]siloxano o de poli[metil(94) fe-
problema (a), (b) o (c) en forma de banda de 40 mm por nil(5)vinil(l)]siloxano (espesor de la pelcula 0,25 m);
3 mm. Migrar por la distancia de 18 cm con la fase mvil gas de arrastre: gas hidrgeno con flujo de 30 a 50 cm/s
ter:n-hexano (35:65; v/v). Secar las placas en corriente de o helio con flujo de 20 a 35 cm/s;
nitrgeno. Revelar con solucin de diclorofluorescena a 2 razn de split (1/50 o 1/100);
g/L en etanol. Examinar en 254 nm. temperaturas: columna: 260 C;
inyector: 280 C;
Consiste de un inyector, un equipo para descomponer la Blanco. Preparar la solucin del blanco, o cualquier otra
muestra, un sistema para separar el dixido de carbono for- solucin necesaria para definir la lnea de base, o proceder
mado, un detector y un registrador del seal elctrico emi- a la calibracin, segn las instrucciones del fabricante. Uti-
tido. El tubo de descomposicin debe ser capaz de generar, lizar el blanco apropiado para regular el cero del aparato.
como mnimo, 0,450 mg/L de carbono orgnico, para una
muestra de 1,071 mg/L de sacarosa. Solucin estndar. Disolver la sacarosa R, previamente de-
secada en temperatura de 105 C durante 3 h, en agua COT,
El lmite de deteccin del equipo, especificado por el fa- para obtener una solucin conteniendo 1,19 mg de sacaro-
bricante, es igual o inferior a 0,050 mg de carbono por li- sa por litro (0,50 mg de carbono por litro), para verificar el
tro (0,05 ppm). La conformidad del sistema es verificada, instrumento.
5
peridicamente, por medio de una solucin preparada con
una sustancia de difcil oxidacin, como por ejemplo, a Utilizar solucin, en agua COT, de ftalato cido de pota-
1,4-benzoquinona. La localizacin del aparato es escogida sio, previamente seco a 105 C durante 4 hs, en la con-
para asegurar que los resultados obtenidos sean representa- centracin determinada por el fabricante del equipo, para
tivos del agua utilizada. La lectura debe ser hecha inmedia- la calibracin del instrumento. Preservar la solucin, aci-
tamente despus de la recoleccin de la muestra de agua. dificando con H3PO4 concentrado o H2SO4 concentrado a
pH < 2. Para determinar carbono orgnico e inorgnico,
AGUA COT (ACOT) separadamente, preparar, tambin, la solucin estndar de
solucin de bicarbonato de sodio (seco en desecador, como
Utilizar agua de alta pureza, que satisfaga las siguientes mnimo por 18 horas) y carbonato de sodio decahidratado
especificaciones: (seco a 500 600 C por 30 minutos), en la proporcin del
contenido de carbono de 1:1, en agua COT.
Conductividad: como mximo 0,1 S.cm-1 a 25 C;
Carbono orgnico total como mximo 0,10 mg/L. La concentracin de la solucin estndar est calculada
para el agua purificada, cuyo lmite de COT es de 500 ppb.
Dependiendo del tipo de equipo utilizado los contenidos en Para otros tipos de agua, hacer la debida adecuacin.
metales pesados y en cobre pueden ser crticos. Observar
las instrucciones del fabricante. Solucin de conformidad del sistema. Disolver 1,4-benzo-
quinona en agua COT, para obtener una solucin a 0,75
Utilizar el agua COT como blanco; en la preparacin de las mg de 1,4-benzoquinona por litro (0,50 mg de carbono por
soluciones del estndar; de solucin de conformidad del litro).
sistema y en la limpieza del equipo. La preparacin de la
solucin estndar y de la solucin de conformidad del sis- Muestra. Recoger la muestra de agua en recipiente limpio;
tema debe ser concomitante a la de la muestra. seco y con tapa, dejando un mnimo de aire. Cuidar para no
haber cualquier tipo de contaminacin. No utilizar material
PREPARACIN DEL MATERIAL DE VIDRIO. de plstico. Proceder al anlisis el ms breve posible, para
minimizar los riesgos de deterioro o de contaminacin de
Lavar, cuidadosamente, el material de vidrio por medio de la muestra.
un proceso que elimine la materia orgnica. Dejar el mate-
rial inmerso en mezcla de partes iguales de solucin de pe- CONFORMIDAD DEL SISTEMA
rxido de hidrgeno diluido a 30% y cido ntrico diluido.
Enjuagar con agua COT. Proceder las lecturas (L) de las soluciones de agua COT
(LCot), solucin estndar (LPa), solucin de conformidad
Caso use una microjeringa para inyectar la muestra, esta del sistema (LCS) y registrar. Calcular la eficacia del siste-
debe ser lavada con mezcla de solucin de hidrxido de so- ma en porcentaje, usando a expresin:
dio a 5% con alcohol etlico absoluto (1:1), o en cido clor-
hdrico a 25%. Enjuagar abundantemente con agua COT. LCS LCot
x 100
LPa LCot
3. Tratar solucin neutra de la muestra con cloruro frrico Amonaco y amina aliftica voltil
SR; se produce color rojo oscuro, que desaparece por la
adicin de cidos minerales. Disolver la muestra en tubo de ensayo, aadir xido de
magnesio y calentar si necesario; se desprenden paulati-
4. Disolver la muestra en agua, aadir cinco gotas de ni- namente vapores alcalinos, que oscurecen el papel de pla-
trato de lantano SR, dos gotas de yodo 0,1 M y una ta-manganeso colocado en la parte superior del tubo.
gota de solucin concentrada de amonaco. Calentar
cuidadosamente hasta ebullicin. Despus de algunos Amonio, ion
minutos se forma precipitado azul o aparece coloracin
azul intensa. Juntar a la muestra exceso de hidrxido de sodio M a fro;
ocurre desprendimiento de amonaco, de olor caractersti-
co, y que cambia para azul a color rojo del papel de torna-
sol. La descomposicin es acelerada por el calentamiento.
5
pofosfito de sodio SR; se forma precipitado de color hdrico, juntar algunas gotas de solucin de yodo a
marrn a negro. En el caso que se trate de As (V), la 0,1% (p/v) y de solucin de alcohol polivinilo a 2%
reduccin es ms lenta; el aumento de yoduro de pota- (p/v); se produce color verde intenso. La reaccin es
sio SR ejercer efecto cataltico. alterada por agentes de oxidacin o reduccin.
Barbtrico sin sustituyente en el nitrgeno 2. Tratar la muestra con cido sulfrico, aadir metanol y
llevar la mezcla a la ignicin; ella quema con llama de
A una solucin metanlica de la muestra juntar algunas go- bordes verdes.
tas de solucin conteniendo nitrato de cobalto (II) a 10%
(p/v) y cloruro de calcio a 10% (p/v), mezclar y aadir, Bromato
con agitacin, algunas gotas de hidrxido de sodio 2 M; se
forma precipitado azul violeta. 1. A solucin de la muestra acidificada con cido sulfrico
SR, juntar agua de cloro SR; se desprende bromo, que
Bario, ion le da color pardo a la solucin; agitndose esta con clo-
roformo, el solvente adquiere color variando de rojo a
1. Tratar solucin de la muestra con cido sulfrico M; se marrn rojizo y la camada acuosa permanece incolora.
forma precipitado blanco, insoluble en los cidos clor-
hdrico y ntrico. 2. Tratar la solucin de la muestra con cido ntrico SR y
nitrato de plata SR; se forma precipitado caseoso blan-
2. Colocar la muestra en la zona reductora de llama; esta co levemente amarillento, insoluble en cido ntrico y
adquiere color verde amarillo, que se presenta azul poco soluble en hidrxido de amonio 6 M
cuando visto a travs de vidrio verde.
Calcio, ion
Benzoato
1. Humedecer la muestra con cido clorhdrico y llevarla
1. Tratar solucin neutra de la muestra con cloruro frrico a la zona reductora de la llama; aparece color rojo ana-
SR; se forma precipitado amarillo oscuro, soluble en ranjado transitorio.
ter etlico.
2. Disolver la muestra, juntar dos gotas de rojo de metilo
2. Acidular solucin moderadamente concentrada de la SI, neutralizar con hidrxido de amonio 6 M, aadir
muestra con cido sulfrico M; se forma precipitado de cido clorhdrico 3 M, gota a gota, hasta acidular la so-
cido benzoico, fcilmente soluble en ter etlico. lucin y verter oxalato de amonio SR; se forma preci-
pitado blanco de oxalato de calcio, insoluble en cido
Bicarbonato actico 6 M, pero soluble en cido clorhdrico SR.
reaccionar con hidrxido de calcio SR, forma inmedia- 2. Mezclar la muestra seca con igual peso de dixido de
tamente precipitado blanco. manganeso, humedecer con cido sulfrico SR y ca-
lentar suavemente; se desprende cloro, identificado por
2. A una solucin fra de la muestra soluble juntar fenolf- el olor y por la produccin de color azul en papel de
talena SI; aparece color rojo. almidn con yoduro humedecido.
3. Tratar solucin de la muestra con cido sulfrico M; se 1. Tratar la solucin de la muestra con ferrocianuro de
forma precipitado blanco, insoluble en cido clorhdri- potasio SR; se forma precipitado marrn rojizo, inso-
co 3 M o cido ntrico 2 M, pero soluble en hidrxido luble en cidos diluidos, pero soluble en hidrxido de
de sodio M calentado, en acetato de amonio a 10% (p/v) amonio.
y en exceso de cido sulfrico M.
2. Tratar solucin de la muestra con cido clorhdrico y
4. Tratar solucin de la muestra, exenta de cidos mine- virutas de hierro metlico; se deposita pelcula roja de
rales, con cromato de potasio SR; se forma precipitado cobre metlico.
amarillo, insoluble en cido actico 6 M, pero soluble
en hidrxido de sodio M y en cido ntrico, en caliente. 3. Tratar solucin de la muestra con exceso de hidrxido
de amonio 6 M; se forma primero precipitado azulado
Cianuro y, en seguida, solucin fuertemente azulada.
5
ebullicin y acidular con cido clorhdrico; se produce co- Juntar a la muestra solucin de clorhidrato de hidroxila-
loracin o precipitado azul. Si la cantidad de cianuro pre- mina a 7% (p/v) en metanol y solucin de hidrxido de
sente es pequea, se forma solucin coloidal de coloracin potasio a 10% (p/v) en etanol, calentar hasta ebullicin,
azul verdosa. enfriar, acidular con cido clorhdrico SR y juntar solucin
de cloruro frrico SI; se produce color rojo azulado o rojo.
Citrato
Hierro
A 15 ml de piridina aadir algunos miligramos de la mues-
tra disuelta o suspendida en 1 ml de agua, agitar, juntar 5 Tratar la muestra con sulfuro de amonio SR; se forma pre-
ml de anhdrido actico a la mezcla, agitar nuevamente; cipitado negro, que se disuelve en cido clorhdrico 3 M,
aparece color rojo claro. con desprendimiento de gas sulfhdrico, caracterizado por
el papel acetato de plomo.
Clorato
Frrico, ion
1. Tratar solucin de la muestra con nitrato de plata SR
en medio de cido ntrico SR; no se forma precipitado. 1. Tratar solucin cida de la muestra con ferrocianuro de
Verter cido sulfuroso o solucin reciente de nitrito de potasio SR; se forma precipitado azul oscuro, que no
sodio SR a esta mezcla; se forma precipitado blanco, disuelve por adicin de cido clorhdrico SR, pero es
insoluble en cido ntrico SR, pero soluble en hidrxido descompuesto por hidrxido de sodio 2 M.
de amonio 6 M.
2. Tratar la muestra con tiocianato de amonio SR; se pro-
2. Someter la muestra a la ignicin; se forma cloruro, duce color rojo intenso que no desaparece con adicin
identificado por ensayos apropiados. de cidos minerales diluidos, pero puede ser extrado
con ter etlico, pasando la coloracin roja para la ca-
3. Tratar la muestra seca con cido sulfrico; ocurre cre- mada etrea.
pitacin desprendindose gas amarillo verdoso (para
este ensayo usar cantidad pequea de clorato, debiendo Ferroso, Ion
tomar cuidado extremo al ejecutarlo, pues el gas que se
forma se descompone de modo explosivo arriba de 45 1. Tratar solucin de la muestra con ferrocianuro de pota-
C utilizar campana). sio SR; se forma precipitado azul oscuro, insoluble en
cido clorhdrico 3 M, pero descompuesto por hidrxi-
Cloruro do de sodio M.
1. Tratar solucin de la muestra, acidificada con cido 2. Tratar solucin de la muestra con hidrxido de sodio M;
ntrico, con nitrato de plata SR; se forma precipitado se forma precipitado blanco verdoso, que pasa rpida-
blanco caseoso, insoluble en cido ntrico, pero, solu- mente a verde y, en seguida, cuando agitado, a marrn.
ble en ligero exceso de hidrxido de amonio 6 M.
1. Tratar solucin neutra de la muestra con nitrato de pla- 1. Tratar solucin de la muestra con sulfuro de hidrgeno
ta SR; se forma precipitado amarillo, soluble en cido SR; se forma precipitado negro, insoluble en sulfuro de
ntrico 2 M o hidrxido de amonio 6 M. amonio SR y en cido ntrico 2 M hirviendo.
2. Tratar solucin ntrica de la muestra con molibdato de 2. Aplicar solucin de la muestra, sin exceso de cido n-
amonio SR; se forma precipitado amarillo, soluble en trico, en lmina de cobre brillante; se forma depsito
hidrxido de amonio 6 M; la reaccin es acelerada por que, al ser pulido, se torna brillante y plateado.
el calor.
Mercurio (II), ion
Hipofosfito
1. Tratar solucin de la muestra con hidrxido de sodio
1. Calentar solucin de la muestra, acidulada por cido M; se forma precipitado amarillo.
sulfrico SR, con sulfato cprico SR; se forma preci-
pitado rojo. 2. Tratar solucin neutra de la muestra con yoduro de po-
tasio SR; se forma precipitado escarlata, muy soluble
2. Tratar solucin de la muestra con cloruro mercrico en exceso de reactivo.
SR; se forma precipitado blanco, que se toma gris en la
presencia de exceso de hipofosfito. Mercurio (I),ion
5
1. Tratar solucin de la muestra con agua de cloro SR,
gota a gota; se desprende yodo, que cambia el color de 2. Tratar solucin de la muestra con cido clorhdrico SR;
la solucin de amarillo para rojo; agitndose esta solu- se forma precipitado blanco, que oscurece al ser tratado
cin con cloroformo, esta adquiere color violeta. con hidrxido de amonio 6 M.
2. Tratar solucin de la muestra acidificada con cido n- 3. Tratar solucin de la muestra con yoduro de potasio
trico SR, con nitrato de plata SR; se forma precipitado SR; se forma precipitado amarillo que, con el tiempo,
amarillo caseoso, insoluble en cido ntrico SR e hi- puede pasar a verde.
drxido de amonio 6 M
Nitrato
Lactato
1. Calentar la muestra con cido sulfrico y cobre me-
Tratar solucin de la muestra, acidulada por cido sulfrico tlico; se desprenden vapores rojo pardos (realizar en
SR, con permanganato de potasio SR y calentar la mezcla; campana).
se desprende acetaldehdo, identificado por el olor carac-
terstico. 2. Tratar solucin de la muestra con igual volumen de ci-
do sulfrico, enfriar la mezcla y juntar 0,5 ml de solu-
Litio, ion cin de sulfato ferroso 0,5 M; en la interfaz se produce
color pardo a violeta.
1. Tratar la solucin de la muestra moderadamente con-
centrada y alcalinizada por hidrxido de sodio SR, con Nitrito
carbonato de sodio SR; se forma, por calentamiento,
precipitado blanco, soluble en cloruro de amonio SR. 1. Tratar la muestra con cidos minerales diluidos o con
cido actico 5 M; se desprenden vapores pardos (rea-
2. Humedecer la muestra con cido clorhdrico y calentar lizar en campana).
en la zona reductora de la llama; esta adquiere color
rojo intenso. 2. Tratar papel de almidn yodado con solucin de la
muestra; el indicador se torna color azul.
Magnesio, ion
3. Aadir la muestra a la solucin acidificada de perman-
1. Tratar solucin de la muestra con hidrxido de sodio ganato de potasio SR; desaparece el color.
SR; se forma precipitado blanco, que se disuelve con la
adicin de cloruro de amonio SR. Oxalato
2. Tratar solucin de la muestra, en la presencia de cloru- 1. Tratar solucin neutra o alcalina de la muestra con clo-
ro de amonio SR, con carbonato de amonio SR; no se ruro de calcio SR; se forma precipitado blanco, insoluble
forma precipitado pero, al aadir fosfato de sodio dib- en cido actico 6 M, pero soluble en cido clorhdrico.
sico heptahidratado SR, se forma precipitado cristalino
blanco, insoluble en hidrxido de amonio 6 M.
5
1. Tratar solucin alcalina de la muestra con tetrafenilbo- se forma precipitado blanco, insoluble en cido clorh-
rato sdico a 1% (p/v); se forma precipitado blanco. drico SR y en cido ntrico SR.
2. Tratar solucin de la muestra con cido actico SR y 1 2. Tratar solucin de la muestra con acetato de plomo
ml de cobaltinitrito de sodio SR; se forma inmediata- SR; se forma precipitado blanco, soluble. en acetato
mente precipitado amarillo o amarillo anaranjado, en la de amonio SR, pero insoluble en cido clorhdrico o
ausencia de iones amonio. ntrico SR.
3. Colocar la solucin de la muestra, acidulada con cido 3. Tratar solucin de la muestra con cido clorhdrico SR;
clorhdrico SR, en la zona reductora de la llama; esta no se forma ningn precipitado (distincin del tiosul-
adquiere color violeta; la presencia de pequea canti- fato).
dad de sodio enmascara el color.
Sulfito
4. Tratar solucin de la muestra con cido perclrico SR;
se forma precipitado blanco cristalino. 1. Tratar la muestra con cido clorhdrico 3 M; se des-
prende dixido de azufre, reconocido por su olor pe-
Plata, ion netrante caracterstico y por oscurecer papel de filtro
humedecido con nitrato de mercurio (I) SR.
1. Tratar solucin de la muestra con cido clorhdrico; se
forma precipitado caseoso blanco, insoluble en cido 2. Acidificar solucin de la muestra con cido clorhdrico
ntrico SR, pero fcilmente soluble en hidrxido de SR, calentar con algunas gotas de permanganato de po-
amonio 6 M tasio SR y juntar gotas de cloruro de bario SR; se forma
precipitado blanco.
2. Tratar la solucin de la muestra con hidrxido de amo-
nio 6 M y pequea cantidad de solucin de formalde- Tartrato
hido; por calentamiento, se deposita espejo de plata
metlica en la superficie del recipiente. 1. Disolver algunos miligramos de la muestra en agua,
acidificada con cido actico SR, aadir una gota de
Salicilato solucin de sulfato ferroso a 1% (p/v) y una gota de
perxido de hidrgeno a 3% (p/v); se produce color
1. Tratar la solucin diluida de la muestra con cloruro f- amarillo fugaz. Juntar hidrxido de sodio 2 M gota a
rrico SR; se produce color violeta. gota; se produce color azul intenso.
2. Tratar solucin moderadamente concentrada de la 2. Acidificar solucin de la muestra con cido sulfrico
muestra con cido mineral; se forma precipitado cris- M, juntar algunas gotas de resorcinol 2% (p/v) y aadir,
talino blanco de cido saliclico, que funde entre 156 cuidadosamente, cido sulfrico, para que se formen
y 160 C. dos camadas; calentando en bao mara, por algunos
minutos, en la interfaz aparece un anillo rojo.
5
mara; se obtiene residuo rojo amarillento que, tratado con Y Mezcla de volmenes iguales de ciclohexano y ter de
hidrxido de amonio 2 M, cambia para rojo violeta. petrleo de banda de ebullicin 40 60 C F Mezcla
de 2 volmenes de cido actico glacial y 3 volmenes
Zinc, ion de agua
G Mezcla de 8 volmenes de hexano y 2 volmenes de
1. Tratar solucin de la muestra con ferrocianuro de pota- dioxano.
sio SR; se forma precipitado blanco, insoluble en cido
clorhdrico 3 M 5.3.1.3 INVESTIGACIONES DE
ESTEROIDES EXTRAOS POR
2. Tratar solucin neutra o alcalina de la muestra con sul- CROMATOGRAFA EN CAMADA
furo de amonio SR; se forma precipitado blanco.
DELGADA
3. Tratar solucin de la muestra con solucin de hidrxido
de sodio 2 M, gota a gota; se forma precipitado blanco, PROCEDIMIENTO I
soluble en exceso de hidrxido de sodio SR.
Preparar cromatoplacas conforme descrito en Cromatogra-
5.3.1.2 IDENTIFICACIN DE fa en camada delgada (5.2.17.1), utilizando gel de slice
ESTEROIDES POR CROMATOGRAFA G como soporte. Preparar 3 soluciones utilizando, como
EN CAMADA DELGADA solvente, mezcla de 9 volmenes de cloroformo y 1 volu-
men de metanol en las siguientes concentraciones: 1,5%
PROCEDIMIENTO (p/v) de la sustancia en examen Solucin 1; 1,5% (p/v) de
la sustancia qumica de referencia (SQR) correspondiente
Preparar cromatoplaca utilizando Kieselguhr G como so- Solucin 2 y 0,03% (p/v) de cada una de las siguientes
porte. Introducir la cromatoplaca en la cuba conteniendo SQR: prednisolona y acetato de cortisona Solucin 3.
el solvente de impregnacin y dejar desarrollar hasta que Aplicar sobre la cromatoplaca 1 L de cada una de estas
el solvente alcance el topo de la cromatoplaca. Retirar la soluciones, separadamente, y desarrollar el cromatograma
cromatoplaca de la cuba y dejar evaporar el solvente. Pre- utilizando, como eluyente, mezcla de 77 volmenes de di-
parar solucin de la muestra a 0,25% (p/v) y solucin del clorometano, 15 volmenes de ter, 8 volmenes de me-
estndar a 0,25% (p/v) utilizando, como solvente, mezcla tanol y 1,2 volmenes de agua. Secar el cromatograma al
de 9 volmenes de cloroformo y 1 volumen de metanol. A aire, calentar a 105 C por 10 minutos y nebulizar con solu-
no ser que la monografa establezca diferentemente, apli- cin de azul de tetrazolio alcalino SR. La mancha principal
car sobre la cromatoplaca 2 L de la solucin de muestra, del cromatograma obtenida con la Solucin 1 correspon-
2 L de la solucin estndar y 2 L de la mezcla 1:1 de de, en posicin, color e intensidad, a la mancha principal
las soluciones de la muestra y del estndar. Desarrollar el del cromatograma obtenido con la Solucin 2. Cualquier
cromatograma con el eluyente especificado en la monogra- mancha secundaria obtenida con la Solucin 1 no es ms
fa, dejndolo subir en el mismo sentido que el solvente intensa que la mancha correspondiente en el cromatograma
de impregnacin. Retirar la cromatoplaca de la cuba, dejar obtenida con la Solucin 3.
evaporar el eluyente, calentar la cromatoplaca a 120 C por
15 minutos y nebulizar con solucin de cido sulfrico a
5
de la sustancia en examen a 1,0% (p/v) utilizando, como sol- 2 y tiene la misma estabilidad por el perodo de, por lo
vente, mezcla de 9 volmenes de etanol a 96% y 1 volumen menos, 20 minutos despus de la nebulizacin.
de hidrxido de amonio 13,5 M Solucin 1. Preparar solu-
cin de sulfanilamida SQR a 0,005% (p/v), usando el mismo 5.3.1.6 INVESTIGACIN DE IMPUREZAS
solvente Solucin 2. Aplicar separadamente sobre la cro- RELACIONADAS A FENOTIAZINAS
matoplaca 10 L de la Solucin 1 y de la Solucin 2. Desa- POR CROMATOGRAFA EN CAMADA
rrollar el cromatograma usando mezcla de 15 volmenes de
1-butanol y 3 volmenes de hidrxido de amonio M como DELGADA
eluyente. Retirar la cromatoplaca de la cuba, calentar a 105
C por 10 minutos y nebulizar con solucin a 0,1% (p/v) de PROCEDIMIENTO
4-dimetilaminobenzaldehdo en etanol a 96%, conteniendo
1% de cido clorhdrico (v/v): cualquier mancha secundaria Preparar cromatoplacas utilizando gel de slice GF254 como
obtenida en el cromatograma con la Solucin 1, diferente de soporte, operando en atmsfera de nitrgeno y al abrigo de
la mancha principal, no es ms intensa que aquella obtenida la luz. Preparar solucin conteniendo 2,0% (p/v) de la sus-
en el cromatograma con la Solucin 2. tancia en examen en mezcla de 95 volmenes de metanol
y 5 volmenes de dietilamina Solucin 1. Preparar solu-
PROCEDIMIENTO II cin a 0,01% (p/v) de la sustancia en examen, utilizando el
mismo solvente Solucin 2. Aplicar sobre la cromatopla-
Proceder a la cromatografa en camada delgada (5.2.17.1) ca, separadamente, 10 L de cada solucin recin prepara-
utilizando gel de slice H como soporte y mezcla de 20 vo- da. Usar fase mvil especificada en la monografa. Dejar el
lmenes de cloroformo, 2 volmenes de metanol y 1 volu- solvente subir 12 cm arriba del punto de aplicacin. Retirar
men de dimetilformamida como fase mvil. Aplicar sobre la cromatoplaca de la cuba, dejar secar al aire y exami-
la cromatoplaca, separadamente, 10 L de cada una de las nar bajo luz ultravioleta (254 nm). Despreciar cualquier
siguientes soluciones: 0,25% (p/v) de la sustancia en exa- mancha sobre a lnea base. Cualquier mancha secundaria
men en mezcla de 9 volmenes de etanol y 1 volumen de obtenida en el cromatograma con la Solucin 1, excepto la
hidrxido de amonio 13,5 M Solucin 1; 0,00125% (p/v) mancha principal, no es ms intensa que la mancha obteni-
de sulfanilamida SQR en el mismo solvente de la Solucin da con la Solucin 2, excepto si la monografa lo establece
1 Solucin 2. Desarrollar el cromatograma, dejar secar diferentemente.
al aire y revelar conforme prescrito en el Procedimiento
I: cualquier mancha secundaria obtenida con la Solucin Fases mviles
1, diferente de la mancha principal, no es ms intensa que
aquella obtenida en el cromatograma con la Solucin 2. A Mezcla de 80 volmenes de ciclohexano, 10 volmenes
de acetona y 10 volmenes de dietilamina
5.3.1.5 IDENTIFICACIN DE B Mezcla de 85 volmenes de hexano, 10 volmenes de
FENOTIAZINAS POR CROMATOGRAFA acetona y 5 volmenes de dietilamina
EN CAMADA DELGADA C Mezcla de 15 volmenes de 1-butanol y 3 volmenes de
hidrxido de amonio M
Proceder conforme descrito en Cromatografa en camada
delgada (5.2.17.1). Usar Kieselguhr G como soporte. Im-
5.3.2.1 ENSAYO LMITE PARA Preparacin estndar: transferir el volumen de cido clor-
CLORUROS hdrico estndar (HCl 0,01 M SV), indicado en la monogra-
fa, o en la Tabla 1, o calculado, para un tubo de Nessler y
Preparacin muestra: transferir la cantidad de muestra es- aadir un volumen de 30 a 40 ml de agua destilada.
pecificada en la monografa, o indicada en la Tabla 1, o
calculada, para un tubo de Nessler (capacidad de 50 ml Procedimiento: a los tubos de Nessler conteniendo la pre-
y 22 mm de dimetro interno), adicionando un volumen paracin estndar y la preparacin muestra, aadir 1 ml de
de 30 a 40 ml de agua destilada. Caso sea utilizada una cido ntrico SR. Si, despus de la acidificacin, la prepara-
solucin de la muestra, transferir el volumen de la solucin cin no est perfectamente lmpida, filtrar a travs de papel
especificado en la monografa, o calculado, para el tubo de de filtro exento de cloruro, transferir el filtrado para el tubo
Nessler y completar el volumen para 30 a 40 ml con agua de Nessler y aadir 1 ml de nitrato de plata SR. Completar
destilada. Neutralizar, si necesario, con cido ntrico SR el volumen para 50 ml con agua destilada y homogeneizar.
Se debe emplear una cantidad de muestra que posibilite el Dejar en reposo, al abrigo de la luz, durante 5 minutos. La
uso de volumen mayor del que 0,2 ml de cido clorhdrico turbidez de la preparacin muestra no debe ser superior a
estndar. la de la estndar.
5
Figura 1 - Lmites de impureza cloruro y cantidades correspondientes de la materia prima para realizarse el ensayo
considerando la utilizacin constante de 1,0 ml de la solucin estndar que contiene 3,546 x 10-4 g de cloruro.
Cantidad de muestra (g) Lmite de cloruro (ppm) Cantidad de muestra (g) Lmite de cloruro (ppm)
0,10 3546 (= 0,355%) 3,8 93
0,15 2364 (= 0,236%) 4,0 88
0,20 1773 (= 0,180%) 4,2 84
0,25 1418 (= 0,142%) 4,4 80
0,30 1182 (= 0,120%) 4,6 77
0,35 1013 (= 0,100%) 4,8 74
0,40 886 5,0 71
0,45 788 5,2 68
0,50 709 5,4 65
0,55 645 5,6 63
0,60 591 5,8 61
0,65 545 6,0 59
0,70 506 6,2 57
0,75 473 6,4 55
0,80 443 6,6 53
0,85 417 6,8 52
0,90 394 7,0 50
0,95 373 7,2 49
1,00 354 7,4 48
1,2 295 7,6 46
1,4 253 7,8 45
1,6 221 8,0 44
1,8 197 8,2 43
2,0 177 8,4 42
2,2 161 8,6 41
2,4 148 8,8 40
2,6 136 9,0 39
2,8 126 9,2 38
3,0 118 9,4 37
3,2 111 9,6 37
3,4 104 9,8 36
3,6 98 10,0 35
Siendo fija la cantidad de cloruro (= 3,546 x 10-4 g) en la est perfectamente lmpida, filtrar a travs de papel de filtro
preparacin estndar, si el lmite de cloruro en determinada exento de sulfato. Transferir lo filtrado para tubo de Ness-
sustancia fuese, por ejemplo, 354 ppm, se deber utilizar 1 ler. Se debe emplear una cantidad de muestra que posibilite
g de la sustancia para obtenerse hasta la misma turbidez del el uso de volumen mayor del que 0,2 ml de solucin de
estndar; si el lmite fuese de 71 ppm de cloruro, debern cido sulfrico estndar. Fijndose el volumen de solucin
ser utilizados 5 g de muestra y as sucesivamente. estndar en 2,5 ml puede calcularse m (masa en gramo de
la muestra) por la frmula:
Alternativamente, proceder conforme descrito en Croma-
tografa inica (5.2.17.4.1), utilizando cromatgrafo equi- m = 1200,8/ l
pado con columna de cambio aninica y detector por con-
ductividad con supresin qumica. siendo l el lmite de sulfato en ppm en la materia prima.
5.3.2.2. ENSAYO LMITE PARA Preparacin estndar: transferir el volumen de cido sul-
SULFATOS frico estndar (H2SO4 0,005 M SV) indicado en la mono-
grafa, o indicado en la Tabla 2, o calculado, para un tubo
Preparacin muestra: transferir la cantidad de la muestra de Nessler y aadir un volumen de 30 a 40 ml de agua
especificada en la monografa, o indicada en la Tabla 2, o destilada.
calculada, para un tubo de Nessler (capacidad de 50 ml y
22 mm de dimetro interno), adicionando 30 a 40 ml de Procedimiento: a los tubos de Nessler conteniendo la pre-
agua destilada. Caso sea utilizada una solucin de la mues- paracin estndar y la preparacin muestra, aadir 1 ml
tra, transferir el volumen de la solucin especificado en la de cido clorhdrico 3 M y 3 ml de cloruro de bario SR.
monografa, o calculado, para el tubo de Nessler y com- Completar el volumen para 50 ml con agua destilada. Ho-
pletar el volumen para 30 a 40 ml con agua destilada. Si mogeneizar. Dejar en reposo por cerca de 10 minutos. La
5
necesario, neutralizar con cido clorhdrico SR. Se puede, turbidez de la preparacin muestra no debe ser superior a
eventualmente, utilizar cido actico. Si la preparacin no la de la estndar.
Tabla 2 - Lmites de impureza sulfato y cantidades correspondientes de la materia prima para realizar el ensayo
considerando la utilizacin constante de 2,5 ml de la solucin estndar que contiene 1,2008 x 10-3 g de sulfato.
Cantidad de muestra (g) Lmite de sulfato (ppm) Cantidad de muestra (g) Lmite de sulfato (ppm)
0,50 2401 (= 0,240%) 4,6 261
0,55 2183 (= 0,220%) 4,8 250
0,60 2001 (= 0,200%) 5,0 240
0,65 1847 (= 0,185%) 5,2 231
0,70 1715 (= 0,171%) 5,4 222
0,75 1601 (= 0,160%) 5,6 214
0,80 1501 (= 0,150%) 5,8 207
0,85 1412 (= 0,141%) 6,0 200
0,90 1334 (= 0,133%) 6,2 194
0,95 1264 (= 0,126%) 6,4 187
1,00 1200 (= 0,120%) 6,6 182
1,2 1001 (= 0,100%) 6,8 177
1,4 858 7,0 171
1,6 750 7,2 166
1,8 667 7,4 162
2,0 600 7,6 158
2,2 546 7,8 154
2,4 500 8,0 151
2,6 462 8,2 146
2,8 429 8,4 143
3,0 400 8,6 139
3,2 375 8,8 136
3,4 353 9,0 133
3,6 333 9,2 130
3,8 316 9,4 127
4,0 300 9,6 125
4,2 286 9,8 122
4,4 273 10,0 120
Siendo fija la cantidad de sulfato (= 1,2008 x 10-3 g), si el Preparo del reactivo de tioacetamida: disolver 4 g de tioa-
lmite de sulfato en determinada sustancia fuese, por ejem- cetamida en agua y completar el volumen a 100 ml. Tomar
plo, 500 ppm, debern ser utilizados 2,4 g de muestra para 0,2 ml y aadir a 1 ml de la mezcla de hidrxido de sodio
obtenerse hasta la misma turbidez del estndar; si el lmite M, 5 ml de agua y 20 ml de glicerina. Calentar en bao
fuese de 151 ppm de sulfato, debern ser utilizados 8 g de mara por 20 s, enfriar y utilizar inmediatamente.
muestra y as sucesivamente.
MTODO I
Alternativamente, proceder conforme descrito en Croma-
tografa inica (5.2.17.4.1), utilizando cromatgrafo equi- Preparacin muestra: transferir para tubo adecuado solu-
pado con columna de cambio aninica y detector por con- cin de la muestra preparada conforme especificado en la
ductividad con supresin qumica. monografa y diluir para 25 ml con agua, o disolver y diluir
con agua para 25 ml a cantidad de muestra, en gramos, es-
5.3.2.3 ENSAYO LMITE PARA METALES pecificada en la monografa o calculada segn a ecuacin:
PESADOS
2 / (1000l)
La determinacin de metales pesados puede ser efectuada
por en que
l = lmite de metales pesados en la muestra en porcentaje
dos mtodos: ensayo lmite por formacin de partculas (p/p).
slidas de sulfuros o determinacin por espectrometra
atmica. Ajustar el pH entre 3,0 y 4,0 con cido actico M o hi-
drxido de amonio 6 M utilizando papel indicador de ban-
El ensayo lmite consiste en la formacin de partculas s- da estrecha como indicador externo. Diluir con agua para
5
lidas de los sulfuros de metales pesados, en suspensin, y aproximadamente 40 ml y homogeneizar.
posterior comparacin visual de la intensidad del color en
las preparaciones muestra y estndar en tubo de Nessler. El Preparacin estndar: transferir para tubo adecuado 2 ml
ensayo es semi cuantitativo y posibilita inferir si a muestra de solucin estndar de plomo (10 ppm Pb) y diluir para 25
pasa o no en la prueba, representando la suma de la con- ml con agua. Ajustar el pH entre 3,0 y 4,0 con cido actico
centracin de los elementos contaminantes en la muestra. M o hidrxido de amonio 6 M utilizando papel indicador
de banda estrecha como indicador externo. Diluir con agua
El mtodo por espectrometra atmica posibilita cuan- para aproximadamente 40 ml y homogeneizar.
tificar cada elemento contaminante en la muestra y lmi-
tes diferenciados son establecidos para cada elemento de Preparacin control: transferir para un tercer tubo volu-
acuerdo con su toxicidad y el tipo de forma farmacutica. men de solucin de la muestra preparada conforme descri-
Elementos como As, Cd, Pb y Hg, debido a la elevada to- to en la monografa o en preparacin muestra y aadir 2 ml
xicidad presentan lmites ms bajos que los dems. Debido de solucin estndar de plomo (10 ppm Pb). Ajustar el pH
a la mayor biodisponibilidad de elementos eventualmente entre 3,0 y 4,0 con cido actico M o hidrxido de amonio
presentes en sustancias utilizadas en la fabricacin de pro- 6 M utilizando papel indicador de banda estrecha como in-
ductos parenterales, los lmites requeridos son inferiores dicador externo. Diluir con agua para aproximadamente 40
aquellos relacionados para utilizacin por va oral. ml y homogeneizar.
MTODO DEL ENSAYO LMITE Procedimiento: cada una de las preparaciones aadir 2 ml
de tampn acetato pH 3,5 y 1,2 ml de tioacetamida. Diluir
Reactivos especiales con agua para 50 ml, homogeneizar y dejar en reposo por
2 minutos. Despus de 2 minutos, se desarrollar tonalidad
Solucin stock de nitrato de plomo: disolver, exactamente, que vara del amarillo al negro. Observar las preparaciones
159,8 mg de nitrato de plomo en 100 ml de agua adicio- de arriba para abajo, segn el eje vertical del tubo, sobre
nada de 1 ml de cido ntrico. Diluir con agua para 1000 fondo blanco. Cualquier coloracin desarrollada en la pre-
ml y homogeneizar. Preparar y almacenar esa solucin en paracin muestra no es ms intensa que en la estndar. La
recipientes de vidrio exentos de sales solubles de plomo. prueba solamente es vlida si la intensidad de la coloracin
desarrollada en la preparacin control fuese igual o supe-
Solucin estndar de plomo (10 ppm Pb): en el da del uso, rior a aquella de la estndar.
diluir 10 ml de la solucin stock de nitrato de plomo para
100 ml con agua. Cada mililitro de esa solucin contiene el MTODO II
equivalente a 10 g de plomo (10 ppm Pb).
Preparacin muestra: transferir para tubo adecuado so-
Tampn acetato pH 3,5: disolver 25,0 g de acetato de amo- lucin de la muestra preparada conforme especificado en
nio en 25 ml de agua y aadir 38 ml de cido clorhdrico la monografa y diluir para 25 ml con solvente orgnico
6 M. si necesario, ajustar el pH en 3,5 con hidrxido de (dioxano o acetona, conteniendo, en el mnimo, 15% v/v
amonio 6 M o cido clorhdrico 6 M. Diluir para 100 ml de agua), o disolver y diluir con el mismo solvente para 25
con agua y homogeneizar. ml la cantidad de muestra, en gramos, especificada en la
monografa o calculada segn a ecuacin:
5
de solucin estndar de plomo (10 ppm Pb). Ajustar el pH Preparacin control: transferir para un tercer tubo volu-
entre 3,0 y 4,0 con cido actico M o hidrxido de amonio men de solucin de la muestra preparada conforme descri-
6 M utilizando papel indicador de banda estrecha como in- to en la monografa o en preparacin muestra y aadir 2 ml
dicador externo. Diluir con el mismo solvente empleado de solucin estndar de plomo (10 ppm Pb). Ajustar el pH
para la disolucin de la muestra para aproximadamente 40 entre 3,0 y 4,0 con cido actico M o hidrxido de amonio
ml y homogeneizar. 6 M utilizando papel indicador de banda estrecha como in-
dicador externo. Diluir con el mismo solvente empleado
Procedimiento: cada una de las preparaciones aadir 2 ml para la disolucin de la muestra para aproximadamente 40
de tampn acetato pH 3,5 y 1,2 ml de tioacetamida. Diluir ml y homogeneizar.
con agua para 50 ml, homogeneizar y dejar en reposo por 2
minutos. Despus de 2 minutos, se desarrollar coloracin Procedimiento: cada una de las preparaciones aadir 2 ml
que vara del amarillo al negro. Observar las preparaciones de tampn acetato pH 3,5 y 1,2 ml de tioacetamida. Diluir
de arriba para abajo, segn el eje vertical del tubo, sobre con agua para 50 ml, homogeneizar y dejar en reposo por 2
fondo blanco. Cualquier coloracin desarrollada en la pre- minutos. Despus de 2 minutos, se desarrollar coloracin
paracin muestra no es ms intensa del que en la estndar. que vara del amarillo al negro. Observar las preparaciones
La prueba solamente es vlida si la intensidad de la colo- de arriba para abajo, segn el eje vertical del tubo, sobre
racin desarrollada en la preparacin control fuese igual o fondo blanco. Cualquier coloracin desarrollada en la pre-
superior a aquella en la estndar. paracin muestra no es ms intensa del que aquella en la
estndar. La prueba solamente es vlida si la intensidad de
MTODO III la coloracin desarrollada en la preparacin control fuese
igual o superior a aquella en la estndar.
Preparado de la muestra: utilizar la cantidad de muestra,
en gramos, especificada en la monografa o calculada se- MTODO IV
gn la ecuacin:
Preparado de la muestra: Pesar, exactamente, cantidad de
2 / (1000l) muestra recomendada en la monografa o calculada segn
la ecuacin:
en que
l = lmite de metales pesados en la muestra en porcentaje 2 / (1000l)
(p/p).
en que
Transferir la muestra para crisol adecuado, aadir cido l = lmite de metales pesados en la muestra en porcentaje
sulfrico suficiente para humedecer la sustancia e incine- (p/p).
rar, cuidadosamente, bajo temperatura baja. Aadir a la
masa carbonizada 2 ml de cido ntrico y 5 gotas de cido Transferir para tubo de digestin de vidrio borosilicato de
sulfrico. Calentar, con cuidado, hasta que no se despren- 100 ml y aadir cerca de 10 ml de cido ntrico. Proceder
dan ms vapores blancos. Incinerar en mufla a 500 600 a la digestin en chapa de calentamiento o bloque digestor
C hasta completa combustin del carbono. en temperatura de 120 C, durante 3 horas. Se recomienda
calentar el sistema lentamente, para evitar proyeccin de
la muestra. Caso haya evaporacin del cido, aadir otra Preparacin estndar: transferir para tubo adecuado 2 ml
alcuota de 5 ml. Caso una preparacin lmpida no sea ob- de solucin estndar de plomo (10 ppm Pb) y diluir para 25
tenida, aadir, despus de enfriamiento, 2 ml de perxido ml con agua. Ajustar el pH entre 3,0 y 4,0 con cido actico
de hidrgeno a 30% (p/p) y calentar a 140 C por una hora M o hidrxido de amonio 6 M utilizando papel indicador
ms. Enfriar y diluir, cautelosamente, con pequeo volu- de banda estrecha como indicador externo. Diluir con agua
men de agua. Transferir, con lavado, para tubo de Nessler para aproximadamente 40 ml y homogeneizar.
de 50 ml, sin asar los 25 ml.
Preparacin control: transferir para un tercer tubo volu-
Preparacin estndar: transferir para tubo adecuado 2 ml men de solucin de la muestra preparada conforme descri-
de solucin estndar de plomo (10 ppm Pb) y diluir para 25 to en la monografa o en preparacin muestra y aadir 2 ml
ml con agua. Ajustar el pH entre 3,0 y 4,0 con cido actico de solucin estndar de plomo (10 ppm Pb). Ajustar el pH
M o hidrxido de amonio 6 M utilizando papel indicador entre 3,0 y 4,0 con cido actico M o hidrxido de amonio
de banda estrecha como indicador externo. Diluir con agua 6 M utilizando papel indicador de banda estrecha como in-
para aproximadamente 40 ml y homogeneizar. dicador externo. Diluir con agua para aproximadamente 40
ml y homogeneizar.
Preparacin control: transferir para un tercer tubo volu-
men de solucin de la muestra preparada conforme descri- Procedimiento: cada una de las preparaciones aadir 2 ml
to en la monografa o en preparacin muestra y aadir 2 ml de tampn acetato pH 3,5 y 1,2 ml de tioacetamida. Diluir
de solucin estndar de plomo (10 ppm Pb). Ajustar el pH con agua para 50 ml, homogeneizar y dejar en reposo por 2
entre 3,0 y 4,0 con cido actico M o hidrxido de amonio minutos. Despus de 2 minutos, se desarrollar coloracin
6 M utilizando papel indicador de banda estrecha como in- que vara del amarillo al negro. Observar las preparacio-
dicador externo. Diluir con agua para aproximadamente 40 nes de arriba para abajo, segn el eje vertical del tubo, so-
ml y homogeneizar. bre fondo blanco. Cualquier coloracin desarrollada en la
5
preparacin muestra no es ms intensa del que aquella en
Procedimiento: cada una de las preparaciones aadir 2 ml la estndar. La prueba solamente es vlida si la intensidad
de tampn acetato pH 3,5 y 1,2 ml de tioacetamida. Diluir de la coloracin desarrollada en la preparacin control es
con agua para 50 ml, homogeneizar y dejar en reposo por 2 igual o superior a aquella en la estndar.
minutos. Despus de 2 minutos, se desarrollar coloracin
que vara del amarillo al negro. Observar las preparaciones MTODO DE ESPECTROMETRA ATMICA
de arriba para abajo, segn el eje vertical del tubo, sobre
fondo blanco. Cualquier coloracin desarrollada en la pre- Utilizar tcnicas de espectrometra atmica para determi-
paracin muestra no es ms intensa del que en la estndar. nacin de As, Cd, Cr, Cu, Hg, Ir, Mn, Mo, Ni, Os, Pb, Pd,
La prueba solamente es vlida si la intensidad de la colo- Pt, Rh, Ru y V, conforme Espectrometra atmica (5.2.13).
racin desarrollada en la preparacin control fuese igual o No obstante, diferentes procedimientos de preparado de la
superior a aquella en la estndar. muestra pueden ser aplicados, como demostrado en la Fi-
gura 1.
MTODO V
Sim
Sim
En el caso de sustancias solubles en agua, no hay necesidad Mtodo de combustin iniciada por micro ondas en
de la descomposicin previa de la muestra y esa puede ser sistema presurizado
analizada directamente despus de disolucin. Caso no sea
soluble en agua y presentar solubilidad en otro solvente, Proceder conforme descrito en el tem Mtodos de combus-
la sustancia puede ser analizada directamente despus de tin (5.3.3.3).
disolucin si no hubiere incompatibilidad entre el solvente
y la tcnica de espectrometra atmica utilizada. Cuando En principio, los dos procedimientos de descomposicin
ninguna de las condiciones anteriores sea atendida, se re- descritos pueden ser utilizados indistintamente. No obs-
comienda la descomposicin previa de la muestra. En esos tante, se recomienda la utilizacin de la descomposicin
casos, dos procedimientos son recomendados: por va hmeda debido a mayor simplicidad y capacidad
de procesamiento de muestras. Otros reactivos, tales como
Descomposicin por va hmeda en sistema cerrado cido clorhdrico, cido sulfrico, perxido de hidrgeno
y cido fluorhdrico (no puede ser utilizado en frascos de
Pesar, exactamente, cantidad de muestra entre 0,1 y 0,5 g cuarzo), tambin, pueden ser utilizados en la etapa de di-
de muestra y aadir cido ntrico conforme recomendacin gestin, dependiendo de la necesidad.
del fabricante y proceder a digestin en sistema cerrado
con calentamiento convencional o con micro ondas en La descomposicin por combustin iniciada por micro on-
temperatura de 180 C o superior. En los sistemas que em- das es recomendada en los casos en que la digestin por va
plean calentamiento convencional y micro ondas, cuando hmeda no sea eficiente para muestras orgnicas.
no hubiere especificacin en la monografa, se recomienda
la digestin por 240 min y 20 min, respectivamente. Los lmites mximos permitidos para cada elemento estn
descritos en la Tabla 1.
5
Tabla 1 - Lmites permitidos de impurezas de metales y no metales.
Uso oral Uso parenteral
Elemento
Lmite mximo (g g-1) Lmite mximo (g g-1)
Arsnico (As) 1,5 0,15
Cadmio (Cd) 0,5 0,05
Plomo (Pb) 1,0 0,1
Mercurio (Hg) 1,5 0,15
Cromo (Cr) 25 2,5
Cobre (Cu) 250 25
Manganeso (Mn) 250 25
Molibdeno (Mo) 25 2,5
Nquel (Ni) 25 2,5
Paladio (Pd) 10 1,0
Platino (Pt) 10 1,0
Vanadio (V) 25 2,5
Iridio (Ir) La suma de la concentracin no La suma de la concentracin no
Osmio (Os) puede exceder 10 puede exceder 10
Rodio(Rh)
Rutenio (Ru)
5.3.2.4 ENSAYO LMITE PARA HIERRO MTODO I
Solucin estndar de hierro (100 ppm Fe): disolver 0,8634 Preparacin muestra: disolver cantidad de la muestra es-
g de sulfato frrico amoniacal decahidratado en agua des- pecificada en la monografa, o en la Tabla 1, o calculada,
tilada en un baln volumtrico de 1000 ml. Aadir 5 ml en solvente adecuado, transferir para tubo de Nessler (ca-
de cido sulfrico SR y completar el volumen con agua pacidad de 50 ml y 22 mm de dimetro interno). Aadir
destilada. agua destilada, o el solvente indicado en la monografa, en
cantidad suficiente para 40 ml. Aadir 2 ml de cido ctrico
Solucin estndar de hierro (10 ppm Fe): diluir 10 ml de la a 20% (p/v).
Solucin estndar de hierro (100 ppm Fe) con agua desti-
lada y completar el volumen para 100 ml. Fijndose el volumen de la Solucin estndar de hierro
(100 ppm Fe) en 1 ml, se puede calcular el valor de m
Solucin estndar de hierro (2 ppm Fe): diluir 2 ml de la (masa en gramo de la muestra) por la frmula:
Solucin estndar de hierro (100 ppm Fe) con agua desti-
lada y completar el volumen para 100 ml. 100
m=
l
Preparacin padro: empregar 10 mL de Soluo padro monografa, o el volumen calculado, conforme descrito en
de ferro (10 ppm de Fe) ou 1 mL da Soluo padro de fer- la preparacin muestra.
ro (100 ppm Fe), conforme Tabela 1, ou volume calculado,
adicionar gua destilada, ou o solvente indicado na mono- Procedimiento: concomitantemente, aadir a los tubos
grafia, em quantidade suficiente para 40 mL. Adicionar 2 conteniendo las preparaciones muestra y estndar, 3 ml de
mL de cido ctrico a 20% (p/v). tiocianato de potasio M, completar el volumen para 50 ml,
homogeneizar y dejar en reposo por 5 minutos. La colora-
Procedimento: concomitantemente, acrescentar aos tubos cin producida en la preparacin muestra no debe ser ms
contendo as preparaes amostra e padro duas gotas de intensa que en la estndar.
cido tiogliclico. Homogeneizar, alcalinizar com hidrxi-
do de amnio, completar o volume para 50 mL com gua MTODO III
destilada e homogeneizar. Deixar em repouso por 5 minu-
tos. A cor rsea produzida na preparao amostra no deve Preparacin muestra: transferir para un tubo de Nessler
ser mais intensa do que na padro. (capacidad de 50 ml y 22 mm de dimetro interno) la canti-
dad de muestra especificada en la monografa, o calculada,
MTODO II o el volumen de la solucin de la muestra indicado en la
monografa. Diluir para 40 ml con agua destilada. Aadir 2
Preparacin amostra: dissolver quantidade da amostra es- ml de cido clorhdrico M y homogeneizar.
pecificada na monografia, ou calculada, em solvente ade-
quado, ou utilizar volumen de la solucin de la muestra Preparacin estndar: transferir el volumen de la Solucin
conforme especificado en la monografa. Aadir 2 ml de estndar de hierro (10 ppm Fe) indicado en la monografa,
cido clorhdrico 2 M y 0,5 ml de agua de bromo SR. Des- o volumen calculado, para un tubo de Nessler y proceder
pus de 5 minutos, retirar el exceso de bromo por corriente conforme descrito en la preparacin muestra.
5
de aire en campana (CUIDADO! REACTIVO TXICO)
y transferir para tubo de Nessler (capacidad de 50 ml y 22 Procedimiento: aadir a los tubos conteniendo las prepa-
mm de dimetro interno). raciones muestra y estndar 50 mg de cristales de peroxi-
disulfato de amonio. Aadir 3 ml de tiocianato de amonio
Preparacin estndar: someter el volumen de la Solucin SR, completar el volumen para 50 ml con agua destilada y
estndar de hierro (2 ppm o 10 ppm de Fe) indicado en la homogeneizar. La coloracin producida en la preparacin
muestra no debe ser ms intensa que en la estndar.
Tabla 1 - Lmites de impureza hierro y cantidad correspondientes de la materia prima para realizar el ensayo considerando a
utilizacin constante de 1,0 ml de la solucin estndar de hierro de 100 ppm, que contiene 10-4 g de hierro, en la preparacin estndar.
Cantidad de muestra (g) Lmite de hierro (ppm) Cantidad de muestra (g) Lmite de hierro (ppm)
0,100 1000 0,4 250
0,105 950 0,5 200
0,111 900 0,667 150
0,116 850 1 100
0,125 800 1,111 90
0,133 750 1,250 80
0,143 700 1,429 70
0,154 650 1,667 60
0,167 600 2 50
0,182 550 2,5 40
0,200 500 3,333 30
0,222 450 5 20
0,250 400 10 10
0,285 350 20 5
0,333 300
5.3.2.5 ENSAYO LMITE PARA ARSNICO 10 ml, de acuerdo con la necesidad del laboratorio) Pre-
servar el medio ambiente. Aadir 1 ml de cido sulfrico M
MTODO ESPECTROFOTOMTRICO y completar el volumen con agua recin hervida y, poste-
riormente, enfriada. Homogeneizar. Conservar la solucin
El mtodo est basado en la reaccin entre el arsano (AsH3) en recipiente de vidrio y utilizar en hasta 3 das. Cada ml de
liberado y dietilditiocarbamato de plata que forman com- la solucin obtenida contiene 1 g de arsnico.
plejo rojo; la absorcin de la radiacin puede ser medida en
espectrofotmetro o colormetro. Mtodo I
Dos mtodos pueden ser empleados diferendo, apenas, en Preparacin muestra: transferir para frasco generador de
el preparado de la muestra y del estndar. El Mtodo I es, arsano la cantidad de sustancia indicada en la monografa,
en general, utilizado para sustancias inorgnicas, mientras o la cantidad calculada.
el Mtodo II es empleado para sustancias orgnicas.
Fijndose el volumen de la solucin estndar de arsnico
El sistema utilizado Figura 1 comprende: (a) gene- en 3 ml se puede calcular m (masa en gramo de la muestra)
rador de arsano; (b) y (d) juntas; (c) unidad esmerilada; por la frmula:
(e) tubo de absorcin. Otro sistema adaptado que tenga las
caractersticas esenciales del presentado puede, eventual- m = 3/l
mente, ser utilizado
siendo l el lmite de arsnico en ppm en la materia prima.
5
de potasio SR, 0,5 ml de cloruro de estao SR fuertemente
cido y 1 ml de alcohol isoproplico. Homogeneizar. De-
jar en reposo por 30 minutos a temperatura ambiente. En
la unidad (c) del aparato descrito, colocar dos porciones
de algodn embebidas en solucin saturada de acetato de
plomo, dejando entre ellas espacio de 2 mm. El exceso de
la solucin debe ser eliminado exprimiendo las porciones
de algodn y secndolas a presin reducida a temperatura
ambiente. Las juntas (b) y (d) deben ser lubricadas con va-
selina y unidas como en la Figura 1.
cuidado, tambin, en la presencia de compuestos haloge- Procedimiento: proceder conforme descrito en el Mtodo I.
nados, especialmente, cuando se caliente la muestra con
cido sulfrico y, posteriormente, aadir perxido de hi- Nota: antimonio es interferente de la reaccin, una vez que
drgeno a 26% (v/v). El calentamiento debe ser ms suave forma estibina (SbH3) dando resultado falsamente positivo
impidiendo que alcance la temperatura de ebullicin de la en el desarrollo de color con dietilditiocarbamato de plata
mezcla y carbonizacin para evitar la prdida de arsnico. SR. En esos casos, se debe comparar las preparaciones en
largo de onda de 535 y 540 nm, en el cual la interferencia
Preparacin muestra: transferir para el frasco generador de la estibina es insignificante.
cantidad de la muestra especificada en la monografa, o
calculada. MTODO DE ESPECTROMETRA DE ABSORCIN
ATMICA CON GENERACIN DE HIDRUROS
Fijndose el volumen de la solucin estndar de arsnico
en 3 ml se puede calcular m (masa en gramo de la muestra) Proceder a preparacin muestra conforme descrito en el
por la frmula: tem Descomposicin por va hmeda en sistema cerrado
Ensayo lmite para metales pesados (5.3.2.3) y determinar
m = 3/l por Espectrometra de absorcin atmica con generacin
de hidruros (5.2.13.1.2). Proceder de acuerdo con las es-
siendo l el lmite de arsnico en ppm en la materia prima. pecificaciones del fabricante empleando largo de onda de
193,7 nm y resolucin del monocromador de (0,5 0,1)
Aadir 5 ml de cido sulfrico y perlas de vidrio. Si nece- nm.
sario, emplear mayor cantidad del cido para humedecer
completamente la sustancia cuidando para que el volu- MTODO DE ESPECTROMETRA DE EMISIN PTI-
men no rebase 10 ml. Proceder a digestin en campana de CA CON PLASMA INDUCTIVAMENTE ACOPLADO
5
preferencia usando placa de calentamiento con tempera-
tura no superior a 120 C por tiempo necesario al inicio Proceder a preparacin de la muestra conforme descrito en
de la digestin. Una vez iniciada la descomposicin de la el tem Descomposicin por va hmeda en sistema cerra-
muestra, aadir gota a gota, cuidadosamente, perxido de do Ensayo lmite para metales pesados (5.3.2.3) y deter-
hidrgeno concentrado. Esperar que la reaccin se ablan- minar por Espectrometra de emisin ptica con plasma
de y, entonces, calentar entre adicin de cada gota. Caso inductivamente acoplado (5.2.13.2.2). Proceder de acuer-
haya exceso de espuma, interrumpir el calentamiento. As do con las especificaciones del fabricante. Se recomienda
que disminuya la intensidad de la reaccin, calentar, cau- la utilizacin del largo de onda de 188,979 a 189,042 nm.
telosamente, con agitacin del frasco para promover ca-
lentamiento homogneo. Es necesario que se mantengan 5.3.2.6 ENSAYO LMITE PARA
las condiciones oxidantes durante toda la digestin. Para AMONACO
ello, aadir pequeas cantidades de perxido de hidrgeno
concentrado siempre que la mezcla se torne marrn o se Solucin estndar de amonaco (2,5 ppm NH3): transferir
oscurezca. Destruida la materia orgnica, aumentar pau- 1 ml de la solucin de cloruro de amonio 0,00741% (p/v)
latinamente la temperatura de calentamiento permitiendo para un baln volumtrico de 10 ml. Completar el volumen
que los vapores de trixido de azufre sean desprendidos con agua destilada.
y la solucin se torne incolora o levemente beige. Enfriar,
aadir, cuidadosamente, 10 ml de agua destilada, evaporar Solucin estndar de amonaco (1 ppm NH3): diluir 40 ml
hasta el trixido de azufre sea nuevamente desprendido y de la solucin estndar de amonaco (2,5 ppm de NH3) para
enfriar. Caso necesario, repetir la operacin, removiendo 100 ml con agua destilada.
trazos de perxido de hidrgeno. Enfriar y aadir 10 ml de
agua destilada. Lavar el frasco y diluir con agua destilada Preparacin muestra: disolver la cantidad indicada de la
completando el volumen para 35 ml. Proceder como en la sustancia en anlisis en 12 ml de agua destilada, alcalini-
preparacin muestra del Mtodo I iniciando por Aadir 20 zar, si necesario, con hidrxido de sodio 2 M. Transferir
ml de cido sulfrico M.... para baln volumtrico de 15 ml, aadir 0,3 ml de solucin
alcalina de tetrayodomercurato (II) de potasio y completar
Preparacin estndar: transferir para frasco generador de el volumen con agua destilada. Homogeneizar y dejar en
arsano 3 ml de la Solucin estndar de arsnico y aadir reposo por 5 minutos. Transferir para un tubo de Nessler
2 ml de cido sulfrico. Homogeneizar. Aadir el mismo (capacidad de 50 ml y dimetro interno de 22 mm).
volumen de perxido de hidrgeno concentrado emplea-
do para la preparacin muestra. Proceder, en seguida, al Preparacin estndar: transferir 10 ml de solucin estn-
calentamiento de la solucin obtenida hasta que se formen dar de amonaco (1 ppm de NH3), o el volumen calculado,
vapores. Enfriar y aadir, cuidadosamente, 10 ml de agua para baln volumtrico de 15 ml, aadir 4,0 ml de agua
destilada. Repetir el procedimiento de calentamiento con destilada, 0,3 ml de solucin alcalina de tetrayodomercu-
ms 10 ml y, despus de, enfriar nuevamente y diluir con rato (II) de potasio y completar el volumen. Homogeneizar
agua destilada para completar 35 ml. Proceder como para y dejar en reposo por 5 minutos. Transferir para un tubo
la preparacin muestra. de Nessler.
Procedimiento: comparar el color desarrollado en las pre- (10 ppm Mg) y 9 ml de agua destilada. Proceder conforme
paraciones. El color amarillo producido en la preparacin preparacin muestra.
muestra no debe ser ms intenso que en la estndar.
Procedimiento: transferir la preparacin muestra para un
5.3.2.7 ENSAYO LMITE PARA CALCIO embudo de separacin y extraer 2 veces, agitando por 1 mi-
nuto cada vez, con 5 ml de una solucin de hidroxiquinolina
Solucin estndar alcohlica de calcio (100ppm Ca): pe- a 0,1% (p/v) en cloroformo. Descartar las fases orgnicas
sar, exactamente, 2,5 g de carbonato de calcio y transferir y aadir a la fase acuosa 0,4 ml de butilamina y 0,1 ml de
para baln volumtrico de 1000 ml con 12 ml de cido ac- trietanolamina. Ajustar el pH entre 10,5-11,5 si necesario.
tico. Disolver y completar el volumen con agua destilada. Aadir 4 ml de la solucin de hidroxiquinolina a 0,1% (p/v)
Transferir, inmediatamente antes del uso, 10 ml de esa so- en cloroformo y agitar por 1 minuto. Utilizar la fase inferior
lucin para baln volumtrico de 100 ml y completar el para a comparacin. Proceder de la misma manera con la
volumen con etanol. preparacin estndar. La coloracin producida en la prepa-
racin muestra no debe ser ms intensa que en la estndar.
Solucin estndar de calcio (10 ppm Ca): pesar, exacta-
mente, 0,624 g de carbonato de calcio y transferir para Alternativamente, proceder a la determinacin de magne-
baln volumtrico de 250 ml con 3 ml de cido acti- sio por Espectrometra de absorcin atmica con llama
co. Disolver y completar el volumen con agua destilada. (5.2.13.1.1) empleando llama del tipo aire acetileno, largo
Transferir, inmediatamente antes del uso, 10 ml de esa so- de onda de 285,2 nm y resolucin del monocromador de
lucin para baln volumtrico de 1000 ml y completar el (1,2 0,1) nm; o Espectrometra de emisin ptica con
volumen con agua. plasma inductivamente acoplado (5.2.13.2.2) empleando
largo de onda de 285,213 nm.
Preparacin muestra: aadir 1 ml de oxalato de amonio
5
SR a un tubo de Nessler (capacidad de 50 ml y 22 mm de 5.3.2.9 ENSAYO LMITE PARA
dimetro interno) conteniendo 0,2 ml de la solucin estn- MAGNESIO Y METALES ALCALINOS
dar alcohlica de calcio (100 ppm Ca). Aguardar 1 minuto, TERROSOS
aadir mezcla de 1 ml de cido actico diluido y 15 ml de
la solucin de la muestra preparada como descrita en la A 200 ml de agua destilada aadir 0,1 g de clorhidrato de
monografa. hidroxilamina, 10 ml de tampn cloruro de amonio pH 10,
1 ml de solucin de sulfato de zinc 0,1 M y cerca de 15 mg
Preparacin estndar: transferir para un tubo de Nessler de negro de eriocromo T. Calentar a, aproximadamente, 40
las mismas cantidades de oxalato de amonio SR y de la C. Titular con EDTA disdico 0,01 M SV hasta que la
solucin estndar alcohlica de calcio (100 ppm Ca) con- coloracin violeta cambie para azul. Aadir a esa solucin
forme preparacin muestra. Aguardar 1 minuto, aadir cantidad recomendada de la muestra disuelta en 100 ml de
mezcla de 10 ml de la solucin estndar de calcio (10 ppm agua destilada o preparada de modo descrito en la mono-
Ca), 1 ml de cido actico diluido y 5 ml de agua destilada. grafa. Si la coloracin de la solucin cambia para violeta,
titular con EDTA disdico 0,01 M SV hasta el cambio para
Procedimiento: Homogeneizar las preparaciones en los tu- azul. El volumen de la solucin de EDTA disdico 0,01 M
bos de Nessler. Despus de 15 minutos, la turbidez de la SV utilizado en la segunda titulacin no debe exceder el
preparacin muestra no debe ser ms intensa que la de la volumen establecido en la monografa.
estndar.
5.3.2.10 ENSAYO LMITE PARA
Alternativamente, proceder al preparado de la muestra ALUMINIO
conforme indicado en la monografa y efectuar la determi-
nacin de calcio por Espectrometra de absorcin atmica Solucin estndar de aluminio (200 ppm Al): tratar una
con llama (5.2.13.1.1) empleando llama del tipo aire ace- porcin de aluminio metlico con cido clorhdrico 6 M
tileno, largo de onda de 422,7 nm y resolucin del mono- a 80 C por pocos minutos. Pesar 100 mg de la porcin
cromador de (0,7 0,1) nm; o Espectrometra de emisin tratada y disolver en mezcla de 10 ml de cido clorhdrico
ptica con plasma inductivamente acoplado (5.2.13.2.2) y 2 ml de cido ntrico, a 80 C por, aproximadamente,
empleando el largo de onda de 393,366 nm. 30 minutos. Mantener bajo calentamiento hasta reduccin
del volumen para cerca de 4 ml. Enfriar hasta temperatura
5.3.2.8 ENSAYO LMITE PARA ambiente y aadir 4 ml de agua destilada. Dejar evaporar
MAGNESIO hasta obtener el volumen de 2 ml. Enfriar y transferir la
solucin, cuantitativamente, usando agua destilada, para
Preparacin muestra: aadir 0,1 g de tetraborato sdico a baln volumtrico de 100 ml. Completar el volumen con
10 ml de la solucin de la muestra preparada conforme lo agua destilada y homogeneizar. Pipetear 20 ml de esa so-
especificado en la monografa. Ajustar el pH entre 8,8-9,2 lucin y transferir para otro baln volumtrico de 100 ml.
con cido clorhdrico SR o hidrxido de sodio SR. Completar el volumen con agua destilada y homogeneizar.
Preparacin estndar: aadir 0,1 g de tetraborato sdico Solucin estndar de aluminio (10 ppm Al): transferir, in-
a una mezcla de 1 ml de la solucin estndar de magnesio mediatamente antes del uso, 5 ml de la Solucin estndar
de aluminio (200ppm Al) para baln volumtrico de 100
ml; completar el volumen con agua destilada y homoge- tiplicacin de la concentracin de la preparacin muestra
neizar. en ppm por 100/P en la cual P es la masa en gramos de la
sustancia utilizada en la preparacin muestra.
Solucin estndar de aluminio (2 ppm Al): transferir, inme-
diatamente antes del uso, 1 ml de la Solucin estndar de MTODO III
aluminio (200ppm Al) para baln volumtrico de 100 ml;
completar el volumen con agua destilada y homogeneizar. Proceder conforme descrito en el Mtodo II y efectuar la
determinacin por Espectrometra de emisin ptica con
Solucin diluyente de cido ntrico: transferir 40 ml de ci- plasma inductivamente acoplado (5.2.13.2.2). Proceder de
do ntrico para baln volumtrico de 1000 ml; completar el acuerdo con las especificaciones del fabricante. Se reco-
volumen con agua destilada y homogeneizar. mienda la utilizacin del largo de onda de 396,153 nm.
5
preparaciones muestra y estndar y extraer con 3 porciones la muestra preparada conforme descrito en la monografa
(20, 20 y 10 ml) de la solucin de hidroxiquinolina a 0,5% para baln volumtrico de 100 ml y completar el volumen
(p/v) en cloroformo. Juntar los extractos clorofrmicos y di- con solvente adecuado. Transferir esa solucin para vaso
luir para 50 ml con cloroformo. Realizar una preparacin en de precipitados y aadir 4 ml de reactivo sulfomolbdico,
blanco utilizando el mismo solvente. Medir la intensidad de 0,1 ml de cloruro estaoso SR y homogeneizar.
la fluorescencia (5.2.15) de la preparacin muestra (I1), de la
preparacin estndar (I2) y de la preparacin en blanco (I3) Preparacin estndar: transferir 2 ml de la Solucin estn-
utilizando largo de onda de excitacin de 392 nm y mono- dar de fosfato (5 ppm) para baln volumtrico de 100 ml
cromador ajustado en 518 nm. La fluorescencia de la prepa- y completar el volumen con solvente adecuado. Continuar
racin muestra (I1), descontada de la preparacin en blanco conforme descrito en la preparacin muestra.
(I3) no debe ser mayor que la de la preparacin estndar (I2),
descontada de la preparacin en blanco (I3). Procedimiento: aguardar 10 minutos, transferir 20 ml del
contenido de las preparaciones muestra y estndar para tu-
MTODO II bos de Nessler (capacidad de 50 ml y 22 ml de dimetro
interno) y comparar la coloracin de las preparaciones. La
Preparacin muestra: transferir cantidad de la muestra es- coloracin producida en la preparacin muestra no es ms
pecificada en la monografa, o calculada, para baln volu- intensa que en la estndar.
mtrico de plstico de 100 ml, aadir 50 ml de agua desti-
lada y someter al ultrasonido durante 30 minutos. Aadir 4 Alternativamente, proceder conforme descrito en Cromato-
ml de cido ntrico; completar el volumen con agua desti- grafa inica (5.2.17.4.1) utilizando cromatgrafo equipado
lada y homogeneizar. con columna de cambio inico para separacin de aniones y
detector por conductividad con supresin qumica.
Preparaciones estndar: preparar soluciones conteniendo
0,01, 0,02 y 0,04 ppm de aluminio, inmediatamente antes 5.3.2.12 ENSAYO LMITE PARA PLOMO
del uso, por medio de la diluicin de la Solucin estndar
de aluminio (1 ppm Al) con Solucin diluyente de cido Solucin estndar de plomo diluida (1 ppm Pb): diluir vo-
ntrico en baln volumtrico de 100 ml. lumen exactamente medido de la Solucin estndar de plo-
mo (10ppm Pb) preparada conforme descrito en Ensayo
Procedimiento: determinar las absorbancias de las pre- lmite para metales pesados (5.3.2.3) con 9 volmenes de
paraciones estndar y de la preparacin muestra por Es- cido ntrico a 1% (v/v).
pectrometra de absorcin atmica con horno de grafito
(5.2.13.1.4) equipado con lmpara de ctodo hueco de alu- Nota: almacenar todas las soluciones de reactivos en re-
minio. Ajustar el largo de onda en 309,3 nm empleando cipientes de vidrio de borosilicato. Enjuagar todos los ele-
una resolucin del monocromador de (0,7 0,1) nm. Uti- mentos de vidrio con solucin de cido ntrico a 20% (v/v)
lizar la Solucin diluyente de cido ntrico como blanco y y, en seguida, con agua destilada.
proceder a calibracin conforme descrito en (5.2.13.1.4)
Mtodo 1(Calibracin directa). Determinar la concentra- Preparacin muestra: en la ausencia de especificacin en
cin de Al en la preparacin muestra en ppm. Calcular la la monografa, preparar la solucin muestra como sigue.
cantidad de Al en la muestra en ppm, por medio de la mul- Proceder cautelosamente, pues algunas sustancias pueden
reaccionar con violencia cuando digeridas con perxido de 5.3.3 ENSAYOS QUMICOS
hidrgeno. Transferir 1 g de la muestra para frasco ade-
cuado, aadir 5 ml de cido sulfrico, algunas perlas de 5.3.3.1 TITULACIONES POR
vidrio y calentar en placa de calentamiento, en campana, DIAZOTACIN
hasta evolucin de humos. Pueden ser utilizados otros
medios de calentamiento adecuados. Si necesario, aadir Ese tipo de titulacin es muy til en el anlisis de frmacos
exceso de cido sulfrico para humedecer completamen- que contienen grupo amino aromtico primario tales como
te la muestra no pasando un total de 10 ml. Aadir, gota las sulfonamidas y los anestsicos locales derivados del
a gota, con cuidado, perxido de hidrgeno concentrado, cido aminobenzico. La titulacin es realizada con solu-
calentando entre las adiciones, permitiendo que la reaccin cin volumtrica de nitrito de sodio, en medio cido, dando
ocurra. Aadir las primeras gotas de a poco y muy lenta- la sal de diazonio de la amina aromtica primaria.
mente mezclando cuidadosamente para prevenir reaccin
rpida e interrumpiendo el calentamiento si llega a ocurrir Son utilizados dos mtodos de cuantificacin.
una excesiva formacin de espuma. Agitar la solucin en
el frasco para permitir la reaccin de la muestra adherida En el Mtodo I, es utilizada solucin de almidn yodado
en las paredes. Aadir perxido de hidrgeno siempre que o papel de almidn yodado como indicador. El exceso de
la mezcla se torne marrn u oscura. Continuar la digestin cido nitroso convierte el yoduro a yodo, que en contacto
hasta que vapores de trixido de azufre sean desprendidos con el almidn resulta en color azul caracterstico.
abundantemente para que la reaccin sea completa y la
solucin se torne incolora. Enfriar, cautelosamente, con el En el Mtodo II, el punto final de la titulacin es deter-
aumento de 10 ml de agua destilada, evaporar nuevamente minado potenciomtricamente. En ese mtodo, se emplean
hasta que el trixido de azufre se desprenda por comple- electrodos de platino calomelano o platino-platino con di-
to y enfriar. Repetir ese procedimiento con 10 ml de agua ferencia de potencial y sensibilidad adecuados. Despus
5
destilada para retirar cualquier rastro de perxido de hidr- del uso, se debe sumergir los electrodos por algunos se-
geno. Cuidadosamente, diluir con 10 ml de agua destilada gundos en cido ntrico SR al cual se adicion 1 mg/ml de
y enfriar. cloruro frrico y, en seguida, lavar con agua destilada.
cado. Titular, lentamente y bajo agitacin magntica, con Kjeldahl de 500 ml y aadir 25 ml de cido sulfrico conte-
nitrito de sodio 0,1 M SV previamente estandarizado con niendo 1 g de cido saliclico disuelto. Mezclar y aguardar
sulfanilamida SQR. durante cerca de 30 minutos agitando con frecuencia. Aa-
dir 5 g de tiosulfato de sodio, mezclar y, en seguida, aadir
El peso, en mg, de la muestra que equivale cada ml de nitri- 0,5 g de sulfato cprico. Proseguir conforme indicado en el
to de sodio 0,1 M SV adicionado se encuentra especificado procedimiento anterior a partir de Inclinar el baln cerca
en la monografa de cada frmaco. de 45o....
Nota: la punta de la bureta debe permanecer poco arriba Cuando el tenor de nitrgeno en la muestra exceda 10%,
de la superficie de la solucin a fin de evitar la oxidacin aadir, previamente a la digestin, 0,5 a 1,0 g de cido ben-
del nitrito de sodio. Se debe agitar con cuidado evitando zoico para facilitar la descomposicin de la sustancia.
la formacin de un torbellino de aire abajo de la superfi-
cie. Cuando la titulacin est a, aproximadamente, 1 ml 5.3.3.2.2 Semimicrodeterminacin (mtodo II)
del punto final calculado, aadir volmenes de 0,1 ml en
intervalos de, como mnimo, 1 minuto. Transferir cantidad exactamente pesada de la sustancia
correspondiente a 2 3 mg de nitrgeno para baln de
5.3.3.2 DETERMINACIN DE Kjeldahl compatible con el aparato. Aadir 1 g de sulfato
NITRGENO POR EL METODO DE de potasio y 0,1 g de sulfato cprico y, si necesario, lavar
KJELDAHL los slidos adherentes al cuello con fino chorro de agua.
Aadir 7 ml de cido sulfrico y, en seguida, 1 ml de pe-
El mtodo de Kjeldahl descrito en la forma de macro y rxido de hidrgeno a 30% (v/v) de modo que los lquidos
de semimicro tcnica se destina a la determinacin de ni- escurran por la pared del baln. Calentar el frasco y mante-
trgeno en sustancias relativamente lbiles como amidas y ner la digestin hasta desaparicin de los residuos de car-
5
aminas. Comprende dos fases: (1) digestin cataltica de la bonizacin y la preparacin azul clara est perfectamente
sustancia orgnica en cido sulfrico con la derivado con- lmpida. Cuidadosamente, aadir 70 ml de agua y enfriar.
versin cuantitativa del nitrgeno en sulfato de amonio; (2) Conectar el baln al aparato de destilacin y, a travs del
destilacin de lo digerido alcalinizado y titulacin volum- embudo, aadir 30 ml de solucin de hidrxido de sodio
trica de la amonaco liberada en el proceso. 40% (p/v) posibilitando que el lcali escurra por la pared
del baln y forme fase independiente bajo la solucin ci-
5.3.3.2.1 Macrodeterminacin (mtodo I) da. Lavar el embudo con agua e, inmediatamente, iniciar
la destilacin. Recolectar el destilado en matraz de 250 ml
Transferir, exactamente, cerca de 1 g de muestra para baln conteniendo 15 ml de solucin de cido brico 5% (p/v),
de Kjeldahl de 500 ml. Aadir 10 g de sulfato de potasio, 0,5 cantidad de agua suficiente para sumergir el tubo colector
g de sulfato cprico y 20 ml de cido sulfrico. Inclinar el y 3 gotas de mezcla de rojo de metilo con azul de metileno
baln cerca de 45o y calentar, lentamente, manteniendo la SI. Destilar hasta que el volumen de destilado alcance 80 a
temperatura abajo del punto de ebullicin mientras hubiere 100 ml; retirar el frasco colector, lavar las paredes con pe-
desarrollo de espuma. Aumentar la temperatura hasta la ebu- quea cantidad de agua y titular con cido sulfrico 0,005
llicin vvida del cido y proseguir con el calentamiento por M SV Realizar ensayo en blanco y hacer las correcciones
30 minutos hasta que la mezcla quede lmpida y adquiera necesarias. Cada ml de cido sulfrico 0,005 M SV equiva-
color verde claro. Enfriar, aadir 150 ml de agua, mezclar y le a 0,1401 mg de nitrgeno.
enfriar nuevamente. Aadir, cuidadosamente, 100 ml de la
solucin de hidrxido de sodio 40% (p/v) posibilitando que 5.3.3.3 MTODO DE COMBUSTIN
el lcali escurra por la pared del baln y forme fase indepen-
diente bajo la solucin cida. Aadir pequea cantidad de Los mtodos de combustin consisten en la descomposi-
zinc granulado; inmediatamente, conectar el baln al bulbo cin de sustancias orgnicas en la presencia de oxgeno,
de aislamiento previamente fijado al condensador, y sumer- a travs de la oxidacin de la materia orgnica para la
gir el tubo colector en 100 ml de solucin de cido brico subsiguiente etapa de identificacin o dosificacin. Estos
5% (p/v) en matraz de 500 ml. Homogeneizar la mezcla en mtodos pueden ser aplicados de dos maneras: mtodo del
el baln agitando suavemente y destilar hasta recolectar en frasco de combustin en presin atmosfrica y mtodo de
el matraz cerca de 80% del volumen contenido en el baln. combustin iniciada por micro ondas en sistema presuri-
Aadir cerca de 3 gotas de mezcla de rojo de metilo con azul zado.
de metileno SI al matraz y titular con cido sulfrico 0,25
M SV. Realizar ensayo en blanco y hacer las correcciones MTODO DEL FRASCO DE COMBUSTIN EN
necesarias. Cada ml de cido sulfrico 0,25 M SV equivale PRESIN ATMOSFRICA
a 7,003 mg de nitrgeno. Para muestras con bajo tenor de
nitrgeno, emplear cido sulfrico 0,05 M SV. En ese caso, Aparatos
cada ml equivale a 1,401 mg de nitrgeno.
Comprende un frasco cnico de vidrio borosilicato refrac-
En la presencia de nitratos o nitritos tario resistente, con volumen interno de 500 ml y tapa de
vidrio esmerilada. Para determinacin de flor, se emplea
Transferir cantidad exactamente pesada de la muestra frasco de cuarzo. La base de la tapa esmerilada que acom-
conteniendo cerca de 150 mg de nitrgeno para baln de paa el frasco presenta una prolongacin de vidrio en la
5
cuello. Lavar tapa, cuello, hilo y red de platino con agua platino, tela de platino y paredes del frasco (Nota 3) con
y juntar estas aguas de lavado a la solucin absorbente. La 40 ml de agua. Aadir 0,6 ml de alizarina SI y, en seguida,
solucin obtenida segn este procedimiento es designada gota a gota, hidrxido de sodio 0,1 M hasta que el color
solucin muestra. Para el preparado del blanco, proceder cambie de rosado para amarillo. Aadir 5 ml de solucin
de la misma manera, omitiendo la muestra (Nota 2). tampn acetato cido clorhdrico pH 3,5 y titular con ni-
trato de torio 0,005 M SV hasta que a color amarilla mude
Muestras lquidas para amarillo rosado. Cada ml de nitrato de torio 0,005 M
SV equivale a 0,380 mg de flor. Habiendo dificultad en la
Embalar pequea cantidad de algodn absorbente en peda- identificacin del punto de cambio, hacer ensayo prelimi-
zo de papel de filtro y pesar, en este dispositivo, la cantidad nar con solucin estandarizada de flor inorgnico.
especificada de la muestra, que es adsorbida en el algodn.
Despus de la fijacin del algodn involucrado en el papel Alternativamente, proceder conforme descrito en Croma-
de filtro a la rejilla de platino, proceder a la combustin tal tografa de iones (5.2.17.4.1), utilizando cromatgrafo
como descrita para muestras slidas. equipado con columna de cambio inico para separacin
de aniones y detector por conductividad con supresin qu-
Determinacin de cloro y bromo mica.
Determinacin de yodo
Determinacin de flor 5
Proseguir conforme descrito en Determinacin de flor
en el Mtodo del Frasco de Combustin en Presin Atmos-
frica.
cadores complejantes que exhiben profundas alteraciones dico 0,05 M SV es equivalente a 10,36 mg de plomo. Cada
de color mediante coordinacin con el metal. Ejemplos ml de edetato disdico 0,1 M SV es equivalente a 20,72 mg
tpicos son: anaranjado de xilenol, chalcona y negro de de plomo.
eriocromo T. El indicador complejomtrico acta de forma
competitiva con el agente titulante, logo debe ser despla- Magnesio
zado efectivamente por este en las proximidades del punto
de equivalencia. Pesar, exactamente, la cantidad de la sustancia indicada en
la monografa y disolver en 5 a 10 ml de agua, o en canti-
PROCEDIMIENTOS dad mnima de cido clorhdrico 2 M. Diluir con agua para
50 ml. Aadir 10 ml de tampn de cloruro de amonio pH
Aluminio 10,0, y algunas gotas de negro de eriocromo T SI. Titu-
lar con edetato disdico 0,05 M SV o 0,1 M SV, conforme
Pesar, exactamente, a cantidad de la sustancia indicada en indicado en la monografa, hasta cambio del color de vio-
la monografa, aadir 50 ml de agua y acidificar, si nece- leta para azul. Cada ml de edetato disdico 0,05 M SV es
sario, con cantidad mnima de cido clorhdrico M, salvo equivalente a 1,215 mg de magnesio. Cada ml de edetato
que la monografa indique otro tipo de solvente. Aadir 25 disdico 0,1 M SV es equivalente a 2,431 mg de magnesio.
ml de edetato disdico 0,1 M SV y 10 ml de la mezcla, en
volmenes iguales, de acetato de amonio 2 M con cido Zinc
actico 2 M. Calentar la solucin hasta ebullicin y mante-
ner por 2 minutos. Enfriar. Aadir 50 ml de etanol y 3 ml Pesar, exactamente, la cantidad de la sustancia indicada en
de solucin recin preparada de ditizona a 0,025% (p/v) la monografa y disolver en 5 a 10 ml de agua, o en can-
en etanol. Titular el exceso de edetato disdico con sulfato tidad mnima de cido actico 5 M. Diluir para 50 ml con
de zinc 0,1 M SV hasta cambio del color de azul verdoso agua. Aadir gotas de anaranjado de xilenol SI y metena-
5
para violeta rosa. Cada ml de edetato disdico 0,1 M SV es mina suficiente (cerca de 5 g) para que la solucin adquiera
equivalente a 2,698 mg de aluminio. color violeta. Titular con edetato disdico 0,05 M SV o 0,1
M SV, conforme indicado en la monografa, hasta cambio
Bismuto del color de violeta para amarillo. Cada ml de edetato di-
sdico 0,05 M SV es equivalente a 3,268 mg de zinc. Cada
Pesar, exactamente, la cantidad de la sustancia indicada ml de edetato disdico 0,1 M SV es equivalente a 6,536
en la monografa y disolver en cantidad mnima de cido mg de zinc.
ntrico 2 M. Aadir 50 ml de agua y solucin concentra-
da de amonaco, gota a gota con agitacin, hasta que la 5.3.3.5 TITULACIONES EN MEDIO NO
preparacin quede turbia. Aadir 0,5 ml de cido ntrico. ACUOSO
Calentar a 70 C hasta la desaparicin de la turbidez de la
preparacin. Aadir algunas gotas de anaranjado de xilenol Los frmacos que son bases o cidos suaves no pueden ser
SI. Titular, lentamente, con edetato disdico 0,05 M SV cuantificados en medio acuoso, pero pueden ser en medio
hasta cambio del color de violeta rosa para amarillo. Cada no acuoso.
ml de edetato disdico 0,05 M SV es equivalente a 10,45
mg de bismuto. La titulacin en medio no acuoso se basa en el concepto
cido / bsico de Brnsted-Lowiy, en el cual el cido es una
Calcio sustancia que dona protn y la base es aquella que recibe
protn. Sustancias potencialmente cidas son cidas sola-
Pesar, exactamente, la cantidad de la sustancia indicada en mente en presencia de base a la cual puedan donar protn
la monografa, disolver en algunos mililitros de agua y aci- y viceversa.
dificar, si necesario, con cantidad mnima de cido clorh-
drico 2 M. Diluir para 100 ml con agua. Titular con edetato El solvente desempea, por consiguiente, papel muy im-
disdico 0,05 M SV hasta cerca de 2 ml antes del punto de portante en la determinacin del carcter cido / bsico
equivalencia previsto. Aadir 4 ml de hidrxido de sodio 10 de una sustancia, ya que la fuerza del cido o de la base
M y gotas de chalcona SI. Proseguir la titulacin hasta que el depende de la capacidad del solvente de recibir o donar
color cambie de rosa para azul intenso. Cada ml de edetato protones. El agua debera ser el solvente de eleccin, de-
disdico 0,05 M SV es equivalente a 2,004 mg de calcio. bido a la fcil disponibilidad. No obstante, el cido ms
fuerte que puede existir en medio acuoso es el ion hidronio
Plomo (H3O+) y la base ms fuerte el ion hidrxido (OH-), eso es
conocido como efecto nivelador del solvente. En la dosifi-
Pesar, exactamente, la cantidad de la sustancia indicada en cacin de cidos o bases muy suaves, el titulante debe ser
la monografa y disolver en 5 a 10 ml de agua, o en can- una base o cido muy fuerte, respectivamente, para que la
tidad mnima de cido actico 5 M. Diluir para 50 ml con reaccin cido-base ocurra; sin embargo debido al efecto
agua. Aadir gotas de anaranjado de xilenol SI y metena- nivelador del agua no es posible titular tales sustancias en
mina suficiente (cerca de 5 g) para que la solucin adquiera medio acuoso.
color violeta. Titular con edetato disdico 0,05 M SV, o 0,1
M SV, conforme indicado en la monografa hasta cambio Utilizando solventes poco protoflicos como el cido acti-
del color de violeta para amarillo. Cada ml de edetato dis- co, es posible la titulacin de bases mucho suaves ya que el
ion acetonio (CH3COOH2+) es un cido mucho ms fuerte les alcalinos y los hidrxidos de alquilamonio cuaternario.
que el ion hidronio. cidos ms fuertes que el ion hidronio El metxido de sodio es el ms empleado de los alcxidos
no pueden ser diferenciados en medio acuoso, pero pueden en mezcla de metanol y tolueno o metanol y benceno. El
en cido actico mostrando que el orden decreciente para metxido de litio en metanol y benceno es utilizado para
la fuerza de los cidos es perclrico, bromhdrico, sulf- los compuestos que forman precipitado gelatinoso en las
rico, clorhdrico y ntrico. Anlogamente, la titulacin de titulaciones con metxido de sodio. El ms utilizado entre
cidos suaves es posible con el uso de solventes bsicos los hidrxidos es el de tetrabutilamonio. Con los hidrxi-
como la n-butilamina. El amideto (CH3CH2CH2CH2NH-) dos de amonio cuaternario como los hidrxidos de tetra-
es una base mucho ms fuerte que el hidrxido. butilamonio y el de trimetilexadecilamonio (en mezcla de
benceno y metanol o alcohol isoproplico) hay ventaja de
Los solventes empleados en la titulacin en medio no acuo- que la sal del cido titulado es, en general, soluble en el
so deben satisfacer ciertas exigencias: (1) no reaccionar medio de titulacin.
con la sustancia ni con el titulante; (2) disolver la sustancia
posibilitando, como mnimo, preparado de solucin 0,01 Es importante que se protejan los solventes para la titu-
M; (3) disolver el producto de la titulacin si la precipi- lacin de sustancias cidas de la exposicin excesiva a
tacin fuese inevitable, el precipitado debe ser compacto la atmsfera debido a la interferencia de CO2. Por eso, se
y cristalino; (4) posibilitar, con facilidad, la visualizacin puede emplear atmsfera inerte o aparato especial durante
del punto final, sea ese medido con el uso de indicadores o la titulacin. Para determinar la absorcin de CO2 se debe
potencimetro; (5) ser de bajo costo y de fcil purificacin. proceder a la titulacin del blanco que no debe consumir
ms que 0,01 ml del metxido de sodio 0,1 M SV por mi-
Para la titulacin de sustancias de carcter bsico (ami- lilitro de solvente.
nas, heterocclicos nitrogenados, compuestos de amonio
cuaternario, sales alcalinas de cidos orgnicos e inorg- El punto final del dosificacin puede ser determinado vi-
5
nicos y algunas sales de aminas) se emplean solventes de sualmente por el cambio de color o potenciomtricamente.
naturaleza relativamente neutra, o cida, siendo el cido Generalmente la eleccin del mtodo se basa en el pKa de
actico glacial el ms utilizado. El anhdrido actico se re- los analitos en agua. Para bases con el pKa de 4, la detec-
serva para bases mucho suaves como amidas. La mezcla cin es, en general, por medio de indicadores; para las que
de dioxana con cido actico puede ocasionalmente ser el pKa est entre 1 y 4, la deteccin es potenciomtrica.
utilizada a fin de la reduccin de la constante dielctrica En ese caso, el electrodo de vidrio / calomelano es til.
y consecuentemente menor potencial de ionizacin de los En cido actico, tal electrodo funciona de acuerdo con
cidos favoreciendo la reaccin de neutralizacin. Como lo previsto tericamente. En el caso del electrodo de ca-
titulante se emplea, generalmente, la solucin de cido lomelano como referencia, es ventajoso sustituir el puente
perclrico en cido actico. Otros titulantes tiles son ci- salino de cloruro de potasio acuoso por perclorato de litio
do perclrico en dioxano; cido p-toluenosulfnico (cido 0,1 M en cido actico glacial para titulacin en solventes
tsico) y cido fluorsulfnico son generalmente utilizados cidos o por cloruro de potasio en metanol para la titula-
con solventes aprticos como cloroformo. cin en solventes bsicos. La determinacin del punto final
en la cuantificacin de cidos cuyo pKa en agua es en tor-
Para la dosificacin de sales de cidos halogenados (clorhi- no de 7 puede ser hecha con el uso de indicador. Para los
drato, bromhidrato y yodhidrato) debe adicionarse acetato cidos con pKa entre 7 y 11 se recomienda determinacin
de mercurio; ese no se disocia en solucin de cido acti- potenciomtrica, aunque en ciertos casos se recurra a indi-
co. El ion haluro es una base demasiadamente suave para cadores, como violeta azoico o o-nitroanilina con menor
reaccionar cuantitativamente con cido perclrico en cido precisin.
actico. Ese ion puede ser sustituido, cuantitativamente,
por el ion acetato siendo retirado en la forma de complejo Con el uso de solventes orgnicos, se debe considerar el
mercrico que no se disocia. El acetato, que es una base alto coeficiente de expansin cbica de la mayora de esos
relativamente fuerte en cido actico, puede ser precisa- en relacin al del agua. Eso porque hay posibilidad de ocu-
mente titulado con cido perclrico. rrir variacin del tenor del titulante en medio no acuoso
en funcin de la temperatura. Se debe corregir el volumen
Para la titulacin de sustancias que se comportan como del titulante, multiplicando-el por el factor de correccin
cidos (haluros de cidos, anhdridos de cidos, cidos abajo:
carboxlicos, aminocidos, enoles, imidas, fenoles, pirro-
les y sulfas) se emplean como solventes los de naturaleza [1 + coeficiente de expansin cbica del solvente (t0 t)]
bsica o aprtica. En la dosificacin de sustancias de aci-
dez intermediaria es comn el uso de dimetilformamida. en que:
Ya en la dosificacin de cidos suaves se emplean bases t0 = temperatura de estandarizacin del titulante,
ms fuertes como morfolina, etilenodiamina y n-butilami- t = temperatura de utilizacin del titulante.
na. Los solventes bsicos seleccionados, adecuadamente,
pueden posibilitar la determinacin selectiva de mezcla de Los sistemas ms empleados para la titulacin en medio no
cidos. Dos clases de titulantes pueden ser empleadas para acuoso estn relacionados en la Tabla 1.
determinacin de sustancias cidas: los alcxidos de meta-
5
Morfolina Violeta azoico Vidrio / calomelano
5
enfriamiento del baln hasta temperatura ambiente bajo
flujo de gas, verter la preparacin contenida en el tubo de
absorcin en matraz con capacidad de 500 ml provisto de
tapa esmerilada conteniendo 10 ml de la solucin acuosa
de acetato de sodio trihidratado (1:5). Lavar las paredes del
tubo con agua, transferir el agua de lavado para el matraz
y diluir para 200 ml con agua. Aadir cido frmico gota a
gota con agitacin hasta la desaparicin del color rojizo del
bromo y aadir 1 ml ms de cido frmico. Aadir 3 g de
yoduro de potasio y 15 ml de cido sulfrico M; tapar, agi-
tar suavemente y dejar en reposo por 5 minutos. Titular el
yodo liberado con tiosulfato de sodio 0,1 M SV empleando
almidn SI como indicador. Realizar titulacin en la pre-
paracin en blanco procediendo de la manera descrita omi-
tiendo la muestra y efectuar correccin si necesario. Cada
ml de Na2S2O3 0,1 M SV equivale a 0,5172 mg de metoxila
(CH3O).
Debe ser usado baln destilador con capacidad de dos a Glicerol Lquidos conteniendo glicerol deben ser aadi-
cuatro, veces, el volumen, del lquido a ser calentado. dos de volumen tal de agua que el residuo, despus de la
destilacin, contenga, como mnimo, 50% de agua.
Durante todas las manipulaciones, tomar precaucin para
minimizar la prdida de alcohol por evaporacin. Yodo Soluciones conteniendo yodo libre deben ser tra-
tadas antes de la destilacin con zinc pulverizado o deste-
Para evitar la ocurrencia de ebullicin violenta, aadir idas con cantidad suficiente de solucin de tiosulfato de
fragmentos de material insoluble y poroso, tal como carbo- sodio 10% (p/v) seguida de la adicin de algunas gotas de
nato de silicio o perlas de vidrio. hidrxido de sodio SR.
5
Los lquidos que formen demasiada espuma durante la Otras sustancias voltiles Elixires, tinturas y preparacio-
destilacin deben ser tratados previamente con cido fos- nes similares que contengan proporciones apreciables de
frico, sulfrico o tnico, hasta reaccin fuertemente ci- sustancias voltiles, adems de alcohol y agua, tales como:
da o con ligero exceso de solucin de cloruro de calcio, o aceites voltiles, cloroformo, ter, alcanfor etc., deben su-
pequea cantidad de parafina o adems aceite de silicona, frir, antes de la destilacin, uno de los tratamientos a con-
antes de iniciar a destilacin. tinuacin.
La velocidad de destilacin debe ser tal que permita la pro- 1. Lquidos con menos de 50% de alcohol Mezclar la
duccin de destilados lmpidos. Destilados turbios deben muestra de 35 ml, exactamente medidos, con volumen
ser clarificados por agitacin con talco o con carbonato de igual de agua, en embudo de separacin, saturando esa
calcio, precipitados y filtrados. Ajustar la temperatura del mezcla con cloruro de sodio. Extraer los componentes
filtrado y determinar el tenor de alcohol por la densidad. voltiles, agitando con porcin de 25 ml de hexano.
Transferir la camada inferior para un segundo embudo
Mtodo 1 de separacin y repetir la extraccin con dos porciones
ms de hexano. Reunir las porciones de hexano y tratar
Lquidos con menos de 30% de alcohol Transferir para con 3 porciones de 10 ml de solucin saturada de clo-
aparato destilador adecuado, por medio de pipeta, muestra ruro de sodio. Reunir las soluciones salinas y destilar
de, en el mnimo, 35 ml del lquido en el cual est siendo recolectando volumen de destilado correspondiente a
determinado el tenor de alcohol, registrar la temperatura en dos veces el volumen inicial de la muestra.
la cual el volumen fue medido. Aadir igual cantidad de
agua, destilar y recoger un volumen de destilado que sea 2. Lquidos con ms de 50% de alcohol Medir una
cerca de 2 ml menor que el volumen inicial de la muestra. muestra y diluir con agua de modo que contenga apro-
Ajustar la temperatura del destilado a aquella en que fue ximadamente 25% de alcohol y que su volumen final
medida la muestra y aadir agua suficiente hasta obtener el sea cerca de 35 ml. a continuacin proceder como indi-
volumen inicial de la muestra y homogeneizar. El destilado cado para lquidos con menos de 50% de alcohol, pro-
debe ser lmpido o, como mximo, levemente turbio. De- siguiendo a partir de saturando esa mezcla con cloruro
terminar la densidad del lquido a 20 C. Con el resultado, de sodio.
evaluar el porcentaje, en volumen, de C2H5OH contenido
en el lquido examinado, por la Tabla Alcohomtrica. En la preparacin de colodin para destilacin, usar agua
en lugar de la solucin saturada de cloruro de sodio, indi-
Mtodo 2 cada anteriormente. Si no fue empleado en la muestra el
tratamiento con hexano y el destilado obtenido es turbio
Lquidos con ms de 30% de alcohol Proceder como (debido a la presencia de aceites voltiles presentes en pe-
indicado en el mtodo anterior, con la siguiente modifi- queas proporciones), l puede ser clarificado y adecuado
cacin: diluir la muestra con volumen de agua dos veces para la determinacin de la densidad, por agitacin con
mayor y recoger volumen de destilado cerca de 2 ml menor cerca de 1/5 de su volumen de hexano o por filtracin a
que dos veces el volumen inicial de la muestra. Ajustar la travs de fina camada de talco.
temperatura del destilado a aquella en que fue medida la
muestra y completar con agua a volumen igual a dos veces
5.3.3.8.2 Mtodo por cromatografa a gas Si el valor obtenido esta fuera de la banda de los valores
incluidos por las soluciones estndar, repetir el procedi-
Proceder de acuerdo con las especificaciones generales miento usando aquellas que dieron una banda que incluya
para Cromatografa a gas (5.2.17.5). Usar aparato eficiente el valor de la muestra.
para la determinacin cuantitativa de alcohol.
5.3.3.9 ANLISIS DE AMINOCIDOS
Solucin estndar
El anlisis de aminocidos es realizado por medio de dos
Para lquidos conteniendo ms que 10% de alcohol, prepa- etapas: hidrlisis de las ligaciones peptdicas y evaluacin
rar dos soluciones estndar de alcohol en agua, de manera de cada aminocido en el hidrolizado resultante.
que las concentraciones sean, respectivamente, cerca de
5% abajo (solucin estandar1) y cerca de 5% arriba (so- Tcnica para hidrlisis de protenas y pptidos aislados
lucin estndar 2) de la concentracin de alcohol esperada
en la muestra bajo anlisis. Determinar la densidad de cada 1. Transferir cantidad de muestra conteniendo de 4 a 10
una de las soluciones estndar a 20 C (5.2.5) y obtener mg de protena para tubo de ensayo de 20 x 150 mm
la concentracin exacta de C2H5OH por la Tabla Alcoho- con tapa de rosca y disco de politetrafluoroetileno pre-
mtrica. Para lquidos conteniendo menos que 10% de al- viamente lavado con hidrxido de sodio 0,2 M, enjua-
cohol, preparar, exactamente, dos soluciones estndar de gado y seco en estufa.
alcohol, de manera que las concentraciones sean, respecti-
vamente, cerca de 1% menor y cerca de 1% mayor que la 2. Si la muestra fuese slida, aadir 5 de cido clorhdrico
concentracin, esperada, diluyendo con agua. Determinar y 5 ml de agua. Si la muestra fuese lquida, aadir cido
las densidades de las soluciones del mismo modo que las clorhdrico de modo que la concentracin final de cido
anteriores. clorhdrico sea 6 M.
Tcnica para hidrlisis de muestras con bajo tenor de 4. Pesar la muestra conteniendo 10 mg de protena en ba-
protena conteniendo carbohidratos y/o lpidos ln de fondo redondo de 25 ml y aadir 2 ml de cido
perfrmico helado.
1. Transferir cantidad de muestra que contenga 10 mg de
protena para baln de 150 ml de fondo redondo y boca 5. Mantener la mezcla en bao de hielo durante 4 h, si la
esmerilada. muestra fuese soluble, o 16 h, se fuese insoluble.
2. Aadir al medio 40 ml de cido clorhdrico 6 M y algu- 6. Aadir 0,5 ml de cido bromhdrico 40% para retirar el
nas perlas de vidrio. exceso de cido perfrmico.
3. Conectar condensador de reflujo e iniciar el calenta- 7. Acoplar el baln a evaporador rotatorio y retirar por
miento del baln usando manta elctrica. Mantener la medio de presin reducida el bromo residual haciendo
suspensin bajo ebullicin constante y suave por 24 h. pasar los vapores por solucin de hidrxido de sodio M.
4. Enfriar hasta la temperatura ambiente y transferir, 8. Proceder a la hidrlisis como descrito anteriormente.
cuantitativamente, el contenido para baln volumtrico
de 50 ml completando el volumen con agua destilada. Separacin y anlisis cuantitativo de aminocidos
aislados
5. Seguir las dems etapas conforme los tems 7 a 10 de
la tcnica anterior. La separacin de los aminocidos en los hidrolizados es,
normalmente, realizada por cromatografa de cambio ini-
Mezclas de aminocidos en solucin (sueros) o en co por medio de resinas de poliestireno sulfonado en ana-
preparaciones farmacuticas lizadores de aminocidos. En esos aparatos, despus de la
5
separacin, los aminocidos eluidos de las columnas cro-
1. Diluir, adecuadamente, la solucin con tampn citrato matogrficas forman sustancias de coloracin azul/violeta
pH 2,2 (0,20 M en Na+) pudiendo ser analizada en se- por la reaccin con ninhidrina. La determinacin cuanti-
guida. tativa est hecha espectrofotomtricamente. En el uso de
autoanalizadores de aminocidos, deben ser seguidas las
2. Caso est en la forma de polvo, o comprimido, solubi- especificaciones de los respectivos fabricantes.
lizar la muestra en cido clorhdrico 0,1 M.
5.3.3.10 ENSAYO YODOMTRICO DE
3. Transferir el material para baln volumtrico y comple- ANTIBITICOS
tar el volumen con el mismo tampn arriba.
Este ensayo yodomtrico de antibitico se destina a la do-
4. Filtrar la solucin y mantener bajo refrigeracin (4 C) sificacin de frmacos antibiticos penicilmicos y de sus
hasta ser analizada. productos farmacuticos elaborados, para los cuales la titu-
lacin yodomtrica es particularmente adecuada.
Tcnica de hidrlisis con oxidacin de cistena y
metionina Preparacin estndar
Debido a prdidas durante la hidrlisis cida de protenas, Disolver cantidad adecuada, exactamente pesada, de la
los aminocidos sulfurados son preferentemente analiza- sustancia qumica de referencia (SQR), previamente dese-
dos por medio de sus respectivos derivados oxidados. La cada, especificada en la monografa individual, utilizando
oxidacin es promovida por cido perfrmico, que con- el solvente descrito en la Tabla 1 o conforme descrito en
vierte cistena y cistena en cido cisteico y metionina en la monografa. Diluir, cuantitativamente, con el mismo sol-
metionina / sulfona, ambos resistentes a las condiciones de vente, para obtener solucin con concentracin final cono-
hidrlisis. cida, especificada en la Tabla 1 o conforme descrito en la
monografa. Transferir 2,0 ml de esta solucin para matraz
1. Preparar el cido perfrmico acrecentando 1 ml de de 250 ml con tapa.
perxido de hidrgeno 30 volmenes a 9 ml de cido
frmico. Preparacin muestra
2. Agitar ligeramente la solucin mantenindola ensegui- A menos que especificado de otra forma en la monografa
da en reposo por 1 h a temperatura ambiente. individual, disolver cantidad adecuada, exactamente pe-
sada, de la muestra, utilizando el solvente descrito en la
3. Enfriar el cido perfrmico formado en bao de hielo. Tabla 1. Diluir, cuantitativamente, con el mismo solvente,
para obtener solucin con concentracin final conocida, es-
pecificada en la Tabla 1. Transferir 2,0 ml de esta solucin
para matraz de 250 ml con tapa.
5 5.4 MTODOS DE
PROCEDIMIENTO
a los de la luz del da. El color de la muestra debe ser com- de ser seccionada, incluir la muestra en material adecuado,
parado con el material de referencia. que permita fijar el fragmento. Secciones de mejor calidad
pueden ser obtenidas con el empleo de micrtomos. Hay,
Superficie, textura y fractura bsicamente, tres tipos de micrtomos: los de congela-
miento, usados para los materiales ms frgiles; los rotati-
Examinar la materia prima antes de cualquier tratamiento. vos, para cortes en serie de material incluido en parafina; y
Cuando necesario, utilizar lente de cinco hasta diez aumen- los de gua, para aquellos materiales ms resistentes, como
tos. Cuando indicado en la monografa, humedecer con ramas, partes de tallos y de races. En ese ltimo caso, un
agua o reactivo especificado para observar caractersticas mtodo relativamente fcil de preparado del material a ser
de la superficie de fractura. Tocar el material para verifi- seccionado consiste en su inclusin en macrogol soluble en
car se es blando o duro, doblar y partir el material para la agua o en historresina.
obtencin de informaciones cuanto a la fragilidad y apa-
riencia de la fractura, si es fibrosa, lisa, rugosa, granulada, Inclusin del material en parafina
entre otras.
Hervir la muestra en agua, cuando seca, para ablandar
Olor y retirar el aire;
deshidratar la muestra en serie de etanol diluido en
Antes de verificar el olor del material, certificarse de que agua: 50, 70, 80, 96% y, por ltimo, en etanol absoluto;
no existe riesgo. Colocar una pequea muestra en la palma transferir la muestra para mezcla de etanol absoluto y
de la mano o en recipiente de vidrio e inhalar despacio y xileno en la proporcin 3:1 (v/v) y, a continuacin, para
repetidamente. Si el olor es indistinto, presionar parte del 1:1 y 1:3;
material entre los dedos e inhalar nuevamente. Cuando la transferir la muestra para xileno puro;
monografa indique material txico, colocar un poco de transferir la muestra para xileno en parafina en la pro-
5
material aplastado en agua caliente. Primeramente, de- porcin 1:1, mantenindola en estufa;
terminar la intensidad del olor: ninguno; suave; distinto o transferir la muestra para parafina calentada, para que
fuerte y, a continuacin, la sensacin causada por el olor: ocurra la infiltracin, mantenindola en la estufa hasta
aromtico; frutado; mofado o rancio. Cuando sea posible, que permanezca depositada en el fondo del recipiente;
es importante la comparacin del olor con sustancia defi- emblocar y dejar enfriar en recipiente con agua helada;
nida, como, por ejemplo, menta pimenta debe tener olor seccionar el bloque para introduccin en el micrtomo;
similar al mentol y clavo de olor, similar al eugenol. seccionar el material y colocar en lmina de vidrio pre-
viamente untada con adhesivo de Haupt o Bissing;
Sabor colocar las lminas sobre placa calentadora para disten-
der los cortes;
Probar el sabor apenas cuando exigido en la monografa. desparafinizar;
aguardar, como mnimo, una hora antes de colorear.
5.4.1.2 PREPARACIN DEL MATERIAL
PARA ANLISIS MICROSCPICA Inclusin del material en macrogol (polietilenglicol
PEG 4000 o PEG 6000)
ABLANDAMIENTO DEL MATERIAL
Hervir la muestra en agua, cuando seca, para ablandar
Los rganos y tejidos vegetales empleados normalmente se y retirar el aire;
presentan secos, y para ser observados al microscopio, es colocar la muestra en vaso de precipitados, contenien-
conveniente primero ablandarlos mediante tratamiento con do macrogol a 20% (p/v);
agua caliente. El tiempo necesario para el ablandamiento marcar el vaso de precipitados, a partir de la superficie
de cada rgano vegetal o sus partes vara de acuerdo con del lquido, dividindolo en cinco partes aproximada-
su textura. Tratndose de rgano recin colectado, apenas mente iguales;
los de consistencia ms firme necesitan de tal tratamiento. dejar el material en estufa a 65 C por 3 a 4 das;
cuando la solucin se evapore hasta 1/5 de su volumen
Mtodo de hidratacin para materiales secos inicial, transferir la muestra para macrogol puro y fun-
dido donde debe permanecer durante 12 a 25 horas, en
Colocar la muestra en solucin de hidratacin, preparada estufa a 65 C;
con cinco partes de agua, cuatro partes de etanol, una par- retirar de la estufa, emblocar y dejar enfriar a tempera-
te de glicerina y cinco gotas de detergente comercial para tura ambiente;
cada 200 ml de solucin, en estufa a 60 C, por, como m- seccionar los bloques para introduccin en el micrto-
nimo, 48 horas. mo;
seccionar el material a seco;
EJECUCIN DE LOS CORTES lavar los cortes con agua y colorear.
blocamiento caracterstica de cada fabricante. Obedecer al que posibilite la observacin. El glicerol es ms usado en
manual de instrucciones. Todas contienen tres elementos los estudios microqumicos de muclagos, goma, inulina
principales: una resina, un agente endurecedor y un agente y aleurona. El hidrxido de potasio es agente diafaniza-
acelerador o catalizador. La mezcla y temperatura deben dor, teniendo accin sobre protenas, almidn, grasa, resi-
seguir las especificaciones, para que haya completa inte- nas y materias colorantes. El hidrato de cloral, tambin, es
raccin, obtenindose como producto final un polmero. agente diafanizador y, a pesar de su accin ms lenta que
Los materiales vegetales deben ser previamente fijados y los hidrxidos alcalinos, tiene la ventaja de no disolver el
deshidratados. Se sugiere que las secciones a ser emblo- oxalato de calcio.
cadas sean inmersas en la resina durante una noche, para
que haya completa infiltracin. Slo despus de, sustituir Dependiendo de la finalidad a que se destina, se pueden
la resina de infiltracin por la mezcla de nueva porcin de montar los cortes en lminas para observacin inmediata o
resina, agente endurecedor y agente acelerador. La resina en lminas dichas permanentes.
de infiltracin puede ser reutilizada de dos a cuatro veces,
debiendo entonces ser descartada. Los cortes son coloca- En las preparaciones para observacin, inmediata, despus
dos sobre las lminas sin adhesivo. Colorear. de seleccionados y coloridos, se montan los cortes en me-
dio adecuado, tomndose el cuidado de evitar la formacin
MTODOS DE COLORACIN de burbujas de aire. Si el examen fuese ms prolongado, se
recomienda revestir los bordes del cubreobjetos de un luto
Los mtodos de coloracin pueden comprender la aplica- (sello), que puede ser esmalte de uas, blsamo de Canad
cin de un slo colorante (coloracin simple) o de dos o o solucin alcohlica de goma laca, para evitar la evapo-
tres colorantes diferentes (coloracin compuesta). racin del medio de montaje, todos ellos aplicables con el
auxilio de pincel suave y pequeo.
Coloracin simples (algunos colorantes pueden ser
5
usados) En las preparaciones, permanentes, despus de selecciona-
dos y coloridos, los cortes deben ser montados entre lmi-
Solucin de safranina a 1% (p/v) en etanol: coloracin na y cubreobjetos, con resina sinttica, blsamo de Canad
de cutina, lignina y suberina. u otro medio conveniente. Se debe mantener el montaje
Solucin de Verde rpido a 0,5% (p/v) en etanol: colo- comprimido por medio de la aplicacin de pequeos pesos
racin de celulosa. sobre el cubreobjetos, en posicin perfectamente horizon-
Azul de Astra a 1% (p/v) en etanol: coloracin de com- tal y sobre papel de filtro, con la finalidad de evitar posibles
puestos pcticos de la laminilla media y pared. excesos del medio de montaje.
Floroglucina SR: coloracin de lignina.
MACERACIN DE LOS TEJIDOS
Coloracin compuesta (algunas mezclas de colorantes
que pueden ser usadas) Secciones de tallos, races, cscaras u otras partes vegeta-
les ni siempre dan idea precisa de la naturaleza real de sus
Safranina-Azul de Astra: coloree la lignina de rojo y la clulas. Lo mismo acontece con materia prima comercia-
celulosa de azul. Colocar la muestra en solucin acuosa lizada, cuando rasurada o en polvo. Para revelar algunas
de safranina a 1% (p/v) de 5 a 25 minutos. Lavar dos particularidades, como, por ejemplo, engrosamientos y
veces con agua destilada. Colocar en Azul de Astra por puntuaciones, se debe emplear uno de los mtodos indi-
10 a 25 minutos. Lavar dos veces con agua destilada. cados para la disociacin de tejidos. En esos mtodos, la
Pasar por batera de etanol a 50%, 70%, 90%, 96%, y estructura a ser estudiada es tratada con sustancias qumi-
etanol absoluto (dos veces), xileno. Montar en lminas cas capaces de disolver la laminilla media y, de esa forma,
con blsamo del Canad o resina sinttica. posibilitar la separacin de las clulas.
Safranina-Verde rpido: coloree la lignina de rojo y la
celulosa de verde. No desparafinizar las lminas. Colo- Mtodo de disociacin de tejidos
car en solucin acuosa de safranina a 1% (p/v) por 10
a 20 minutos (o ms). Lavar en agua corriente. Colocar Cortar el material en pequeos fragmentos o en lminas
en agua destilada por 1 minuto. Escurrir el agua de la con cerca de 300 nm de espesor y colocar en agua;
lmina. Colocar en Verde rpido a 0,5% (p/v) en etanol retirar todo el aire del material, hirviendo y enfriando
de 10 a 40 minutos. Lavar en agua corriente. Colocar rpidamente;
en agua destilada por 1 minuto. Repetir la operacin. macerar el material en solucin de Jeffrey. El tiempo de
Escurrir el agua de la lmina. Secar en placa calentado- maceracin vara con la naturaleza del material. Gene-
ra por 30 minutos. Retirar la parafina con xileno en dos ralmente las clulas comienzan a separarse en cerca de
cambios de 5 minutos. Montar en lminas con blsamo 24 horas. si necesario, puede ser usado bastn de vidrio
de Canad o resina sinttica. de punta arredondada para amasar muy levemente el
material.
PREPARADO Y MONTAJE DE LAS LMINAS Habiendo dificultad en la separacin de las clulas, re-
novar la solucin maceradora;
Los cortes histolgicos son montados, entre lmina y cu- lavar muy bien el material con agua de grifo, para reti-
breobjetos, en agua, glicerol, hidrxido de potasio a 30% rar los cidos. Verter la mezcla con el tejido macerado
(p/v), hidrato de cloral a 50% (p/v), u otro lquido cualquier para un embudo conteniendo papel de filtro;
cerrar la abertura inferior del embudo y cubrir el ma- 2. Anisoctico (clulas desiguales): los estomas son nor-
cerado con solucin acuosa de safranina a 1% (p/v), malmente rodeados por 3 o 4 clulas subsidiarias, sien-
durante tiempo suficiente para buena coloracin del do una de ellas, ntidamente, menor del que las otras;
material (de 15 minutos a 6 horas);
abrir la punta del embudo y lavar nuevamente con agua, 3. Diactico (clulas transversales): los estomas son
hasta retirar el exceso de colorante; acompaados por 2 clulas subsidiarias, cuyas pare-
deshidratar por la adicin de soluciones de etanol a des comunes forman un ngulo recto con las clulas de
50%, 70%, 90% y etanol absoluto; retirar con pinza el guarda de los estomas;
macerado del papel de filtro y colocar en xileno;
montar entre lmina y cubreobjetos, con resina sintti- 4. Paractico (clulas paralelas): los estomas presentan de
ca o blsamo de Canad; cada lado una o varias clulas subsidiarias paralelas al
mantener la lmina en posicin horizontal, sin embargo eje longitudinal del ostiolo y a las clulas de guarda de
no utilizar peso sobre el cubreobjetos, pues las clulas los estomas.
maceradas son muy frgiles.
5
hoja (la solucin atacar el mesfilo, dejando la epider-
mis aislada);
cuando el mesfilo est destruido, lavar las muestras
varias veces con agua destilada;
colocar una muestra sobre lmina, seccionar entre las
epidermis y colocar las dos partes de forma que las
frentes externas estn dirigidas para cima;
corar el material sobre la lmina con solucin etanlica
de safranina a 1% (p/v);
preparar la lmina con gelatina glicerinada y sellar.
Figura 1 - Tipos de estomas. 1. anomoctico;
Separacin de la epidermis con hidrato de cloral 2. anisoctico; 3. diactico; 4. paractico.
Tabla 2 - Nmero de embalajes a ser muestreadas de acuerdo con el nmero de embalajes existentes.
Nmero de embalajes Nmero de embalajes a ser muestreados
1a3 Todos
4 a 10 3
11 a 20 5
21 a 50 6
51 a 80 8
81 a 100 10
Ms de 100 10% del total de embalajes
GRADO DE DIVISIN Y CANTIDAD DE DROGA Races, rizomas, cascaras, planta entera y partes areas:
500 g;
Consistiendo la droga de componentes de dimensiones hojas, inflorescencias, semillas y frutos: 250 g;
inferiores a 1 cm o cuando ella se constituye de material materiales particulados o fraccionados (peso medio in-
finamente fragmentado o pulverizado, emplear aparato de ferior a 0,5 g/componente): 50 g;
muestreo (tubo provisto de dispositivo de cierre en la base). polvos: 25 g.
Recolectar muestras de arriba para abajo y de abajo para
arriba (direccin vertical) y lateralmente (direccin hori- Recoger, por cuarteamiento, la cantidad de muestra espe-
zontal), sumando muestra de, como mnimo, 250 g hasta cificada, a partir de la muestra obtenida, segn el procedi-
100 kg de droga. Habiendo ms de 100 kg a muestrear, pro- miento descrito anteriormente, y desparramarla en camada
ceder al muestreo seguida de seleccin por cuarteamiento, fina sobre la superficie plana. Separar, manualmente los
generando muestra de 250 g en el final del proceso. materiales extraos a la droga, inicialmente a ojo y, en se-
guida, con auxilio de lente de aumento (cinco a diez veces).
Para drogas con dimensiones superiores a 1 cm, proceder al Pesar el material separado y determinar su porcentaje con
muestreo manual. Combinar las muestras retiradas de cada base en el peso de la muestra sometida al ensayo.
embalaje abierto, tomando la precaucin de no aumentar
su grado de fragmentacin durante la manipulacin. Para 5.4.2.3 DETERMINACIN DE AGUA EN
cantidades de droga hasta 100 kg, a muestra debe consti- DROGAS VEGETALES
tuirse de, como mnimo, 500 g. Habiendo ms de 100 kg
de droga a muestrear, proceder al muestreo seguida de se- Tres mtodos son empleados para la determinacin de agua
leccin por cuarteamiento, generando muestra de 500 g en en drogas vegetales: mtodo gravimtrico (desecacin),
el final del proceso. mtodo azeotrpico (destilacin con tolueno) y mtodo
volumtrico (Karl Fischer). El primero, tcnicamente ms
5
En ambos los casos, drogas con dimensiones inferiores o simple y rpido, no es aplicable cuando la droga contiene
superiores a 1 cm, es permitido muestrear cantidades infe- sustancias voltiles. Los dems requieren equipos especia-
riores a las especificadas arriba desde que la cantidad total les y comprenden tcnicas ms complejas.
de droga disponible sea inferior a 10 kg. Todava, la mues-
tra final no deber ser inferior a 125 g. PREPARADO DE LA MUESTRA
5
cido clorhdrico diluido despus de filtrado; lavado e inci-
neracin. El mtodo se destina a la determinacin de slice
y constituyentes silcicos de la droga.
PROCEDIMIENTO
5
4. soporte vertical adecuado. 5.4.2.8 DETERMINACIN DE ACEITES
FIJOS
Antes de la utilizacin, el aparato debe ser limpiado por
lavados repetidos y sucesivos con acetona, agua, mezcla La determinacin de aceites fijos se basa en su extraccin
sulfocrmica y nuevamente agua. Despus de seco, debe por solvente que, despus de evaporado, deja como residuo
ser montado en local protegido de corrientes de aire. La el aceite cuya cantidad es determinada por pesaje.
escala graduada debe ser medida y, si necesario, establecer
factor de correccin para cada aparato. En el caso de que la muestra contenga tenor elevado de
componentes hidrosolubles (carbohidratos, urea, cido
PROCEDIMIENTO lctico, entre otros), cabe pretratamiento de la muestra a
fin de evitar interferencia en la determinacin de materias
Introducir en el baln el volumen del lquido indicado en grasas. Para tanto, transferir la porcin de ensayo para em-
la monografa y fragmentos de porcelana porosa o cuentas budo conteniendo papel de filtro, lavar con agua y secar el
de vidrio para regularizar la ebullicin. Adaptar el conden- residuo en estufa a 105 C durante 2 horas.
sador al baln. Retirar el tapn esmerilado (K) y, por la
abertura (K), introducir el agua hasta que esta comience a Emplear el aparato de Soxhlet (Figura 1). El equipo, con-
escurrir en (B). Usando pipeta volumtrica, introducir xi- feccionado en vidrio resistente, de calidad apropiada, com-
leno, en la cantidad prescrita, apoyndose la punta de la prende baln de fondo redondo (A), con 500 ml a 1000 ml
pipeta en el fondo de la salida lateral (K). Calentar el lqui- de capacidad, conectado al extractor Soxhlet (B) y conden-
do en el interior del baln hasta el inicio de la ebullicin sador de reflujo (C).
y destilar en la razn de 2 a 3 ml por minuto, o conforme
prescrito en la monografa.
5
ser puro y seco, presentando punto de fusin superior a
30 C. Debe ser conservado en frasco hermtico, por ser
higroscpico.
PROCEDIMIENTO
Figura 3 - Aparato de Soxhlet.
Secar la muestra del aceite esencial en ensayo, agitndola
Antes de la utilizacin, el aparato debe ser limpiado por en mezcla con sulfato de sodio o con cloruro de calcio,
lavados repetidos y sucesivos con acetona, agua, mezcla anhidros, en tubo de ensayo o en Matraz provisto de tapa
sulfocrmica y, nuevamente, agua. Despus de seco, debe esmerilada. Dejar en contacto durante 24 horas y filtrar.
ser montado en local protegido de corrientes de aire. Transferir para tubo de ensayo (cerca de 15 mm de dime-
tro y 80 mm de altura) 3,0 g de aceite esencial, exactamen-
PROCEDIMIENTO te, pesados y aadir 2,1 g de o-cresol en sobrefusin. Agitar
la mezcla con bulbo de termmetro (0 60 C, graduado
Transferir, exactamente, cerca de 10 g de droga previamente en dcimos de grado) suspenso sobre el tubo de modo que
desecada conforme descrito en Determinacin de agua en la extremidad del bulbo no exceda el lmite de 5 mm de la
drogas vegetales (5.4.2.3), Mtodo gravimtrico, y transferir base del tubo y sin tocar en sus paredes, hasta induccin
para aparato extractor de Soxhlet (B), cubrindola con algo- de cristalizacin. Anotar la temperatura mxima observada
dn desengrasado. Pesar el baln (A) limpio y seco (conte- en el termmetro durante la cristalizacin. Calentar el tubo
niendo fragmentos de porcelana o cuentas de vidrio) y mon- a cerca de 5-10 C arriba de la temperatura leda e intro-
tarlo en el aparato sobre bao mara, tomando la precaucin ducirlo en otro tubo mayor (cerca de 60 mm de dimetro
de asegurar sellado en la junta esmerilada del baln (se re- y 100 mm de altura) para crear camada de aire. Fijar el
comienda operacin en campana). Transferir para el extrac- tubo menor dentro del otro con auxilio de placas de corcho
tor ter de petrleo en cantidad suficiente para realizar tres adaptadas o por cualquier otro medio y sumergir el conjun-
sifonajes y encajar el condensador de reflujo (C). Proceder a to en bao de agua con temperatura controlada, mantenien-
la extraccin bajo calentamiento suficiente para mantener el do la temperatura cerca de 5 C abajo del punto de conge-
solvente en ebullicin moderada durante 4 horas. lamiento previamente anotado para el cresineol. Agitar la
mezcla con movimientos verticales del termmetro y, al
Concluida la extraccin, aguardar enfriamiento, transferir el iniciarse la cristalizacin (turbacin del lquido), observar
contenido del cartucho para mortero de porcelana y juntar a estabilizacin de la temperatura. Habiendo fluctuaciones
cantidad aproximadamente igual de arena lavada y seca. durante la cristalizacin, considerar siempre la temperatura
Pulverizar la droga y transferirla nuevamente, en el interior mxima leda durante el perodo de congelamiento.
del cartucho, para el extractor. Reiniciar y mantener a ex-
traccin en las condiciones arriba por perodo adicional de Repetir la determinacin cuantas veces sea necesario para
2 horas. Desligar el baln del aparato y evaporar el solvente que dos lecturas sucesivas den una variacin mxima de
(de preferencia por destilacin bajo corriente de dixido de 0,1 C.
carbono). Transferir el baln para estufa a 105 C, enfriar y
pesar. Repetir la operacin hasta peso constante. Calcular el
5
43 72,3 72,5 72,7 72,9 73,1 73,3 73,4 73,6 73,8 74,0
44 74,2 74,4 74,6 74,8 75,0 75,2 75,3 75,5 75,7 75,9
45 76,1 76,3 76,5 76,7 76,9 77,1 77,2 77,4 77,6 77,8
46 78,0 78,2 78,4 78,6 78,8 79,0 79,2 79,4 79,6 79,8
47 80,0 80,2 80,4 80,6 80,8 81,1 81,3 81,5 81,7 81,9
48 82,1 82,3 82,5 82,7 82,9 83,2 83,4 83,6 83,8 84,0
49 84,2 84,4 84,6 84,8 85,0 85,3 85,5 85,7 85,9 86,1
50 86,3 86,6 86,8 87,1 87,3 87,6 87,8 88,1 88,3 88,6
51 88,8 89,1 89,3 89,6 89,8 90,1 90,3 90,6 90,8 91,1
52 91,3 91,6 91,8 92,1 92,3 92,6 92,8 93,1 93,3 93,6
53 93,8 94,1 94,3 94,6 94,8 95,1 95,3 95,6 95,8 96,1
54 96,3 96,6 96,9 97,2 97,5 97,8 98,1 98,4 98,7 99,0
55 99,3 99,7 100,0
5.4.2.10 DETERMINACIN DEL NDICE Si, en cualquiera de los tubos, la altura de la espuma medi-
DE ESPUMA da es 1 cm, la diluicin del material vegetal en ese tubo (A)
es el ndice observado. Si ese tubo es el primero o segundo
Pesar, exactamente, 1 g del material vegetal reducido a pol- en la serie, es necesario hacer una diluicin intermediaria,
vo fino (malla de 180 m, 5.2.11) y transferir para matraz por el mismo mtodo descrito anteriormente, para obtener
conteniendo 50 ml de agua hirviendo. Mantener bajo ebu- un resultado ms preciso.
llicin moderada durante 30 minutos. Enfriar, filtrar para
baln volumtrico de 100 ml. Completar el volumen, a tra- Si la altura de la espuma es mayor que 1 cm en todos los
vs del filtro, hasta 100 ml. tubos, el ndice de espuma es mayor del que 1000. En ese
caso, la determinacin precisa ser hecha con una nueva se-
Distribuir el decocto obtenido, en 10 tubos de ensayo con rie de diluiciones del decocto para obtenerse un resultado
tapa (16 mm de dimetro por 16 cm de altura), en serie preciso.
sucesiva de 1, 2, 3, hasta 10 ml, y ajustar el volumen del
lquido en cada tubo a 10 ml con agua. Tapar los tubos y El ndice de espuma es calculado segn a ecuacin 1000/A,
agitarlos con movimientos verticales por 15 segundos, con siendo A el volumen, en mililitros, del decocto usado para
dos agitaciones por segundo. Dejar en reposo por 15 minu- preparacin de la diluicin en el tubo donde la espuma fue
tos y medir la altura de la espuma. observada.
5
agua y pesar para obtener el peso total, incluyendo el fras- diferentes (cansancio, humo, ingestin de alimentos). Por
co. Tapar, agitar bien y dejar descansar por 1 h. Acoplar un lo tanto, la determinacin de la concentracin umbral de
condensador de reflujo y calentar por 1 h, enfriar y pesar. amargor del material a ser probado con clorhidrato de qui-
Despus del reflujo, corrija el peso original con solvente nina debe ser hecha por la misma persona, dentro de un
especificado en el ensayo para la droga vegetal. Mezclar corto espacio de tiempo. La sensacin de amargor no es
bien y filtrar, rpidamente, por medio de un filtro seco. percibida por toda la superficie de la lengua, pero es res-
Transferir 25 ml del filtrado para una cpsula de porcelana tricta a las partes superior y lateral de la base de la lengua.
tarada y evaporar hasta sequedad en bao de agua. Secar La determinacin de la concentracin limiar de la solucin
105 C por 6 h, enfriar en desecador por 30 min y pesar, requiere entrenamiento del analista. Primeramente, es he-
inmediatamente. Calcular el porcentaje de materiales ex- cha la determinacin de la concentracin umbral del clor-
trados en mg/g de material seco. hidrato de quinina y, en seguida, la del material a ser proba-
do. Individuos insensibles a la sensacin amarga inducida
MTODO C: EXTRACCIN A FRO por una solucin conteniendo 0,058 mg de clorhidrato de
quinina en 10 ml de agua no son indicados para la realiza-
Pesar un matraz de 250 ml, con boca esmerilada y transfe- cin de la prueba.
rir hacia l, exactamente, cerca de 4,0 g de droga vegetal
seca, finamente, pulverizada. Macerar, con 100 ml de sol- La preparacin de la solucin-stock de material vegetal a
vente especificado, durante 6 h, agitando frecuentemente, ser probado (ST) debe ser especificada en la monografa
y dejar en reposo por 18 h. Filtrar, rpidamente, sin dejar correspondiente. En series nicas de prueba, la determi-
perder cualquier cantidad de solvente; transferir 25 ml del nacin siempre inicia con la menor concentracin (a me-
filtrado para una cpsula de porcelana tarada y evaporar nos que otra orden sea especificada en la monografa) para
hasta sequedad en bao de agua. Secar a 105 C por 6 h, mantener la sensibilidad de las papilas gustativas.
enfriar en desecador por 30 min y pesar inmediatamente.
Calcular el porcentaje de materiales extrados en mg/g de PREPARADO DE LAS SOLUCIONES
material vegetal seco.
Solucin stock y solucin diluida de clorhidrato de
quinina
Tabla 1 - Diluiciones de clorhidrato de quinina para la prueba inicial en la obtencin del ndice de amargor.
1 2 3 4 5 6 7 8 9
ST (b) (ml) 4,2 4,4 4,6 4,8 5,0 5,2 5,4 5,6 5,8
Agua potable (ml) 5,8 5,6 5,4 5,2 5,0 4,8 4,6 4,4 4,2
Clorhidrato de quinina (mg/10 mL) (c) 0.042 0.044 0.046 0.048 0.050 0.052 0.054 0.056 0.058
Preparar la solucin stock como especificado en la monografa (ST). Utilizar 10 tubos de ensayo para la diluicin en serie,
como indicado en la Tabla 2 para la segunda prueba.
Tabla 2 - Diluiciones de la solucin stock para la segunda prueba en la obtencin del ndice de amargor.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
ST (b) (ml) 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 10,0
Agua potable (ml) 9,00 8,00 7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 -
PROCEDIMIENTO en que
V = valor de amargor, en unidades/g;
Despus de enjuagar la boca con agua potable, probar 10 a = cantidad de material, en mg/ml, en la ST;
ml de la diluicin, girndola en la boca, principalmente b = volumen de ST en 10 ml de la diluicin de la concenra-
cerca de la base de la lengua por 30 segundos. Siempre cin umbral de amargor;
comenzar con la solucin menos concentrada de la serie, c = cantidad de clorhidrato de quinina, en mg/10 ml, en la
excepto cuando prescrito de manera diferente en la mo- diluicin de la concentracin umbral de amargor.
nografa. Si la sensacin de amargor no es ms sentida,
retirar la solucin y esperar 1 minuto para asegurarse que 5.4.2.13 DETERMINACIN DE LA
no haya sensibilidad retardada. Enjuagar la boca con agua. ACTIVIDAD HEMOLTICA
Aguardar, por lo menos, 10 minutos para probar la prxima
diluicin. La concentracin umbral de amargor es la dilui- La actividad hemoltica de extractos vegetales, o de una
5
cin de menor concentracin en que el material adems preparacin conteniendo saponinas, es determinada por
provoca sensacin de amargor. Despus de la primera serie comparacin con la actividad de una referencia de saponi-
de pruebas, enjuagar bien la boca con agua, hasta que el na con actividad hemoltica de 1000 unidades por gramo.
amargor no sea ms percibido y esperar, como mnimo, 10 Una suspensin de eritrocitos es mezclada con volmenes
minutos antes de hacer la segunda serie de pruebas. iguales de una diluicin en serie del extracto. La menor
concentracin a provocar hemlisis completa es determi-
En esa serie de pruebas, para mayor rapidez, es aconsejable nada despus de dejar el sistema en reposo por un perodo
asegurar que la solucin en el tubo nmero 5 (contenien- especfico de tiempo. Una prueba similar es hecha simult-
do 5 ml de ST en 10 ml de solucin) provoque sensacin neamente con solucin de referencia de saponina.
de amargor. Si es percibida, encontrar la concentracin de
amargor del material, probando las diluiciones en los tubos PROCEDIMIENTO
de nmeros 1 a 4. Si la solucin en el tubo de nmero 5 no
provoca sensacin de amargor, encontrar la concentracin Para la preparacin de la suspensin de sangre, colocar ci-
umbral de amargor en los tubos de nmeros 6 a 10. trato de sodio a 3,65% (p/v) en un frasco con tapa hasta
1/10 de su capacidad. Agitar para mojar totalmente las pa-
Todas las soluciones y el agua deben estar en una tempera- redes del frasco y aadir sangre bovina fresco, con nueva
tura entre 20 C y 25 C. agitacin.
El ndice de amargor es calculado segn a ecuacin: La sangre, con citrato de sodio, as preparado puede ser
almacenada por 8 das a una temperatura entre 2 C y 4 C.
2000 x c
V=
(a x b)
Tabla 1 - Diluicin en serie del extracto vegetal para determinacin de la actividad hemoltica.
Tubo 1 2 3 4
Extracto vegetal (ml) 0,10 0,20 0,50 1,00
Tampn fosfato pH 7,4 (ml) 0,90 0,80 0,50 -
Suspensin de sangre (2%) (ml) 1,00 1,00 1,00 1,00
Logo que los tubos sean preparados, invertirlos cuidadosa- Si, despus de 6 horas, todos los tubos convierten un lqui-
mente para mezclar, evitando la formacin de la espuma. do lmpido y rojo, preparar una solucin diluida 10 veces y
Despus de 30 minutos, agitar nuevamente y dejar descan- hacer la prueba preliminar, como descrito arriba.
sar por 6 horas a temperatura ambiente. Examinar los tubos
y anotar en cual diluicin ocurri hemlisis total, lo que Si la hemlisis total no es observada en ninguno de los tu-
ser constatado en el lquido, lmpido, rojo y sin depsito bos, repetir la prueba preliminar, usando un extracto ms
de eritrocitos. concentrado.
Si la hemlisis total es observada en los tubos 2, 3 y 4, Hacer las diluiciones y evaluaciones como en la prueba
preparar una solucin diluida cinco veces, como descrito preliminar, observando los resultados despus de 24 horas.
arriba. Calcular la cantidad de material vegetal en gramos, o pro-
porcin en g/ml que produce hemlisis total (b).
Tabla 2 - Diluicin en serie del extracto vegetal con tampn fosfato y suspensin de sangre para la prueba principal
Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
5
Extracto vegetal (o diluicin) (ml) 0,40 0,45 0,50 0,55 0,60 0,65 0,70 0,75 0,80 0,85 0,90 0,95 1,00
Tampn fosfato (ml) 0,60 0,55 0,50 0,45 0,40 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 -
Suspensin de sangre 2% (ml) 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00
5
Los extractos fluidos pueden ser obtenidos por percolacin, en la proporcin adecuada. Presentan, como mnimo, 70%
maceracin o por disolucin de extractos secos o blandos de residuo seco (p/p). En extractos blandos pueden ser aa-
utilizando como solvente nicamente etanol, agua o mez- didos conservantes para inhibir el crecimiento microbiano.
clas etanol/agua de proporcin adecuada. Si necesario, el
extracto obtenido puede ser filtrado. Cualquiera que sea el OBTENCIN
proceso de obtencin, los extractos fluidos presentan com-
posicin y caractersticas comparables. La formacin de un Los extractos blandos son obtenidos a partir de extractos
ligero sedimento durante el almacenamiento es aceptable, fluidos preparados empleando nicamente etanol, agua o
siempre que la composicin del extracto no sufra modifi- mezclas etanol/agua en la proporcin adecuada; despus
caciones significativas. de evaporacin parcial del solvente. Presentan como mni-
mo 70 % de residuo seco (p/p).
ENSAYOS DE PUREZA
ENSAYOS DE PUREZA
Densidad relativa (5.2.5). Cuando sea el caso, los extrac-
tos fluidos deben cumplir con los lmites prescritos en la Residuo seco (5.4.3.2.2). El residuo seco debe cumplir con
monografa. lo especificado en la monografa.
5.4.3.1.3 Extractos secos (Extracta sicca) adecuados o por la adicin de extractos secos obtenidos
con la misma droga utilizada en la preparacin.
DEFINICIN
Cuando necesario, la monografa podr prescribir realiza-
Extractos secos son preparaciones slidas obtenidas por cin de ensayo lmite para el solvente utilizado en la pre-
la evaporacin del solvente utilizado en su preparacin. paracin.
Presentan, como mnimo, 95% de residuo seco, calculados
como porcentaje de masa. Los extractos secos pueden ser OBTENCIN
aadidos de materiales inertes adecuados.
Extractos secos son preparaciones slidas obtenidas por
Los extractos secos estandarizados tienen el tenor de sus evaporacin o vaporizacin del solvente. Independiente de
constituyentes ajustado por la adicin de materiales inertes la tcnica de secado, deben presentar como mnimo 95 %
adecuados o por la adicin de extractos secos obtenidos de residuo seco, calculados como porcentaje de masa.
con la misma droga utilizada en la preparacin.
ENSAYOS DE PUREZA
Cuando necesario, la monografa podr prescribir realiza-
cin de ensayo lmite para el solvente utilizado en la pre- Residuo seco (5.4.3.2.3). El residuo seco debe cumplir con
paracin. lo especificado en la monografa.
Extractos secos son preparaciones slidas obtenidas por En recipientes hermticamente cerrados, al abrigo de la
evaporacin o vaporizacin del solvente. Independiente de luz.
5
la tcnica de secado, deben presentar en el mnimo 95 % de
residuo seco, calculados como porcentaje de masa. ETIQUETADO
Residuo seco (5.4.3.2.3). El residuo seco debe cumplir con nomenclatura botnica de la droga que dio origen al
lo especificado en la monografa. extracto;
nombre y cantidad del material inerte utilizado;
EMBALAJE Y ALMACENAMIENTO si el extracto fue preparado con planta fresca (cuando
sea el caso);
En recipientes hermticamente cerrados, al abrigo de la nombre del solvente y el tenor de etanol en porcentaje
luz. (v/v) en el solvente utilizado en la preparacin;
tenor de principios activos y/o relacin droga / extracto
ETIQUETADO final.
50 ml con agua o etanol a 90% (v/v), ajustando el tenor de nitro-anilida. Reconstituya de acuerdo con las instruccio-
etanol para 10% (v/v). nes del fabricante.
Solucin estndar: preparar 50 ml de solucin conteniendo Tampn de diluicin: solucin de trometamina a 0,605%
2 ml de solucin estndar interno, 10% de etanol (v/v), (p/v). si necesario, ajuste para pH 8,4 con cido clorhdrico.
0,05% de 2-propanol (v/v) y 0,05% de metanol anhidro
(v/v). Solucin problema: diluir la muestra con el Tampn de di-
luicin para obtener una solucin que supuestamente con-
Procedimiento: inyectar, separadamente, 1 L de la So- tenga 0,1 UI de heparina por mililitro.
lucin estndar y de la Solucin muestra, registrar los
cromatogramas y medir las reas de los picos. Calcular Solucin de referencia: diluir la preparacin de referencia
los contenidos de metanol y 2-propanol con relacin a la de la heparina con el Tampn de diluicin para obtener una
muestra sometida a la destilacin a partir de las respuestas solucin que contenga 0,1 UI de heparina por mililitro. Las
obtenidas con la Solucin estndar y la Solucin muestra. condiciones descritas son aplicables a las placas de micro-
titulacin. Si el ensayo es realizado en tubos, ajustar los
5.4.3.2.2 Determinacin de residuo seco en volmenes para mantener las proporciones en la mezcla.
extractos fluidos y blandos Poco tiempo antes del ensayo, colocar todas las soluciones
a 37 C en bao mara. Distribuir en una serie de pozos, 20
Transferir 2 ml o 2 g de extracto para pesafiltros o placa L de plasma humano normal y 20 L de antitrombina III
de Petri, midiendo, aproximadamente, 50 mm en dimetro SR. Juntar a los pozos una serie de volmenes (20 L, 60
y 30 mm de altura. Evaporar hasta secura en bao mara y L, 100 L y 140 L) de la Solucin problema o de la So-
desecar en estufa a 100 105 C, por 3 horas. Dejar enfriar lucin de referencia y completar el volumen de cada pozo
en desecador, sobre pentxido de fsforo y pesar. Calcular el con 200 L utilizando el Tampn de diluicin (0,02 0,08
5
residuo seco en porcentaje sobre la masa o sobre el volumen. UI de heparina por mililitro en la mezcla reactiva final).
5.5.1 MTODOS BIOLGICOS Transferir 40 L de cada pozo para una segunda serie de
pozos, juntar 20 L de la solucin del Factor Xa bovino
5.5.1.1 DETERMINACIN DE LA e incubar a 37 C durante 30 segundos. Juntar 40 L de
HEPARINA EN LOS FACTORES DE LA la solucin del Sustrato cromognico para el Factor Xa
COAGULACIN a 2 mmol/L, incubar a 37 C y determinar la velocidad de
clivaje del sustrato procediendo a la lectura continua de la
La heparina es determinada bajo la forma de un complejo variacin de absorbancia a 405 nm (5.2.14) posibilitando,
a la antitrombina III (AT) va inhibicin de la actividad as, calcular la velocidad inicial de clivaje del sustrato. Esa
del Factor Xa de la coagulacin. En la mezcla reactiva es velocidad debe ser proporcional a la concentracin residual
mantenido un exceso de AT para garantizar una concen- del Factor Xa. Verificar la validez del ensayo y calcular la
tracin constante del complejo heparina-AT. El Factor Xa actividad de la heparina de la muestra por los procedimien-
es neutralizado por el complejo heparina-AT y el Factor tos estadsticos aplicables a los ensayos biolgicos (8).
Xa residual hidroliza un sustrato cromognico peptdico
especfico libertando un cromforo. La cantidad del cro- 5.5.1.2 DETERMINACIN DEL FACTOR
mforo es inversamente proporcional a la actividad de la DE VON WILLEBRAND HUMANO
heparina.
La potencia del Factor de Von Willebrand humano es de-
Sustrato cromognico para el Factor Xa: sustrato cromo- terminada por la comparacin, en condiciones obligatoria-
gnico especfico del Factor Xa tal como: el clorhidrato mente dadas, de su actividad en colgeno o como cofactor
de N-a-benzoil-L-isoleucil-L-glutamil-glicil-L-arginina-4- de ristocetina con la misma actividad, y calibrada utilizn-
dose un estndar de referencia internacional, en unidades
internacionales, cuando aplicable. La Unidad Internacional das para ensayo inmunoenzimtico y protena de alta capa-
es la actividad de un monto declarado del estndar de refe- cidad de conexin.
rencia internacional para el Factor de Von Willebrand exis-
tente en el concentrado de Factor VIII de la coagulacin de PROCEDIMIENTO
la sangre humana. La equivalencia en unidades internacio-
nales del estndar de referencia internacional es indicada Solucin prueba: reconstituir la preparacin a ser analiza-
por la Organizacin Mundial de Salud (OMS). da como indicado en el rtulo. Diluir con Tampn para
diluicin para preparar una solucin conteniendo cerca de
DOSIFICACIN DE LA CONEXIN AL COLGENO 1 UI/ ml de Factor de Von Willebrand. Preparar dos series
independientes con por lo menos tres diluiciones mediante
La conexin al colgeno es determinada por tcnica de el uso del Tampn para diluicin.
inmunoensayo enzimtico en placas de micro titulacin,
revestidas por colgeno. El mtodo se basa en la cone- Soluciones de referencia: reconstituir la preparacin de re-
xin especfica del Factor de Von Willebrand a las fibras ferencia como indicado. Diluir con Tampn para diluicin
de colgeno y de la subsiguiente conexin de un anticuer- para preparar una solucin conteniendo cerca de 1 UI/ml
po policlonal anti- Factor de Von Willebrand conjugado a de Factor de Von Willebrand. Preparar dos series indepen-
una enzima. Despus de la adicin de un sustrato cromo- dientes con por lo menos tres diluiciones mediante el uso
gnico hay formacin de un producto cuantificable espec- del Tampn para diluicin.
trofotomtricamente. En condiciones apropiadas, hay una
relacin lineal entre el colgeno, Factor de Von Willebrand Posibilitar que la solucin de colgeno alcance la temperatu-
y la absorbancia indicada. ra ambiente. Diluir con Diluyente de colgeno para obtener
una solucin conteniendo 30 a 75 mg/ml de colgeno. Mez-
MATERIALES clar, suavemente, para producir una suspensin uniforme de
5
las fibras de colgeno y enseguida pipetear 0,1 ml y trans-
Colgeno: usar fibrillas de colgeno de equino nativo, o ferir para cada pozo de la microplaca. Cubrir la placa con
humanas, tipo I o III. Para facilitar la manipulacin, pue- pelcula plstico e incubar a 37 C de un da para el otro.
den ser usadas las soluciones de colgeno. Vaciar los pozos de la placa revestida con el colgeno por
inversin y drenaje en una servilleta de papel. Aadir 0,25
Diluyente de colgeno: disolver 50 g de glucosa en agua. ml de Solucin de lavado tamponada. Vaciar los pozos de la
Ajustar el pH en 2,7 a 2,9 con cido clorhdrico M y diluir placa por inversin y drenar en una servilleta de papel, repi-
en agua a 1000 ml. tiendo esa operacin tres veces. Aadir, cada pozo, 0,25 ml
de Reactivo de neutralizacin, cubrir la placa con pelcula
Tampn de cloruro-fosfato: disolver 8 g de cloruro de sodio, plstico e incubar a 37 C por 1 hora. Los pozos de la placa
1,05 g de fosfato de sodio dibsico, dihidratado, 0,2 g de deben ser vaciados por inversin y drenaje en servilleta de
fosfato de sodio monobsico dihidratado y 0,2 g de cloruro papel. Aadir 0,25 ml de Solucin de lavado tamponada.
de potasio en agua. Ajustar el pH en 7,2 con hidrxido de Vaciar los pozos de la placa por inversin y drenar en una
sodio M o cido clorhdrico M. Diluir a 1000 ml con agua. servilleta de papel. Repetir esa operacin tres veces.
Solucin de lavado tamponada: solucin de polisorbato 20 Aadir 0,1 ml de cada una de las Soluciones prueba o refe-
a 0,1% (p/v) en Tampn de cloruro fosfato. rencia a los pozos. Aadir 0,1 ml de Tampn para diluicin
a una serie de pozos para obtenerse el control negativo.
Reactivo de neutralizacin: preparar el Tampn de cloruro Cubrir la placa con pelcula plstico e incubarla a 37 C
fosfato conteniendo polisorbato 20 a 0,1% (p/v) y albmi- por 2 horas. Los pozos de la placa deben ser vaciados por
na bovina a 1% (p/v). inversin y drenaje en servilleta de papel. Aadir 0,25 ml
de Solucin de lavado tamponada. Vaciar los pozos de la
Tampn para diluicin: preparar el Tampn de cloruro fos- placa por inversin y drenaje en una servilleta de papel,
fato conteniendo polisorbato 20 a 0,1% (p/v) y albmina repitiendo esta operacin por tres veces.
bovina a 5% (p/v).
Preparar una diluicin adecuada de Conjugacin con Tam-
Conjugacin: suero de conejo del anti-Factor de Von Wi- pn de cloruro fosfato conteniendo albmina bovina a
llebrand humano conjugado a la peroxidasa del rbano sil- 0,5% (p/v) y aadir 0,1 ml cada pozo. Cubrir la placa con
vestre, un marcador histoqumico. Seguir las recomenda- pelcula plstico e incubar a 37 C por 2 horas. Vaciar los
ciones del fabricante. pozos de la placa por inversin y drenaje en una servilleta
de papel. Aadir 0,25 ml de Solucin de lavado tampona-
Solucin de sustrato: disolver, inmediatamente antes de da. Vaciar los pozos de la placa por inversin y drenar en
su uso, un comprimido de clorhidrato de el-fenilendiami- una servilleta de papel. Repetir esta operacin tres veces.
na y un comprimido de perxido de carbamida en 20 ml
de agua, o usar un volumen adecuado de agua oxigenada. Aadir 0,1 ml de Solucin de sustrato a cada uno de los po-
Proteger de la luz. zos e incubar a la temperatura ambiente por 20 minutos en lo
oscuro. Aadir 0,1 ml de cido clorhdrico M a cada uno de
Placas de microtitulacin: deben poseer fondo plano, pla- los pozos. Medir la absorbancia a 492 nm (5.2.14). Utilizar
cas de polietileno con propiedades de superficie optimiza- los valores de absorbancia para estimar la potencia de la pre-
paracin a ser analizada mediante el empleo de los procedi- Solucin estndar: diluir el estndar en el Tampn de di-
mientos estadsticos aplicables a los ensayos biolgicos (8). luicin para obtener una solucin conteniendo 0,015 UI
de Factor II por mililitro. Preparar, por lo menos, ms tres
El ensayo es vlido si las absorbancias medidas para los diluiciones de esa solucin en el Tampn de diluicin.
controles negativos fuesen mayores que 0,05. Colocar todas las soluciones en bao mara a 37 C, poco
tiempo antes del ensayo. Las condiciones descritas se apli-
5.5.1.3 DETERMINACIN DEL FACTOR can a las placas de microtitulacin. Si la determinacin es
II DE LA COAGULACIN SANGUINEA realizada en tubos, ajustar los volmenes para mantener las
HUMANA proporciones en la mezcla. Introducir 25 L de las dife-
rentes diluiciones de la Solucin muestra y de la Solucin
La determinacin del Factor II de la coagulacin humana estndar, en una serie de pozos de la placa de microtitu-
es realizada despus de activacin especfica en Factor IIa. lacin mantenida a 37 C. Juntar en cada pozo125 L del
El Factor IIa es calculado comparando su actividad en un Tampn de diluicin y 25 L de Activador especfico del
sustrato cromognico peptdico especfico con la misma Factor II proveniente del veneno de la vbora e incubar
actividad del estndar internacional o de una preparacin durante exactamente 2 minutos. Juntar en cada pozo 25 L
estndar calibrada en Unidades Internacionales (UI). La de Sustrato cromognico para el Factor IIa.
Unidad Internacional del Factor II corresponde a la acti-
vidad de una dada cantidad del estndar internacional, que Proceder a la lectura de la velocidad de variacin de la ab-
es constituido por un concentrado liofilizado del Factor II sorbancia en 405 nm (5.2.14) y continuar durante tres minu-
de la coagulacin sangunea. La correspondencia entre la tos de modo obtener la velocidad promedio de variacin de
Unidad Internacional y el Estndar Internacional es esta- la absorbancia. Se no es posible una lectura continua, deter-
blecida por la Organizacin Mundial de Salud. minar la absorbancia en 405 nm en intervalos consecutivos
apropiados, por ejemplo, de 40 en 40 segundos. Construir
5
El mtodo de la determinacin cromognica incluye dos el grfico lineal de los valores de absorcin en funcin del
etapas sucesivas: activacin del Factor II por accin del tiempo y calcular la velocidad promedio de variacin de la
veneno de cobra y el clivaje enzimtica de un sustrato absorbancia. A partir de los valores individuales encontrados
cromognico por el Factor IIa que liberta un cromforo para cada diluicin del estndar y de la muestra, calcular la
cuantificable por espectrofotometra. En condiciones de actividad de la muestra y verificar la validez de la dosifica-
dosificacin apropiados, existe una relacin lineal entre la cin por los mtodos estadsticos habituales (8).
actividad del Factor IIa y el clivaje del sustrato cromog-
nico. 5.5.1.4 DETERMINACIN DEL FACTOR
IX DE LA COAGULACIN SANGUNEA
REACTIVOS HUMANA
Activador especfico del Factor II proveniente del veneno Se determina la actividad de la muestra, comparando la
de la vbora (Ecarina): protena obtenida a partir del vene- cantidad de la muestra necesaria para reducir el tiempo
no de la vbora Echis carinatus, activa especficamente el de coagulacin de una mezcla de prueba que contiene las
Factor II. Reconstituir la preparacin siguiendo las instruc- sustancias, adems del Factor IX, necesarias para la coagu-
ciones del fabricante. Una vez reconstituida, conservar a 4 lacin de la sangre; con la cantidad de una preparacin de
C y utilizar en el tiempo de 1 mes. referencia, evaluada en unidades internacionales, necesa-
rias para obtener el mismo efecto.
Sustrato cromognico para el Factor IIa: sustrato cro-
mognico especfico del Factor IIa como: clorhidrato de La Unidad Internacional corresponde a la actividad de una
H-D-fenilalanil-L-pipecolil-L-arginina-4-nitroanilida, 4-to- determinada cantidad del Estndar Internacional consti-
luenosulfonil-glicil-prolil-Larginina-4-nitroanilida, H-D-ci- tuido por un concentrado liofilizado del Factor IX de la
clohexilglicil-a-aminobutiril-L-arginina-4-nitroanilida, coagulacin sangunea. La equivalencia en unidades inter-
D-ciclohexilglicil-L-alanilarginina-4-nitroanilida-diacetato. nacionales del estndar internacional es establecida por la
Reconstituir siguiendo las instrucciones del fabricante. Organizacin Mundial de Salud.
Tampn de diluicin: solucin conteniendo 0,606% (p/v) Reconstituir, respectivamente, la muestra y la preparacin
de trometamina, cloruro de sodio a 1,753% (p/v), cido de referencia de acuerdo con las indicaciones del rtulo y
edtico a 0,279% (p/v) y albmina bovina o de albmina utilice inmediatamente. Cuando aplicable, determinar la
humana a 0,1% (p/v). Ajustar, si necesario, el pH para 8,4 cantidad de heparina presente y neutralcela juntando sulfa-
con cido clorhdrico. to de protamina (10 g de sulfato de protamina neutralizan
1,0 UI de heparina). Diluya la muestra y la preparacin de
PROCEDIMIENTO referencia con tampn de imidazol de pH 7,3 para obtener
soluciones con 0,5 a 2,0 UI por mililitro. Con una mezcla de
Solucin prueba: diluir la muestra en el Tampn de dilui- citrato de sodio a 3,8% (p/v) y tampn de imidazol de pH 7,3
cin para obtener una solucin conteniendo 0,015 UI de (1:5), preparar una serie de diluiciones comprendiendo 1/10,
Factor II por mililitro. Preparar, por lo menos, tres diluicio- 1/20, 1/40 y 1/80. Esas diluiciones debern ser preparadas
nes ms de esa solucin en Tampn de diluicin. con precisin y son utilizadas inmediatamente.
5
blanco est comprendido entre 100 y 200 segundos. especialmente, protenas purificadas de origen humana, o
bovina, especficamente el Factor X, la tromboplastina y
5.5.1.5 DETERMINACIN DEL FACTOR Factor Tisular/fosfolpido y un activador del Factor VII.
VII DE LA COAGULACIN SANGUINEA Esas protenas son, parcialmente, purificadas y no contie-
HUMANA nen impurezas capaces de interferir en la activacin del
Factor VII o del Factor X. El Factor X est presente en
La determinacin del Factor VII de la coagulacin es rea- cantidad tal que su concentracin final, fuera de la etapa
lizada por la determinacin de su actividad biolgica como de activacin, sea de 10 350 nmol/L, de preferencia de
un cofactor en la activacin del Factor X por el Factor 14 70 nmol/L. La tromboplastina utilizada puede ser de
VIIa/Factor Tisular en presencia de iones de calcio y de origen natural (cerebro de buey o conejo) o sinttica. La
fosfolpidos. La actividad de una preparacin del Factor tromboplastina utilizada para la determinacin del tiempo
VII es calculada por comparacin de las cantidades res- de Quick es diluida de 5 a 50 veces en una solucin tampn
pectivas de esa preparacin y del estndar internacional o de manera que la concentracin final de Ca2+ sea de 15-
de una preparacin de referencia determinada en unidades 25 nmol/L. La etapa final de formacin del Factor Xa es
internacionales que son necesarias para obtener una velo- conducida en una solucin conteniendo albmina humana
cidad de formacin del Factor Xa en un medio de reaccin o albmina bovina a una concentracin en que no ocurren
conteniendo las diferentes sustancias que intervienen en la prdidas en la adsorcin y, convenientemente, tamponada
activacin del Factor X. a pH comprendido entre 7,3 y 8,0. El Factor VII es el nico
Factor que limita la formacin del Factor Xa en la mezcla
La Unidad Internacional de la actividad del Factor VII co- de incubacin final y ninguno de los constituyentes reac-
rresponde a la actividad de una dada cantidad del estndar tivos de la mezcla tiene el poder de inducir por si slo la
internacional que es actualmente constituido por un plasma formacin el Factor Xa.
liofilizado. La correspondencia entre la Unidad Internacio-
nal y el Estndar Internacional es establecida por la Orga- La segunda etapa consiste en la cuantificacin del Factor
nizacin Mundial de Salud. Xa formado en la etapa precedente, en el medio de un sus-
trato cromognico especfico del Factor Xa. Ese sustrato
El mtodo de la determinacin cromognica comporta dos es generalmente un pptido corto derivado de 3 a 5 cidos
etapas sucesivas: la activacin del Factor X, bajo la ac- aminados ligados a un agrupamiento cromforo. La cisin
cin del Factor VIIa, en una mezcla reactiva conteniendo de ese agrupamiento y del sustrato peptdico promueve un
el Factor Tisular/fosfolpido y el ion calcio y la lisis enzi- desplazamiento de la actividad cromofrica para un largo
mtica de un sustrato cromognico por el Factor Xa que de onda que posibilita su cuantificacin por espectrofoto-
liberta un cromforo cuantificable por espectrofotometra. metra. El sustrato es generalmente disuelto en agua y uti-
En condiciones apropiadas de dosificacin, existe una re- lizado en una concentracin final de 0,2 2 nmol/L. Puede
lacin lineal entre la velocidad de formacin del Factor Xa igualmente comprender los inhibidores apropiados impi-
y la concentracin del Factor VII. El esquema siguiente diendo el proseguir de la formacin del Factor Xa (adicin
resume el principio de la determinacin: de yoduro).
5
tndar Internacional es establecida por la Organizacin
Todas las diluiciones son preparadas en tubos de plstico y Mundial de Salud.
utilizadas durante la primera hora.
El mtodo de la determinacin cromognica incluye dos
Etapa 1. A cada una de las diluiciones, obtenidas a partir de etapas: activacin del Factor X bajo accin del veneno
la preparacin de referencia y de la muestra, aadir un vo- de cobra, seguida de clivaje enzimtico de un sustrato
lumen apropiado del reactivo de coagulacin precalentado cromognico por el Factor Xa que liberta un cromforo
(o de una mezcla de sus constituyentes separados), mezclar cuantificable por espectrofotometra. En condiciones de
e incubar a 37 C en tubos de plstico o pozos de una mi- dosificacin apropiados, existe una relacin lineal entre la
croplaca. La concentracin de los diferentes constituyentes actividad del Factor Xa y el clivaje del sustrato.
durante la formacin del Factor Xa es como la especificada
en reactivos. Dejar desarrollar la reaccin de activacin del REACTIVOS
Factor X durante un tiempo apropiado; el trmino de la re-
accin acontece, de preferencia, antes que la concentracin Activador especfico del Factor X proveniente del veneno
en Factor Xa haya alcanzado su nivel mximo, a fin de que de la vbora de Russell (VVR): protena obtenida a partir
la curva dosis-respuesta presente una linealidad satisfacto- del veneno de la vbora de Russell (Vipera russelli) que
ria. El tiempo de reaccin es igualmente escogido de modo activa, especficamente, el Factor X. Reconstituir la prepa-
que la condicin de linealidad de la curva de produccin racin siguiendo las instrucciones del fabricante. Una vez
del Factor Xa en funcin del tiempo sea satisfactoria. Es reconstituida, conservar a 4 C y utilizar en el espacio de
generalmente de la orden de 2 a 5 minutos, pero son admi- 1 mes.
sibles ciertas variaciones para posibilitar mejorar la lineali-
dad de la curva dosis-respuesta. Sustrato cromognico para el Factor Xa: sustrato cro-
mognico especfico del Factor Xa tal como: clorhidrato
Etapa 2. Parar la reaccin de activacin por adicin de una de N-a-benciloxicarbonil-D-arginil-L-glicil-L-arginina-
mezcla reactiva conteniendo el sustrato cromognico. La 4-nitroanilida, clorhidrato de Nbenzoilo-L-isoleucil-L-
velocidad de clivaje del sustrato, que es proporcional a la glutamil-glicil-L-arginina-4-nitroanilida, metanosulfo-
concentracin del Factor Xa es determinada con el auxilio nil- D-leucil-glicil-L-arginina-4-nitroanilida, acetato de
de un espectrofotmetro por la variacin de la absorban- metoxicarbonil-D-ciclo-hexilalanil-glicil-L-arginina- 4-ni-
cia en un largo de onda apropiado. Puede determinarse la troanilida. Reconstituir siguiendo las instrucciones del fa-
absorbancia, continuamente, lo que posibilita calcular la bricante.
velocidad inicial de clivaje del sustrato, interrumpiendo
la reaccin de hidrlisis al final de un tiempo apropiado, Tampn de diluicin: solucin conteniendo trometamina
bajando el pH con un reactivo apropiado tal como el ci- a 0,37% (p/v), cloruro de sodio a 1,8% (p/v), imidazol a
do actico a 50% (p/v) o una solucin de citrato de sodio 0,21% (p/v), bromato de hexadimetrina a 0,002% (p/v) y
M en pH 3,0. Ajustar el tiempo de hidrlisis de modo que albmina bovina, o de albmina humana a 0,1% (p/v). Si
la condicin de linealidad de formacin del cromforo en necesario, ajustar para pH 8,4 con cido clorhdrico.
funcin del tiempo sea satisfactoria. Este tiempo es gene-
ralmente de los 3 a 15 minutos, pero son toleradas ciertas
variaciones si posibilitan mejorar la linealidad de la curva
Poco tiempo antes del ensayo, colocar todas las soluciones Etapa 1
en bao mara a 37 C. Factor VIII activado
Factor X Factor Xa
Las condiciones descritas se aplican a las placas de micro- Factor IXa, fosfolpido, Ca2+
titulacin. Si la determinacin es realizada en tubos, ajustar Etapa 2
los volmenes para mantener la proporcin en las mezclas. Factor Xa
sustrato cromognico pptido + cromforo
Transferir 12,5 L de las diferentes diluiciones de la So-
lucin prueba o de la Solucin estndar para una serie de Las dos etapas utilizan reactivos que pueden ser obtenidos
pozos de una placa de microtitulacin mantenida a 37 C. comercialmente. A pesar de que la composicin de esos
5
Aadir en cada pozo 25 L de VVR. Incubar durante exac- reactivos pueda estar sujeta a alguna variacin, sus carac-
tamente 90 segundos. Aadir cada pozo, 150 L Sustrato tersticas esenciales son descritas en las presentes especi-
cromognico para el Factor Xa, diluido seis veces en el ficaciones. Pueden ser permitidos desvos con relacin a
Tampn de diluicin. Proceder a la lectura de la variacin tales especificaciones desde que sea demostrado, mediante
de absorbancia en 405 nm (5.2.14) y continuar durante tres el uso del Estndar Internacional, que los resultados obte-
minutos para obtener la velocidad promedio de variacin nidos no difieren significativamente. Los embalajes comer-
de la absorbancia. Se no es posible una lectura contina, ciales son utilizados de acuerdo con las instrucciones del
determinar la absorbancia en 405 nm con intervalos con- fabricante; es importante asegurar que el embalaje escogi-
secutivos apropiados, por ejemplo, de 40 en 40 segundos. do es adecuado.
Construir el grfico lineal de los valores de absorbancia en
funcin del tiempo y calcular la velocidad media de varia- Los conjuntos usados deben ser debidamente validados,
cin de la absorbancia. A partir de los valores individuales pudiendo ser utilizada en ese caso, la verificacin del tiem-
encontrados para cada diluicin del estndar y de la mues- po de generacin del Factor Xa, a fin de determinar el tiem-
tra, calcular la actividad de la muestra y verificar la validez po necesario para alcanzar 50% de formacin mxima de
de la medida por los mtodos estadsticos habituales (8). Factor Xa.
como mnimo, 1 mg/ml de albmina humana, o bovina, Factor X haya alcanzado su nivel Mximo, a fin de que la
convenientemente tamponada (pH 7,3 a 8,0). Los diferen- curva dosis-respuesta presente una linealidad satisfactoria.
tes constituyentes del medio reactivo son generalmente El tiempo de reaccin es igualmente escogido de modo que
reunidos en dos preparaciones separadas, que no debern la condicin de linealidad de la curva de produccin del
inducir por s solas a la formacin de Factor Xa. Despus Factor Xa en funcin del tiempo sea satisfactoria. Y gene-
de la reconstitucin esas dos preparaciones pueden ser re- ralmente de la orden de 2 a 5 minutos no siendo admisibles
unidas con la condicin de que no se formen cantidades de ciertas variaciones que posibiliten mejorar la linealidad de
Factor Xa en la ausencia del Factor VIII. El Factor VIII es la curva dosis-respuesta.
el nico factor que limita la formacin del Factor Xa en la
mezcla de incubacin final. La segunda etapa consiste en Etapa 2. Interrumpir la reaccin de activacin por adicin
la cuantificacin del Factor Xa formado en la etapa ante- de una mezcla reactiva conteniendo el sustrato cromog-
rior en el medio de un sustrato cromognico especfico del nico. La velocidad de clivaje del sustrato, que es propor-
Factor Xa. Ese sustrato es generalmente un pptido corto cional a concentracin del Factor Xa, es determinada en
derivado de 3 a 5 aminocidos ligados a un agrupamiento un espectrofotmetro, por la variacin de la absorbancia
cromforo. La cisin de ese agrupamiento y del sustra- en un largo de onda apropiado. Determinar la absorbancia,
to peptdico promueve un desplazamiento de la actividad continuadamente, para posibilitar el clculo de la veloci-
cromofrica para un largo de onda que posibilita su cuanti- dad inicial de clivaje del sustrato, interrumpiendo la reac-
ficacin por espectrofotometra. El sustrato, generalmente cin de hidrlisis al final de un tiempo apropiado bajando
disuelto en agua y utilizado en una concentracin final de el pH, con un reactivo apropiado tal como el cido actico
0,2 a 2 mmol/L, debe contener los inhibidores apropiados (50% v/v de C2H4O2) o tampn citrato M pH 3,0. Ajustar
al impedimento de la formacin adicional del Factor Xa el tiempo de hidrlisis de modo que la condicin de linea-
y suprimir toda la actividad trombnica, lo que posibilita lidad de la formacin del cromforo en funcin del tiempo
mejorar la selectividad de la dosificacin en presencia del sea satisfactoria. Ese tiempo es generalmente de los 3 a
5
Factor Xa. 15 minutos, siendo toleradas ciertas variaciones, siempre
que posibiliten el mejoramiento de la linealidad de la curva
PROCEDIMIENTO dosis-respuesta. Verificar la validez del ensayo y calcular
la actividad de la muestra por procedimientos estadsticos
Debe ser reconstituido todo contenido de una ampolla de aplicados a los ensayos biolgicos (8).
la preparacin de referencia y de la muestra adicionando la
cantidad de agua; usar inmediatamente. Aadir cantidades 5.5.1.8 DETERMINACIN DE FACTORES
de prediluyentes necesarios para obtener soluciones entre DE LA COAGULACIN ACTIVADOS
0,5 a 2,0 UI/ml. El prediluyente es constituido por plasma
proveniente de un donante portador grave de la hemofilia Si la muestra contiene heparina, determine la cantidad
A, o de un reactivo preparado artificialmente, dando resul- existente y neutralcela juntando sulfato de protamina (10
tados equivalentes a los obtenidos con plasma hemoflico g de sulfato de protamina neutralizan 1 UI de heparina).
y con las mismas preparaciones estndar y muestra. Las Con el tampn tris-cloruro de sodio pH 7,5, prepare dilui-
soluciones prediluidas deben presentar buena estabilidad ciones a 1/10 y 1/100. Coloque una serie de tubos de polie-
para adems del tiempo necesario a la determinacin (por tileno en bao mara a 37 C. Introduzca en cada tubo 0,1
lo menos 30 minutos) a 20 C, y deben ser utilizadas den- ml de plasma pobre en plaquetas y 0,1 ml de una diluicin
tro de 15 minutos. Realizar las diluiciones siguientes de apropiada de cefalina SR o de una preparacin fosfolipdi-
la preparacin estndar y de la muestra por medio de una ca que acte como sustituto de plaquetas. Deje en reposo
solucin tampn isotnica sin agente de quelacin, y con- durante 60 segundos y junte cada tubo 0,1 ml de una de las
teniendo 1% de albmina humana o bovina; la solucin diluiciones y para el tubo de ensayo en blanco 0,1 ml de la
puede contener, por ejemplo, trometamina o imidazol y es solucin tampn.
de preferencia tamponada (pH 7,3 a 8,0). Preparar, como
mnimo, tres diluiciones adicionales independientes, de Junte, inmediatamente, cada tubo 0,1 ml de una solucin
preferencia en duplicado. Las soluciones deben ser prepa- de cloruro de calcio a 0,37% (p/v), previamente calentada
radas de modo que la concentracin final en Factor VIII, a 37 C, y determine el intervalo de tiempo entre la adicin
fuera de la etapa de formacin del Factor Xa, sea inferior de la solucin de cloruro de calcio y la formacin del co-
a 0,03 UI/ml y de preferencia a 0,01 UI/ml. Preparar un gulo, esa determinacin es realizada en los 30 minutos que
estndar conteniendo el conjunto de los constituyentes de siguen a la primera diluicin. El ensayo slo es vlido si
la mezcla reactiva, con excepcin del Factor VIII. Preparar el tiempo de coagulacin del ensayo en blanco es de 200 a
las diluiciones en tubos plsticos y usar inmediatamente. 350 segundos.
Etapa 1. A cada una de las diluiciones precalentadas, ob- 5.5.1.9 DETERMINACIN DE TTULO DE
tenidas a partir de la preparacin estndar y de la muestra, HEMAGLUTININAS ANTI-A Y ANTI-B
juntar un volumen apropiado del reactivo de coagulacin (MTODO INDIRECTO)
precalentado (o de una mezcla de sus constituyentes sepa-
rados), mezclar e incubar a 37 C en tubos plsticos o pozo Preparar una diluicin seriada en duplicado de la prepa-
de una microplaca. Dejar correr la reaccin de activacin racin a ser examinada en solucin de cloruro de sodio a
del Factor X durante tiempo apropiado; el fin de la reac- 0,9% (p/v). Para cada diluicin de una serie, aadir volu-
cin acontece de preferencia antes que la concentracin en men igual a 5% (v/v) de la suspensin de eritrocitos del
grupo A1. Los eritrocitos deben ser previamente lavados desnaturalizacin del cido nucleico por el calor (se-
tres veces en solucin de cloruro de sodio. Para cada di- cuencia blanco a ser amplificada) en dos cadenas mo-
luicin de la otra serie aadir volumen igual de 5% (v/v) no-cuaternarias;
de la suspensin de eritrocitos del grupo B. Los eritrocitos hibridacin especfica de los iniciadores con la secuen-
deben ser previamente lavados tres veces en solucin de cia a ser amplificada, bajo condiciones adecuadas de
cloruro de sodio a 0,9% (p/v). Incubar las series de dilui- reaccin;
cin a 37 C por 30 minutos y entonces lavar tres veces alargamiento, mediante la accin del ADN polimerasa,
con cloruro de sodio a 0,9% (p/v). Dejar los eritrocitos en de los iniciadores ligados cada una de las dos cadenas
contacto con el reactivo antiglobulina humano polivalente simples, a una temperatura adecuada (favorable al pro-
por 30 minutos. Sin centrifugar, examinar cada suspensin ceso de sntesis de ADN).
para aglutinacin en microscopio.
Los ciclos repetidos de desnaturalizacin por el calor, a hi-
5.5.1.10 TCNICAS DE AMPLIFICACIN bridacin de los iniciadores y la sntesis de ADN dan lugar
DE CIDOS NUCLEICOS a una amplificacin exponencial del fragmento de ADN
entonces delimitado por los iniciadores.
INTRODUCCIN
El producto especfico de la reaccin de PCR, conocido
Las tcnicas de amplificacin de cidos nucleicos fueron como amplicon, puede ser detectado por medio de una va-
establecidas con base en dos principios diferentes: riedad de mtodos de especificidad y sensibilidad apropia-
a) amplificacin de una secuencia blanco de cidos nu- das.
cleicos utilizando la reaccin en cadena de la polime-
rasa (PCR), la reaccin en cadena de la ligasa (LCR), o El ensayo de PCR Multiplex usa varios pares de iniciado-
la amplificacin isotrmica de una secuencia de cido res, destinados a amplificacin simultnea para diferentes
5
ribonucleico (RNA); objetivos de una reaccin.
b) amplificacin de una seal de hibridacin para el cido
desoxirribonucleico (ADN) mediante el empleo del m- MATERIAL PARA El ENSAYO
todo del ADN ramificado (bADN), por ejemplo. En ese
caso, la amplificacin de la seal se realiza sin someter Debido a la gran sensibilidad de la PCR, las muestras de-
el cido nucleico a ciclos repetitivos de amplificacin. ben ser protegidas de la incidencia de luz y de cualquier
contaminacin externa. El muestreo, conservacin y trans-
En lneas generales, el mtodo PCR es descrito como la porte del material a ser ensayado deben ser desarrollados
tcnica de referencia. Pueden ser utilizados mtodos alter- en condiciones que posibilitan reducir al mnimo los ries-
nativos, siempre que satisfagan los requisitos de calidad y gos de degradacin de la secuencia a ser amplificada. En el
sean debidamente validados. caso de las secuencias de RNA marcado, deben ser tomas
precauciones especiales ya que el RNA es mucho sensible
CAMPO DE APLICACIN a la degradacin por ribonucleasa, como tambin, a algu-
nos aditivos (anticoagulantes y conservantes) que pueden
Establecer los requisitos de preparacin de la muestra, de interferir en los ensayos.
la amplificacin de secuencias del ADN y de la deteccin
especfica del producto de la reaccin PCR. La PCR posi- PROCEDIMIENTO
bilita deteccin y amplificacin de secuencias definidas de
ADN y de RNA (despus de su transcripcin reversa en Prevencin de los contaminantes
ADN complementario cADN).
El riesgo de contaminacin requiere la existencia de reas
PRINCIPIO DEL MTODO restrictas, segn la naturaleza de los materiales y tecnolo-
ga utilizados. Los puntos a ser considerados incluyen: el
La PCR es el fundamento de un mtodo que posibilita la movimiento de personal, el flujo de trabajo, el movimiento
amplificacin especfica in vitro de segmentos de ADN o de materiales, sistemas de ventilacin y los procedimientos
RNA. Despus de la desnaturalizacin de la cadena doble de descontaminacin.
de ADN en cadenas simples de ADN, de los oligonucle-
tidos sintticos iniciadores, de polaridad opuesta, se hibri- Conviene realizar una subdivisin del sistema en reas,
dan con sus respectivas secuencias complementarias, en el como:
ADN a ser amplificado. En ese caso, la actividad de los ini- rea de preparacin primaria (local donde se manipulan
ciadores posibilita que sea completada la cadena simple del exclusivamente los materiales no contenidos en la ma-
ADN, dando lugar a secuencias cortas, bi-cuaternarias que triz, por ejemplo, los iniciadores y tampones);
rodean el fragmento del ADN a ser amplificado; sirviendo rea pre-PCR (donde son manipulados los reactivos,
as como punto de partida de la sntesis del ADN. Sealn- las muestras y los controles);
dose que tal proceso es realizado mediante la accin de un rea de amplificacin (donde el material amplificado es
ADN polimerasa termoestable. manipulado en sistema cerrado);
rea de deteccin polvos-PCR (nica rea en que los
La amplificacin del ADN ocurre en ciclos que consisten productos de la amplificacin son manipulados en sis-
en: tema abierto).
La preparacin de las muestras consiste en la extraccin La secuencia amplificada generada puede ser identificada:
o en la liberacin de la secuencia blanco a ser amplificada por su tamao, por su secuencia, por modificacin qumica
a partir del material a examinar. El mtodo utilizado para o por la combinacin de esos parmetros. La deteccin y
tal fin debe ser eficaz, tener reproductibilidad y compati- caracterizacin por medio del tamao puede ser realizada
bilidad con la realizacin de la amplificacin en las condi- por electroforesis en gel (utilizando placas de gel de aga-
ciones de reaccin seleccionadas. Puede ser utilizada una rosa, o de gel de poliacrilamida, o por electroforesis capi-
variedad de mtodos fsico qumicos para extraccin y/o de lar), o adems por cromatografa de columna (por ejemplo,
enriquecimiento. HPLC High performance liquid chromatographe)). La
deteccin y caracterizacin mediante la composicin de la
Posibles aditivos en el material en anlisis pueden interferir secuencia puede ser realizada por hibridacin especfica
en el mtodo PCR. Deben ser utilizados los procedimien- con sondas complementarias de la secuencia blanco o por
tos descritos en el tem de Control Interno, con objetivo de fragmentacin del material amplificado mediante una enzi-
verificar la ausencia de factores de inhibicin en el material ma de restriccin en los sitios especficos de la secuencia a
a ser examinado. ser amplificada. La caracterizacin por medio de la modi-
ficacin qumica puede ser realizada por incorporacin de
Cuanto a los modelos de RNA, deben ser tomas precau- un fluorforo en las secuencias marcadas y posterior exci-
ciones para que haya ausencia de actividad del tipo ribo- tacin y deteccin de la fluorescena. Pueden ser, tambin,
nucleasa. utilizadas sondas marcadas que posibilitan una deteccin
posterior radioisotpica o inmunoenzimtico.
Amplificacin
EVALUACIN E INTERPRETACIN DE LOS RESUL-
5
La amplificacin de una secuencia blanco por la tcnica TADOS
de PCR requiere, como mnimo, un par de iniciadores, los
cuatro tipos de desoxinucletidos trifosfato (dNTPs), iones El resultado de un ensayo slo es vlido si el (los) con-
de magnesio (MgCl2), y un ADN polimerasa termoestable trol(es) positivo(s) es (son), inequvocamente positivo(s) y
para sntesis del ADN. el control(es) negativo(s) es (son), inequvocamente nega-
tivo(s). Debido a la alta sensibilidad del mtodo PCR y a
La amplificacin de la secuencia blanco por PCR es con- los riesgos inherentes de contaminacin, es necesario con-
ducida bajo condiciones cclicas definidas: perfil de tempe- firmar los resultados positivos realizando el ensayo en du-
ratura para desnaturalizacin de la doble-hlice de ADN; plicado o, cuando hay posibilidad, con una nueva alcuota
anillado y extensin de los iniciadores y tiempos de incu- de la muestra. La muestra se considera positiva si al menos
bacin en temperaturas seleccionadas dentro de una banda uno de los ensayos repetidos presenta resultado positivo.
de variacin.
GARANTA DE CALIDAD
Deben ser considerados los siguientes parmetros:
el largo y la composicin base del iniciador y de la se- Validacin del sistema de ensayo de la PCR
cuencia blanco;
el tipo de ADN polimerasa, la composicin del tampn El programa de validacin debe incluir los equipos y el m-
y el volumen de reaccin usado en la amplificacin; todo PCR utilizado. Como referencias deben ser utilizadas
el tipo de termociclador usado y la tasa de conducti- las recomendaciones del ICH (The International Conference
vidad trmica entre el equipo, el tubo de reaccin y el on Harmonisation of Technical Requirements for Registra-
medio de reaccin. tion of Pharmaceuticals for Human Use: Q2B, Validacin
del Mtodo Analtico), o referencia alternativa equivalente.
La amplificacin ocurre en ciclos que consisten en:
desnaturalizacin de la secuencia blanco del cido nu- Es indispensable efectuar esa validacin mediante estn-
cleico por calentamiento de las dos hlices simples; re- dares biolgicos de referencia oficiales, adecuadamente
accin es calentada entre 92 96 C; calibrados por medio de Estndares Internacionales para
anillado especfico de los iniciadores a la secuencia las secuencias blanco utilizadas en el ensayo.
blanco que ser sintetizada, bajo condiciones adecua-
das de reaccin. La temperatura normalmente es de 55 La validacin debe incluir la determinacin del umbral de
C, dependiendo de la homologa de los iniciadores por respuesta positiva, o sea, el nmero mnimo de secuencias
la secuencia blanco a ser amplificada, de la composi- marcadas por unidad de volumen que se pueden detectar
cin de los iniciadores y de la cantidad de bases citosi- en por lo menos 95% de los ensayos. Ese valor depende de
na y guanina; varios factores inter-relacionados, como: el volumen de la
extensin de los iniciadores que estn ligados a las h- muestra sometida a la extraccin y de la eficacia del mtodo
lices simples, por medio de la accin de la ADN poli- de extraccin; de la transcripcin del RNA marcado en ADN
merasa termoestable, a una temperatura adecuada a la complementario; del procedimiento de amplificacin y del
sntesis de ADN. Normalmente a 72 C; sistema de deteccin. Para definir el lmite de deteccin del
despus del trmino del ciclo se tiene el enfriamiento a sistema utilizado, conviene considerar el umbral de respues-
4 C y conservacin. ta positiva para cada secuencia a ser amplificada y las carac-
tersticas de funcionamiento del ensayo con los respectivos 5.5.1.10.1 Recomendaciones para la validacin
lmites mximos y mnimos de la respuesta positiva. de las tcnicas de amplificacin de los cidos
nucleicos para la deteccin del RNA del virus de
Control de calidad de los reactivos
la hepatitis c (HCV) en las mezclas de plasma
Todos los reactivos cruciales usados en la metodologa
puesta en prctica deben ser objeto de control antes de su INTRODUCCIN
uso en rutina. La aceptacin/rechazo debe estar basada en
criterios de calidad predefinidos. Este captulo es suministrado a ttulo de informacin.
Los iniciadores constituyen un de los componentes esen- La mayora de las tcnicas de amplificacin de cidos nu-
ciales del mtodo PCR exigiendo as, atencin particular cleicos corresponde a ensayos analticos cuantitativos des-
cuanto a su concepcin; pureza y validacin de su uso en tinados a detectar su presencia. Hay algunos ensayos cuan-
el ensayo. Cada nuevo lote de iniciadores debe ser contro- titativos comercializados o desarrollados internamente por
lado cuanto a la especificidad; eficacia de la amplificacin los propios laboratorios. Para detectar la contaminacin de
y ausencia de impurezas inhibidoras. Los iniciadores pue- RNA del HCV en las mezclas de plasma, son adecuados los
den ser modificados (por ejemplo, por conjugacin con un ensayos cualitativos, pudiendo, inclusive, ser considerados
fluorforo, o un antgeno) para posibilitar la utilizacin de como ensayos lmite para control de impurezas. En esas re-
un mtodo especfico de deteccin de la secuencia blanco comendaciones estn descritos los mtodos de validacin
a ser amplificada; desde que aquellas modificaciones no de las tcnicas de amplificacin de los cidos nucleicos
inhiban la precisin y la eficacia de la amplificacin de la aplicables apenas a los ensayos cualitativos destinados a
secuencia blanco. detectar el RNA del VHC en las mezclas de plasma. Por
consiguiente, los dos parmetros de validacin considera-
5
Controles del ensayo dos los ms importantes son la especificidad y el lmite de
deteccin. La robustez es, tambin, evaluada. Sin embargo,
Controles externos ese documento puede, tambin, ser utilizado como base de
validacin general de las tcnicas de amplificacin.
Para detectar eventuales contaminaciones y asegurar la
sensibilidad adecuada, conviene incluir en todos los ensa- En ese documento est definida la tcnica analtica como el
yos de PCR los siguientes controles externos: conjunto de operaciones realizadas despus de extraccin
un control positivo con un nmero definido de copias del cido nucleico, seguido de deteccin de los productos
de la secuencia blanco, siendo ese nmero determi- amplificados. Sealndose que en casos de uso de conjun-
nado, especficamente, para cada sistema de ensayo y tos comerciales, como parte del procedimiento analtico
expresado como un mltiplo del umbral de respuesta completo, las consideraciones de validacin documentadas
positiva del sistema en cuestin; ya realizadas por el fabricante pueden sustituir la valida-
un control negativo constituido por una muestra de ma- cin por el operador. No obstante, el desempeo del con-
triz que demostr estar exenta de secuencias blanco. junto comercializado con respecto al uso al cual se destina
tiene que ser demostrado por el usuario (ej: lmite de detec-
Control interno cin, robustez y contaminacin cruzada).
El producto amplificado debe ser identificado, inequvoca- Por ejemplo, en un laboratorio se testean tres series de
mente, por el uso de mtodos como: amplificacin con ini- diluiciones con ocho replicaciones para cada diluicin en
ciadores entrelazados, anlisis de enzimas de restriccin, das diferentes; cuatro series de diluicin con seis replica-
secuenciamiento, o hibridacin con sonda especfica. ciones para cada diluicin en das diferentes, o seis series
de diluiciones con cuatro replicaciones para cada diluicin
Para validacin de la especificidad de la tcnica analtica, en das diferentes.
es conveniente probar, como mnimo, 100 mezclas de plas-
ma negativo para el RNA del HCV, y que todos los resulta- Para que el nmero de diluiciones utilizadas se manten-
dos obtenidos sean negativos. La Organizacin Mundial de ga igual, es indispensable efectuar un ensayo preliminar
Salud (OMS) dispone de muestras apropiadas de plasmas (como, por ejemplo, diluiciones logartmicas en la muestra
no reactivos. de la mezcla de plasma para obtener un valor preliminar
del umbral de respuesta positiva, o sea, la mayor diluicin
La capacidad de la tcnica en la deteccin de todos los ge- en que ocurre una seal positiva).
notipos del HCV depender de la eleccin de los iniciado-
res, de las sondas y de los parmetros operacionales. Es La distribucin de las diluiciones puede entonces ser rea-
conveniente que esa capacidad sea demostrada por medio lizada con base en ese valor preliminar precalculado (uti-
del uso de una coleccin de preparaciones de referencia lizando, por ejemplo, un factor de diluicin de 0,5 log),
caracterizadas. o inferior a una mezcla de plasma negativo como matriz
de diluicin. El tenor en RNA del HCV que puede ser de-
Tiene sido sugerido que el estndar de distribucin de los tectado es de 95% en los ensayos y puede ser calculado
genotipos del HCV en Brasil es semejante al encontrado en utilizando un mtodo estadstico apropiado.
muchos pases europeos, con la prevalencia de los tipos 1 y
3. Se observa un comportamiento epidemiolgico tpico de Esos resultados, tambin, sirven para demostrar la varia-
5
una propagacin exponencial en los ltimos aos, proba- cin interna del ensayo y la variacin en los varios das del
blemente como consecuencia de transfusiones sanguneas. mtodo analtico.
En ese contexto, los genotipos 1 y 3 deben ser detectados
en niveles apropiados. ROBUSTEZ
5
ferencia utilizadas; Bromato de hexadimetrina 50 mg
frmulas detalladas del clculo de los resultados, inclu- Azida Sdica 0,100 g
yendo a evaluacin estadstica.
Disolver los reactivos en agua, ajustar el pH para 8,0 con
El uso de un control apropiado (por ejemplo, una diluicin cido clorhdrico 2 M y completar a 1000 ml con agua.
apropiada del virus de la hepatitis C, estndar biolgico de
referencia; o de plasma al cual fue adicionada una muestra Tampn B
del HCV calibrada por comparacin con el Estndar Inter-
nacional del HCV 96/790 de la OMS) puede ser considera- Trometamina 6,055 g
do un medio estable satisfactorio de control del sistema y Cloruro de sodio 8,77 g
de asegurar y mantener la viabilidad de la tcnica en cada
utilizacin. Disolver los reactivos en agua, ajustar el pH para 8,0 con
cido clorhdrico 2 M y completar a 1000 ml con agua.
Calificacin tcnica. Para cada elemento crtico del equi-
po utilizado es criada una instalacin apropiada y un pro- PREPARACIN DEL SUSTRATO DE
grama de calificacin operacional. Despus de cualquier PRECALICRENA.
modificacin de un equipo crtico (por ejemplo, los ter-
mocicladores) es indispensable reconfirmar la aceptabili- La sangre o el plasma usado en la preparacin de la pre-
dad de la tcnica procediendo en paralelo el examen de calicrena debe ser recolectado y manipulado apenas en
ocho muestras de una mezcla de plasma al cual se adicion materiales de plstico o de vidrio siliconado para evitar la
una concentracin tripla de RNA del HCV de aquella que activacin de la precalicrena resultante de la coagulacin.
corresponde al umbral de respuesta positiva previamente Mezclar 9 volmenes de sangre humana con 1 volumen de
determinada; todos los resultados obtenidos son positivos. solucin anticoagulante (ACD, CPD o una solucin de ci-
trato de sodio a 38 g/L) adicionada de 1 mg por mililitro de
Calificacin de los operadores. Es desarrollado un progra- bromato de hexadimetrina. Centrifugar a 3600 g durante 5
ma apropiado de calificacin para el conjunto de opera- minutos. Separar el plasma y centrifugar a 6000 g durante
dores involucrados en el ensayo. Para ese efecto, es con- 20 minutos para separar las plaquetas. Separar el plasma
veniente que cada operador examine por lo menos ocho pobre en plaquetas y proceder a la dilisis contra 10 vol-
muestras de una mezcla de plasma a la cual fue adicionada menes de Tampn A durante 20 horas. Despus de la dili-
una concentracin triple de RNA del HCV que correspon- sis, depositar el plasma en una columna de cromatografa
de al umbral de respuesta positiva, previamente, determi- conteniendo dos veces su volumen de agarosa-DEAE para
nada. Ese ensayo (ocho muestras) es repetido dos veces en cromatografa de cambio inico previamente equilibrada
das diferentes en un total de veinticuatro anlisis realiza- con Tampn A. Proceder a elucin con Tampn A (dbito
dos en tres das diferentes. Todos los resultados obtenidos de 20 ml/cm2/hora). Recolectar el eluato por fracciones
son positivos. y registrar la absorbancia en 280 nm (5.2.14). Reunir las
fracciones que contienen el primer pico de protenas para
obtener un volumen de cerca de, 1,2 veces el del plasma
pobre en plaquetas.
Para verificar que el sustrato no presenta calicrena acti- la Unidad Internacional con el Estndar Internacional es
va, mezclar 1 volumen con 20 volmenes de solucin de indicada por la Organizacin Mundial de Salud.
sustrato cromognico que ser utilizado en la dosificacin,
previamente calentado a 37 C, y mantener la mezcla a 37 PROCEDIMIENTO
C durante 2 minutos. El sustrato es apropiado si la absor-
bancia no aumenta ms de 0,001 por minuto. Aadir a la Para la muestra y para el estndar preparar con tampn de
solucin de sustrato 7 g por litro de cloruro de sodio y fil- tris-EDTA ASB de pH 8,4 conteniendo 15 UI de heparina
trar por membrana (0,45 m). Congelar el filtrado despus por mililitro, dos series independientes de tres o cuatro di-
de partirlo en alcuotas y conservar a -25 C; se puede, luiciones comprendidas entre 1/75 y 1/200 a partir de 1 UI/
tambin, liofilizar el filtrado antes de la conservacin. Rea- ml. Calentar a 37 C durante 1 a 2 minutos 200 L de cada
lizar las operaciones comprendidas entre la cromatografa diluicin. Aadir a cada diluicin 200 L de una solucin
y la congelacin de las alcuotas en el mismo da. de trombina bovina conteniendo 2 UI/ml en tampn de tris-
EDTA ASB de pH 8,4. Mezclar y mantener a 37 C duran-
TITULACIN te, exactamente, 1 minuto. Aadir 500 L de un sustrato
cromognico apropiado (por ejemplo, D-fenilalanil-L- pi-
De preferencia, la titulacin es realizada en un analizador pecolil-L-arginina-4-nitroanilida; disolver ese sustrato en
enzimtico automtico, a 37 C. Ajustar los volmenes, la agua para obtener una solucin conteniendo 4 mmol/L y
concentracin de los sustratos y los tiempos de incubacin diluir con tampn de tris-EDTA ASB de pH 8,4 sin alb-
para que la velocidad de la reaccin sea lineal por lo menos mina hasta una concentracin apropiada para el ensayo de
hasta 35 UI por mililitro. Si necesario, se puede diluir los titulacin). Determinar, inmediatamente, la absorbancia en
estndares, las muestras y el sustrato de precalicrena con 405 nm (5.2.14) por lo menos por 30 segundos. Calcular
Tampn B. la variacin de la absorbancia (AA/min). Se puede utilizar
igualmente una titulacin de punto final parando la reac-
5
Incubar los estndares o las muestras diluidas con el sus- cin con cido actico y determinando la absorbancia en
trato de precalicrena durante 10 minutos; el volumen del 405 nm. La variacin de la absorbancia (AA/min) es in-
estndar o de la muestra antes de la diluicin no excede versamente proporcional a la actividad de la antitrombina
1/10 del volumen total de la mezcla a ser incubada para III humana. Verificar la validez del ensayo y calcular la
evitar errores resultantes de las diferencias de fuerza inica actividad de la muestra por los procedimientos estadsticos
o de pH. Incubar la mezcla o una parte de la mezcla con aplicables a los ensayos biolgicos (8).
un volumen igual o superior de una solucin de un sustrato
cromognico sinttico, reconocidamente especfico, para 5.5.1.13 DETERMINACIN DE LA
la calicrena (por ejemplo, acetato de N-benzolo-L-pro- ACTIVIDAD ANTICOMPLEMENTARIA
lil- L-fenilalanil- L-arginina 4-nitroanilida o diclorhidrato DE LA INMUNOGLOBULINA
de D-propil- L-fenilalanil- L-arginina 4-nitroanilida ) y
disuelto en Tampn B. Registrar la variacin de la absor- La determinacin de la actividad anticomplementaria
bancia por minuto (AA/min) durante 2 a 10 minutos en (AAC) de la inmunoglobulina es realizada por incubacin
el largo de onda apropiado para el sustrato utilizado. Para de una muestra de inmunoglobulina (10 mg) con una de-
cada mezcla del estndar o de la muestra, preparar un blan- terminada cantidad de complemento de cobaya (20 CH50).
co sustituyendo el sustrato de precalicrena por Tampn Sigue la titulacin del complemento restante: la actividad
B. Corregir la variacin de la absorbancia por minuto sus- anticomplementaria est expresada por la proporcin del
trayendo el valor obtenido con el blanco correspondiente. complemento consumido, tomando el complemento estn-
Trazar una curva de calibracin a partir de los valores de dar como 100%.
la variacin de la absorbancia por minuto, obtenidos con el
estndar y las respectivas concentraciones y determinar el La unidad hemoltica de actividad complementaria (CH50)
tenor en APC de la muestra. es la cantidad de complemento que, en las estipuladas con-
diciones de reaccin, provoca la lisis de 2,5 x 108 de un
5.5.1.12 DETERMINACIN DE LA nmero total de 5 x 108 eritrocitos debidamente sensibi-
ANTITROMBINA III HUMANA lizados
5
dores. Vi = volumen inicial,
A = absorbancia determinada en 541 nm para la suspensin
Hemolisina. Suero anti-hemates de carnero, preparado en original.
conejo. Tales sueros pueden ser obtenidos, comercialmen-
te, en diversos proveedores. Una vez ajustada la concentracin celular, la suspensin
contiene cerca de 1 x 109 clulas por mililitro.
Complemento de cobaya. Mezclar los sueros obtenidos a
partir de, por lo menos, 10 cobayas. Separar el suero de Titulacin de hemolisina
la sangre coagulado por centrifugacin a una temperatura
cerca de 4 C. Conservar el suero, en pequeas porciones, Preparar las diluiciones de hemolisina de acuerdo con la
a una temperatura inferior a -70 C. Tabla 1.
Juntar 1 ml de la suspensin a 5% de eritrocitos de carnero mezcla incubada de diluicin de hemolisina para nuevos
en cada uno de los tubos de la serie de diluiciones de hemo- tubos y aadir 1,1 ml de Tampn de gelatina-barbital y 0,2
lisina a partir de la diluicin a 1/75 y mezclar. Incubar los ml de una diluicin de complemento de cobaya (por ejem-
tubos a 37 C durante 30 minutos. Transferir 0,2 ml de cada plo, 1/150). Realizar esas manipulaciones en duplicado.
Preparar tres tubos control de clulas no hemolizadas En el caso que el porcentaje de hemlisis total no pueda
transfiriendo para cada uno de ellos 1,4 ml de Tampn ge- ser determinado a partir de la diluicin utilizada, repetir la
latina-barbital y 0,1 ml de la suspensin de eritrocitos de titulacin utilizando una solucin de complemento ms o
carnero a 5%. menos diluida.
Preparar tres tubos control de clulas totalmente hemoli- Preparacin ptima de eritrocitos de carnero
zadas transfiriendo para cada uno de ellos 1,4 ml de agua sensibilizada (sistema hemoltico).
y 0,1 ml de la suspensin de eritrocitos de carnero a 5%.
Preparar una cantidad apropiada de hemolisina diluida
Incubar todos los tubos a 37 C durante 60 minutos y cen- conteniendo 2 UHM por mililitro y un volumen igual de
trifugar a 1000 g durante 5 minutos. Determinar la absor- suspensin estandarizada de eritrocitos de carnero a 5%.
bancia (5.2.14) de los sobrenadantes en 541 nm y calcular Aadir la diluicin de hemolisina a la suspensin estan-
el porcentaje de hemlisis ocurrido en cada tubo, usando darizada de clulas y mezclar. Incubar a 37 C durante 15
la frmula: minutos, conservar la temperatura de 2 a 8 C y utilizar
dentro del perodo de 6 horas.
Ac A1
x 100
Ab A1 Titulacin del complemento
5
hemlisis. A cada tubo, aadir 0,2 ml de eritrocitos de carnero sensi-
bilizados, mezclar bien e incubar todos los tubos a 37 C
Construir un grfico conteniendo los porcentuales de he- durante 60 minutos. Enfriar los tubos en agua con hielo
mlisis en el eje de las ordenadas y los inversos de las di- y centrifugar a 1000 g durante 5 minutos. Determinar la
luiciones de hemolisina en el eje de las abscisas. Determi- absorbancia de los sobrenadantes en 541 nm y calcular el
nar la diluicin ptima de hemolisina a partir del grfico, grado de hemlisis (Y), usando la frmula:
eligiendo una diluicin tal que un aumento de la cantidad
de hemolisina no produzca una variacin apreciable en el Ac A1
x 100
grado de hemlisis. Esa diluicin se considera como con- Ab A1
teniendo 1 unidad de hemlisis mnima (1 UHM) en 1,0
ml. Para la preparacin de los eritrocitos de carnero sensi- en que
bilizados, la diluicin de hemolisina correspondiente a la Ac = absorbancia de los tubos 1 a 12,
hemlisis ptima contiene 2 UHM por mililitro. Ab = absorbancia promedio de los tubos con 100% de he-
mlisis,
La titulacin de hemolisina slo es vlida si el porcentaje
de hemlisis total est comprendido entre 50 y 70%. Construir un grfico inscribiendo los valores en abscisas, y
el correspondiente volumen en mililitros de complemento
diluido en ordenadas.
Construir un grfico inscribiendo los valores en abscisas, y Ca = volumen en mililitros de complemento diluido que
el correspondiente volumen en mililitros de complemento produce 50% de hemlisis, 5 = Factor de escala para tener
diluido en ordenadas. en cuenta el nmero de eritrocitos.
A partir de los puntos, trazar la recta ideal y determinar la El ensayo slo es vlido si, entre 15 y 85% de hemlisis, la
ordenada de la dosis hemoltica a 50% del complemento en curva obtenida es una recta cuya inclinacin se sita entre
el punto donde Y/(1-Y) = 1,0. Calcular la actividad en tr- 0,15 y 0,40, de preferencia, entre 0,18 y 0,30.
minos de unidades hemolticas (CH50/ml) de acuerdo con
la frmula: Determinacin de actividad anticomplementaria
Cd Diluir el complemento de cobaya titulado con el Tampn
x5
Ca de gelatina-barbital para obtener 100 CH50/ml. si necesa-
rio, ajustar la muestra para pH 7,0. Para una inmunoglobu-
en que lina conteniendo 50 mg/ml, preparar las mezclas de incu-
Cd = valor inverso de la diluicin de complemento, bacin (Tabla 3)
5
Realizar la determinacin en la muestra y preparar el con- 5.5.1.14 DOSIFICACIN DE PROTENAS
trol de la AAC negativo y positivo a partir de un estndar TOTALES
internacional de inmunoglobulina humana, de acuerdo con
las instrucciones suministradas en el rtulo que acompaa la MTODO 1
preparacin estndar. Si la muestra no contiene 50 mg/ml de
inmunoglobulina, ajustar los volmenes de la preparacin y Las protenas en solucin absorben la luz ultravioleta en
del Tampn de gelatina- barbital; por ejemplo, pipetear 0,33 el largo de onda de 280 nm, debido a la presencia en su
ml de una preparacin que contienen 30 mg/ml de inmuno- estructura de aminocidos aromticos (especialmente tiro-
globulina y aadir 0,47 ml de Tampn de gelatina-barbital sina y triptfano), propiedad que puede ser utilizada para
para obtener el mismo volumen total de 0,8 ml. Cerrar los la dosificacin de protenas. El uso de un tampn como
tubos e incubarlos a 37 C durante 60 minutos. Aadir 0,2 lquido de compensacin puede remediar la interferencia
ml de cada mezcla de incubacin a 9,8 ml de Tampn de producida en el caso de que el tampn utilizado para di-
gelatina- barbital para diluir el complemento. En cada tubo, solucin de la protena posea absorbancia elevada, lo que
realizar las titulaciones del complemento tal como descrito podra comprometer los resultados. En bajas concentracio-
arriba para determinar a actividad anticomplementaria resi- nes, la protena adsorbida sobre la curva puede provocar
dual (Tabla 2). Calcular la actividad anticomplementaria de una disminucin significativa del tenor proteico de la solu-
la muestra, por referencia al control del complemento consi- cin. Es posible prevenir ese fenmeno preparando mues-
derado como 100%, de acuerdo con la frmula: tras de tenor elevado o utilizando un detergente no inico
durante la preparacin.
ab
x 100
a Solucin muestra. Disolver una cantidad apropiada de la
muestra en el tampn escogido para obtener una solucin
en que cuya concentracin proteica se site entre 0,2 mg/ml y 2
a = actividad complementaria promedio (CH50/ml) de los mg/ml.
controles,
b = actividad complementaria (CH50/ml) de la muestra. Solucin estndar. Preparar una solucin de la sustancia de
referencia apropiada correspondiente a la protena a dosi-
El ensayo slo es vlido si: ficar, en el mismo tampn que se usa para la solucin de la
muestra y para obtener la misma concentracin.
las actividades anticomplementares encontradas para el
control AAC negativo y control AAC positivo se sitan Procedimiento. Mantener la solucin de la muestra, la so-
dentro de los lmites indicados en el rtulo que acom- lucin estndar y el lquido de compensacin a la misma
paa la preparacin estndar; temperatura durante todo el ensayo. Determinar la absor-
la actividad complementaria del control del comple- bancia (5.2.14) de la solucin muestra y de la solucin
mento (a) es de 80 a 120 CH50/ml. estndar en 280 nm en cubetas de cuarzo, utilizando el
tampn especfico como lquido de compensacin. Para
exactitud de los resultados, la respuesta es lineal en el in-
tervalo de las concentraciones proteicas a dosificar.
Difusin de la luz. La difusin de la luz por la muestra pue- protena a dosificar y la protena estndar son las mismas.
de afectar la exactitud de la dosificacin de las protenas. Si Si es necesario, separar las sustancias interferentes de la
las protenas en solucin forman partculas cuyo tamao es protena de la muestra, proceder como es indicado a con-
de la misma grandeza del largo de onda del haz de medida tinuacin en sustancias interferentes antes de preparar la
(250 300 nm), la difusin del haz luminoso se traduce solucin de la muestra. Es posible minimizar el efecto de
por un aumento de la absorbancia aparente de la muestra. las sustancias interferentes por diluicin, siempre que el
Para calcular la contribucin de ese efecto de difusin en tenor en protena a dosificar se mantenga suficientemente
la absorbancia lida en 280 nm, determinar la absorbancia elevado para posibilitar una determinacin exacta.
de la solucin de la muestra en varios largos de onda (320
nm, 325 nm, 330 nm, 335 nm, 340 nm, 345 nm y 350 nm). Utilizar el agua destilada para la preparacin de todos los
Construir un grfico del logaritmo de la absorbancia le- tampones y reactivos utilizados en ese mtodo.
da en funcin del logaritmo del respectivo largo de onda
y determinar, por anlisis de regresin lineal, la curva de Solucin muestra. Disolver una cantidad apropiada de la
calibracin que mejor se ajuste a los diferentes puntos ins- muestra en el tampn especificado para obtener una con-
critos en el grfico. centracin comprendida en el intervalo alcanzado por la
curva de calibracin. El pH de una solucin preparada con
Determinar por extrapolacin el logaritmo de la absorban- un tampn apropiado est comprendido entre 10,0 y 10,5.
cia en 280 nm. La absorbancia debido al efecto de difusin
es el antilogaritmo de ese valor. Corregir los valores ob- Soluciones estndar. Disolver la sustancia de referencia
servados sustrayndose la absorbancia total en 280 nm de correspondiente a la protena a dosificar en el tampn es-
la absorbancia debido al efecto de difusin para obtener el pecificado. Tomar muestras de esa solucin y completarlas
valor de la absorbancia debido a la protena en solucin. Es con el mismo tampn para obtener, por lo menos, cinco
posible realizar una filtracin usando un filtro de 0,2 que soluciones estndar de diferentes concentraciones com-
5
no absorba las protenas, o una clarificacin por centrifuga- prendidas entre 5 g/ ml y 100 g/ml y uniformemente
cin, a fin de que sean reducidos los efectos de la difusin repartidas en el intervalo escogido.
de la luz en caso de solucin.
Solucin en blanco. Utilizar el mismo tampn que fue uti-
Clculos. Utilizar los valores corregidos para los clculos. lizado para preparar la Solucin muestra y las Soluciones
Calcular el tenor en protena de la solucin de la muestra estndar.
(Cu), usando la expresin:
Au Reactivo de sulfato de cobre. Disolver 100 mg de sulfato
Cu = Cs de cobre y 0,2 g de tartarato de sodio en agua destilada y
As completar 50 ml con el mismo diluyente. Disolver 10 g de
carbonato de sodio anhidro en agua destilada y completar
en que 50 ml con el mismo diluyente. Verter, lentamente, la so-
CS = tenor en protena de la solucin estndar; lucin de carbonato de sodio en la solucin de sulfato de
Au = valor de la absorbancia corregida de la solucin de la cobre, mezclando siempre. Esa solucin es utilizada en las
muestra; 24 horas siguientes a su preparacin.
AS = valor de la absorbancia corregida de la solucin es-
tndar. Reactivo alcalino de cobre. Preparar una mezcla de 1 volu-
men de Reactivo de sulfato de cobre, 2 volmenes de lau-
MTODO 2 rilsulfato de sodio a 5% (p/v) con 1 volumen de hidrxido
de sodio a 3,2% (p/v). Conservar esa mezcla a temperatura
Ese mtodo fue concebido con base en la propiedad que las ambiente. La mezcla es utilizada en las 2 semanas que si-
protenas poseen de reducir cidos fosfomolibdenotungst- guen a su preparacin.
nico contenidos en el reactivo fosfomolibdeno y tungsteno;
esa reaccin es cromognica y se traduce por la existencia Reactivo fosfomolibdeno y tungsteno diluido. Mezclar 5 ml
de un pico de absorcin en 750 nm. de reactivo fosfomolibdeno y tungsteno con 55 ml de agua
destilada. Conservar el reactivo a temperatura ambiente en
El reactivo fosfomolibdeno y tungsteno reaccionan prime- frasco de vidrio mbar.
ramente con los residuos de la tirosina de la protena. El
desarrollo de la coloracin alcanza un mximo al final de Procedimiento. A 1 ml de cada Solucin estndar, de la
20 30 minutos de incubacin a temperatura ambiente; se Solucin muestra y de la Solucin en blanco aadir 1 ml
produce enseguida una descoloracin progresiva. Siendo el del Reactivo alcalino de cobre y mezclar. Dejar en reposo
mtodo sensible a sustancias interferentes, puede utilizarse durante 10 minutos. Aadir 0,5 ml del Reactivo fosfomo-
un tratamiento que produzca la precipitacin de las prote- libdeno y tungsteno diluido, mezclar y dejar en reposo a
nas de la muestra. La mayor parte de las sustancias interfe- temperatura ambiente durante 30 minutos.
rentes reduce la intensidad de la coloracin obtenida, pero
algunos detergentes la aumentan, ligeramente. Una fuerte Determinar la absorbancia (5.2.14) de las soluciones en
concentracin salina puede provocar la formacin de un 750 nm, utilizando la solucin en blanco para ajuste del
precipitado. Dado que la intensidad de la coloracin obte- cero.
nida puede variar segn la especie proteica considerada, la
Clculos. La relacin entre la absorbancia y el tenor en Reactivo azul cido 90. Disolver 0,10 g de azul cido 90
protena no es lineal; no obstante, si el intervalo de con- en 50 ml de etanol. Aadir 100 ml de cido fosfrico, com-
centracin alcanzado por la curva de calibracin es sufi- pletar 1000 ml con agua destilada y mezclar. Filtrar la so-
cientemente estrecho, la curva obtenida ser sensiblemente lucin y conservarla a temperatura ambiente en frasco de
lineal. Construir un grfico de la absorbancia de las solu- vidrio mbar. Se produce una lenta precipitacin del colo-
ciones estndar en funcin del tenor en protena de esas rante durante el almacenamiento. El precipitado es elimi-
soluciones y determinar la curva de calibracin por anlisis nado por filtracin antes de utilizar el reactivo.
de regresin lineal. A partir de la curva de calibracin y de
la absorbancia de la solucin de la muestra, determinar el Procedimiento. A 0,100 ml de cada Solucin estndar, de
tenor en protena de la solucin muestra. la Solucin muestra y de la Solucin en blanco aadir 5 ml
del Reactivo azul cido 90. Homogeneizar la mezcla por
Sustancias interferentes. En ese mtodo se aade desoxi- rotacin, evitando la formacin de espuma que puede crear
colato de sodio y cido tricloroactico a la muestra para problemas de reproductibilidad. Determinar la absorbancia
precipitar las protenas y separarlas de las sustancias inter- (5.2.14) de las Soluciones estndar y de la Solucin mues-
ferentes, antes de dosificar. Esa tcnica puede igualmente tra en 595 nm, utilizando la Solucin en blanco para ajuste
ser utilizada para concentrar las protenas contenidas en del cero. Se evita el uso de cubetas de cuarzo (slice) ya que
una solucin muy diluida. A 1 ml de una solucin de la el colorante se liga a ese material.
muestra adicione 0,1 ml de desoxicolato de sodio a 0,15%
(p/v). Agitar con un agitador tipo vortex y dejar en reposo Clculos. La relacin entre la absorbancia y el tenor en
a temperatura ambiente durante 10 minutos. Aadir 0,1 ml protena no es lineal. No obstante, si el intervalo de con-
de cido tricloroactico a 72% (p/v). Agitar con un agita- centracin cubierto por la curva de calibracin fuese sufi-
dor tipo vortex y centrifugar a 3000 g durante 30 minu- cientemente estrecho, la curva obtenida ser sensiblemente
tos. Rechazar el sobrenadante lquido y eliminar el lquido lineal. Construir un grfico de la absorbancia de las Solu-
5
residual con una pipeta. Disolver el cogulo en 1 ml del ciones estndar en funcin del tenor en protena de esas
Reactivo alcalino de cobre. soluciones y determinar la curva de calibracin por anlisis
de regresin lineal. A partir de la curva de calibracin y de
MTODO 3 la absorbancia de la Solucin muestra determinar el tenor
en protena de la Solucin muestra.
Este mtodo fue basado en la propiedad que las protenas
poseen de desplazar de 470 nm para 595 nm el mximo de MTODO 4
absorcin del azul cido 90 cuando se ligan al colorante.
El colorante azul cido 90 presenta una afinidad marcada Ese mtodo, tambin, conocido como mtodo del cido bi-
para los residuos de arginina y de lisina en la protena lo cinconnico (BCA), fue elaborado con base en la propiedad
que puede provocar variaciones de la respuesta a la dosifi- que las protenas poseen de reducir el ion cprico (Cu2+) a
cacin de diferentes protenas. La protena utilizada como ion cuproso (Cu+). El reactivo de cido bicinconnico sirve
sustancia de referencia debe, por tanto, ser la misma que para detectar los iones cuprosos. Existen pocas sustancias
la protena a ser dosificada. Existen, relativamente, pocas interferentes. Se existiesen sustancias interferentes, es po-
sustancias interferentes, pero es preferible evitar los deter- sible minimizar sus efectos por diluicin, siempre que el
gentes y los analitos en la muestra a ser dosificada. Mues- tenor en protenas a ser dosificadas se mantenga suficien-
tras muy alcalinas pueden provocar interferencias con el temente elevado para posibilitar una determinacin exacta.
reactivo cido. La tcnica de precipitacin de las protenas descrita en el
Mtodo 2 puede ser utilizada para eliminar las sustancias
Utilizar el agua destilada para la preparacin de todos los interferentes. La intensidad de la coloracin obtenida por
tampones y reactivos a ser usados en ese mtodo. la reaccin con el reactivo puede variar de un tipo de pro-
tena para otro y, por eso, a protena a ser dosificada y la
Solucin muestra. Disolver una cantidad apropiada de la protena de referencia son las mismas.
muestra en el tampn indicado para obtener una concen-
tracin comprendida en el intervalo cubierto por la curva Utilizar el agua destilada para la preparacin de todos los
de calibracin. tampones y reactivos a ser usados en ese mtodo.
Soluciones estndar. Disolver la sustancia de referencia Solucin muestra. Disolver una cantidad apropiada de la
correspondiente a la protena a dosificar en el tampn indi- muestra en el tampn indicado para obtener una concentra-
cado. Tomar muestras de esa solucin y completar con el cin comprendida en el intervalo de la concentracin de las
mismo tampn para obtener por lo menos cinco soluciones Soluciones estndar.
estndar de concentraciones proteicas comprendidas entre
0,1 mg/ ml y 1 mg/ml y uniformemente repartidas en el Soluciones estndar. Disolver la sustancia de referencia
intervalo escogido. correspondiente a la protena a ser dosificada en el tam-
pn indicado. Tomar muestras de esa solucin y completar
Solucin en blanco. Utilizar el mismo tampn que fue uti- con el mismo tampn para obtener por lo menos cinco so-
lizado para preparar la solucin de la muestra y las solu- luciones estndar de concentraciones comprendidas entre
ciones estndar. 10 g/ml y 1200 g/ml y uniformemente repartidas en el
intervalo escogido.
Solucin en blanco. Utilizar el mismo tampn que fue uti- Solucin muestra. Disolver una cantidad apropiada de la
lizado para preparar la Solucin de la muestra y las Solu- muestra en solucin de cloruro de sodio a 0,9% (p/v) para
ciones estndar. obtener una concentracin comprendida en el intervalo de
la concentracin de las soluciones estndar.
Reactivo BCA. Disolver 10 g de bicinconinato disdico, 20
g de carbonato de sodio monohidratado, 1,6 g de tartarato Soluciones estndar. Disolver la sustancia de referencia co-
de sodio, 4 g de hidrxido de sodio y 9,5 g de bicarbonato rrespondiente a la protena a ser dosificada en solucin de
de sodio en agua destilada. Si necesario, ajustar el pH para cloruro de sodio a 0,9% (p/v). Tomar muestras de esa solu-
11,25 con solucin de hidrxido de sodio o bicarbonato de cin y completar con solucin de cloruro de sodio a 0,9%
sodio. Completar para 1000 ml con agua destilada y mez- (p/v) para obtener por lo menos tres soluciones estndar de
clar. concentraciones comprendidas entre 0,5 mg/ml y 10 mg/ ml
y, uniformemente, repartidas en el intervalo escogido.
Reactivo de cobre-BCA. Mezclar 1 ml de sulfato de cobre
a 4% (p/v) con 50 ml de Reactivo BCA. Solucin en blanco. Utilizar solucin de cloruro de sodio
a 0,9% (p/v).
Procedimiento. Mezclar 0,1 ml de cada Solucin estndar,
de la Solucin muestra y de la Solucin en blanco con 2 ml Reactivo de biuret. Disolver 3,46 g de sulfato de cobre en
de Reactivo de cobre-BCA. Incubar las soluciones a 37 C 10 ml de agua destilada caliente y deje enfriar (solucin A).
durante 30 minutos, tomar nota de la hora y dejar enfriar Disolver 34,6 g de citrato de sodio y 20 g de carbonato de
hasta la temperatura ambiente. En los 60 minutos a conti- sodio anhidro en 80 ml de agua destilada caliente y dejar
nuacin al perodo de incubacin, determinar la absorban- enfriar (solucin B). Mezclar las soluciones A y B y com-
cia (5.2.14) en 562 nm de las Soluciones estndar y de la pletar 200 ml con agua destilada. Ese reactivo es utilizado
Solucin muestra en cubetas de cuarzo, utilizando la Solu- dentro de los 6 meses que siguen a su preparacin; no es
5
cin en blanco para ajuste del cero. Cuando la temperatura utilizado si desarrolla turbacin o precipitado.
de las soluciones retorne para la temperatura ambiente, la
intensidad de la coloracin contina aumentando, progre- Procedimiento. A un volumen de la Solucin muestra aa-
sivamente. dir un volumen igual de solucin de hidrxido de sodio
a 6% (p/v) y mezclar. Aadir, inmediatamente, 0,4 volu-
Clculos. La relacin entre la absorbancia y el tenor en men (calculado con relacin a la solucin de la muestra)
protena no es lineal. No obstante, si el intervalo de con- de Reactivo de biuret y mezclar rpidamente. Mantener las
centracin cubierto por la curva de calibracin es suficien- muestras durante, por lo menos, 15 minutos a una tempe-
temente estrecho, la curva obtenida ser sensiblemente ratura comprendida entre 15 C y 25 C. En los 90 mi-
lineal. Registrar en un grfico la absorbancia de las solu- nutos que siguen a la adicin del reactivo, determinar la
ciones estndar en funcin del tenor en protena de esas absorbancia (5.2.14), como mximo en 545 nm, de las So-
soluciones y determinar la curva de calibracin por anlisis luciones estndar y de la Solucin de la muestra, usando la
de regresin lineal. A partir de la curva de calibracin y de Solucin en blanco como lquido de compensacin. Si en
la absorbancia de la solucin de la muestra determine el las soluciones surge turbacin o precipitado, no son usadas
tenor en protena de la solucin de la muestra. para el clculo del tenor en protena.
Ese mtodo fluorimtrico fue elaborado con base en una de- Ftalaldehido y dejar en reposo a temperatura ambiente du-
rivacin de la protena por el o-ftalaldehido que reacciona rante 15 minutos. Aadir 3 ml de hidrxido de sodio 0,5
con las aminas primarias de la protena, eso es, el aminoci- M y mezclar. Determinar la intensidad de la fluorescencia
do N-terminal y la funcin -amina de los residuos de lisina. (5.2.15) de las muestras de la Solucin estndar y de la
La sensibilidad de la dosificacin puede ser mejorada por Solucin muestra en el largo de onda de excitacin de 340
una hidrlisis previa de la protena, antes de la adicin del nm y en el largo de onda de emisin de 440 nm a 455 nm.
o-ftalaldehido. La hidrlisis liberta la funcin -amina de los Determinar la intensidad de la fluorescencia de una mues-
aminocidos constituyentes de la protena y que le posibilita tra una sola vez porque la irradiacin provoca una disminu-
reaccionar con el reactivo de ftalaldehido. Ese mtodo es cin de la intensidad de la fluorescencia.
aplicable a diminutas cantidades de protena.
Clculos. La relacin entre la intensidad de fluorescencia
Las aminas primarias contenidas, por ejemplo, en los tam- y el tenor en protena es lineal. Registrar en un grfico las
pones de trometamina y en los tampones de aminocidos intensidades de fluorescencia obtenidas con las Soluciones
reaccionan con el ftalaldehido y son, por tanto, de evitar o estndar en funcin del tenor en protena de esas solucio-
eliminar. El amonaco en elevada concentracin reacciona nes y determine la curva de calibracin por anlisis de re-
igualmente con el ftalaldehido. La fluorescencia resultante gresin lineal. A partir de la curva de calibracin y de la
de la reaccin amina ftalaldehido puede ser inestable. El intensidad de fluorescencia de la Solucin muestra, deter-
empleo de procesos automatizados para estandarizar el m- mine el tenor en protena de la Solucin muestra.
todo puede posibilitar mejorarle la exactitud y la viabilidad.
MTODO 7
Utilice el agua destilada para la preparacin de todos los
tampones y reactivos a ser usados en ese mtodo. Ese mtodo fue elaborado con base en la cuantificacin de
las protenas por dosificacin del nitrgeno. La presencia
5
Solucin muestra. Disolver una cantidad apropiada de la en la muestra de otras sustancias nitrogenadas puede afec-
muestra en solucin de cloruro de sodio a 0,9% (p/v) para tar el resultado de la dosificacin de las protenas. Las tc-
obtener una concentracin comprendida en el intervalo de nicas utilizadas para dosificar el nitrgeno conducen a la
la concentracin de las Soluciones estndar. Ajustar el pH destruicin de la muestra durante el anlisis, pero no se li-
de la solucin para 8 10,5 antes de juntar el Reactivo de mitan a la determinacin de las protenas en medio acuoso.
ftalaldehido.
Tcnica A. Proceder como indicado para la dosificacin del
Soluciones estndar. Disolver la sustancia de referencia nitrgeno despus de mineralizacin por el cido sulfrico
correspondiente a la protena a ser dosificada en solucin (5.3.3.2) o utilizar instrumentos disponibles en el mercado
de cloruro de sodio a 0,9% (p/v). Tomar muestras de esa adaptados a la dosificacin del nitrgeno por el mtodo de
solucin y completar con solucin de cloruro de sodio a Kjeldahl.
0,9% (p/v) para obtener por lo menos cinco soluciones es-
tndar de concentraciones comprendidas entre 10 g/ml Tcnica B. Existen en el mercado instrumentos adaptados
y 200 g/ ml y uniformemente repartidas en el intervalo para la dosificacin del nitrgeno. La mayor parte de ellos
escogido. Ajustar el pH de las soluciones para 8-10,5 antes utiliza la pirolisis (combustin de la muestra en presencia
de aadir el Reactivo de ftalaldehido. del oxgeno a temperaturas prximas de 1000 C), que
provoca la formacin de monxido de nitrgeno (NO) y
Solucin en blanco. Utilizar solucin de cloruro de sodio otros xidos de forma NOx a partir del nitrgeno existente
a 0,9% (p/v). en la muestra. Ciertos instrumentos convierten esos xi-
dos de nitrgeno en nitrgeno gaseoso que es cuantificado
Tampn de borato. Disolver 61,83 g de cido brico en por conductimetra trmica. Otros mezclan el monxido
agua destilada y ajuste el pH para 10,4 con solucin de de nitrgeno (NO) con ozono (O3) para producir dixido
hidrxido de potasio. Completar a 1000 ml con agua des- de nitrgeno en el estado excitado (NO2) que emite una
tilada y mezclar. radiacin luminosa cuando de su reduccin y es cuantifi-
cado por quimioluminiscencia. Un producto de referencia,
Solucin madre de ftalaldehido. Disolver 1,20 g de ftalal- relativamente puro, y semejante, como su composicin, a
dehido en 1,5 ml de metanol, aadir 100 ml de Tampn de la protena a ser dosificada es utilizado para atomizar los
borato y mezclar. Aadir 0,6 ml de solucin de ter lurico parmetros de inyeccin y de pirolisis y para evaluar la
de macrogol 23 a 30% (p/v) y mezclar. Conservar la so- reproductibilidad del anlisis.
lucin a temperatura ambiente y utilizar, dentro de las 3
semanas siguientes de su preparacin. Clculos. El tenor en protena se calcula dividiendo el te-
nor en nitrgeno de la muestra por el tenor en nitrgeno
Reactivo de ftalaldehido. A 5 ml de la Solucin madre de (conocido) de la protena que puede ser determinada o a
ftalaldehido junte 15 L de 2-mercaptoetanol. Preparar el partir de la estructura qumica de la protena, o por compa-
reactivo 30 minutos, por lo menos, antes de utilizar y den- racin con una sustancia de referencia apropiada.
tro de las 24 horas despus de su preparacin.
La actividad de la inmunoglobulina humana anti-D es eva- Determinar las concentraciones de anticuerpos para las
luada por comparacin de la cantidad necesaria para pro- cuales existe una relacin lineal entre la concentracin y
ducir a aglutinacin de eritrocitos D-positivos y la de una la modificacin de la absorbancia (A). Con base en los
preparacin de referencia, medida en unidades internacio- resultados, construir una curva de calibracin y utilizar la
nales, necesarias para producir el mismo efecto. La Unidad parte lineal de la curva para determinar la actividad de la
Internacional corresponde a la actividad de una determi- muestra. Calcular la actividad de la muestra en unidades
nada cantidad de la preparacin internacional de referen- internacionales por mililitro usando la frmula:
cia. La correspondencia entre unidades internacionales y la
preparacin de referencia internacional es indicada por la axd
Organizacin Mundial de Salud. D
5
pender 20 volmenes de los eritrocitos en una mezcla de 15 DE LA FUNCIN FC DE LA
volmenes de suero inerte, 20 volmenes de solucin de INMUNOGLOBULINA
albmina bovina a 30% (p/v) y 45 volmenes de solucin
de cloruro de sodio a 0,9% (p/v). Colocar la suspensin en REACTIVOS
agua con hielo bajo agitacin continua.
Sangre humana estabilizada. Hacer una flebotoma para
Con un aparato automtico de diluicin calibrado preparar recoger la sangre humana del grupo O en solucin anticoa-
diluiciones de la muestra y de la preparacin de referencia gulante conservadora y preservadora del tipo ACD. Con-
en una solucin de albmina bovina a 0,5% (p/v) y solu- servar la sangre humana estabilizndola a 4 C, durante 3
cin de cloruro de sodio a 0,9% (p/v). semanas, como mximo.
Utilizar un aparato apropiado para anlisis automtico con- Solucin salina tamponada de fosfato de pH 7,2. Disolver
tinuo; mantenga la temperatura en los estuches a 15 C con 1,022 g de fosfato de sodio dibsico anhidro, 0,336 g de
excepcin de los espirales de incubacin. Aspirar para los fosfato de sodio monobsico y 8,766 g de cloruro de so-
estuches de admisin del aparato a suspensin de eritroci- dio en 800 ml de agua y completar 1000 ml con el mismo
tos con un dbito de 0,1 ml por minuto y una solucin de diluyente.
metilcelulosa 450 a 0,3% (p/v) con un dbito de 0,05 ml
por minuto. Solucin madre de magnesio y de calcio. Disolver 1,103 g
de cloruro de calcio y 5,083 g de cloruro de magnesio en
Introducir las diluiciones de la muestra y de la preparacin agua y completar 25 ml con el mismo diluyente.
de referencia con un dbito de 0,1 ml por minuto durante
2 minutos y despus el diluyente a la razn de 0,1 ml por Solucin madre de tampn de barbital. Disolver 207,5 g de
minuto durante 4 minutos antes de introducir la diluicin cloruro de sodio y 25,48 g de barbital sdico en 4000 ml de
siguiente. Introducir aire a la razn de 0,6 ml por minuto. agua y ajustar para pH 7,3 con cido clorhdrico M. Juntar
Incubar a 37 C durante 18 minutos y despus dispersar 12,5 ml de la Solucin madre de magnesio y de calcio y
los espirales por introduccin, con un dbito de 1,6 ml por completar 5000 ml con agua. Filtrar por membrana (0,22
minuto, de una solucin de cloruro de sodio a 0,9% (p/v) m) y conservar a 4 C en recipiente de vidrio.
que contiene un agente humectante apropiado (por ejem-
plo, polisorbato 20 en una concentracin final de 0,2 g/L) Tampn de albmina-barbital. Disolver 0,150 g de alb-
para evitar alterar la continuidad de las burbujas. Dejar de- mina bovina en 20 ml de Solucin madre de tampn de
positar los aglutinados y decantar 2 veces, la primera vez barbital y completar 100 ml con agua.
a 0,4 ml por minuto y la segunda vez a 0,6 ml por minuto.
Proceder a lisis del residuo de los eritrocitos no aglutinados Solucin de cido tnico. Disolver 10 mg de cido tnico
con la ayuda de una solucin de octoxinol 10 a 0,5% (p/v), en 100 ml de Solucin salina tamponada de fosfato de pH
de ferricianuro de potasio a 0,02% (p/v), de bicarbonato de 7.2. Preparar inmediatamente antes del uso.
sodio a 0,1% (p/v) y de cianuro de potasio a 0,005% (p/v),
con un dbito de 2,5 ml por minuto. Es introducida una Complemento de cobaya. Mezclar los sueros obtenidos a
serpentina de ralentizacin de 10 minutos para permitir la partir de, por lo menos, 10 cobayas. Separar el suero de la
transformacin de la hemoglobina. sangre coagulada por centrifugacin a una temperatura de
5
pensin de eritrocitos e incubar a 37 C durante 10 minu- na-barbital calentada a 37 C a la muestra, suspender, cui-
tos. Recolectar los eritrocitos tratados con cido tnico por dadosamente, los eritrocitos pipetendolos, repetidamente,
centrifugacin (400 800 g, durante 10 minutos), rechazar (por lo menos cinco veces) y colocar la cubeta en el porta
el sobrenadante y lavar los eritrocitos una vez con Solucin muestra de un espectrofotmetro con termostato. Despus
salina tamponada de fosfato de pH 7,2. Suspender a 1% de 2 minutos, juntar 200 L de Complemento de cobaya
(v/v) los eritrocitos tratados con cido tnico en la Solucin diluido para 125 200 CH50/ml, mezclar, cuidadosamente,
salina tamponada de fosfato de pH 7,2. pipeteando la mezcla dos veces e inicie inmediatamente
despus de la segunda pipeteada el registro de la absorban-
Adicin de los antgenos a los eritrocitos. Tomar un volu- cia en 541 nm en funcin del tiempo, utilizando el Tampn
men apropiado (v) de eritrocitos tratados con cido tnico, de albmina-barbital como lquido de compensacin. Pa-
junte 0,2 ml de antgeno de la rubola por 1,0 ml de eritro- rar el registro si la curva de la absorbancia en funcin del
citos e incubar a 37 C durante 30 minutos. Recolectar los tiempo pasa ntidamente el punto de inflexin.
eritrocitos por centrifugacin (400-800 g, durante 10 mi-
nutos) y rechazar el sobrenadante, dejando un volumen de Dosificacin. Determinar el declive (S) de la curva de hem-
200 L. Juntar un volumen de Tampn de albmina- bar- lisis en el punto aproximado de la inflexin segmentando la
bital igual al volumen del sobrenadante rechazado, agitar curva en la regin de mayor declive por intervalos de tiempo
hasta suspensin de los eritrocitos, recolectar estos como apropiados (por ejemplo, t = 1 minuto) y calculando S, ex-
arriba es descrito y repetir el lavado. Completar el volumen presado en A por minuto entre los puntos de interseccin
remanente obtenido de 0,2 ml hasta tres-cuartos de vs, obte- adyacentes. El valor ms elevado de S corresponde a (Sexp).
niendo as el volumen inicial (vi). Determinar, tambin, la absorbancia en el inicio de la curva
(As) por extrapolacin de la curva, la cual es casi siempre
Mezclar 900 L de Tampn de albmina-barbital con 100 lineal y paralela al eje del tiempo en los primeros minutos
L de vi, que es as reducido al volumen residual y deter- del registro. Corregir Sexp de acuerdo con la frmula:
minar la absorbancia inicial en 541 nm (A). Diluir vr por un
factor igual a A utilizando Tampn de albmina- barbital. Sexp
S =
Se obtiene, as, el volumen final ajustado vf = vr x A de eri- As
trocitos humanos sensibilizados y un valor para A de 1,0
0,1 en el caso de una diluicin a 1/10. Para cada preparacin, calcular el promedio aritmtico de
los valores de S. Calcular el ndice de la funcin Fc (IFc) a
Conexin de los anticuerpos a los eritrocitos con cido t- partir de la frmula:
nico y cubiertos de antgeno. Preparar, en duplicado y, su-
cesivamente, las siguientes soluciones utilizando para cada S Sc
IFc = 100 x
solucin, en separado, una cubeta semimicro (por ejemplo, S s Sc
placas descartables) o un tubo de ensayo para cada solu-
cin: S = media aritmtica del declive corregido para la mues-
tra; Ss = media aritmtica del declive corregido para el es-
Soluciones problema. si necesario, ajustar la muestra a pH tndar; Sc = media aritmtica del declive corregido para el
7 adicionando, por ejemplo, hidrxido de sodio M. Tomar testigo del complemento.
5
asegurndose de que la solucin no sea contaminada.
Despus de la seleccin, mantener los animales en jaulas
individuales en sala con temperatura uniforme entre 20 y Inyectar por la vena marginal de la oreja de tres conejos no
23 C libre de perturbaciones que puedan estresarlos. La menos que 0,5 ml ni ms que 10 ml de la solucin por kg de
temperatura seleccionada puede variar hasta 3 C. peso corporal o la cantidad indicada en la monografa. La
inyeccin no debe durar ms que 10 minutos, a menos que
Realizar condicionamiento para determinacin de la tem- en la monografa se especifique tiempo diferente.
peratura de los animales, por lo menos una vez, hasta siete
das antes de iniciar la prueba. Los animales debern ser Registrar la temperatura de cada animal en intervalos de 30
condicionados segn el mismo procedimiento de la prueba minutos durante 3 horas despus de la inyeccin.
apenas sin inoculacin del producto. Animales que presen-
ten elevacin de temperatura igual o superior a 0,5 C, con Interpretacin
relacin a la temperatura inicial, no debern ser utilizados
en la prueba. No considerar las disminuciones de temperatura presen-
tados por los animales durante la prueba. El aumento de
Cuando se realice la prueba, usar apenas animales con tem- temperatura es verificado por la diferencia entre la mayor
peratura igual o inferior a 39,8 C y que no presenten, de temperatura presentada por el conejo durante la prueba y
uno para el otro, variacin superior a 1,0 C. su temperatura de control.
Las jeringas, agujas y elementos de vidrios estriles y piro- La prueba de endotoxina bacteriana es usada para detec-
gnicos. Los diluyentes y soluciones extractoras o de lava- tar o cuantificar endotoxinas de bacterias gram negativas
do deben, tambin, ser estriles y pirognicos. presentes en muestras para cual la prueba es solicitada. Se
utiliza el extracto acuoso de los amibocitos circulantes de temperatura mnimos de 250 C por 30 minutos. Si utilizar
Limulus polyphemus o de Tachypleus tridentatus prepara- descartables plsticos, como punteras y pipetas usen sola-
do y caracterizado como reactivo LAL. mente los certificados que indican ser libres de endotoxinas
para no haber interferencia en la prueba.
Hay dos tcnicas con sensibilidad diferente para esta prue-
ba: PREPARACIN DE LA ENDOTOXINA ESTNDAR
DE REFERENCIA Y DEL ESTNDAR DE
1. MTODO DE COAGULACIN EN GEL: basado en ENDOTOXINA
la formacin de cogulo o gel (mtodo semi-cuantita-
tivo) El estndar de endotoxina de referencia tiene una poten-
cia definida de 10.000 UE (unidades de endotoxina) por
2. MTODOS FOTOMTRICOS cuantitativos que in- frasco. Reconstituya el frasco con 5 ml de agua grado re-
cluyen: activo LAL (libre de pirgenos) y agite en vortex intermi-
tentemente por 30 minutos. Use esta solucin concentrada
El MTODO TURBIDIMTRICO, (basado en el desarro- (conservada en refrigerador por no ms que 14 das) para
llo de turbidez despus de quiebra de un sustrato endge- hacer diluiciones seriadas. Agite vigorosamente antes del
no); uso por lo menos por 3 minutos y proceda a las diluicio-
nes seriadas, agitando como mnimo 30 segundos antes de
El MTODO CROMOGNICO (basado en el desarrollo las prximas diluiciones. Despus del uso descartar las di-
de color despus de quiebra de un complejo pptido sint- luiciones debido a la prdida de actividad por adsorcin.
tico cromgeno). Para la preparacin del estndar de endotoxina (siga las
orientaciones del proveedor, certificados en el laudo de en-
Cualquiera de estos procedimientos puede ser realizado, a dotoxina).
5
menos que sea indicado lo contrario en la monografa.
Preparacin para la prueba
En el mtodo de coagulacin en gel, la determinacin del
punto final de la reaccin est hecha a partir de diluicio- Usar reactivo LAL con sensibilidad declarada confirmada.
nes de la sustancia bajo prueba en comparacin directa con
diluiciones paralelas de la endotoxina estndar. Las canti- La validez de los resultados de la prueba para endotoxinas
dades de endotoxinas estn expresadas en unidades de en- bacterianas requiere la demostracin de que las muestras,
dotoxina (UE) definidas. soluciones de lavados o extractos bajo prueba no inhiben
o potencializan la reaccin y tampoco interfieren con la
Nota: 1 UE es igual a 1 UI (unidad internacional). prueba. La validacin es realizada por medio de prueba
de inhibicin o potencializacin descrito para cada una de
El reactivo LAL (lisado de amebocito de Limulus sp.) es las tcnicas indicadas. Estn incluidos controles negati-
preparado para las lecturas turbidimtricas o colorimtricas vos apropiados. La validacin debe ser repetida si hubiere
y estos procedimientos pueden ser utilizados si cumplen cambio en el origen del reactivo LAL, en el mtodo de
los requisitos de los mtodos. Para su calibracin es nece- produccin o en la formulacin de la sustancia bajo prueba.
saria la elaboracin de una curva estndar obtenindose su
regresin lineal, en la cual se determina, por interpolacin, Preparacin de la muestra
la concentracin de endotoxina de la sustancia bajo prueba.
Prepare la solucin de muestra disolviendo la misma en
El procedimiento incluye incubacin de la endotoxina es- agua grado reactivo LAL. Si necesario ajuste el pH de la
tndar para obtencin de una curva de calibracin y de las solucin de la muestra para que la mezcla reactiva LAL
soluciones control con reactivo LAL, por tiempo predeter- ms muestra caiga en la banda de pH de 6 a 8. El pH puede
minado y lectura espectrofotomtrica en el largo de onda ser ajustado usando un tampn adecuado recomendado por
adecuado. el proveedor. cidos y bases pueden ser preparados con
agua grado reactivo LAL y ser validados para ser libres de
En el caso del procedimiento del mtodo turbidimtrico, endotoxinas y factores de interferentes.
la lectura est hecha inmediatamente despus de perodo
final de incubacin, y para el procedimiento colorimtrico DETERMINACIN DE LA MXIMA DILUICIN
la reaccin enzimtica es interrumpida en el final del tiem- VALIDA (MDV)
po predeterminado por la adicin del reactivo, antes de las
lecturas. Para los procedimientos cinticos turbidimtricos La mxima diluicin vlida es la mxima diluicin permi-
y colorimtricos los valores de absorbancia medida duran- tida de la muestra en anlisis donde el lmite de endotoxina
te el perodo de la reaccin y valores de velocidades son puede ser determinado. Ella se aplica para inyecciones o
determinados para aquellas lecturas. soluciones de administracin parenteral en la forma re-
constituida o diluida para administracin, cantidad de fr-
ELEMENTOS DE VIDRIO Y DESCARTABLES. maco por peso, si el volumen de la forma de la dosificacin
fuese variable.
Todos los elementos de vidrio deben ser higienizados en
estufa usando un proceso validado. Utilice un tiempo y La frmula para el clculo de la MDV es la siguiente:
Para garantizar la precisin y validez de la prueba son ne- La prueba es vlida para la muestra bajo anlisis si el pro-
cesarios pruebas para confirmar la sensibilidad del LAL medio geomtrico de esta concentracin es mayor o igual
rotulada as como pruebas para verificacin de factores in- a 0,5 y menor o igual a 2 . Si el resultado obtenido en
terferentes, como descrito en la preparacin de la muestra las muestras en las cuales fueron adicionadas endotoxina
para la prueba. est fuera del lmite especificado, la prueba de inhibicin o
potencializacin de endotoxina deber ser repetida despus
de neutralizacin, inactivacin o eliminacin de las sustan-
cias interferentes o despus de la diluicin de la muestra
por factor que no exceda la MDV. Repetir la prueba en
una diluicin mayor no excediendo la MDV o usar un LAL Si la prueba es realizada en la muestra diluida, determi-
de sensibilidad mayor para que la interferencia pueda ser na la concentracin de endotoxina en la solucin original
eliminada en la muestra analizada. multiplicando el resultado por el factor de diluicin de la
muestra. Si ninguna de las diluiciones de la muestra prue-
Interferencias pueden ser eliminadas por un tratamiento ba es positiva, exprese el resultado de la concentracin de
adecuado como filtracin, neutralizacin, dilisis o calen- endotoxina como menor que la sensibilidad del LAL () o
tamiento. menor del que a sensibilidad del LAL multiplicado por el
menor factor de diluicin de la muestra.
COAGULACIN EN GEL PRUEBA LMITE
Si todas las diluiciones de la muestra presentan reacciones
Esta prueba es usada cuando la monografa contiene requi- positivas, la concentracin de endotoxina es expresa como
sitos para lmite de endotoxina. igual o mayor que multiplicado por el ms alto factor de
diluicin de la muestra.
Procedimiento. Realice las pruebas en duplicatas con las
soluciones A, B, C, D como sigue. Prepare solucin de La muestra encuentra los requisitos de la prueba si la con-
muestra diluida sin adicin de endotoxina (solucin A); centracin de endotoxina es menor que el lmite individual
con adicin de endotoxina (control positivo del producto) especificado en la monografa.
a 2 (solucin B); agua grado reactivo LAL con adicin de
endotoxina a 2 (solucin C) y agua grado reactivo LAL TCNICAS FOTOMTRICAS
sin adicin de endotoxina (solucin D control negativo).
La diluicin de la solucin A y B no debe pasar la MDV. Los mtodos fotomtricos cuantitativos incluyen:
Interpretacin. La prueba solamente ser vlida si las r- a) Mtodo cintico turbidimtrico: basado en el desarrollo
5
plicas de los controles positivos de las soluciones B y C de turbidez despus de quiebra de un sustrato endge-
forman gel, y las rplicas de los controles negativos de las no.
soluciones A y C no forman gel. Resultados contrarios, no b) Mtodo cintico cromognico: basado en el desarrollo
sern vlidos y debern ser repetidos. de color despus de quiebra de un complejo pptido
sinttico cromgeno.
Ensayo de la prueba por la coagulacin en gel c) Mtodo cromognico lmite (endpoint).
d) Mtodo turbidimtrico lmite (endpoint).
Mezcle un volumen (ej. 100 L) de LAL con igual volu-
men de las soluciones arriba, muestra, estndares, y control Tcnica turbidimtrica
negativo de la prueba en tubos de ensayo 10 x 75mm, en
duplicatas. Incubar los tubos por 1 hora a 37 C 1 C, evi- Esta tcnica se basa en la medida de aumento de turbidez, y
tando vibraciones. Despus de este perodo retire los tubos dependiendo del principio empleado, puede ser clasificado
uno a uno, girando a 180 grados y verificando la integridad en 2 tipos:
del gel; si el gel permanece firme despus de la inversin
de los tubos considere el resultado como positivo, y si no a) Lmite Turbidimtrico: basado en la relacin entre la
hubiere formacin de gel o el mismo no se presenta firme concentracin de endotoxina y la turbidez (absorbancia
considere como negativo. o transmisin) de la reaccin
b) Cintico Turbidimtrico: mtodo basado en el tiempo
La prueba solamente ser vlida si las siguientes condicio- de reaccin (onset time) necesario para la mezcla que
nes son obedecidas: la reaccin alcance una absorbancia predeterminada o
en la relacin de desarrollo de turbidez.
Si ambas rplicas del control negativo (D) presentan reac-
ciones negativas; La prueba es realizada en una temperatura de incubacin
recomendada de 37 C 1 C.
Si ambas rplicas del control positivo del producto (B) pre-
sentan reacciones positivas; Tcnica cromognica
Si el promedio geomtrico de la solucin C est dentro de Esta tcnica es basada en la medida de un cromforo li-
la banda de 0,5 a 2. berado por un pptido cromognico por la reaccin de la
endotoxina con el lisado y dependiendo del principio em-
Para calcular la concentracin de endotoxina de la solu- pleado puede ser clasificado en dos tipos:
cin A, calcule la concentracin del punto final de cada
rplica de la serie de diluiciones, multiplicando cada factor a) Prueba cromognica lmite- est basada en la relacin
de diluicin del punto final por la sensibilidad rotulada del entre la concentracin de endotoxina y la cantidad del
reactivo LAL () cromforo liberado en el final de un perodo de incu-
bacin.
La concentracin de endotoxina en la solucin prueba es b) Prueba cintica cromognica: basada en la medida del
el promedio geomtrico de la concentracin del lmite de tiempo de reaccin (onset time) necesaria para que la
las rplicas.
mezcla de la reaccin alcance una predeterminada ab- quier endotoxina detectada en la solucin sin adicin de
sorbancia o en la velocidad de desarrollo de color. endotoxina.
La prueba es realizada en una temperatura de incubacin Cuando la recuperacin de endotoxina est en la banda de
recomendada de 37 1 C. especificacin, factores interferentes deben ser retirados
conforme descritos en la seccin de la tcnica de coagu-
Preparacin de la prueba lacin en gel.
5
plicado de cada concentracin, como recomendado por el
proveedor del LAL (relacin de volumen, tiempo de incu- El resultado obtenido de la solucin D (control negativo)
bacin, temperatura y pH, etc.) no excede el lmite del valor del blanco requerido en la
descripcin del lisado empleado;
Si se desea una banda mayor que 2 logs, una concentracin
estndar deber ser adicionada para aumentar la banda de El resultado obtenido con la serie de control positivo, solu-
la curva estndar. cin C, est de acuerdo con los requisitos para validacin
definidos en los criterios para curva estndar.
El valor absoluto de correlacin lineal R deber ser mayor
o igual a 0,980 para la banda. De concentracin de endoto- La recuperacin de endotoxina, calculada a partir de la en-
xina indicada por el proveedor de LAL. dotoxina encontrada en la solucin B despus de sustrac-
cin de la concentracin de endotoxina encontrada en la
Prueba para factores de interferencia para las tcnicas solucin A est dentro de la banda de 50 a 200%.
fotomtricas
Interpretacin de los resultados en ensayos fotomtricos
Prepare soluciones de muestra diluida sin exceder la MDV
(mxima diluicin vlida) sin endotoxina (solucin A) y La solucin de muestra a ser examinada estar de acuerdo
con endotoxina adicionada (solucin B) en la concentra- con la prueba si el promedio de la concentracin de endo-
cin igual o prxima del punto medio de la curva estndar. toxina encontrada en las rplicas (solucin A), despus de
Prepare tambin una serie de control positivo con solucio- correccin para diluicin y concentracin es menor que el
nes de endotoxina (solucin C) con tres concentraciones lmite de endotoxina del producto probado.
diferentes, y tambin el control negativo con agua pirog-
nica (solucin D) y realizar las pruebas adicionando reacti- REACTIVOS
vo LAL, como mnimo en duplicado (siga las orientaciones
del reactivo utilizado con relacin al volumen de muestra Lisado de Amebocito
y del reactivo, tiempo de incubacin), el punto ms bajo de
la curva es considerado . El lisado de amebocito es un liofilizado obtenido del lisado
de amebocitos de crustceo en forma de herradura (Limu-
Calcule el promedio de recuperacin de la endotoxina adi- lus polyphemus o Tachypleus tridentatus) Este reactivo se
cionada a la muestra sustrayndose el promedio de la con- refiere apenas al producto manufacturado de acuerdo con
centracin de endotoxina en la solucin prueba (solucin las reglamentaciones de autoridad competente.
A) (si hubiere) de la media de la solucin cuya endotoxina
fue adicionada (solucin B). El lisado reacciona tambin con algunos B-Glucanos ade-
ms de endotoxinas.
La solucin prueba es considerada libre de interferentes si
la medida de la concentracin de endotoxina adicionada Preparado del lisado que no reacciona con B-Glucanos
a la solucin prueba (solucin B) est en la banda de 50 tambin estn disponibles; ellos son preparados o por eli-
a 200% de recuperacin, despus de sustraccin de cual- minacin o por inhibicin del factor G, que reacciona con
los glucanos. Estos preparados pueden ser utilizados para nografa. La muestra cumple la prueba si todos los animales
prueba de endotoxina en la presencia de glucanos. sobreviven y no ms de uno presenta sntomas anormales
en el intervalo de tiempo establecido. Si uno o dos animales
Reconstitucin del reactivo. Disuelva el lisado de amebo- mueren, o ms de uno presenta sntomas anormales o de to-
cito (LAL) en agua grado reactivo para BET (prueba de xicidad inesperada, repetir la prueba utilizando otros cinco o
endotoxina bacteriana) o tampn, sin agitacin y almacene ms ratones, con peso entre 19 g y 21 g. La muestra cumple
el mismo en refrigerador o freezer de acuerdo con la reco- los requisitos de la prueba si el nmero de ratones muertos
mendacin del proveedor. no excede 10% del total de animales probados, incluyendo
la prueba original, y ningn animal del segundo grupo pre-
Agua para prueba de endotoxina bacteriana senta sntomas indicativos de toxicidad anormal.
El agua para prueba y agua para inyeccin o producida PRUEBA PARA PRODUCTOS BIOLGICOS,
para otros procedimientos que demuestre no tener ninguna SUEROS Y VACUNAS
reaccin con el lisado empleado en el lmite de deteccin
del reactivo. Seleccin de los animales
5.5.2.3 TOXICIDAD Usar, por lo menos, cinco ratones con peso entre 17 g y 22
g y, por lo menos, dos cobayos sanos con peso entre 250
La prueba de toxicidad posibilita detectar reactividad bio- g y 350 g.
lgica inesperada y no aceptable de frmacos y medica-
mentos. Esa prueba in vivo es sugerida para la evaluacin Procedimiento
de la seguridad de productos biolgicos y derivados de
biotecnologa. Pesar los animales y registrar en formulario propio antes
5
de inyectar la muestra. A menos que especificado de otra
PRUEBA GENERAL forma en la monografa, inyectar intraperitonealmente en
cada animal el equivalente a una dosis humana de la pre-
Seleccin de los animales paracin, sin pasar de 1,0 ml para ratones y de 5,0 ml para
cobayos. La dosis humana es definida en el rtulo de la
Usar ratones sanos, de ambos los sexos, de especmenes preparacin a prueba o en la bula que la acompaa.
conocidos, no utilizados previamente en pruebas biolgi-
cas. Mantenerlos a dieta uniforme, agua a gusto y en tem- Interpretacin
peratura ambiente constante de 21 3 C. En el da de la
prueba, seleccionar ratones con peso entre 17 g y 22 g. Por un perodo de, como mnimo, 7 das, observar los ani-
males cuanto a seales de enfermedad, prdida de peso,
Preparacin de la muestra anormalidades o muerte. Si, durante el perodo de obser-
vacin, todos los animales sobreviven, no manifiestan res-
La muestra debe ser preparada conforme especificado en puestas que no son especficas o esperadas para el producto
la respectiva monografa y administrada inmediatamente. y no sufren reduccin de peso, la preparacin cumple la
prueba. De lo contrario, la prueba debe ser repetida para las
Procedimiento especies en las cuales los requisitos no fueron cumplidos.
La preparacin cumple la prueba si todos los animales del
Usar jeringas, agujas y elementos de vidrio estriles. Ad- segundo grupo cumplen los criterios especificados para la
ministrar, en cinco ratones, volumen de la preparacin prueba inicial.
muestra indicada en la monografa, por una de las vas des-
critas a continuacin. Si, despus de la segunda prueba, la preparacin no cumple
los requisitos, pero no son observadas muertes en porcen-
Intravenosa Inyectar la dosis en la vena caudal, mante- taje igual o superior a 50% del nmero total de animales
nindose la velocidad constante de 0,1 ml por segundo o la probados, una segunda prueba puede ser realizada, en las
indicada en la monografa. especies en las cuales se observ el no cumplimiento de
los requisitos. Utilizar el doble de animales de la prueba
Intraperitoneal Inyectar la dosis en la cavidad peritoneal. inicial. Si los animales cumplen los criterios especificados
para la prueba inicial, la preparacin cumple la prueba.
Subcutnea Inyectar la dosis en la regin cervical o ab-
dominal. 5.5.2.4 SUSTANCIAS VASOPRESORAS
Oral Administrar la dosis por medio de sonda u otro dis- Preparacin estndar de referencia
positivo adecuado.
Como preparacin estndar, emplear bitartrato de epinefri-
Interpretacin na. Esa preparacin debe ser conservada en frascos her-
mticos y opacos y desecada sobre gel de slice durante 18
Mantener los animales en observacin durante 48 horas des- horas antes del uso.
pus de la administracin o por el tiempo indicado en la mo-
5
arterial). Inmovilizar el animal y mantenerlo caliente para con cerca de dos o tres centmetros de largo y amarrar dos
prevenir la prdida de calor corporal. Quirrgicamente lneas finas en las extremidades. Efectuar pequea incisin
proceder a la intubacin traqueal, si necesario, y exponer en la porcin central del tejido. Transferirlo para cuba de
la vena femoral o yugular, preparndola, para inyecciones rgano aislado, de 10 ml a 20 ml de capacidad, en tem-
intravenosas. Administrar 200 unidades de heparina por peratura controlada entre 34 C a 36 C bajo corriente de
100 g de peso corporal. Quirrgicamente exponer la arte- aire o mezcla de 95% de oxgeno y 5% de CO2. Fijar una
ria cartida y canular, conectndola al manmetro ajustado de las lneas en el fondo de la cuba y amarrar la otra en
para el registro continuo de la presin arterial. la palanca destinada a registrar las contracciones muscula-
res en el quimgrafo u otro sistema de registro adecuado.
Inyectar, intravenosamente, solucin de sulfato de atropina Ajustar la palanca para el registro de las contracciones del
0,1% (p/v) en la proporcin de 1 ml por quilogramo de leon con grado de amplificacin de la orden de 20 veces.
peso corporal. Considerar el receptor muscarnico suficien- Lavar la preparacin con solucin y dejarla en reposo por
temente bloqueado solamente si inyecciones subsiguientes 10 minutos.
de la solucin reciente de cloruro de acetilcolina 0,001%
(p/v) en la dosis de 1 ml por quilogramo de peso no produ- Aadir volmenes conocidos de 0,2 ml a 0,5 ml de so-
ce cada transitoria en la presin arterial. Si ese mecanis- lucin estndar de referencia de histamina (1 g/ ml) para
mo no est suficientemente paralizado, inyectar dosis de obtener respuesta submxima (dosis mayor). Lavar el leon
0,5 ml de la solucin de sulfato de atropina hasta parlisis tres veces con solucin nutritiva. Efectuar las adiciones
completa. sucesivas en intervalos regulares de aproximadamente 2
minutos. Aadir nuevas dosis de solucin estndar de refe-
Procedimiento rencia de histamina obtenida por diluicin de la solucin
original, para mantener los volmenes de dosis siempre
Seleccionar dosis de la diluicin estndar que produzca iguales estableciendo la dosis responsable de respuesta
aumento entre 2,7 kPa y 9,3 kPa (20 mm a 70 mm de mer- cuya intensidad sea la mitad de la dosis mayor (dosis me-
curio) en la presin arterial. Inyectar la dosis en intervalos nor).
constantes de, como mnimo, cinco minutos para posibili-
tar el retorno de la presin arterial al nivel basal. Despus Proseguir la prueba adicionando secuencias de tres dosis:
de cada inyeccin administrar, inmediatamente, 0,2 ml de dosis estndar de referencia menor, dosis de solucin de la
solucin fisiolgica para lavar la cnula. Asegurarse de la sustancia bajo prueba y dosis estndar de referencia mayor.
reproductibilidad de la respuesta, repitiendo la dosis dos Ajustar la diluicin de la muestra para que, ocurriendo con-
o ms veces. Administrar nueva dosis de la diluicin del traccin del leon, esta sea menor que la producida por la
estndar para obtener respuesta hipertensora aproximada- dosis estndar de referencia mayor.
mente 20% mayor que el promedio de las respuestas de la
dosis menor. Considerar el animal apto para la prueba si Establecer la reproductividad de la contraccin por repeti-
(1) las respuestas para la primera dosis seleccionada fueren ciones sucesivas de las secuencias de dosis.
reproducibles entre 2,7 kPa y 9,3 kPa (20 mm a 70 mm de
mercurio) y (2) significativamente menores con relacin a Calcular la actividad de la sustancia bajo prueba en tr-
la respuesta de la dosis mayor. minos de su equivalente en microgramo por mililitro de
histamina (base libre), tomando por base las diluiciones
5
Agua para inyectables suficiente para 1000 ml en intervalos uniformes de, como mnimo cinco minutos,
dosis correspondientes a 0,05 g (dosis A); 0,10 g (dosis
Solucin A B) y 0,15 g (dosis C) de histamina (base libre) por quilo-
gramo de peso corporal. Despus de cada administracin,
Cloruro de sodio 160,0 g lavar inmediatamente a cnula por inyeccin de aproxima-
Cloruro de potasio 4,0 g damente 0,5 ml de solucin fisiolgica, para retirar acti-
Cloruro de calcio anhidro 2,0 g vidad residual. Repetir tres veces la administracin de la
Cloruro de magnesio anhidro 1,0 g dosis B a fin de observar la uniformidad de respuesta a la
Fosfato de sodio dibsico 0,05 g misma dosis. El animal es considerado apto a la realizacin
Agua para inyectables suficiente para 1000 ml de la prueba si las respuestas a los tres niveles de dosifica-
cin fueren ntidamente diferenciadas y las respuestas a la
5.5.2.6 SUSTANCIAS VASODEPRESORAS secuencia de dosis B fueren aproximadamente similares,
correspondiendo a cadas de presin arterial no inferiores a
Preparacin del estndar de referencia 2,7 kPa (20 mm de mercurio).
Emplear diclorhidrato de histamina, conservando en frasco Inyectar dos series de cuatro dosis, consistiendo cada serie
hermtico y opaco, desecado sobre gel de slice durante de dos inyecciones de la dosis especificada en la monogra-
dos horas, antes del uso. fa de la muestra, intercaladas con la dosis B, siempre con
intervalo uniforme de, como mnimo, cinco minutos.
Solucin estndar de referencia
Medir la alteracin de la presin arterial despus de cada
Disolver, en agua para inyectable estril, cantidad sufi- una de las inyecciones. En el anlisis de los resultados, se
ciente y exactamente pesada de diclorhidrato de histamina considera que la muestra cumple los requisitos de la prueba
para obtener solucin conteniendo el equivalente a 1 mg/ si el promedio de sus respuestas depresoras es inferior a
ml de histamina (base libre). Conservar bajo refrigeracin aquella de la dosis B.
en recipiente de vidrio mbar dotado de tapa esmerilada,
al abrigo de la luz, durante un mes. En el da de la prue- Terminar la prueba administrando una dosis C del estndar
ba, preparar solucin estndar de referencia conteniendo el para comprobar que la respuesta se mantiene superior a la
equivalente a 1 g/ml de histamina (base libre), en solu- dosis B: caso esto no ocurra, la prueba no es vlida.
cin fisiolgica.
El animal puede ser usado mientras permanezca estable y
Solucin de muestra responda, adecuadamente, a la administracin de la solu-
cin estndar de referencia.
Preparar a solucin de muestra conforme a especificacin
de la monografa respectiva.
5
ble en las diferentes categoras de productos y la va de
administracin. Fosfato de potasio monobsico 34,0g
Hidrxido de sodio 4% Aadir aproximadamente 175 ml
La naturaleza y la frecuencia de la prueba varan de acuer- Agua purificada 1000 ml
do con el producto. Ciertas categoras deben ser probadas
reiteradamente cuanto a la contaminacin total microbia- Disolver el fosfato de potasio monobsico en 500 ml de
na, tales como: productos de origen vegetal, mineral y/o agua, acertar el pH para 7,2 0,2 con hidrxido de sodio
animal as como productos con elevado tenor de agua (so- 4%. Completar el volumen con agua, esterilizar y conser-
luciones orales acuosas, cremas, etc). Para las dems ca- var bajo refrigeracin. En ocasin de la utilizacin diluir
tegoras como comprimidos, polvos, cpsulas, productos la solucin stock con agua en la proporcin de 1 para 800
lquidos no acuosos, pomadas y supositorios, la frecuencia (v/v) y esterilizar.
de la prueba puede ser establecida con base en datos hist-
ricos de las pruebas de monitoreo microbiolgico tanto el Fluido de lavado
ambiental como el de equipos. Otros criterios a ser consi-
derados seran la carga microbiana de la materia prima, el Peptona de carne digestin pptica 1,0 g
proceso de fabricacin, la formulacin del producto y los Polisorbato 80 1,0 g (si necesario)
resultados de determinacin de la actividad de agua, cuan- Agua 1000 ml
do aplicable. Resultados de baja actividad de agua (igual
o inferior a 0,75 medidos a la 25 C), as como bajo o alto Pesar y disolver el ingrediente en el agua destilada agitan-
pH, ausencia de nutrientes y adicin de conservantes ayu- do constantemente. Calentar si necesario. Ajustar el pH de
dan a prevenir la contaminacin microbiana. forma que sea 7,1 0,2. Esterilizacin en autoclave usando
ciclo validado.
5.5.3.1.1 Condiciones generales
Diluyente Universal
Para los ensayos microbiolgicos en productos no estri-
les, se debe utilizar tcnicas aspticas en el muestreo y en Fosfato de potasio monobsico 3,6 g
la ejecucin de la prueba. La prueba debe ser realizada, Fosfato disdico Dihidratado 7,2 g
preferentemente, en campana de flujo laminar y emplear, Cloruro de sodio 4,3 g
cuando posible, la tcnica de filtracin por membrana. Peptona de carne o de casena 1,0 g
Lecitina de gema de huevo 3,0 g
Si la muestra posee actividad antimicrobiana, esa debe ser L-histidina 1,0g
convenientemente retirada o neutralizada. Polisorbato 80 30,0 g
Agua purificada 1000 ml
La eficacia y la ausencia de toxicidad del agente inactivan-
te para los microorganismos considerados debe ser demos- Pesar y disolver los ingredientes en el agua destilada agi-
trada. Si se usan sustancias tensoactivas en la preparacin tando constantemente. Calentar si necesario. Ajustar el pH
de la muestra, tambin, debe ser demostrada la ausencia de de forma que sea 6,8 0,2. Esterilizar en autoclave usando
toxicidad para los microorganismos y compatibilidad con ciclo validado.
Caldo neutralizante DEY-ENGLEY pH 7,2 0,2. Calentar a 100 C durante 30 minutos. En-
friar inmediatamente.
Casena enzimtica hidrolizada 5,0 g
Prpura Bromocresol 20,0 mg Caldo MacConkey
Extracto de Levadura 2,50 g
Tiosulfato de Sodio 6,00 g Hidrolizado de pancretico de gelatina 20,0 g
Tioglicolato de Sodio 1,0 g Lactosa monohidratada 10,0 g
Bisulfito de sodio 2,50 g Bilis de buey deshidratada 5,0 g
Polisorbato 80 5,00 g Prpura de bromocresol 10,0 mg
Dextrosa 10,0 g Agua purificada 1000 ml
Lecitina 7,0 g pH 7,3 0,2. Esterilizar en autoclave usando ciclo vali-
Agua 1000 ml dado.
Pesar y disolver los ingredientes en el agua destilada agi-
tando constantemente. Calentar si necesario. Ajustar el pH Agar MacConkey
de forma que sea 7,6 0,2. Esterilizar en autoclave usando
ciclo validado. Hidrolizado de pancretico de gelatina 17,0 g
Peptona (carne o casena) 3,0 g
Caldo Casena-soja Lactosa monohidratada 10,0 g
Cloruro de sodio 5,0 g
Peptona de Casena pancretica 17,0 g Bilis de buey deshidratada 1,5 g
Harina de soja obtenida por digestin papanica 3,0 g Rojo neutro 30,0 mg
Cloruro de sodio 5,0 g Cristal violeta 1,0 mg
Fosfato de potasio dibsico 2,5 g Agar 13,5 g
5
Glucosa monohidratada 2,5 g Agua purificada 1000 ml
Agua purificada 1000 ml pH 7,1 0,2. Hervir 1 minuto con constante agitacin. Es-
pH 7,3 0,2. Esterilizar en autoclave usando ciclo vali- terilizar en autoclave usando ciclo validado.
dado.
Agar Xilosa, Lisina, Desoxicolato
Agar Casena-soja
Xilosa 3,5 g
Peptona de casena pancretica 15,0 g L-Lisina 5,0 g
Harina de soja obtenida por digestin papanica 5,0 g Lactosa monohidratada 7,5 g
Cloruro de sodio 5,0 g Sacarosa 7,5 g
Agar 15,0 g Cloruro de sodio 5,0 g
Agua purificada 1000 ml Extracto de levadura 3,0 g
pH 7,3 0,2. Esterilizar en autoclave usando ciclo vali- Rojo fenol 80,0 mg
dado. Agar 13,5 g
Desoxicolato de sodio 2,5 g
Agar Violeta Rojo Neutro Glucosa Citrato de amonio frrico 0,8 g
Tiosulfato de sodio 6,8 g
Extracto de levadura 3,0 g Agua purificada 1000 ml
Peptona de gelatina pancretica 7,0 g Ajustar de forma que despus de calentamiento sea pH 7,4
Sales Biliares 1,5 g 0,2. Calentar hasta la ebullicin. No esterilizar en auto-
Cloruro de sodio 5,0 g clave.
Glucosa monohidratada 10,0 g
Agar 15,0 g Caldo Enriquecimiento Salmonela Rappaport Vassiliadis
Rojo neutro 30,0 mg
Cristal violeta 2,0 mg Peptona de soja 4,5 g
Agua purificada 1000 ml Cloruro de magnesio hexahidratado 29,0 g
pH 7,4 0,2.. Calentar hasta ebullicin. No esterilizar en Cloruro de sodio 8,0 g
autoclave. Fosfato de potasio dibsico 0,4 g
Fosfato de potasio monobsico 0,6 g
Caldo de Enriquecimiento para Enterobacterias Mossel Verde malaquita 36,0 mg
Agua purificada 1000 ml
Hidrolizado de pancretico de gelatina 10,0 g pH 5,2 0,2. Esterilizar en autoclave en temperatura que
Glucosa monohidratada 5,0 g no exceda 115 C.
Bilis de buey deshidratada 20,0 g
Fosfato de potssico monobsico 2,0 g Agar Cetrimida
Fosfato disdico dihidratado 8,0 g
Verde brillante 15,0 mg Hidrolizado de pancretico de gelatina 20,0 g
Agua purificada 1000 ml Cloruro de magnesio 1,4 g
Sulfato dipotsico 10,0 g
5
Peptona de carne digestin 5,0 g
Infusin de papa 200,0 g Digesto pancretico de corazn 3,0 g
Dextrosa 20,0 g Extracto de levadura 5,0 g
Agar 15,0 g Almidn de maz 1,0 g
Agua purificada 1000 ml Cloruro de sodio 5,0 g
Suspender 39 g en 1000 ml de agua. pH 5,6 0,2. Esterili- Agar, de acuerdo con el poder gelificante 10,0 15,0 g
zar en autoclave usando ciclo validado. Si pretende pH 3,5, Agua purificada 1000 ml
aadir aproximadamente 14 ml de solucin estril de cido Dejar entumecer el agar y disolver calentando hasta ebulli-
tartrico 10% (p/v) al medio enriado a 45-50 C. cin, agitando constantemente. Si necesario ajustar el pH
de forma que sea 7,3 0,2. Esterilizar en autoclave usando
Agar Sabouraud-dextrosa 4% ciclo validado. Enfriar para 45 a 50 C y aadir, si nece-
sario, sulfato de gentamicina correspondiente a 20 mg de
Dextrosa 40,0 g gentamicina base, verter en placas de Petri.
Peptonas 10,0 g
Agar 15,0 g 5.5.3.1.2 Conteo del nmero total de
Agua purificada 1000 ml microorganismos mesfilos
pH 5,6 0,2. Esterilizar en autoclave usando ciclo vali-
dado. Con esta prueba es posible determinar el nmero total de
bacterias mesfilas y hongos en productos y materias pri-
mas no estriles y es aplicado para determinar si el produc-
to satisface las exigencias microbiolgicas farmacopeicas.
Caldo Sabouraud-dextrosa Cuando usado para ese propsito, se debe seguir las indi-
caciones dadas, incluyendo el nmero de muestras tomas
Dextrosa 20,0 g e interpretacin de los resultados. La prueba no es aplica-
Peptonas 10,0 g da para productos que contienen microorganismos viables
Agua purificada 1000 ml como ingrediente activo.
pH 5,6 0,2. Esterilizar en autoclave usando ciclo vali-
dado. Esa prueba consiste en el conteo de la poblacin de mi-
croorganismos que presentan crecimiento visible, en hasta
Agar Selectivo para Candida segn Nickerson 5 das, en Agar casena-soja a 32,5 C 2,5 C y en hasta 7
das, en Agar Sabouraud-dextrosa a 22,5 C 2,5 C.
Extracto de levadura 1,0 g
Peptona harina de soja 2,0 g Mtodos microbiolgicos alternativos, inclusive los auto-
Glicina 10,0 g matizados, pueden ser utilizados desde que su equivalencia
Glucosa 10,0 g con el mtodo farmacopeico haya sido debidamente vali-
Indicador bismuto-sulfito 2,0 g dada.
Agar 15,0 g
Agua purificada 1000 ml
PREPARACIN DE LAS MUESTRAS minutos. Si necesario, ajustar el pH para 6,5 7,5. Prepa-
rar diluiciones decimales sucesivas con el mismo diluyente
Productos hidrosolubles acrecido de 0,1% de tetradecil sulfato de sodio.
5
con el mismo diluyente.
Productos de naturaleza lipdica
Gelatinas
Mtodo de filtracin por membrana Disolver 1 g o 1 ml
de la mezcla de muestra en 100 ml de miristato de isopro- Transferir 10 g de la mezcla de muestra para frasco conte-
pilo esterilizado por filtracin en membrana (y su extracto niendo agua estril calentada a 40 45 C y dejar en reposo
acuoso debe presentar pH no inferior a 6,5) y calentado a durante una hora (diluicin 1:10). Enseguida transferir el
40 45 C. Puede ser utilizado polisorbato 80 estril u otro frasco para bao mara a 45 C, agitando vigorosamente
agente tensoactivo no inhibitorio; en intervalos frecuentes. Si necesario, ajustar el pH para
6,0 a 8,0. Preparar diluiciones decimales sucesivas en agua
Mtodo de conteo en placa Transferir 10 g o 10 ml de la estril.
mezcla de muestra para frasco conteniendo no ms que 5 g
de polisorbato 20 o 80 estril u otro agente tensoactivo no Dispositivo transdrmico
inhibitorio. Calentar si necesario, a una temperatura entre
40 45 C. Con pinzas estriles, retirar la pelcula protectora de 10 dis-
positivos transdrmicos y colocarlos con el frente adhesivo
Homogeneizar, cuidadosamente, manteniendo, si necesa- para arriba, en placas estriles y cubrir el frente adhesivo
rio, la temperatura 40 45 C. Aadir diluyente adecuado con gaza esterilizada. Transferir los 10 dispositivos para
entre los presentados en 5.5.3.1.1 Soluciones y Medios 500 ml, en el mnimo, de solucin tampn cloruro de so-
de Cultivo, previamente calentado, en la cantidad necesa- dio-peptona pH 7,0 conteniendo agente inactivante apro-
ria para obtener una diluicin a 1:10 del producto inicial. piado como polisorbato 80 o lecitina de soja. Agitar vigo-
rosamente durante como mximo de 30 minutos.
Mezclar, cuidadosamente, manteniendo la temperatura
mxima de 40 45 C durante el tiempo necesario para Relacionados
la formacin de una emulsin, en cualquier caso no ms
que 30 minutos. Si necesario, ajustar el pH para 6,5 7,5. Algodn y gaza transferir tres porciones de 3,3 g de las
Preparar diluiciones decimales sucesivas con el mismo di- partes ms internas de las muestras para solucin tampn
luyente acrecido de polisorbato 20 o 80. cloruro de sodio-peptona pH 7,0 conteniendo agente in-
activante apropiado. Preparar diluiciones decimales suce-
Cremas y pomadas insolubles en miristato de isopropilo sivas con el mismo diluyente.
Transferir 10 g de la mezcla de muestra para obtener una Otros relacionados transferir 10 unidades cuya forma y
diluicin a 1:10 en caldo casena-soja conteniendo 0,1 de dimensin permita su fragmentacin o inmersin total en
tetradecil sulfato de sodio, calentado a 40 45 C. Agitar no ms que 1000 ml de solucin tampn cloruro de sodio-
hasta mezcla homognea. peptona pH 7,0 u otro diluyente adecuado. Dejar en con-
tacto entre 10 30 minutos. Preparar diluiciones decimales
Mezclar, cuidadosamente, manteniendo siempre la tempe- sucesivas con el mismo diluyente. Para aquellos que no
ratura durante el tiempo mnimo necesario para la forma- pueden ser fragmentados o inmersos, introducir asptica-
cin de una emulsin, en cualquier caso no ms que 30 mente, en el recipiente 100 ml de solucin tampn cloruro
de sodio-peptona pH 7,0. Agitar. Utilizar mtodo de fil- para soluciones acuosas, oleosas o levemente alcohlicas y
tracin por membrana de 0,45 m. las membranas de acetato de celulosa para soluciones fuer-
temente alcohlicas. Preparar la muestra usando el mtodo
El mtodo para preparacin depende de las caractersti- ms adecuado previamente determinado.
cas fsicas del producto a ser probado. Si ninguno de los
procedimientos descritos son satisfactorios, desarrollar un Transferir 10 ml, o la cantidad de diluicin que represente 1
procedimiento adecuado1. g o 1 ml de la muestra a ser probada, para dos membranas y
filtrar inmediatamente. Si necesario, diluir la muestra para
ANLISIS DEL PRODUCTO obtener conteo de colonias entre 10 y 100 UFC. Lavar las
membranas por lo menos tres veces con aproximadamente
Cantidad de muestra 100 ml del fluido de lavado adecuado. Transferir una de
las membranas para la superficie de una placa conteniendo
Salvo indicacin contraria, utilizar mezcla de muestras agar casena-soja, incubar a 32,5 C 2,5 C durante 3-5
conteniendo 10 g o 10 ml del producto a examinar. Tomar das, para determinacin del nmero de microorganismos
10 unidades para aerosol forma lquida o slida y para aerbicos totales. Transferir la otra membrana para la su-
dispositivos transdrmicos. perficie de una placa conteniendo agar Sabouraud-dextrosa
e incubar a 22,5 C 2,5 C durante 5-7 das, para la deter-
La cantidad a ser probada podr ser reducida en el caso minacin de mohos y levaduras.
de sustancias activas que son formuladas en las siguientes
condiciones: la cantidad por dosis unitaria (ejemplo: com- Calcular el nmero de UFC por gramo o mililitro del pro-
primido, cpsula) es menor o igual a 1 mg. En ese caso, la ducto.
cantidad de muestra a ser probada no debe ser menor que
la cantidad presente en 10 dosis unitarias. Cuando se analicen dispositivos transdrmicos y produc-
5
tos mdicos, filtrar, separadamente, 10% del volumen de
Para productos en que el tamao del lote es extremamente la preparacin, conforme procedimiento de adecuacin del
pequeo (eso es, menor que 1000 ml o 1000 g), la cantidad producto, y proceder al lavado e incubacin conforme des-
a ser probada debe ser 1% del lote o menor cuando justifi- crito anteriormente.
cado o autorizado.
Conteo en placa
Para productos donde el nmero total de unidades en el lote
es menor que 200, usar dos unidades o una unidad si el lote Mtodo de profundidad Aadir 1 ml de la muestra pre-
fuese menor o igual a 100 unidades. parada como descrito en Preparacin de las muestras, en
placa de Petri y verter, separadamente, 15 20 ml de agar
En el muestreo de productos en procesamiento, recoger 3 casena soja y, agar Sabouraud-dextrosa mantenidos a 45
muestras del inicio, 4 del medio y 3 del final del proceso. 50 C. Utilizar dos placas para cada medio y diluicin. In-
Ejecutar la prueba en la mezcla de esas muestras. cubar las placas conteniendo agar casena-soja a 32,5 C
2,5 C durante 3 5 das y las placas conteniendo agar Sa-
PROCEDIMIENTOS bouraud- dextrosa a 22,5 C 2,5 C durante 5-7 das para
determinacin del nmero de microorganismos aerbicos
La determinacin puede ser efectuada por el Mtodo de totales y mohos y levaduras, respectivamente. Solamente
filtracin por membrana, Mtodo en placa o Mtodo de los las placas que presenten nmero de colonias inferior a 250
Tubos Mltiples (MNP). Ese ltimo es reservado para las (bacterias) y 50 (mohos y levaduras) por placa debern ser
determinaciones bacterianas que no puedan ser realizadas consideradas para el registro de los resultados. Tomar el
por uno de los otros mtodos y cuando se espera que el promedio aritmtico de las placas de cada medio y calcular
producto presente baja densidad bacteriana. el nmero de UFC por gramo o ml del producto.
La eleccin del mtodo es determinada por factores tales Mtodo de superficie aadir en placas de Petri, separa-
como la naturaleza del producto y el nmero esperado de damente, 15 20 ml de agar casena soja y agar Sabou-
microorganismos. Cualquier mtodo escogido debe ser de- raud-dextrosa y dejar solidificar. Secar las placas. Aadir a
bidamente validado. la superficie de cada medio de cultivo, 0,1 ml de la muestra
preparada como descrito en Preparacin de las muestras.
Filtracin por membrana Incubar las placas conteniendo agar casena-soja a 32,5 C
2,5 C durante 3-5 das y las placas conteniendo agar Sa-
Utilizar equipo de filtracin que posibilite la transferencia bouraud-dextrosa a 22,5 C 2,5 C durante 5 7 das para
de la membrana para los medios de cultivo. Las membranas determinacin del nmero de microorganismos aerbicos
de nitrato de celulosa, por ejemplo, pueden ser utilizadas totales y mohos y levaduras, respectivamente. Tomar el
promedio aritmtico de las placas de cada medio y calcular
1 Algunos productos pueden requerir una calefaccin mayor en la Prepa- el nmero de UFC por gramo o ml del producto.
racin de la muestra, pero esta no debe pasar los 48 C.
5
2 0 2 20 05 38
2 1 0 15 04 38
2 1 1 20 05 38
2 1 2 27 09 94
2 2 0 21 05 40
2 2 1 28 09 94
2 2 2 35 09 94
2 3 0 29 09 94
2 3 1 36 09 94
3 0 0 23 05 94
3 0 1 38 09 104
3 0 2 64 16 181
3 1 0 43 09 181
3 1 1 75 17 199
3 1 2 120 30 360
3 1 3 160 30 380
3 2 0 93 18 360
3 2 1 150 30 380
3 2 2 210 30 400
3 2 3 290 90 990
3 3 0 240 40 990
3 3 1 460 90 1980
3 3 2 1100 200 4000
3 3 3 >1100
Interpretacin El crecimiento de colonias bien desarro- Interpretacin El crecimiento de colonias bien desarro-
lladas de bacterias Gram-negativas, generalmente rojas o lladas, rojas con o sin centro negro indica presencia proba-
rojizas, indica contaminacin (resultado positivo). Anotar ble de Salmonela que debe ser confirmada por pruebas de
5
los resultados positivos y negativos. Determinar el nmero identificacin microbiana. El producto cumple la prueba
ms probable de bacterias por gramo o mililitro del pro- se no es observado crecimiento de tales colonias o si las
ducto segn Tabla 1. pruebas microbianas fueren negativas.
Preparado de la muestra y pre-incubacin Preparar la Seleccin y subcultivo Agitar y transferir una ansa para
muestra usando la diluicin 1:10 de no menos que 1 g del placa conteniendo Agar Cetrimida. Incubar a 32,5 C 2,5
producto a ser examinado conforme descrito en Conteo del C durante 18 72 horas. El crecimiento de colonias indica
nmero total de microorganismos mesfilos (5.5.3.1.2). presencia probable de Pseudomonas aeruginosa que debe
ser confirmada por pruebas de identificacin microbiana.
Utilizar 10 ml de la diluicin para 90 ml de Caldo de En- El producto cumple la prueba se no es observado creci-
riquecimiento (Caldo Casena-soja), o cantidad correspon- miento de tales colonias o si las pruebas de identificacin
diente a 1 g o 1 ml. Homogeneizar e incubar 32,5 C 2,5 fueren negativas.
C durante 18 a 24 horas.
Staphylococcus aureus
Seleccin y subcultivo Agitar y transferir 1 ml de la mues-
tra enriquecida para 100 ml de Caldo MacConkey. Incubar Preparacin de la muestra y pre-incubacin Preparar la
a 43 C 1 C durante 24 48 horas. Realizar subcultivo muestra usando la diluicin 1:10 de no menos que 1 g del
en placa de Agar MacConkey e incubar a 32,5 C 2,5 C producto a ser examinada conforme descrito en Conteo del
durante 18 a 72 horas. nmero total de microorganismos mesfilos (5.5.3.1.2).
Utilizar 10 ml de la diluicin para 90 ml de Caldo de En-
Interpretacin El crecimiento de colonias rojas, general- riquecimiento (Caldo Casena-soja) o cantidad correspon-
mente no mucosas, con micromorfologa caracterstica de diente a 1 g o 1 ml. Homogeneizar e incubar 32,5 C 2,5
bacilo Gram-negativo, indica presencia probable de E.coli C durante 18 a 24 horas.
que debe ser confirmada por pruebas de identificacin mi-
Cuando se pruebe el dispositivo transdrmico, filtrar 50 El producto cumple la prueba se no es observado el creci-
ml de Caldo de Enriquecimiento por membrana estril y miento de las colonias.
transferir la membrana para 100 ml de Caldo Casena-soja.
Incubar a 32,5 C 2,5 C durante 18 a 24 horas. 5.5.3.1.4 Adecuacin de los mtodos
farmacopeicos
Seleccin y subcultivo Agitar y transferir una ansa para
placa conteniendo Agar Manitol Salado. Incubar a 32,5 C Para adecuacin de los mtodos farmacopeicos a los pro-
2,5 C durante 18 72 horas. ductos no estriles debe ser demostrada la eliminacin de
cualquier propiedad antimicrobiana antes de la verificacin
Interpretacin El crecimiento de colonias amarillas o de la existencia de contaminacin microbiana en los pro-
blancas rodeada por una zona amarilla indica presencia ductos.
probable de S. aureus que debe ser confirmada por pruebas
de identificacin microbiana. El protocolo de la prueba de adecuacin debe mimetizar la
prueba de lmite microbiano preparacin de la muestra,
El producto cumple la prueba se no es observado creci- tipo de medio de cultivo y soluciones tampn, nmero y
miento de tales colonias o si las pruebas de identificacin tipo de la solucin de lavados de las membranas as como
fueron negativas. las condiciones de incubacin. Ese protocolo requiere el
uso de microorganismos para la prueba de recuperacin
Clostridium microbiana.
Preparacin de la muestra y pre-incubacin Preparar la Durante la adecuacin, demostrar que la eleccin del m-
muestra conforme descrito en Conteo del nmero total de todo para estimativa cualitativa y/o cuantitativa de los
microorganismos mesfilos (5.5.3.1.2). Utilizar dos frac- microorganismos viables es sensible, exacta y confiable y
5
ciones iguales correspondientes a no menos que 1 g o ml que es capaz eliminar cualquier interferencia o inhibicin
del producto a ser examinado. Calentar una de las porcio- durante la recuperacin de los microorganismos viables.
nes a 80 C durante 10 minutos y enfriar inmediatamente.
Inocular 10 ml de cada fraccin homogeneizada en 2 fras- Revalidar el mtodo de adecuacin si fuesen modificadas
cos conteniendo 100 ml de medio Caldo Reforzado para las condiciones de ensayo y/u ocurriesen alteraciones en el
Clostridium. Incubar en anaerobiosis a 32,5 C 2,5 C producto que puedan afectarlo.
durante 48 horas.
Con la finalidad de indicacin, fueron listados los microor-
Seleccin y subcultivo Transferir una ansa de cada frasco ganismos disponibles en la ATCC. Los mismos microor-
para placa conteniendo Agar Columbia. Incubar en anaero- ganismos pueden, tambin, ser obtenidos de otras fuentes:
biosis a 32,5 C 2,5 C durante 48 horas. INCQS, CIP, NBRC, NCIMB, NCPF, NCTC, NCYC, IMI
y IP. La correspondencia entre los microorganismos y las
Interpretacin El crecimiento de colonias catalasa- nega- direcciones de las entidades que los proveen se encuentra
tivas, con micromorfologa de bacilo Gram-positivo (con o indicada en Microorganismos empleados en pruebas y en-
sin endosporas) indica presencia probable de Clostridium. sayos (5.5.3.5).
El producto cumple la prueba se no es observado creci-
miento de microorganismo anaerobio o si la prueba de ca- CONTEO DEL NMERO TOTAL DE
talasa es negativa. MICRORGANISMOS MESFILOS
Agar Casena- -
C, 3 das
Agar Casena- -
(ATCC 6633) soja o Caldo soja y Caldo de soja /MNP Caldo
de Casena-soja Casena-soja de Casena-soja
32,5 C 2,5 C,
18-24 horas
100 UFC 100 UFC
32,5 C 2,5 32,5 C 2,5
C, 3 das C, 3 das
Cndida albicans Agar Sabouraud- Agar Casena- Agar Sabouraud- Agar Casena- Agar Sabouraud-
(ATCC 10231) dextrosa o Caldo Soja dextrosa soja dextrosa
Sabouraud
100 UFC 100 UFC 100 UFC 100 UFC
22,5 C 2,5 C
32,5 C 2,5 22,5 C 2,5 32,5 C 2,5 22,5 C 2,5
2-3 das C, 5 das C, 5 das C, 5 das C, 5 das
NMP: no
se aplica
Aspergillus Agar Sabouraud- Agar Casena- Agar Sabouraud- Agar Casena- Agar Sabouraud-
brasiliensis dextrosa o Agar Soja dextrosa soja dextrosa
(ATCC 16404) Papa-dextrosa
100 UFC 100 UFC 100 UFC 100 UFC
22,5 C 2,5 C
32,5 C 2,5 22,5 C 2,5 32,5 C 2,5 22,5 C 2,5
5-7 das, o hasta C, 5 das C, 5 das C, 5 das C, 5 das
esporulacin
evidente NMP: no
se aplica
_________
Usar solucin tampn cloruro de sodio-peptona pH 7,0 o solucin tampn fosfato pH 7,2 para preparar las suspensiones. Al preparar la suspensin
de esporas de A. brasiliensis, aadir a la solucin tampn 0,05% de polisorbato 80. Usar las suspensiones dentro de 2 horas o dentro de 24 horas si
mantenidas a la temperatura de 2- 8 C. Tiempos mayores podrn ser utilizados desde que validados.
Capacidad nutritiva de los medios de cultivo Para demostrar la recuperacin del microorganismo en el
producto, usar el menor factor de diluicin posible. Si la
Para los medios indicados en la Tabla 3, inocular una pe- recuperacin no es adecuada debe ser realizado un mtodo
quea cantidad de microorganismo, inferior a 100 UFC. alternativo como neutralizacin, diluicin o filtracin.
Usar una placa o tubo para cada microorganismo.
a) Neutralizacin/eliminacin de la actividad antimicro-
Probar cada lote de medio de cultivo cuanto a su capacidad biana
nutritiva conforme descrito a continuacin:
El nmero de microorganismos recuperados en la muestra
Medio de cultivo lquido: inocular menos que 100 UFC diluida es comparable con el nmero de microorganismos
del microorganismo prueba en el medio de cultivo in- en el control.
dicado. Incubar a temperatura adecuada y observar el
crecimiento visible comparando con un control (blan- Si el crecimiento fuese inhibido (reduccin menor que
co) del mismo medio de cultivo. 50%), se debe hacer modificaciones en el procedimiento
Medio de cultivo slido: inocular cada placa contenien- de conteo para asegurar la validez de los resultados. Las
do el medio de cultivo indicado con menos que 100 modificaciones incluyen las relacionadas a continuacin.
UFC del microorganismo prueba. Incubar a tempera-
tura adecuada y comparar el crecimiento obtenido que Aumentar el volumen del diluyente o medio de cultivo,
no debe ser inferior a 50% en relacin al inculo estan- manteniendo constante la cantidad del producto.
darizado. Incorporar un agente neutralizante especfico o agente
neutralizante universal.
Control negativo Para verificar la esterilidad de los me- Asociar ambos procedimientos arriba.
dios de cultivo, colocarlos en incubacin por, como mni- Realizar filtracin por membrana.
5
mo, 72 horas, en la temperatura adecuada. No debe haber
crecimiento de microorganismos. Si las modificaciones en el mtodo de neutralizacin fue-
sen ineficaces, es posible atribuir que la falla sea debido a
Inoculacin de los microorganismos prueba en la muestra la actividad antimicrobiana del producto, que no permite el
desarrollo del microorganismo control probado.
Aadir a la muestra diluida y al control (diluyente sin
muestra) conforme descrito en Preparacin de la muestra, b) Agentes neutralizantes
en Conteo del nmero total de microorganismos mesfilos
(5.5.3.1.2), cantidad suficiente del microorganismo para Agentes neutralizantes para inhibicin de la actividad an-
obtener una concentracin de no ms que 100 UFC/ml. El timicrobiana deben ser aadidos al diluyente escogido o al
volumen de la suspensin del inoculo no debe exceder 1% medio de cultivo preferencialmente antes de la esteriliza-
del volumen del producto diluido. cin (Tabla 2). Demostrar su eficacia y ausencia de toxi-
cidad a los microorganismos prueba utilizando diluyente
Debe ser demostrada la capacidad del medio de cultivo con neutralizante y producto y realizando un blanco con
para detectar microorganismos en la presencia y en la au- diluyente y neutralizante, respectivamente.
sencia de la muestra.
5
* Tioglicolato puede ser txico para ciertos microorganismos, especialmente esporas y estafilococos; tiosulfato puede ser txico para estafilococos.
Utilizar Caldo Neutralizante Day-Engley o Neutralizante Universal.
Si la neutralizacin no fuese adecuada, puede admitirse que la falla en recuperar el microorganismo inoculado sea atribuida a la actividad antimicrobiana
del producto. Esta informacin sirve para indicar que el producto no es suceptible a la contaminacin por los microorganismos probados, sin embargo
no puede inhibir otros no incluidos en la lista, los cuales no son representativos y prdrn ser empleados en la sustitucin de aquellos preconizados.
Recuperacin de los microorganismos en el producto tra y aadir 15 20 ml de agar Casena-soja o agar Sabou-
raud-dextrosa mantenidos a 45 50 C. Para cada microor-
Realizar las pruebas separadamente para cada microorga- ganismo probado, utilizar dos placas para cada medio y
nismo prueba listada en la Tabla 3. Utilizar la muestra con- cada diluicin. Incubar en las condiciones descritas en la
forme preparada en Inoculacin de los microorganismos Tabla 1. Tomar la media aritmtica de las placas con cada
prueba en la muestra. medio de cultivo y calcular el nmero de UFC.
a) Filtracin por membrana Mtodo de superficie Para cada placa de Petri de 9 cm,
aadir 15 20 ml de agar casena soja o agar Sabou-
Usar membrana filtrante con 0,45 m de dimetro de poro- raud-dextrosa y dejar solidificar. Secar las placas. Aadir
sidad y eficacia comprobada de retencin. Las membranas a la superficie del medio de cultivo 0,1 ml de la muestra
de nitrato de celulosa, por ejemplo, pueden ser utilizadas preparada como descrito en inoculacin del microorga-
para soluciones acuosas, oleosas o levemente alcohlicas nismo en la muestra. Para cada microorganismo probado
y las de acetato de celulosa para soluciones fuertemente utilizar dos placas. Realizar el conteo y calcular el nmero
alcohlicas. Para cada microorganismo prueba, utilice una de UFC.
membrana.
c) Mtodo del Nmero Ms Probable
De la muestra preparada, conforme descrito en Inoculacin
de los microorganismos prueba en la muestra, transferir 10 A partir de la muestra preparada conforme descrito en Ino-
ml para equipo de filtracin por membrana y filtrar inme- culacin de los microorganismos prueba en la muestra
diatamente. Lavar la membrana con volumen apropiado de (1:10), preparar diluiciones 1:100 y 1:1000. Transferir 1
lquido de lavado. ml de cada diluicin para 3 tubos conteniendo cada uno 9
ml de caldo Casena-soja. Si necesario aadir agente inac-
Para determinacin del conteo de microorganismo aerbi- tivante.
co y conteo de mohos y levaduras, transferir las membra-
nas para agar Casena-soja y Agar Sabouraud- dextrosa, Incubar todos los tubos a 32,5 C 2,5 C no ms que 5
respectivamente. Incubar en las condiciones descritas en la das. Anotar el nmero de tubos positivos. Si la naturaleza
Tabla 3 y realizar el conteo de las colonias. de la muestra torna la lectura difcil, efectuar subcultivo
para otros tubos conteniendo el mismo medio de cultivo o
b) Conteo en placa para agar Casena- soja por 2 das en la misma temperatu-
ra. Determinar el nmero ms probable de microorganismo
Mtodo de profundidad Utilizar placas con 9 cm de di- por gramo o mililitro del producto de acuerdo con informa-
metro. Aadir 1 ml de la muestra preparada como descrito ciones en la Tabla 3.
en Inoculacin de los microorganismos prueba en la mues-
5
eliminacin de la actividad antimicrobiana del tem Con- anaerbicas en Medio Reforzado para Clostridium a 32,5
teo del nmero total de microorganismos mesfilos de este C 2,5 C durante 24 48 horas. Como mtodo alter-
mtodo general. nativo, realizar diluiciones de una suspensin de clulas
vegetativas de Clostridium sporogenes. Esta suspensin de
Microorganismos aislados del ambiente u otras especies esporas puede ser utilizada como inculo se mantenida a
pueden ser incluidos en las pruebas de desafos, especial- 2 8 C por un perodo adecuado.
mente, se ellos representan contaminantes que puedan ser
introducidos durante la fabricacin o durante el uso del Capacidad nutritiva y selectiva de los medios de cultivo
producto.
Para los medios de cultivo indicados en la Tabla 3, inocu-
Mantenimiento y preparacin de los microorganismos lar una pequea cantidad de microorganismo prueba (no
prueba ms que 100 UFC). Usar una placa de Petri o tubo para
cada microorganismo.
Los cultivos liofilizados deben ser rehidratados de acuer-
do con las instrucciones de proveedores y mantenidos por Probar cada lote de medio de cultivo utilizado en los ensa-
transferencias para medios frescos o por proceso de conge- yos cuanto a su capacidad nutritiva o selectiva conforme
lamiento o refrigeracin por perodos de almacenamiento descrito a continuacin.
debidamente calificados.
Medio de cultivo lquido Inocular menos que 100 UFC
Usar suspensiones estandarizadas de las cepas pruebas del microorganismo prueba en el medio de cultivo indi-
conforme establecido abajo. Utilizar tcnica de manteni- cado. Incubar a temperatura adecuada y observar el cre-
miento de forma que el inculo no rebase 5 pasajes del cimiento visible comparando con un control (blanco) del
cultivo original. Cultivar cada microorganismo (bacteria y mismo medio de cultivo.
hongo) separadamente.
Medio de cultivo slido Inocular cada placa conteniendo
Usar solucin tampn cloruro de sodio-peptona pH 7,0 o el medio de cultivo indicado con menos que 100 UFC del
solucin tampn fosfato pH 7,2 para preparar las suspen- microorganismo prueba. Incubar a temperatura. El creci-
siones de los microorganismos. Al preparar la suspensin miento obtenido debe poseer las caractersticas estndares
de esporas de A. brasiliensis, aadir a la solucin tampn del microorganismo en el medio utilizado.
0,05% de polisorbato 80. Usar las suspensiones dentro de
2 horas o dentro de 24 horas si mantenidas a temperatura Control negativo
de 2 8 C.
Para verificar las condiciones del ensayo, realizar prueba
de esterilidad de los medios de cultivos. No debe haber
crecimiento de microorganismos.
Tabla 3 - Promocin del crecimiento, propiedades inhibitorias e indicativas del medio de cultivo
Medio de cultivo Propiedad Microorganismo prueba
Bacteria Gram-negativa bilis tolerante
Caldo de Enriquecimiento de Promocin de crecimiento Inhibitorio Escherichia coli
Enterobacterias segn Mossel
Pseudomonas aeruginosa
Inhibitorio Staphylococcus aureus
Agar Bilis, Violeta, Rojo y Glucosa Crecimiento presuntivo E. coli
P. aeruginosa
Escherichia coli
Caldo MacConkey Promocin de crecimiento E. coli
Inhibitoria S. aureus
Agar MacConkey Crecimiento presuntivo E. coli
Salmonela
Caldo Enriquecimiento Salmonela, Promocin de crecimiento Salmonela enterica ssp serotipo
segn Rappaport Vassiliadis typhimurium
5
typhimurium
Con base en datos histricos de las pruebas de monitoreo cultivo de bacterias anaerbicas, a pesar de que, tambin,
microbiolgico, de la baja carga microbiana de la materia pueda detectar el crecimiento de bacterias aerbicas. El se-
prima, de los ingredientes acuosos, del proceso de fabri- gundo es adecuado para el cultivo de levaduras, hongos y
cacin, de la formulacin, la frecuencia de la prueba para bacterias aerbicas. Los medios utilizados deben cumplir
la determinacin del lmite microbiano puede ser altera- con los requisitos de las Pruebas de promocin de creci-
da para las formas farmacuticas si presentan actividad de miento de los medios de cultivo. Preparar los medios de
agua (Aa) inferior a 0,75 medida a 25 C.Para los relacio- cultivo conforme descrito a continuacin. Formulaciones
nados, considerar como lmite microbiano aquellos expre- deshidratadas, tambin, pueden ser utilizadas, debindose
sados de acuerdo con la va de aplicacin. demostrar que, despus de reconstitucin conforme indi-
caciones del fabricante, los requisitos de las Pruebas de
5.5.3.2 ENSAYOS MICROBIOLGICOS promocin de crecimiento de los medios de cultivo sean
PARA PRODUCTOS ESTRILES cumplidos. Los medios de cultivo deben ser esterilizados
por proceso validado.
5.5.3.2.1 Prueba de esterilidad
Medio fluido de tioglicolato
Las pruebas de esterilidad se aplican a insumos farmacuti-
cos, medicamentos y productos para salud que, de acuerdo L-Cistina 0,5 g
con la Farmacopea, deben ser estriles, siendo adecuados Cloruro de sodio 2,5 g
para revelar la presencia de bacterias y hongos. Sin embar- Dextrosa 5,5 g
go, un resultado satisfactorio indica que no fue encontra- Agar granulado (humedad no superior a 15%) 0,75 g
do microorganismo contaminante solamente en la muestra Extracto de levadura (soluble en agua) 5,0 g
examinada. Casena obtenida por digestin pancretica 15,0 g
Tioglicolato de sodio (o cido tiogliclico) 0,5 g (0,3 ml)
5
La extensin de ese resultado a lo restante del lote requie- Resazurina sdica a 0,1% (p/v)
re la seguridad de que todas las unidades del mismo lote recientemente preparada 1,0 ml
hayan sido preparadas para garantizar gran probabilidad Agua purificada 1000 ml
de que todo el lote pasara por la prueba. Obviamente, eso pH del medio despus de esterilizacin 7,1 0,2
depende de las precauciones tomadas durante los procesos
operacionales de fabricacin, de acuerdo con las Buenas Mezclar la L-cistina, cloruro de sodio, dextrosa, extracto
Prcticas de Fabricacin. de levadura y casena de digestin pancretica con 1000
ml de agua purificada y calentar hasta disolucin total. Di-
PRECAUCIONES DURANTE LA PRUEBA solver el tioglicolato de sodio o cido tiogliclico en esa
solucin y ajustar el pH con hidrxido de sodio M de modo
Para la realizacin de la prueba de esterilidad es impor- que, despus de la esterilizacin, el pH de la solucin sea
tante que las personas sean adecuadamente entrenadas y de 7,1 0,2. Si hubiere necesidad de filtracin, calentar la
calificadas. solucin nuevamente, sin dejar alcanzar la ebullicin y fil-
trar, todava caliente, en papel de filtro. Aadir la solucin
Las pruebas deben ser realizadas bajo condiciones asp- de resazurina sdica, mezclar y distribuir en frascos ade-
ticas, utilizando, por ejemplo, campana de flujo laminar cuados. El medio debe presentar una coloracin rosa en su
clase II tipo A (mximo 3520 partculas 0,5 m/m3), superficie que no exceda un tercio de la altura de su masa
que debe estar instalada en sala limpia clase B ISO 7 lquida. En el caso de se obtenga un medio con coloracin
(mximo 352 000 partculas 0,5 m/m3). Para pruebas rosa en ms de un tercio de su masa lquida, restaurar el
de esterilidad de frmacos oncognicos, mutagnicos, an- medio por un nico calentamiento en bao mara o en va-
tibiticos, hormonas, esteroides y otros, las pruebas deben por fluente.
ser realizadas en la campana clase II tipo B2, que posee
sistema de extraccin externa al ambiente del laboratorio. Esterilizar utilizando proceso validado. Si no fuese a uti-
lizar inmediatamente, estocar en temperatura entre 2 C y
No deben ser realizadas pruebas bajo exposicin directa 25 C conforme orientacin del fabricante. No utilizar el
de luz ultravioleta o en reas bajo tratamiento con aero- medio por un perodo de almacenamiento superior a aquel
soles. Las condiciones deben ser adecuadas para evitar para el cual l fue validado.
contaminacin accidental de la muestra durante la prueba
y, tambin, no afectar la deteccin de posibles contaminan- El Medio lquido de tioglicolato debe ser incubado a 32,5
tes. Controles ambientales de las reas de trabajo deben ser C 2,5 C bajo condiciones aerbicas.
realizados regularmente (control del aire y de superficies,
conteos de partculas, determinacin de velocidad y direc- Medio alternativo del fluido tioglicolato
cin del flujo de aire, entre otros).
Proceder conforme descrito para Mediofluido de tioglico-
MEDIOS DE CULTIVO lato sin la adicin del agar y de la resazurina sdica. El pH
despus de esterilizacin es 7,1 0,2.
Los medios de cultivo utilizados para pruebas de este-
rilidad son el Medio fluido de tioglicolato y el Caldo de El Medio alternativo del fluido tioglicolato debe ser incu-
casena- soja. El primero es utilizado primariamente para bado a 32,5 C 2,5 C bajo condiciones anaerbicas.
5
Preparar diluiciones en serie (1:100, 1:10000 y 1:1000000)
Medios para penicilinas y cefalosporinas a partir de la suspensin stock utilizando solucin estril
de cloruro de sodio a 0,9% (p/v) o agua peptonada 0,1%
En los casos en que los medios de cultivo sean utilizados (p/v) estril como diluyente. Incorporar 1 ml de cada di-
para la prueba de esterilidad de penicilinas y cefalospori- luicin en medio slido adecuado para el microorganismo,
nas por el mtodo de Inoculacin directa, la preparacin previamente fundido y enfriado a aproximadamente 45 C.
del Medio fluido de tioglicolato y del Caldo de casena soja Homogeneizar e incubar.
debe ser modificada conforme descrito a continuacin.
Transferir, aspticamente, para los frascos esterilizados Proceder al conteo del nmero de colonias que se desa-
conteniendo cada medio, cantidad de -lactamasa sufi- rrollaron en el medio slido y escoger, a partir de los re-
ciente para inactivar el antibitico presente en la muestra. sultados, la diluicin a ser utilizada para obtenerse, como
Nmero representativo de frascos conteniendo medio con mximo, 100 UFC por frasco de medio de cultivo.
-lactamasa sin muestra deben ser incubados durante el pe-
rodo de la prueba (control negativo). Controles positivos, Repetir el procedimiento para cada microorganismo utili-
tambin, deben ser incluidos para verificar si toda penicili- zado.
na o cefalosporina fue inactivada. Proceder a la prueba de
validacin para bacteriostasis y fungistasis, utilizando Sta- Para el preparado de suspensin fngica, la solucin de
phylococcus aureus (ATCC 6538 / INCQS 00039) como cloruro de sodio a 0,9% (p/v) estril puede ser sustituida
microorganismo prueba. La observacin de crecimiento por agua purificada estril.
microbiano tpico constituye confirmacin de que la con-
centracin de -lactamasa utilizada es apropiada. PRUEBAS DE ADECUACIN DE LOS MEDIOS DE
CULTIVO
ESTANDARIZACIN DEL INCULO
Los medios de cultivo utilizados deben cumplir con las
Usualmente, son necesarios ajustes para obtener densidad pruebas descritas a continuacin, realizadas antes de la
especfica de clulas microbianas viables (no ms que 100 prueba de esterilidad de la muestra.
UFC) en el medio de cultivo. Para establecer un volumen
que contenga la densidad recomendada de clulas, diluicio- Esterilidad
nes en serie deben ser realizadas a partir de una suspensin
stock, procedindose a conteo en placas para determinar la Confirmar la esterilidad de cada lote de medio esterilizado
densidad microbiana obtenida con cada diluicin. incubando todos los frascos de los medios en las condicio-
nes especificadas por 14 das. No debe ocurrir crecimiento
Si el procedimiento est bien estandarizado, es posible re- microbiano.
producir los resultados con la misma cepa microbiana.
La ocurrencia de crecimiento microbiano inutiliza el lote
Es recomendable la utilizacin de subcultivos de microor- de medio para la prueba de esterilidad.
ganismos hasta como mximo 5 transferencias, a partir del
cultivo original.
Medio fluido de Staphylococcus aureus ATCC 6538, NCTC 10788, NCIMB 9518, CIP 4.83,
tioglicolato NBRC 13276, INCQS 00039
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118, NBRC 13275,
INCQS 00230
Clostridium sporogenes* ATCC 19404, NCTC 532, CIP 79.3, INCQS 00352 o
ATCC 11437, NCIMB 14239, CIP 100651, NBRC
14293
Alternativo del Clostridium sporogenes ATCC 19404 ,NCTC 532, CIP 79.3, INCQS 00352 o
tioglicolato ATCC 11437, NCIMB 14239, CIP 100651, NBRC
5
14293
Caldo de casena-soja Bacillus subtilis ATCC 6633, NCIMB 8054, CIP 52.62, NBRC 3134,
INCQS 00001
Bacteroides vulgatus (ATCC 8482, NCTC 11154, INCQS FLUIDOS DE DILUICIN Y LAVADO
00059) puede ser utilizado alternativamente a Clostridium
sporogenes, cuando no sea necesario el uso de un microor- Fluido I
ganismo esporulado.
Peptona de Carne 1,0 g
Una alternativa a Staphylococcus aureus es el Bacillus Agua purificada 1000 ml
subtilis (INCQS 00001, ATCC 6633, CIP 52.62,NBRC pH despus de esterilizacin 7,1 0,2
3134, NCIMB 8054, NCTC 10400).
Disolver la peptona de carne en agua purificada, filtrar
Un microorganismo alternativo para Pseudomonas aerugi- o centrifugar para clarificacin del medio, si necesario y
nosa es la Kocuria rhizophila (INCQS 00010, ATCC 9341, ajustar el pH en 7,1 0,2. Distribuir en frascos adecuados
CIP 53.65, NCTC 8340). y esterilizar utilizando proceso validado.
Usar ese fluido para productos que contienen lecitina o los medios de cultivo, aadir no ms que 100 UFC de los
aceite y para productos para salud. microorganismos pruebas a los medios.
5
tividad bacteriosttica o fungisttica inherente al produc- lidacin debe ser repetida para verificar si la actividad an-
to no tenga influencia adversa sobre la confiabilidad de la timicrobiana fue eliminada por la modificacin propuesta.
prueba, demostrndose que el procedimiento utilizado es
adecuado para el producto bajo examen. PROCEDIMIENTOS PARA LA PRUEBA DE
ESTERILIDAD
La prueba de validacin para bacteriostasis y fungistasis
debe ser realizada cuando la prueba de esterilidad sea rea- La prueba de esterilidad puede ser realizada utilizando los
lizada por la primera vez para un producto y siempre que mtodos de filtracin en membrana o de inoculacin di-
hubiere modificaciones en la formulacin del producto y/o recta conforme la naturaleza del producto, excepto cuando
en las condiciones experimentales de la prueba. La valida- uno de los mtodos es especificado en la monografa in-
cin debe ser hecha previamente a la prueba de esterilidad dividual. En ambos casos, controles negativos apropiados
del producto bajo examen. deben ser incluidos.
Tabla 2 - Nmero mnimo de unidades a ser probadas en funcin del tamao del lote.
Nmero de unidades del lote Nmero mnimo de unidades a ser probadasa b
Preparaciones parenterales
Hasta 100 10% o 4 unidades (lo que sea mayor)
Arriba de 100 hasta 500 10 unidades
Arriba de 500 2% o 20 unidades (lo que sea menor)
Parenterales de gran volumen 2% o 10 unidades (lo que sea menor)
Antibiticos slidos
Frascos con capacidad < 5 g 20 unidades
Frascos con capacidad 5 g 6 unidades
Oftlmicos y otras preparaciones no inyectables
Hasta 200 5% o 2 unidades (lo que sea mayor)
Arriba de 200 10 unidades
Producto presentado en embalaje de dosis nica aplicar lo mismo recomendado para preparaciones parenterales
Productos para salud
Hasta 100 10% o 4 unidades (lo que sea mayor)
Arriba de 100 hasta 500 10 unidades
Arriba de 500 2% o 20 unidades (lo que sea menor)
Productos slidos a granel
Hasta 4 cada unidad
Arriba de 4 hasta 50 20% o 4 unidades (lo que sea mayor)
5
Arriba de 50 2% o 10 unidades (lo que sea mayor)
Dispositivos mdicos quirrgicos
Catgut y otras suturas 2% o 5 embalajes (lo que sea mayor) como mximo 20 embalajes
Hasta 100 10% o 4 unidades (lo que sea mayor)
Arriba de 100 hasta 500 10 unidades
Arriba de 500 2% o 20 unidades (lo que sea mayor)
___________
a. muestreo especificado considerndose que el contenido de un recipiente es suficiente para inocular ambos medios de cultivo.
b. para materias primas, el muestreo satisfactorio puede ser basado en la raz cuadrada del nmero total de recipientes del lote
5
otros relacionados mdicos todo el material cortado en pedazos, o desmontado
Utilizar membranas filtrantes con porosidad nominal no Transferir pequea cantidad de diluyente estril, como el
superior a 0,45 m cuya eficiencia en retener microorga- Fluido I, para la membrana y filtrar. El diluyente puede
nismos haya sido establecida. Filtros de nitrato de celu- contener sustancias neutralizantes y o inactivantes, como
losa, por ejemplo, son utilizados para soluciones acuosas, en el caso de antibiticos. Transferir para la membrana los
oleosas y suavemente alcohlicas y filtros de acetato de ce- contenidos de los recipientes a ser probados o la diluicin
lulosa, por ejemplo, para soluciones fuertemente alcohli- apropiada (previamente definida en la prueba de validacin
cas. Filtros especialmente adaptados pueden ser requeridos para bacteriostasis y fungistasis) en cantidades no inferio-
para determinados productos, como antibiticos. res a las recomendadas en las Tablas 2 y 3 y filtrar inme-
diatamente. Si el producto presenta actividad antimicrobia-
Para productos oncolgicos extremamente agresivos sus- na, lavar la membrana, como mnimo, tres veces filtrando,
tituir a membrana de ster de celulosa por difluoruro de cada vez, el volumen del diluyente estril establecido en la
polivinilideno (PVDF) o politetrafluoroetileno (PTFE). prueba de validacin para bacteriostasis y fungistasis. La
cantidad de fluido de lavado utilizada no debe ser superior
Los procedimientos descritos a continuacin se aplican a cinco porciones de 200 ml, incluso si durante la prueba
a membranas con dimetro de aproximadamente 50 mm. de validacin haya sido demostrado que tal ciclo de lava-
Si filtros con dimetros diferentes son utilizados, los vo- dos no elimina completamente la actividad antimicrobiana.
lmenes de las diluiciones y lavados deben ser ajustados Transferir la membrana entera para medios seleccionados.
conforme el dimetro de la membrana empleada. El dis- Utilizar los mismos volmenes de medio empleados en la
positivo de filtracin y la membrana son esterilizados por prueba de validacin. Incubar los medios por lo menos por
proceso adecuado. El dispositivo presenta configuracin 14 das.
tal que la solucin a ser examinada pueda ser introducida y
filtrada bajo condiciones aspticas. El dispositivo de filtra- Aceites y soluciones oleosas
cin debe posibilitar, adems, la eliminacin asptica de la
membrana para su transferencia al medio de cultivo o ser Utilizar, para cada medio de cultivo la cantidad de mues-
adecuado para proceder a la incubacin despus de adicin tra especificada en las Tablas 2 y 3. Aceites y soluciones
del medio de cultivo al propio dispositivo. El tipo de fluido oleosas de baja viscosidad pueden ser filtradas sin diluicin
utilizado en el lavado de la membrana depende de la natu- a travs de la membrana seca. Aceites viscosos deben ser
raleza del producto, siendo especificado en la monografa diluidos en solvente estril adecuado como, por ejemplo,
individual, cuando sea el caso. miristato de isopropilo, siempre que demostrado no poseer
actividad antimicrobiana en las condiciones de la prueba.
Controles negativos, o blancos deben ser incluidos para los Dejar el aceite penetrar en la membrana, filtrar utilizando
fluidos y solventes utilizados, para los cuales no se debe vaco gradualmente. Lavar la membrana con, como mni-
observar crecimiento microbiano. Se debe verificar, ade- mo, tres porciones del Fluido III. Proseguir conforme des-
ms, si los fluidos utilizados no presentan actividad anti- crito para Lquidos miscibles en vehculos acuosos.
microbiana en las condiciones de la prueba.
Utilizar, para cada medio de cultivo, cantidad de muestra Expeler el contenido de cada jeringa directamente sobre
especificada en las Tablas 2 y 3. Pomadas de base oleosa y la(s) membrana(s) o en frascos separados y despus filtrar.
emulsiones del tipo agua en aceite pueden ser diluidas para Proseguir conforme descrito para Lquidos miscibles en ve-
1% en solvente adecuado (miristato de isopropilo, u otro) hculos acuosos.
como descrito en el tem anterior, calentando, si necesario,
a 40 C (en casos excepcionales, calentar como mximo Dispositivos estriles
hasta 44 C). Filtrar, lo ms rpidamente posible, y pro-
seguir conforme descrito en Aceites y soluciones oleosas. Pasar aspticamente un volumen de Fluido II no inferior a
En el caso de utilizacin del miristato de isopropilo como 10% del volumen de cada unidad del total de dispositivos a
diluyente, siempre que demostrado no poseer actividad an- ser probados conforme establecido en las Tablas 2 y 3. Re-
timicrobiana en las condiciones de la prueba, este debe ser colectar el fluido en un recipiente adecuado estril y proce-
esterilizado antes del uso, por filtracin en membrana, y su der conforme indicado para lquidos miscibles en vehculos
extracto acuoso debe presentar pH no inferior a 6,5. acuosos o soluciones acuosas de aceites y soluciones oleo-
sas, conforme el caso. En el caso de las jeringas vacas, est-
Slidos solubles (no antibiticos) riles, extraer el diluyente estril del recipiente a travs de la
aguja estril, si est acoplada, o a travs de una aguja estril
Utilizar, para cada medio de cultivo, cantidad de muestra acoplada para proceder al ensayo, y expulsar el contenido en
especificada en las Tablas 2 y 3. Disolver el producto en un recipiente estril. Proceder como indicado anteriormente.
fluido adecuado, como el Fluido I, y proseguir conforme
descrito para Lquidos miscibles en vehculos acuosos. MTODO DE INOCULACIN DIRECTA EN MEDIO
DE CULTIVO
5
Slidos para preparaciones inyectables (no antibiticos)
Transferir, directa y aspticamente, para los medios de cul-
Reconstituir el producto como descrito en el rtulo y proce- tivo la cantidad del producto especificada en las Tablas 2 y
der conforme descrito para Lquidos miscibles en vehculos 3, de tal forma que el volumen del producto no sea mayor
acuosos, o Aceites y soluciones oleosas, dependiendo del que 10% del volumen del medio de cultivo, a menos que
caso. Si necesario, puede ser utilizado un exceso de diluyen- especificado de manera diferente en la monografa indivi-
te para auxiliar en la reconstitucin y filtracin del producto. dual o en esa seccin. Si la muestra presenta actividad anti-
microbiana, realizar la prueba despus de la neutralizacin
Antibiticos slidos para preparaciones inyectables de la actividad con una sustancia neutralizante adecuada o
por diluicin en cantidad suficiente de medio de cultivo.
Para embalajes con menos de 5 g retirar, aspticamente, de Cuando sea necesario el uso de grandes volmenes del pro-
cada uno de los 20 frascos recomendados, cerca de 0,3 g ducto, puede trabajarse con medio de cultivo concentrado,
de muestra, disolver en 200 ml de Fluido I y mezclar. Al- preparado teniendo en cuenta la diluicin subsiguiente a la
ternativamente, reconstituir el producto conforme descrito adicin del producto. Si el recipiente sirve, el medio con-
en el rtulo, transferir el equivalente, en lquido, a 0,3 g de centrado puede ser adicionado directamente a la muestra.
muestra y diluir para 200 ml con Fluido I. Para embalajes
con 5 g o ms transferir, aspticamente, de cada seis reci- Lquidos
pientes, 1 g de muestra para frasco adecuado, disolver en
200 ml de Fluido I y mezclar. Transferir el volumen indicado de cada muestra conforme
Tabla 3 para tubos conteniendo los medios fluidos de tio-
Alternativamente, reconstituir los seis frascos del producto glicolato y caldo de casena-soja, utilizando pipeta estril o
como recomendado por el fabricante, transferir cantidad de jeringa y aguja estriles. Mezclar el lquido con el medio,
lquido, equivalente a 1 g de la muestra, para frasco ade- sin airear excesivamente. Incubar en las condiciones espe-
cuado, diluir para 200 ml con Fluido I y mezclar. Proseguir cificadas para cada medio durante 14 das.
conforme descrito para Lquidos miscibles en vehculos
acuosos. Lquidos oleosos
frascos de medio de cultivo conteniendo aceite, diariamen- frascos nuevos de los mismos medios 14 das despus del
te, durante todo el perodo de incubacin. Los frascos con- inicio de la incubacin. Incubar los frascos originales y los
teniendo Medio lquido de tioglicolato u otro medio similar frascos nuevos por un perodo adicional de no menos que 4
deben ser agitados para no perjudicar las condiciones de das. Si, al final del perodo de incubacin, no hubiere evi-
anaerobiosis. dencias de crecimiento microbiano, la muestra en examen
cumple con el requisito de esterilidad. Si fuese evidencia-
Slidos do crecimiento de microorganismos, la muestra no cumple
con el requisito de esterilidad, a no ser que se evidencie
Transferir la cantidad de muestra especificada en las Ta- falla durante la ejecucin de la prueba como, por ejemplo,
blas 2 y 3 o preparar una solucin o suspensin del produc- contaminacin no relacionada con el producto en anlisis.
to adicionando volumen no superior a 20 ml de diluyente
estril al recipiente. Transferir el material as obtenido para La prueba de esterilidad puede ser considerada invlida si
200 ml de Medio fluido de tioglicolato. Del mismo modo, una o ms de las siguientes condiciones fueren observadas.
transferir la misma cantidad del material para 200 ml de
Caldo de casena-soja y mezclar. Proseguir conforme des- a) los datos de monitoreo microbiolgico del rea de rea-
crito para Lquidos. lizacin de la prueba demuestran falla;
b) una revisin de los procedimientos analticos utilizados
Catgut y otras suturas quirrgicas durante la prueba revela falla;
c) crecimiento microbiano es observado en los controles
Para cada medio, utilizar la cantidad de muestra especifi- negativos;
cada en las Tablas 2 y 3. Abrir el embalaje aspticamente d) despus de la identificacin del microorganismo(s) ais-
y retirar tres porciones del hilo para cada medio de cultivo. lado(s) a partir de la prueba, el crecimiento de esa es-
Esas porciones deben ser retiradas en el inicio, en el medio pecie(s) puede ser atribuido, inequvocamente, a fallas
5
y en el final y tener 30 cm de largo. Cubrir cada parte del relacionadas al material utilizado y/o a tcnicas utiliza-
hilo con volumen suficiente de los medios (20 ml a 150 das en la ejecucin de la prueba de esterilidad.
ml).
Si fuese considerada invlida, la prueba de esterilidad debe
Algodn purificado, gaza, vendaje y material relacionado ser repetida con el mismo nmero de unidades de la prue-
ba inicial. Si, despus de la repeticin de la prueba, no es
De cada embalaje de algodn, gaza en rollo o gaza en ven- observado crecimiento microbiano, la muestra cumple con
daje a ser analizado, retirar, con instrumentos estriles, dos el requisito de esterilidad. Si es observado crecimiento mi-
porciones de 0,1 g a 0,5 g de las partes ms internas de crobiano despus de la repeticin de la prueba, la muestra
la muestra. Para materiales en embalaje individual, tales bajo examen no cumple con el requisito de esterilidad.
como copo de gaza, retirar dos porciones individuales de
0,25 g a 0,5 g, o dos unidades totales, en el caso de unida- Tcnicas microbiolgicas/bioqumicas convencionales son
des pequeas (ej.: vendaje menores que 25 mm a 75 mm). generalmente satisfactorias para identificacin de los mi-
Transferir una porcin para tubo con 40 ml de Medio fluido croorganismos recuperados en una prueba de esterilidad.
de tioglicolato y otra para tubos con 40 ml de Caldo de En el caso de considerarse solamente que, despus de la
casena-soja. Proseguir conforme descrito para Lquidos. determinacin de la identidad de los microorganismos
aislados en la prueba, el crecimiento de esa(s) especie(s)
Aparatos parenterales pueda ser atribuido inequvocamente a fallas con respecto
al material y/o tcnica utilizados en el procedimiento del
Para aparatos de formas y dimensiones que permitan su ensayo de esterilidad, puede ser necesario emplear tcni-
inmersin en volumen de medio que no rebase 1000 ml, cas ms sensibles para demostrar que el microorganismo
hacer su inmersin utilizando las cantidades especificadas aislado en el producto es idntico al aislado en materiales
en las Tablas 2 y 3 y proceder conforme descrito en L- o en el ambiente. Mientras las tcnicas de identificacin
quidos. Para aparatos muy grandes, hacer la inmersin de microbiolgicas / bioqumicas de rutina pueden demostrar
partes que entren en contacto con el paciente en volumen que dos aislados no son idnticos, esos mtodos pueden no
de medio suficiente para la inmersin de todas las partes. ser suficientemente sensibles o confiables para suministrar
Para catteres cuyos lmenes, interno y externo, deban ser evidencia inequvoca de que dos aislados son provenien-
estriles, pasar el medio dentro del lumen o llenar el lumen tes de una misma fuente. Mtodos moleculares pueden ser
con el medio y promover la inmersin del aparato entero. empleados para determinar si dos microorganismos perte-
necen a un mismo clon y poseen origen en comn.
OBSERVACIONES E INTERPRETACIN DE LOS
RESULTADOS APLICACIN DE LA PRUEBA DE ESTERILIDAD A
PREPARACIONES PARENTERALES, OFTLMICAS
Durante el perodo de incubacin y hasta su trmino, exa- Y OTRAS PREPARACIONES NO-INYECTABLES
minar los medios cuanto a las evidencias macroscpicas CON REQUERIMENTO PARA ESTERILIDAD
de crecimiento microbiano. Si la muestra bajo examen
provoca turbacin de los medios de cultivo, para impedir Al emplear la tcnica de filtracin por membrana, utilizar,
la observacin del crecimiento microbiano, transferir por- siempre que posible, todo el contenido del recipiente, pero
ciones adecuadas de cada frasco (no menos que 1 ml) para no menos que la cantidad indicada en las Tablas 2 y 3, di-
luyendo, cuando necesario, para aproximadamente 100 ml estndar de la Organizacin Mundial de la Salud, poseen
con una solucin estril adecuada, como el Fluido I. valor legal idntico.
Al emplear la tcnica de inoculacin directa, utilizar las Se recomienda que sean preparados y empleados estnda-
cantidades indicadas en las Tablas 2 y 3, a menos que de res de trabajo (secundarios); todava, es imprescindible que
otra forma autorizada y justificada. Las pruebas para bac- la potencia haya sido determinada por nmero adecuado de
terias y hongos sean realizados con una misma unidad de ensayos comparativos con relacin a un estndar primario
la muestra bajo examen. Cuando el volumen o la cantidad o farmacopeico, validados por anlisis estadstica apropia-
en un nico recipiente es insuficiente para la realizacin da y que los datos y resultados sean archivados a disposi-
de la prueba, los contenidos de dos o ms recipientes son cin de la fiscalizacin competente por plazo idntico al de
utilizados para inocular los diferentes medios. la validez de los productos ensayados.
APLICACIN DE LA PRUEBA DE ESTERILIDAD A Para el ensayo de lotes de sustancias antibiticas para las
PRODUCTOS FARMACUTICOS RADIOACTIVOS cuales existan Preparaciones Estndar nacionales, refren-
dadas por organizaciones internacionales, es obligatorio el
Debido al rpido decaimiento radioactivo, no es practica- uso de esas preparaciones.
ble atrasar la liberacin de algunos productos farmacuti-
cos radioactivos por cuenta de la prueba de esterilidad. SOLUCIONES
En tales casos, los resultados de las pruebas de esterilidad Solucin 1 (tampn fosfato de potasio a 1%, estril. pH
dan apenas evidencia retrospectiva confirmatoria para la 6,0) Disolver 2,0 g de fosfato de potasio dibsico y 8 g
garanta de la esterilidad, y por tanto dependen de los m- de fosfato de potasio monobsico en agua purificada sufi-
todos iniciales establecidos en la fabricacin y en los pro- ciente para alcanzar 1000 ml. Esterilizar la solucin por 20
5
cedimientos de validacin / certificacin. minutos en autoclave a 121 C y, si necesario, ajustar el
pH para 5,9 6,1 con cido fosfrico 6 M o hidrxido de
5.5.3.3 ENSAYO MICROBIOLGICO DE potasio 10 M.
ANTIBITICOS
Solucin 2 (tampn fosfato de potasio 0,1 M, estril, pH
Se determina la potencia o actividad de un producto que 8,0) Disolver 16,73 g de fosfato de potasio dibsico y
contiene antibitico comparando la dosis que inhibe el cre- 0,523 g de fosfato de potasio monobsico en agua purifica-
cimiento de un microorganismo susceptible con relacin a da suficiente para alcanzar 1000 ml. Esterilizar la solucin
la dosis de una sustancia estndar o preparacin biolgica por 20 minutos en autoclave a 121 C y, si necesario, ajus-
de referencia del antibitico que produce inhibicin similar. tar el pH para 7,9 8,1 con cido fosfrico 6 M o hidrxido
de potasio 10 M.
UNIDAD INTERNACIONAL Y PREPARACIN
ESTNDAR Solucin 3 (tampn fosfato de potasio 0,1 M, estril, pH
4,5) Disolver 13,6 g de fosfato de potasio monobsico en
Unidad Internacional es la actividad especfica contenida agua purificada suficiente para alcanzar 1000 ml. Esterili-
en una cantidad (masa) de Estndar Biolgico Internacio- zar la solucin por 20 minutos en autoclave a 121 C y, si
nal o Preparacin de Referencia Biolgica Internacional. necesario, ajustar el pH para 4,4 4,5 con cido fosfrico
La cantidad equivalente de unidades para uso internacional 6 M o hidrxido de potasio 10 M
es establecida, siempre que necesario, por la Organizacin
Mundial de la Salud. Solucin 4 (tampn fosfato de potasio a 10%, estril,
pH 6,0) Disolver 20,0 g de fosfato de potasio dibsico y
Sustancias Qumicas de Referencia Internacional no presen- 80,0 g de fosfato de potasio monobsico en agua purificada
tan unidades de actividad biolgica definidas. Cuando son suficiente para alcanzar 1000 ml. Esterilizar la solucin por
necesarios ensayos biolgicos, la potencia de esos productos 20 minutos en autoclave a 121 C y, si necesario, ajustar
es en trminos de masa equivalente a la de la sustancia pura. el pH 5,9 6,1 con cido fosfrico 6 M o hidrxido de
potasio 10 M.
El nmero de unidades, o la masa equivalente de la sustan-
cia pura, en microgramos, contenidos en 1 mg de sustancia Solucin 5 (tampn fosfato de potasio 0,2 M, estril, pH
antibitica, est indicado en la monografa de cada uno de 10,5) Disolver 35,0 g de fosfato de potasio dibsico y
los productos inscritos en la Farmacopea. aadir 2,0 ml de hidrxido de potasio 10 M en agua purifi-
cada suficiente para alcanzar 1000 ml. Esterilizar la solu-
Para los ensayos microbiolgicos registrados en la Farma- cin por 20 minutos en autoclave a 121 C y, si necesario,
copea, Preparaciones Estndar (Estndares Primarios) son ajustar el pH para 10,4 10,6 con cido fosfrico 6 M o
los Estndares Internacionales y Preparaciones de Referen- hidrxido de potasio 10 M
cia establecidos por la Organizacin Mundial de la Salud y
por la Farmacopea Europea o los Estndares y Preparacio- Solucin 6 (cido clorhdrico metanlico 0,1 M) Diluir
nes de Referencia brasileos. Otras preparaciones adecua- 10,0 ml de cido clorhdrico 1,0 M en metanol suficiente
das, de uso internacional corriente, en las cuales la poten- para alcanzar 1000 ml.
cia haya sido determinada con relacin a las preparaciones
Solucin 7 (solucin de alcohol isoproplico a 80%) Medio de cultivo n 9 Disolver 17,0 g de casena de
Diluir 800 ml de alcohol isoproplico en agua purificada digestin pancretica, 3,0 g de soja de digestin papanica,
suficiente para alcanzar 1000 ml. 5,0 g de cloruro de sodio, 2,5 g de fosfato de potasio dib-
sico, 2,5 g de dextrosa y 20,0 g de agar en agua purificada
Solucin 8 (tampn fosfato de potasio 0,1 M, estril, pH suficiente para alcanzar 1000 ml. El pH, despus de esteri-
7,0) Disolver 13,6 g de fosfato de potasio dibsico y 4,0 lizacin, deber ser 7,3.
g de fosfato de potasio monobsico en agua purificada su-
ficiente para alcanzar 1000 ml. Esterilizar la solucin por Medio de cultivo n 10 Usar el medio de cultivo n 9,
20 minutos en autoclave a 121 C y, si necesario, ajustar el adicionando, sin embargo, en lugar de 20,0 g, 12,0 g de
pH para 6,8 7,2 con cido fosfrico 6 M o hidrxido de agar y 10,0 ml de polisorbato 80 (ese ltimo adicionado
potasio 10 M. despus de calentar el medio para disolver el agar, diluyen-
do inmediatamente, con agua para alcanzar 1000 ml). El
MEDIOS DE CULTIVO pH, despus de esterilizacin, deber ser 7,3.
Pueden ser empleados medios de cultivo deshidratado, dis- Medio de cultivo n 11 Usar el medio de cultivo n. 1,
ponible en el comercio que, al ser reconstituidos con agua pero el pH, despus de esterilizacin, deber ser ajustado
purificada, conforme las especificaciones del fabricante, po- para 8,0.
sean la misma composicin que el medio producido con los
ingredientes individualmente indicados para su obtencin. Medio de cultivo n 12 Preparar como el medio de cul-
tivo n 1, adicionando, sin embargo, 300 mg de sulfato de
Medio de cultivo n 1 Disolver 6,0 g de peptona seca, manganeso hidratado (MnSO4.H2O) para cada 1000 ml de
4,0 g de casena de digestin pancretica. 3,0 g de extracto medio.
de levadura, 1,0 g de dextrosa y 15,0 g de agar en agua
5
purificada suficiente para alcanzar 1000 ml. El pH, despus Medio de cultivo n 13 Disolver 10,0 g de peptona seca
de esterilizacin, deber ser 6,6. y 20,0 g de dextrosa en agua purificada suficiente para al-
canzar 1000 ml. El pH, despus de esterilizacin, deber
Medio de cultivo n 2 Disolver 6,0 g de peptona seca, ser 5,6.
3,0 g de extracto de levadura, 1,5 g de extracto de carne y
15,0 g de agar en agua purificada suficiente para alcanzar Medio de cultivo n 14 Disolver 10,0 g de glicerol, l0,6
1000 ml. El pH, despus de esterilizacin, deber ser 6,6. g de peptona seca, 10,6 g de extracto de carne y 3,0 g de
cloruro de sodio en agua purificada suficiente para alcanzar
Medio de cultivo n 3 Disolver 5,0 g de peptona seca, 1000 ml. El pH, despus de esterilizacin, deber ser 7,0.
1,5 g de extracto de levadura, 1,5 g de extracto de carne,
2,5 g de cloruro de sodio, 1,0 g de dextrosa, 3,68 g de fos- Medio de cultivo n 15 Preparar como el medio de cul-
fato de potasio dibsico y 1,32 g de fosfato de potasio mo- tivo n 14, adicionando, sin embargo, 17,0 g de agar para
nobsico, en agua purificada suficiente para alcanzar 1000 cada 1000 ml de medio.
ml. El pH, despus de esterilizacin, deber ser 7,0.
Medio de cultivo n 16 Disolver 15,0 g de casena de
Medio de cultivo n 4 Disolver 6,0 g de peptona seca, digestin pancretica, 5,0 g de soja de digestin papanica,
3,0 g de extracto de levadura, 1,5 g de extracto de carne, 5 g de cloruro de sodio y 15,0 g de agar en agua purificada
1,0 g de D-glucosa y 15,0 g de agar en agua purificada suficiente para alcanzar 1000 ml. El pH, despus de esteri-
suficiente para alcanzar 1000 ml. El pH, despus de esteri- lizacin, deber ser 7,3.
lizacin, deber ser 6,6.
Medio de cultivo n 17 Disolver 17,0 g de casena de
Medio de cultivo n 5 Usar el medio de cultivo n 2, sin digestin pancretica, 3,0 g de peptona de soja, 2,5 g de
embargo, el pH, despus de esterilizacin, deber ser 7,8. dextrosa. 5,0 g de cloruro de sodio y 2,5 g de fosfato de
potasio dibsico en agua purificada suficiente para alcanzar
Medio de cultivo n 6 Disolver 40,0 g de dextrosa y 10,0 1000 ml. El pH, despus de esterilizacin, deber ser 7,3.
g de peptona seca en agua purificada suficiente para alcanzar
1000 ml. El pH, despus de esterilizacin, deber ser 5,6. Medio de cultivo n 18 Usar el medio de cultivo n 11,
pero, despus de calentar la solucin para disolver los in-
Medio de cultivo n 7 Usar el medio de cultivo n 1, gredientes, aadir 20,0 ml de polisorbato 80. El pH, des-
esterilizado y enfriado a 50 C. Preparar solucin acuosa pus de esterilizacin deber ser 8,0.
conteniendo 10 mg de neomicina por ml y esterilizar por
filtracin en membrana con porosidad de 0,22 m. Aadir, Medio de cultivo n 19 Disolver 9,4 g de peptona seca,
aspticamente, solucin estril de sulfato de neomicina, 4,7 g de extracto de levadura, 2,4 g de extracto de carne,
para obtener concentracin final con potencia de 100 g de 15,0 g de cloruro de sodio, 10,0 g de dextrosa y 23,5 g agar
neomicina por ml de medio. en agua purificada suficiente para alcanzar 1000 ml. El pH,
despus de esterilizacin, deber ser 6,1.
Medio de cultivo n 8 Usar el medio de cultivo n 2,
sin embargo, el pH, despus de esterilizacin, deber ser Medio de cultivo n 20 Disolver 40,0 g de dextrosa, 10,0
ajustado para 5,8 6,0. g de peptona seca, 15,0 g de agar y 0,05 g de cloranfenicol
(en potencia) en agua purificada suficiente para alcanzar transmitancia de 25% en el largo de onda de 580 nm, em-
1000 ml. El pH, despus de esterilizacin, deber ser 5,6. pleando espectrofotmetro adecuado y tubos de ensayo con
13 mm de dimetro como cuba de absorcin. Determinar la
Medio de cultivo n 21 Usar el medio de cultivo n 20, cantidad de suspensin a ser adicionada cada 100 ml de agar
esterilizado y enfriado a 50 C. Aadir, aspticamente, 2,0 o caldo nutriente para producir zonas de inhibicin claras y
ml de solucin estril de cicloheximida para cada 100 ml definidas o relacin satisfactoria dosis- respuesta en el m-
de agar fundido. Preparar solucin conteniendo 10,0 mg de todo turbidimtrico. Las suspensiones de los microorganis-
cicloheximida por ml, en agua purificada, y esterilizar, por mos sometidos al procedimiento 1 pueden ser estocadas a
filtracin en membrana con porosidad de 0,22 m. una temperatura de 4 C, respectivamente, por los siguientes
perodos: 1 semana, 2 semanas, 2 semanas, 2 semanas, 2
Medio de cultivo n 22 Disolver 15,0 g de peptona seca, semanas, 6 meses, 1 semana, 2 semanas y 2 semanas.
5,0 g de harina de soja de digestin papanica, 4,0 g de
cloruro de sodio, 0,2 g de sulfito de sodio, 0,7 g de L-cis- Micrococcus luteus ATCC 14452. Efectuar como indicado
tina, 5,5 g de dextrosa y 15,0 g de agar, en agua purificada en el Procedimiento 1. Emplear, no obstante, en el tubo con
suficiente para alcanzar 1000 ml. El pH, despus de esteri- medio inclinado y en el frasco de Roux, medio de cultivo
lizacin, deber ser 7,0. n 7, incubando el frasco por perodo de 48 horas. La sus-
pensin puede ser estocada por dos semanas, a una tempe-
PREPARACIN DEL INCULO ratura no superior a 4 C.
5
Kocuria rhizophila (ATCC 9341) cultivo n 12, cuyo perodo de incubacin es de 5 das. En
Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228) la estandarizacin de la suspensin, proceder a choque tr-
Saccharomyces cerevisiae (ATCC 9763) mico y estandarizar la suspensin de la siguiente manera:
Bordetella bronchiseptica (ATCC 4617) centrifugar y decantar el lquido sobrenadante. Resuspen-
Bacilius cereus var. mycoides (ATCC 11778) der el sedimento con 50 a 70 ml de solucin fisiolgica es-
Bacillus subtilis (ATCC 6633) tril y calentar la suspensin por 30 minutos a 70 C. Eje-
Klebsiella pneumoniae (ATCC 10031) cutar pruebas en placas, para asegurar la viabilidad de las
Escherichia coli (ATCC 10536) esporas y determinar la cantidad que deber ser adicionada
Enterococcus hirae (ATCC 10541) cada 100 ml de medio, para obtener zonas de inhibicin
Micrococcus luteus (ATCC 10240) adecuadas. La suspensin puede ser estocada, por 6 meses,
Microsporum gypseum (ATCC 14683) en temperatura no superior a 4 C.
Saccharomyces cerevisiae (ATCC 2601)
Micrococcus luteus (ATCC 14452) Procedimiento 3 Bacillus cereus.
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 25619)
Mycobacterium smegmatis (ATCC 607) Efectuar como indicado en el Procedimiento 1. No obstan-
te, incubar el tubo con el microorganismo por una semana.
Con la finalidad de indicacin, fueron listados los microor- En la estandarizacin de la suspensin, proceder a choque
ganismos disponibles en la ATCC. Los mismos microor- trmico y estandarizar la suspensin de la siguiente mane-
ganismos pueden, tambin, ser obtenidos de otras fuentes: ra: calentar la suspensin por 30 minutos, a 80 C. Lavar
INCQS, CIP, NBRC, NCIMB, NCPF, NCTC, NCYC, IMI tres veces la suspensin de esporas con 20 a 25 ml de agua
y IP. La correspondencia entre los microorganismos y las estril. Resuspender los microorganismos en 50 a 70 ml de
direcciones de las entidades que los proveen se encuentran agua estril y promover nuevo choque trmico por 30 mi-
indicadas en Microorganismos empleados en pruebas y en- nutos a 70 C. Ejecutar pruebas en placas para asegurarse
sayos (5.5.3.5). de la viabilidad de las esporas y determinar la cantidad de
los que debern ser aadidos cada 100 ml de agar, para ob-
Procedimiento 1 Staphylococcus aureus, Micrococcus tener zonas de inhibicin adecuadas. La suspensin puede
luteus, Kocuria rhizophila, Staphylococcus epidermidis, ser estocada, por 6 meses, a una temperatura no superior
Bordetella bronchiseptica, Bacillus subtilis, Klebsiella a 4 C.
pneumoniae, Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa.
Procedimiento 4 Microsporum gypseum.
Preparacin de la suspensin Transferir el microorganis-
mo de un cultivo stock para tubos que contengan 10 ml de Incubar el microorganismo, por 6 a 8 semanas a 25 C, en
medio de cultivo n 1 inclinado. Incubar el tubo a 32 35 frascos de Matraz de 3 litros, conteniendo 200 ml de medio
C, por 24 horas. Despus de incubacin, lavar el creci- de cultivo n 6. Verificar el crecimiento por esporulacin.
miento del microorganismo con 50 ml de solucin fisiol- Cuando a esporulacin sea 80% o ms, recolectar los co-
gica estril. nidiforos de la capa micelial con esptula estril u otro
instrumento adecuado. Los conidiforos estarn en la parte
Estandarizacin de la suspensin Diluir la suspensin superior de la capa fluctuante. Mantener los conidiforos
preparada, con solucin fisiolgica estril, para obtener la en 50 ml de solucin fisiolgica. Determinar, experimen-
Mantener el microorganismo en tubos conteniendo 10 ml Proceder conforme el Mtodo 1. Desecar, sin embargo la
de medio de cultivo n 19 inclinado. Incubar los tubos a muestra a 40 C, bajo presin de 0,67 kPa o menos, durante
32 35 C, durante 24 horas. Inocular 100 ml de caldo nu- dos horas.
triente medio de cultivo n 13 e incubar, por 16 a 18 ho-
ras, a 37 C. Estandarizar la suspensin conforme descrito Mtodo 5
en el Procedimiento 1. La suspensin puede ser estocada,
por 4 semanas, a una temperatura no superior a 4 C. Proceder conforme el Mtodo 1. Desecar, sin embargo la
muestra a 100 C, bajo presin de 0,67 kPa o menos, du-
5
Procedimiento 7 Saccharomyces cerevisiae. (ATCC rante cuatro horas.
9763 y ATCC 2601).
Mtodo 6
Seguir lo indicado en el Procedimiento 1. Incubar, sin em-
bargo, el tubo inclinado con el medio de cultivo n 19, a Proceder conforme el Mtodo 1. Desecar, sin embargo la
30 C, el ltimo por perodo de 48 horas. La suspensin muestra a 40 C, bajo presin de 0,67 kPa o menos, durante
puede ser estocada, por 4 semanas, a una temperatura no tres horas.
superior a 4 C.
Mtodo 7
Procedimiento 8 Mycobacterium smegmatis.
Proceder conforme el Mtodo 1. Desecar, sin embargo la
Mantener el microorganismo en tubos con medio inclinado muestra a 25 C, bajo presin de 0,67 kPa o menos, durante
conteniendo 10 ml del medio de cultivo n 16 y efectuar tres horas.
repiques semanalmente. Incubar el tubo a 37 C, por 48
horas. Usando 3 ml de solucin fisiolgica estril, transfe- Mtodo 8
rir las cultivos que crecern en el agar inclinado para frasco
matraz de 500 ml, conteniendo 100 ml de medio de culti- La sustancia antibitica no es sometida a la desecacin.
vo n 14 y 50 g de perlas de vidrio. Agitar el cultivo por PROCEDIMIENTO
rotacin a una velocidad de 130 ciclos por minuto, en un
radio de 3,5 cm y a una temperatura de 27 C, por perodo Todo material debe ser adecuado para el uso pretendido y
de cinco das. Determinar la cantidad de suspensin a ser debe ser minuciosamente limpiado, despus de cada uti-
adicionada cada 100 ml de agar por medio de ensayo en lizacin, para retirar cualquier vestigio de antibitico. El
placas. La suspensin puede ser estocada, por dos sema- material debe permanecer cubierto cuando no est en uso.
nas, a una temperatura no superior a 4 C. Todos los elementos de vidrio utilizados en contacto con el
microorganismo deben ser esterilizados en estufa, en tem-
Mtodo 1 peratura entre 200 C y 220 C por 2 horas. En la diluicin
de la solucin estndar y muestra emplear balones volum-
Transferir quantidade suficiente de padro para pesa-fil- tricos, pipetas o equipos cuidadosamente calibrados.
tro tarado provido de tampa esmerilhada. Pesar o frasco
e coloc-lo em estufa sob presso reduzida, inclinando a 5.5.3.3.1 Ensayo microbiolgico por difusin en
tampa sobre a boca do frasco para assegurar que perma- agar
nea aberto durante a dessecao. Dessecar a 60 C, sob
presso de 0,67 kPa ou menos, durante trs horas. Conclu- PROCEDIMIENTO
do o processo, introduzir ar seco na estufa, submetendo-o
a agente dessecante como cido sulfrico ou silica-gel. Re- Para cada antibitico relacionado en la Tabla 1, verificar
por a tampa e colocar o pesa-filtro em dessecador contendo el medio de cultivo (conforme la relacin de los medios de
agente dessecante como pentxido de fsforo ou slica-gel. cultivo), la cantidad de medio a ser usada en la capa base
Deixar esfriar temperatura ambiente e pesar, calculando y en la capa inoculada y el microorganismo de ensayo. El
a perda porcentual de massa do padro.
volumen de inculo a ser adicionado cada 100 ml de medio d) concentracin de la solucin de trabajo, expresada en
de cultivo debe ser determinado experimentalmente. peso, o Unidades Internacionales por ml de solucin;
e) plazo de validez de la solucin estndar de trabajo bajo
No obstante, como referencia inicial, se sugiere cantidad refrigeracin;
de inculo a ser adicionada por 100 ml de medio. f) solucin empleada para diluicin de la solucin de tra-
bajo, por ocasin de la preparacin de la curva estn-
Preparar la capa base por medio de la adicin de cantidad dar, conforme Soluciones;
apropiada de agar fundido en las placas de Petri las cuales g) bandas de concentracin sugeridas, en peso o Unidades
deben ser, especialmente seleccionadas, tener fondo plano, Internacionales por ml, dentro de las cuales pueden ser
poseer dimensiones de 20 x 100 mm y tapa de material encontradas las concentraciones adecuadas para la cur-
apropiado. Distribuir el agar uniformemente en las placas, va estndar.
que deben ser colocadas en superficie nivelada para que la
capa de medio tenga profundidad uniforme. Colocar la tapa Procedimiento para delineamiento rectas paralelas (3 x 3
de cada placa al lado de esa; se fuese utilizada tapa no po- o 2 x 2)
rosa, dejarla levemente entreabierta para evitar la acumu-
lacin de humedad condensada a partir de la capa de agar Emplear, en el ensayo, por lo menos seis placas de Petri.
caliente. Despus del endurecimiento del agar, tapar las Disponer las soluciones del estndar y muestra, en cada
placas. Para preparar la capa inoculada superficie, aadir placa, con 3 concentraciones para ensayo 3 x 3 (baja, media
el volumen de inculo determinado para la cantidad apro- y alta) o 2 concentraciones para ensayo 2 x 2 (baja y alta).
piada de medio de cultivo que haya sido fundido y enfriado Las soluciones deben ser distribuidas de tal forma que las
entre 46 C y 48 C. Agitar el frasco, por rotacin para ob- soluciones de la preparacin estndar y muestra estn alter-
tener suspensin homognea y aadir la cantidad indicada nadas en la capa inoculada (concentracin alta y baja) para
del medio inoculado en cada placa de Petri, que contiene la evitar la sobreposicin de los halos de inhibicin.
5
capa base no inoculada. Esparcir uniformemente la capa,
tapar las placas y permitir su endurecimiento sobre super- Procedimiento para delineamiento 5 x 1
ficie plana. Despus del endurecimiento del medio, colocar
seis cilindros de acero inoxidable, con dimetro externo de Para la curva estndar, utilizar un total de 12 placas, 3 para
8 mm 0,1 mm, dimetro interno de 6 mm 0,1 mm y cada una de las soluciones del estndar (P1, P2, P4, P5), ex-
largo de 10 mm 0,1 mm, sobre la superficie del agar ino- cepto para la concentracin media de la curva (P3) que es
culado, de manera que formen entre s ngulo de 60 y con incluida en todas las placas. En cada conjunto de 3 pla-
radio de 2,8 cm. Tambin, pueden ser utilizados cilindros cas, utilizar 3 cilindros para la concentracin media (P3)
confeccionados en vidrio, porcelana o aluminio y esterili- y alternar 3 cilindros para la concentracin baja (P1) y as
zados en las condiciones ya descritas. En lugar de los ci- sucesivamente con las dems soluciones del estndar. De
lindros, pueden ser perforados, en el medio, con perforador esa manera, se obtienen 36 halos de inhibicin para la con-
estril, pozos de 5 a 8 mm de dimetro. Pueden, adems, centracin (P3) y 9 halos de inhibicin para cada una de las
ser usados discos de papel, confeccionados con papel de otras cuatro concentraciones de la curva.
calidad apropiada o moldes de acero inoxidable. Cuando
son usados discos de papel, estos deben ser estriles. Para cada muestra, emplear 3 placas, donde sern coloca-
dos 3 cilindros para la concentracin media del estndar
Preparacin de la solucin estndar de trabajo, de la mues- (P3) y 3 con la solucin de la muestra preparada en la mis-
tra y de la curva estndar ma concentracin del estndar (A3).
La preparacin de las muestras de los antibiticos est in- Aplicar 0,2 ml de las soluciones en los cilindros o en los
dicada en la respectiva monografa. moldes de acero inoxidable por medio de pipeta u otro ins-
trumento calibrado. Cuando es usado el sistema de pozos,
Las concentraciones del antibitico utilizadas en el ensayo el volumen de lquido aplicado debe ser suficiente para lle-
deben estar en progresin geomtrica; por ejemplo, por la narlos completamente.
preparacin de series de diluicin en la razn 2:1 u otra de-
terminada experimentalmente desde que sea comprobada Despus de realizar los procedimientos adecuados para el
la relacin lineal entre el logaritmo de la concentracin del delineamiento escogido, incubar las placas a la tempera-
antibitico y el dimetro del halo de inhibicin. tura indicada, cuya variacin no deber exceder 0,5 C,
durante un perodo de 16 a 18 horas. En seguida, medir el
En la Tabla 2 est indicada para cada antibitico, la re- dimetro de los halos de inhibicin empleando dispositivo
paracin de la solucin estndar de trabajo y de la curva adecuado para medida, como calibrador, o proyector pti-
estndar, comprendiendo: co que tenga precisin de 0,1 mm o menos.
a) condiciones de desecacin, conforme descrito en el Para algunos microorganismos, el procedimiento puede ser
tem Desecacin de sustancias antibiticas (5.5.3.3); mejorado si las placas preparadas permanecen a tempera-
b) solvente inicial para disolucin del antibitico, caso sea tura ambiente por perodo de 30 minutos a 2 horas antes de
necesario, y hasta cual concentracin es usado; la incubacin, perodo en que ocurre la difusin del anti-
c) solucin para diluicin hasta la concentracin de traba- bitico para el medio.
jo, conforme descrito en Soluciones;
5
5
Tabla 2 - Preparacin de la solucin estndar y de la curva estndar
268
f.
a. Condicin d. Concentracin e. Plazo de validez Solucin
c. Solucin para g. Dosis mediana (g o U.I./
Antibitico de desecacin b. Solvente inicial de la solucin de de la solucin bajo para
diluicin (5.5.3.3) ml)
(5.5.3.3) trabajo (/ml) refrigeracin diluicin
(5.5.3.3)
Amoxicilina 8 - Agua estril 1 mg 1 das 2 0,05 a 0,2 g7
Ampicilina 8 - Agua estril 0,1 mg 7 das 2 0,05 a 0,2 g7
Anfomicina8 1 - 2 0,1 mg 14 das 2 5 a 20 g
Anfotericina B 1 - Dimetilsulfxido 1 mg2 Usar en el mismo da 5 0,5 a 2 7
Bacitracina 1 - HC10,01 M 100 U.I. Usar en el mismo da 1 1 a 4 U.I.
Farmacopea Brasilea, 5 edicin
5
270 Farmacopea Brasilea, 5 edicin
a) condiciones de desecacin, conforme descrito en el En la Tabla 1 estn descritos los antibiticos a ser ana-
tem Desecacin de sustancias antibiticas (5.5.3.3); lizados por el mtodo turbidimtrico con descripcin del
b) solvente inicial para disolucin del antibitico, caso sea microorganismo, medio de cultivo, volumen de inculo es-
necesario, y hasta cual concentracin es usado; tandarizado sugerido como referencia inicial y temperatura
c) solucin para diluicin del antibitico hasta la concen- de incubacin para cada caso.
tracin de trabajo, conforme Soluciones;
d) concentracin de solucin de trabajo, expresada en Incubar en bao mara, por 3 a 4 horas, tomando la pre-
peso o Unidades Internacionales por ml de solucin; caucin de asegurar temperatura adecuada y uniforme para
5
e) plazo de validez de la solucin estndar de trabajo bajo todos los tubos. El tiempo adecuado debe ser verificado
refrigeracin; por la observacin del crecimiento en el tubo conteniendo
f) solucin empleada para diluicin de la solucin de tra- a concentracin media (P3) utilizada en el ensayo. Despus
bajo, en la ocasin de la preparacin de la curva estn- del perodo de incubacin, interrumpir la multiplicacin de
dar, conforme Soluciones; los microorganismos por la adicin de 0,5 ml de solucin
g) banda de concentracin, en peso o Unidades Internacio- de formaldehido a 12 por ciento, en cada tubo.
nales por ml, dentro de la cual las concentraciones ade-
cuadas para la curva estndar pueden ser encontradas. Determinar la absorbancia para cada tubo en espectrofot-
metro, en el largo de onda de 530 nm. Estandarizar el apa-
Emplear para cada antibitico el microorganismo y el cal- rato en absorbancia por medio del blanco conteniendo la
do nutritivo relacionados en la Tabla 1. Determinar expe- misma cantidad de caldo nutriente y formaldehido, a 12%.
rimentalmente el volumen de inculo a ser adicionado a
100 ml de caldo a partir de la cantidad sugerida como re- En ensayos de rutina, cuando la linealidad del sistema fue
ferencia inicial. El medio inoculado debe ser preparado y comprobada por nmero adecuado de experimentos usan-
utilizado inmediatamente. do el ensayo de tres puntos (3 x 3), puede ser empleado
ensayo de dos puntos (2 x 2). Ser aceptado, igualmente, el
Procedimiento para delineamiento rectas paralelas (3 x 3 delineamiento 5 x 1, adoptado oficialmente por otras far-
o 2 x 2) macopeas de uso internacional corriente. Todava, en caso
de controversia o litigio, debe ser aplicado el ensayo de
Distribuir, en tubos idnticos, volumen igual de cada una de tres puntos.
las soluciones del estndar y de la muestra. Aadir para cada
tubo volumen igual de caldo nutriente inoculado, por ejem- Clculo de la potencia
plo, 1 ml de solucin con antibitico y 9 ml del medio (0,1
ml de solucin para gramicidina y tirotricina). Por lo menos A partir de los resultados, calcular la potencia de la mues-
dieciocho tubos son usados para ensayo por rectas paralelas tra y sus lmites de confianza, por medio de mtodo es-
3 x 3 y doce tubos para ensayo por rectas paralelas 2 x 2. El tadstico estndar descrito en Procedimientos estadsticos
nmero de rplicas por concentracin en cada ensayo debe aplicables a los ensayos biolgicos ensayos indirectos
ser suficiente para asegurar la precisin estadstica especifi- cuantitativos (8.5).
cada en la monografa, sin embargo se debe realizar, como
mnimo, tres tubos para cada concentracin del estndar y Intervalo de confianza (IC)
de la muestra. Puede ser necesario realizar el ensayo con
nmero mayor de dosis estndar y de la muestra o repetirlo y La precisin de un ensayo es verificada por el intervalo de
combinar los resultados para obtener la precisin requerida. confianza el cual garantiza que la verdadera potencia est
Las dosis usadas deben estar en progresin geomtrica. dentro de los lmites especificados.
5
Tetraciclina Staphylococcus aureus (ATCC 6538p) 3 0,1 37
Tirotricina Enterococcus hirae (ATCC 10541) 3 1,0 37
Tobramicina Staphylococcus aureus (ATCC 6538p) 3 0,15 37
a.
Condicin d. Concentracin e. Plazo de validez
c. Solucin para f. Solucin para g. Banda de
Antibitico de b. Solvente inicial de la solucin de de la solucin bajo
diluicin (5.5.3.3) diluicin (5.5.3.3) concentracin (/ml)
disecacin trabajo (/ml) refrigeracin
(5.5.3.3)
Amicacina 8 - Agua estril 1 mg 14 das Agua estril 6 a 14 g
Kanamicina 8 - Agua estril 1 mg 30 das Agua estril 6 a 14 g
Candimicina1 6 - Dimetilsulfxido 1 mg Usar en el mismo Agua estril 0,02 a 0,14 g3
da
Capreomicina 5 - Agua estril 1 mg 7 das Agua estril 60 a 180 g
Farmacopea Brasilea, 5 edicin
5
da para productos tpicos mltiple-dosis; productos orales;
oftlmicos; otolgicos; nasales; fluidos de dilisis; irriga- Recuperar el material en medio de cultivo lquido o slido.
cin, etc. Las condiciones para la preparacin del cultivo estn regis-
tradas en la Tabla 1.
Si la recuperacin del microorganismo se da en medio de En ambos los casos, dispensar pequeas alcuotas de la
cultivo lquido, despus de incubacin, centrifugar y des- suspensin en tubos criognicos estriles, apropiados para
cartar el sobrenadante. Suspender el sedimento con una di- congelamiento de microorganismos.
luicin 1/20 del medio de cultivo de mantenimiento estril
y aadir un volumen igual de solucin de glicerol estril Estocar los tubos criognicos en nitrgeno lquido o ultra-
20% v/v en agua. freezer (no ms que -50 C).
Si la recuperacin del microorganismo se da en medio de Esa cultivo stock puede ser utilizado para inocular una se-
cultivo slido, transferir el crecimiento de la superficie rie de cultivo de trabajo.
para el medio de cultivo de mantenimiento lquido estril,
aadindole 10% de glicerol estril.
A partir del cultivo stock, inocular la superficie del medio La concentracin del inculo utilizado debe ser suficiente
de cultivo slido especificado en la Tabla 1. para obtener una concentracin final en el producto entre 1
x 105 y 1 x 106 UFCs / g o ml aplicable a las categoras
Para recolectar el crecimiento de bacterias y levaduras, uti- 1, 2 y 3 (ver Tabla 2 columna Tipo de Producto).
lizar solucin salina estril. Recoger la suspensin obteni-
da en un tubo o frasco estril apropiado y aadir cantidad Para la categora 4, la concentracin del inculo deber ser
suficiente de solucin salina estril para obtener una con- suficiente para obtener una concentracin final en el pro-
centracin de 1 x 108 UFC/ml. ducto entre 1 x 103 y 1 x 104 UFCs / g o ml.
Para recolectar el crecimiento de A. niger, utilizar solucin El volumen de inculo a ser introducido debe estar entre
salina estril conteniendo 0,05% de polisorbato 80. Reco- 0,5% y 1,0% en relacin al volumen (muestra lquida) o
ger la suspensin obtenida en un tubo o frasco estril apro- peso (muestra slida o semislida) total del producto.
piado y aadir cantidad suficiente de solucin salina estril
para obtener una concentracin de 1 x 108 UFC/ml. Incubar las muestras inoculadas en estufa con temperatura
entre 22,5 C 2,5C.
Alternativamente, el cultivo stock puede ser inoculado en
5
medio lquido (Tabla 1), incubado y posteriormente centri- Muestrear cada embalaje o frasco con muestra inoculada
fugado. Descartar el sobrenadante y suspender el sedimen- en intervalos de 7, 14 y 28 das.
to con cantidad suficiente de solucin salina estril para
obtener una concentracin de 1 x 108 UFC /ml. Determinar por el mtodo de plaqueamiento, el nmero de
Unidades Formadoras de Colonias (UFCs) de cada mues-
Refrigerar las suspensiones si no se utilizarn en un pero- tra, en el tiempo inicial y en cada intervalo de tiempo es-
do de 2 horas. pecificado.
Determinar el nmero de UFCs /ml de cada suspensin Un agente neutralizante especfico para el(los) preservati-
por turbidimetra o conteo en placa, verificando las condi- vo(s) presentes en la formulacin del producto, determina-
ciones de tiempo y temperatura de incubacin y el tiempo do en el estudio de validacin, debe(n) ser incorporado(s)
de incubacin para la recuperacin microbiana descritas en en las placas de conteo o en la diluicin de la muestra pre-
la Tabla 1, con el objetivo de confirmar el conteo en UFC parada para el plaqueamiento.
inicial. Esos valores servirn para calibrar el tamao del
inculo a ser utilizado en las contaminaciones del producto Calcular la concentracin de cada microorganismo (UFC/
en prueba. ml) presente en la muestra, comparar con el conteo en el
tiempo inicial y expresar el cambio en trminos de reduc-
La suspensin de bacterias y levaduras deber ser utilizada ciones logartmicas.
en 24 horas. La suspensin de mohos puede ser utilizada en
hasta 7 das si mantenida bajo refrigeracin. CATEGORA DE PRODUCTO Y CRITERIOS PARA LA
EFICACIA ANTIMICROBIANA
PROCEDIMIENTO
Para el propsito con la prueba, los productos fueron sepa-
Cuando el tipo de embalaje permita la introduccin de la rados en 4 categoras conforme la Tabla 2.
suspensin de microorganismos y cuando su contenido sea
suficiente para la realizacin de todas las etapas, realizar Los requisitos para la eficacia antimicrobiana del conser-
la prueba en 5 embalajes originales del producto a ser pro- vante son cumplidos se atienden a los criterios establecidos
bado. Caso contrario, transferir el contenido de uno o ms para cada categora conforme Tabla 2.
embalajes originales para un frasco con tapa, previamente
Nota. El no aumento del n de UFCS inoculados es definido como no ms que 0,5 log10 de unidades mayores que el
valor previamente obtenido.
CIP
Collection de lInstitut Pasteur NCTC National Collection of Type Cultures
http://www.pasteur.fr/ip/index.jsp http://www.hpacultures.or.uk
Email: hpacultures@hpa.org.uk
IMI United Kingdom National Culture Collection
(UKNCC) NCYC National Collection of Yeast Cultures
http://www.cabi.org Email: cultures@cabi.org http://www.ncyc.co.uk
Email: ncyc@ncyc.co.uk
INCQS Instituto Nacional de Control de Calidad
en Salud Departamento de Microbiologia
Laboratorio de Materiales de Referencia
Av. Brasil, 4365, Manguinhos, Rio de Janeiro,
5
RJ, Brasil, CEP: 21.040-900
http://www.incqs.fiocruz.br
Email: coleo@incqs.fiocruz.br
Bacterias
Bacillus atrophaens 9372 - - - - - - - - -
Bacillus cereus var. mycoides 11778 64.52 003 - - 10230 - - - -
Bacillus pumilis 27142 77.25 - - 10692 10327 - - - -
Bacillus subtilis 6633 52.62 001 3134 8054 10400 - - - -
Bacteroides vulgatus 8482 103717 059 - - 11154 - - - -
Bordetella bronchiseptica 4617 53.157 023 - - 8347 - - - -
Clostridium sporogenes 19404 79.3 - - 532 532 - - - -
Clostridium sporogenes 11437 - 060 - - - - - - -
Enterococcus hirae 10541 - 019 - - - - - - -
Escherichia coli 8739 53.126 - 3972 8545 12923 - - - -
Escherichia coli 10536 54.127 031 8879 10418 - - - -
Geobacillus stearothermophilus 7953 - - - - - - - - -
Klebsiella pneumoniae 10031 53.153 030 - 9111 7427 - - - -
Kocuria rhizophila 9341 53.65 010 - 8340 - - - -
Micrococcus Intens 7468 - 009 - - - - - - -
Micrococcus Intens 10240 53.160 011 8166 7743 - - - -
5
278 Farmacopea Brasilea, 5 edicin
5
trucciones del fabricante, siendo importante asegurar que reactivo externo, es directamente proporcional a la concen-
ellos son adecuados al anlisis de la muestra, especialmen- tracin del antgeno aplicado e inversamente proporcional
te, en lo que se refiere a la selectividad y sensibilidad. Los a la concentracin de anticuerpos en el gel.
requisitos relativos a los conjuntos para inmunoanlisis
son suministrados por la Organizacin Mundial de Salud Mtodos de Difusin Doble. Los gradientes de concentra-
(Serie de Reports Techniques 658,1981). cin son establecidos para dos reactivos. Tanto el antgeno
como el anticuerpo difunden a partir de locales separados
MTODOS EN QUE SON UTLIZADOS ANTGENOS, en un gel inicialmente neutro bajo el punto de vista inmu-
O ANTICUERPOS MARCADOS nolgico. Los mtodos de inmunodifusin doble son uti-
lizados para comparar, cualitativamente, varios antgenos
Las tcnicas que utilizan sustancias marcadas deben em- con relacin a un anticuerpo apropiado o viceversa. La
plear marcadores apropiados, tales como enzimas y radioi- comparacin est basada en la presencia o ausencia de in-
stopos. Cuando el marcador es un radioistopo llamamos teraccin entre los estndares de precipitacin. Es posible
a la tcnica de ensayo radioinmunolgico. Todas las tcni- distinguir reacciones de identidad, de no identidad, o de
cas realizadas con sustancias radioactivas deben ser hechas identidad parcial entre antgenos y anticuerpos.
en conformidad con la legislacin nacional e internacional
para proteccin contra el riesgo de radiaciones. Mtodos de Inmunoelectroforesis. La Inmunoelectrofore-
sis (IE) es una tcnica cualitativa de dos mtodos asocia-
MTODOS EN QUE SON UTILIZADOS ANTGENOS, dos: electroforesis en gel, seguida de inmunodifusin. La
O ANTICUERPOS NO MARCADOS Inmunoelectroforesis cruzada es una modificacin de la In-
munoelectroforesis (IE), adaptada al anlisis cualitativo y
Mtodos de Inmunoprecipitacin. Los mtodos de imu- cuantitativo. En un primer momento es realizada una elec-
noprecipitacin incluyen las reacciones de floculacin y de troforesis clsica. Una banda del gel que contiene las frac-
precipitacin. Cuando una solucin de un antgeno es mez- ciones a ser analizadas, separadas por la electroforesis, es
clada a los anticuerpos correspondientes, en condiciones posteriormente recortada y transferida a la otra placa. Esa
adecuadas, los reactivos forman agregados floculantes o nueva placa es entonces sujeta a una segunda electroforesis
precipitantes. La relacin entre las cantidades de los reacti- en una direccin perpendicular a la banda anterior, median-
vos correspondientes al ms corto tiempo de floculacin, o te el uso de un gel que contiene un tenor relativamente bajo
a la precipitacin ms acentuada se llama relacin ptima. en anticuerpos correspondientes al antgeno. Para una dada
Esta es generalmente obtenida en presencia de cantidades concentracin de anticuerpos y espesor del gel, la relacin
equivalentes de antgeno y anticuerpo. La imunoprecipita- entre el rea de cada uno de los picos de precipitacin y la
cin puede ser evaluada, visualmente, o por la medicin de cantidad del antgeno correspondiente es lineal.
la dispersin de la luz.
Mtodo Electroinmunolgico o Inmunoelectroforesis Fu-
Mtodos Inmunoqumicos Turbidimtricos. Puede obte- siforme. El Ensayo Electroinmunolgico muchas veces
nerse un aumento de la sensibilidad del mtodo mediante referido como Inmunoelectroforesis Fusiforme es un m-
el uso de partculas revestidas de anticuerpos, o de ant- todo rpido para analizar los antgenos cuya carga difiere
genos (por ejemplo, ltex). En los mtodos de floculacin del anticuerpo y viceversa. La electroforesis del antgeno
se utilizan, generalmente, diluiciones sucesivas de uno de a ser analizado es realizada en un gel que debe contener
5
piedades serolgicas. La visualizacin y caracterizacin de puestas para los valores ms prximos de la conexin
las lneas de imunoprecipitacin pueden ser realizadas por no especfica a la conexin mxima, de preferencia tan-
coloraciones selectivas, o no selectivas, por fluorescencia, to para la muestra como para el estndar.
por marcadores enzimticos, marcadores isotpicos, o por
otras tcnicas apropiadas. Las coloraciones selectivas son, CLCULO ESTADSTICO
habitualmente, utilizadas para la caracterizacin de sustan-
cias no proteicas en los precipitados. Para anlisis de los resultados, las curvas de respuesta de la
muestra y del estndar pueden ser analizados por los pro-
En los geles translcidos, tales como agar o agarosa, la l- cedimientos estadsticos aplicables a los ensayos biolgicos
nea de precipitacin se torna claramente visible en el gel, (8). El no paralelismo significativo indica que antgeno o
siempre que la concentracin de cada uno de los reactivos anticuerpo distingue la muestra del estndar e implica la in-
sea apropiada. validacin del resultado. En los inmunoanlisis con despla-
zamiento, los valores de conexin no especfica y del despla-
VALIDACIN DEL MTODO zamiento mximo a una alta concentracin de la muestra o
del estndar no deben ser significativamente diferentes. Las
Criterios de validacin. diferencias podrn reflejar efectos debido a la matriz, ya sea
por inhibicin de la conexin o degradacin del marcador.
Un mtodo inmunoqumicos cuantitativo slo ser vlido
si:
5.7 MTODOS FSICOS
a) el antgeno o el anticuerpo no discriminen, significa- APLICADOS A MATERIALES
tivamente, del estndar la sustancia en anlisis. En el
caso de un reactivo marcado, el reactivo correspon- QUIRRGICOS Y
diente no debe distinguir, de manera significativa, la
sustancia marcada de la no marcada;
HOSPITALARIOS
b) el mtodo no sea influenciado por la matriz del ensayo,
eso es, todos los componentes de la muestra en anlisis, 5.7.1 RESISTENCIA A LA
o sus excipientes, que puedan variar de una muestra a
otra. Esos pueden incluir altas concentraciones de otras TRACCIN
protenas, sales, conservantes en concentraciones ele-
vadas o ejercer una actividad de contaminacin proteo- La determinacin de la resistencia a la traccin de las sutu-
ltica; ras quirrgicas debe ser realizada en ambiente con hume-
c) el lmite de cuantificacin est abajo de los criterios de dad y temperatura constantes. La humedad relativa debe
aceptabilidad indicados en la monografa individual; ser de 60 80 por ciento y la temperatura 20 25 C.
d) la exactitud del anlisis sea tal que la variacin de los
resultados corresponda a las exigencias establecidas en EQUIPO
la monografa individual;
e) no ocurren errores sistemticos ligados al orden en que En la determinacin de la resistencia a la traccin de las
el ensayo es realizado. suturas quirrgicas el equipo debe poseer motor elctrico
que aplique a la sutura en anlisis tasa de carga constante a) agarrar las puntas de la sutura quirrgica, una en cada
por unidad de tiempo. mano;
b) colocar la punta que se encuentra en la mano izquierda
EQUIPO DE PLANO INCLINADO sobre la punta de la mano derecha formando un crculo;
c) introducir la punta superpuesta en el crculo;
Especificaciones d) repetir la operacin;
e) prender en el tubo de caucho flexible;
Los prendedores deben ser del tipo de rollo con superficies f) colocar a punta del lado derecho sobre a punta del iz-
planas para la fijacin de las suturas. El dimetro del rollo quierdo formando un segundo crculo;
debe ser de 1,8 cm a 1,9 cm y las superficies planas deben g) cerrar el nudo.
tener, en el mnimo, 2,5 cm de largo. La distancia entre
los prendedores debe ser de 1,25 cm. El rozamiento del
carro de la carga debe permitir que la pena incritora deslice
hasta 2,5% de la capacidad de registro cuando no hubiere
muestra.
5
Determinar la resistencia a la traccin de las suturas quirr-
gicas con los mismos cuidados preliminares exigidos para Los resultados deben atender a lo descrito en las Tablas 1,
la prueba de determinacin del dimetro. Ajustar el peso 2 y 3 de las respectivas monografas.
del carro para que, en el momento en que ocurre la ruptura,
la posicin de la pena inscritora est entre 20 y 80% de la 5.7.2 DIMETRO DE SUTURAS
capacidad de registro.
La determinacin del dimetro de las suturas quirrgicas
Traccin directa debe ser realizada en ambiente con humedad y tempera-
tura constante. La humedad relativa debe ser de 60 80
Colocar la sutura en el equipo prendiendo una de las ex- por centro y la temperatura entre 20 25 C. Los pesos
tremidades y pasando la extremidad libre por el otro pren- para pre-tensin para determinacin de dimetro de hilos
dedor. Aplicar en esa ltima una tensin equivalente a 1/4 de multifilamentos estn registrados en la Tabla 1.
de la resistencia mnima exigida para la sutura en prueba y
apretar el prendedor. Ajustar la pena inscritora en el punto APARATOS
cero del grfico y ligar el equipo; anotar la lectura y evaluar
la resistencia. Eliminar la determinacin toda vez que la El reloj comparador utilizado para determinar el dimetro
sutura se rompa en punto prximo de los prendedores. de suturas es del tipo peso muerto, mecnico o electrni-
co y est equipado con un mostrador de lectura directa, di-
Traccin sobre-nudo gital o de salida de lectura impresa. La resolucin de escala
es de por lo menos 0,002 mm y la zapata de apoyo debe
Determinar la resistencia a la traccin sobre-nudo quirr- tener aproximadamente 12,70 mm 0,02 mm de dimetro.
gico ejecutando en la sutura a prueba un nudo de cirujano La zapata de apoyo y las partes mviles conectadas a ella
(Figura 1) sobre un segmento de 5 cm de largo de un tubo deben aplicar una carga total de 210 g 3 g a la muestra.
de caucho flexible de 6,5 mm de dimetro interno y 8,1
mm de dimetro externo. Colocar la sutura en el equipo de Para suturas de nmero quirrgico 9-0 y menores, retirar
modo que el nudo quede equidistante de los prendedores. el peso adicional de la zapata de manera que el peso total
Ajustar la pena inscritora en el punto cero del grfico y en- sobre la muestra no exceda 60 g.
cender el equipo; anotar la lectura y evaluar la resistencia.
Eliminar la determinacin toda vez que la sutura se rompa La zapata y la base del equipo deben presentar paralelismo
en punto prximo de los prendedores. y planicidad de 0,005 mm.
Para determinacin del dimetro de las suturas de monofi- Utilizar una mquina universal de traccin equipada con
lamentos, se debe proceder de la siguiente forma: motor elctrico que aplique tasa de carga constante por uni-
dad de tiempo.
a) efectuar la medida en suturas en la forma seca o con
fluido, inmediatamente, despus de su eliminacin del La clula de carga utilizada debe ser compatible con la
embalaje sin secado previo; fuerza de traccin necesaria para la verificacin.
b) posicionar la sutura en el reloj comparador, entre la
base fija y la base de la traba mvil; PROCEDIMIENTO
c) bajar la palanca lentamente de modo que toda la carga
quede bajo la sutura; Fijar la aguja en uno de los prendedores del equipo de
d) medir el dimetro de la sutura en tres puntos, aproxima- modo que la parte fija quede libre y alineada con la direc-
damente a 1/4, 1/2 y 3/4 de su largo total. cin en que se va a aplicar la fuerza por el prendedor mvil.
Medir la fuerza requerida para destrabar el hilo de la sutura
Resultado de la aguja.
5
mediatamente, inferior y posterior al analizado. siderar simultneamente los lmites individuales para los
hilos y los lmites para el promedio de cinco hilos del lote
5.7.3 RESISTENCIA A FIJAR EL analizado. En el caso que uno de los resultados de lmite
individual, y no ms de que uno, no satisfaga los lmites
HILO DE LA AGUJA mnimos para valores individuales, repetir el ensayo con
diez hilos ms. El requisito del ensayo ser atendido si nin-
La finalidad de ese ensayo es evaluar la fijacin de los guna de las 10 muestras est abajo de los lmites descritos.
hilos para suturas en agujas atraumticas.
5
dejar caer en la misma. Determinar, de preferencia por el ciopelo. Los platos cubiertos por terciopelo, sobre los cua-
uso de un cronmetro, el tiempo en segundos requerido les las fibras pueden ser colocadas en orden, son placas de
para sumersin completa. aluminio de aproximadamente 100 mm por 225 mm y 2,4
mm de espesor, cubiertas en ambos los lados por terciopelo
Retirar el cesto del agua, dejarlo drenar por 10 segundos en de alta calidad, de preferencia negro.
la misma posicin horizontal, entonces colocarlo inmedia-
tamente en un recipiente tarado y cubierto y pesar. Calcular SELECCIN DEL ALGODN
la masa de agua absorbida a partir de la masa del cesto de
prueba y de la masa del algodn hidrfilo. Despus de desenrollar el algodn, preparar una muestra
representativa por la porcin, a partir de un paquete con-
5.7.5 DETERMINACIN DEL teniendo de 225 g a 450 g, de 32 muestras (cada una con
cerca de 75 mg) bien distribuidas a lo largo de la pieza,
LARGO DE LA FIBRA siendo 16 retiradas de una mitad longitudinal y lo restante
de la otra mitad. Evitar las extremidades de la pieza y to-
Para la realizacin de las pruebas de Determinacin del mar particular cuidado, asegurando que las porciones sean
largo de la fibra, retirar el algodn de su embalaje original retiradas tenindose en cuenta el espesor de la pieza. Para
y condicionarlo por, como mnimo, 4 horas, en atmsfera evitar la seleccin de solamente fibras largas o fibras cor-
estndar de 65% 2% de humedad relativa a 21 C 1,1 tas, retirar todas las fibras de cada muestra y no dejar que
C. las mismas pasen a travs de los dedos.
Este procedimiento se aplica al aparato separador dplex De paquetes de, como mximo, 112,5 g, pesar 8 muestras y
de fibra de algodn Suter-Webb. Con alteraciones en el de paquetes pesando entre 112,5 g y 225 g, pesar 16 mues-
procedimiento, puede ser aplicado a dos separadores Baer tras, todas bien distribuidas.
arreglados uno atrs del otro o aplicado a un Johannsen u
otro aparato semejante. Mezclar las muestras en pares, indiscriminadamente, y
combinar cada par tirando y enrollando suavemente en
APARATOS los dedos. Entonces dividir longitudinalmente cada par
combinado en dos partes aproximadamente iguales y uti-
El separador consiste en dos bancos de peines rgidamente lizar una parte en la mezcla posterior (la otra parte puede
montados lado a lado sobre una base comn. Cada banco ser descartada o reservada para cualquier otras prueba o
de peines consiste en por lo menos 12 peines individuales controle).
espaciados por 3,2 mm, uno atrs del otro y montados de
modo encajado para que, a medida que ellos sean apro- Repetir el proceso descrito en el prrafo anterior con las
ximados durante el proceso de fraccionamiento y no ms mitades sucesivas de las series bifurcadas hasta que resulte
necesarios, ellos puedan ser sueltos para que caigan abajo solamente una muestra. Suavemente, disponer en posicin
del plano de trabajo. Cada peine tiene una serie simple de paralela las fibras de la muestra final, tirando y enrollndo-
dientes precisamente alineados y bien puntiagudos, de 12 las en los dedos. Retener todas las fibras, incluyendo, tanto
mm de largo, consistiendo en agujas de 0,38 mm de dime- como posible, las enredadas y las masas de fibras trenza-
das, descartando solamente los fragmentos de semillas in-
maduras con fibras y material extrao no fibroso tal como prximamente como posible a la superficie frontal del pei-
pecolos, hojas y fragmentos de tegumentos. ne proximal. Tal aplanamiento puede envolver la retirada
de fibras aisladas de ambos lados, frontal y distal, de los
A partir de la muestra final descrita en el prrafo anterior, bancos de peines y el re-depsito de las mismas en el haz
separar longitudinalmente una muestra de 75 mg 2 mg, principal de los peines.
exactamente pesados. Retener el residuo para cualquier
prueba necesaria. Girar el equipo nuevamente a 180. Dejar caer peines su-
cesivos, si necesario, para exponer las extremidades de las
PROCEDIMIENTO fibras ms largas. Puede ser necesario re-depositar algunas
fibras aisladas. Utilizando el frceps, retirar las pocas fibras
Utilizando la rejilla depresora de fibras, insertar cuidado- ms salientes. De esta manera, continuar retirando sucesi-
samente la muestra pesada en un banco de peines del sepa- vamente las fibras salientes remanentes de vuelta a la parte
rador de algodn, de modo que ella se extienda a travs de frontal del peine proximal. Dejar caer este peine y repetir las
los peines en ngulos aproximadamente rectos. series de operaciones de la misma manera hasta que todas
las fibras hayan sido retiradas. Para no perturbar seriamente
Con el frceps separador, sujetar, por las extremidades la muestra y por tanto viciar el fraccionamiento en grupos,
libres, una pequea porcin de las fibras que se extiende jalar diversas veces (ocho a diez) entre cada par de peines.
a travs de los dientes del peine ms prximo al opera-
dor; suavemente sacarla de los peines y transferirla para Colocar los tirones sobre los platos cubiertos por terciope-
las puntas de los dientes del segundo banco, poniendo las lo en paralelo unos a los otros, tan rectamente como posi-
fibras paralelamente unas a las otras, linealmente y apro- ble, con las extremidades tan claramente definidas como
ximadamente en ngulos rectos con relacin a las caras de posible y con las partes distales arregladas en lnea recta,
los peines, liberando tan prximo a la cara del peine frontal presionndolas para abajo suavemente con el plato plano
5
como sea posible. Utilizando la rejilla depresora, cuida- depresor de fibras antes de liberar el tirn del frceps. Em-
dosamente presionar las fibras transferidas para abajo, en plear, como mnimo, 50 y, como mximo, 100 tirones para
los dientes de los peines. Continuar la operacin hasta que fraccionar la muestra.
todas las fibras sean transferidas para el segundo banco de
peines. Durante esta transferencia de las fibras, dejar caer Agrupar todas las fibras que tengan largo de 12,5 mm o
los peines del primer banco sucesivamente siempre y cuan- ms y pesar el grupo hasta dcimos de miligramo. De la
do todas las fibras salientes hayan sido retiradas. misma manera, agrupar todas las fibras que tengan largo
de 6,25 mm o menos y pesar de la misma manera. Final-
Girar el equipo a 180 y transferir las fibras de algodn de mente, agrupar las fibras remanentes, de largos intermedia-
vuelta para el primer banco de peines de la manera descrita rios y pesar. La suma de los tres pesos no debe diferir del
en el prrafo anterior. peso inicial de la muestra por ms de 3 mg. Dividir la masa
de cada uno de los dos primeros grupos por la masa de la
Tomar mucho cuidado al aplanar las extremidades de las muestra para obtener el porcentaje en peso de fibra en las
fibras durante ambas transferencias, arreglndolas tan dos bandas de largo.
6.1 RECIPIENTES DE VIDRIO Molino de bolas con estrictor de acero templado y es-
feras de acero pulido o mortero en acero templado con
CLASIFICACIN las especificaciones en la Figura 1.
6
resistencia hidroltica media, sin embargo con buena resis-
tencia mecnica, sin cualquier tratamiento superficial, con
alcalinidad mxima de 8,5 ml de H2SO4 0,01 M (ensayo
en frasco de vidrio molido). Destinado al envasado de so-
luciones de uso tpico y oral; pudiendo ser utilizado para
soluciones parenterales, cuando aprobado por ensayos de
estabilidad.
Figura 2 - Figura 1 Mortero y piln
Vidrio tipo NP (no parenteral). Vidrio alcalino del tipo para pulverizacin de vidrio.
sdico / clcico, de resistencia hidroltica baja y alta alcali-
nidad, de como mximo 15 ml de H2SO4 0,01 M (ensayo en Estufa para secado con temperatura de 140 C;
frasco de vidrio molido). Indicado al envasado de produc- Balanza de precisin con dos casas decimales;
tos no parenterales, o sea, de uso tpico y oral. Conjunto de tamices en acero inoxidable, n 20, n 40
y n 50, con dimetro de 20,3 cm (8), incluyendo la
6.1.1 RESISTENCIA olla y la tapa;
Imn;
HIDROLTICA O ALCALINIDAD Vaso de precipitados o papel aluminio;
Matraz de 250 ml;
Ensayo que cuantifica la intensidad de la reaccin qumica Desecador;
entre el agua y los elementos alcalinos existentes en el vi- Bureta y microbureta para titulacin;
drio, especialmente sodio y potasio. Esa resistencia deter- Probeta graduada de 100 ml;
mina la clasificacin del tipo de vidrio. Agua bidestilada o desionizada, con conductividad
mxima de 0,15 S/cm (o 6,67 M /cm) a 25 C;
EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS Solucin de rojo de metilo (24 mg en 100 ml de agua);
Acetona PA;
Autoclave con control de temperatura de 121 C 1,0 Solucin de H2SO4 a 0,01 M;
C, equipada con termmetro, manmetro, vlvula de Solucin de HCl a 0,01 M.
seguridad y estantera para sustentacin de, como m-
nimo, 12 frascos.
6
molido.
Transferir la muestra para matraz de 250 ml y lavar las par-
tculas de vidrio con 6 porciones de 30 ml de acetona PA, PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO EN FRASCO DE
agitando por cerca de 30 segundos cada procedimiento, y VIDRIO ENTERO
decantar cuidadosamente la acetona. Despus del lavado,
la muestra debe estar libre de bloques de polvo de vidrio Lavar frascos, escogidos aleatoriamente, con agua bides-
y la superficie de los granos debe estar prcticamente libre tilada o desionizada y secarlos en corriente de aire limpio
de la adherencia de partculas finas. Secar el material por y seco. Aadir volumen de agua bidestilada o desioniza-
20 minutos a 140 C. da correspondiente a 90% de la capacidad total del frasco,
determinada conforme descrito en Capacidad Volumtrica
La muestra debe ser probada hasta 48 horas despus del Total (6.1.3).
secado y en ese caso, debe ser mantenida en desecador.
Cerrar los frascos con papel aluminio previamente lavado
Pesar 10,0 g del vidrio molido, transferir para matraz de 250 con agua bidestilada o desionizada y colocarlos en la auto-
ml, previamente preparado con agua bidestilada o desioni- clave. Someterlos al siguiente tratamiento:
zada en bao a 90 C, por lo menos, por 24 horas o a 121 C
por 1 hora, y aadir 50 ml de agua bidestilada o desionizada. calentar a autoclave a 100 C, con la vlvula de escape
abierta, por 10 minutos;
Como blanco, utilizar matraz de 250 ml, previamente pre- promover el aumento de la temperatura de la autoclave
parado en agua bidestilada o desionizada en bao a 90 C, despus del cierre de la vlvula de escape, en 1 C/min,
por lo menos, por 24 horas o a 121 C por 1 hora, y aadir hasta alcanzar 121 C 1 C;
50 ml de agua bidestilada o desionizada. mantener la temperatura de 121 C 1 C durante 60
minutos;
Cerrar los frascos matraz con el uso de vaso de precipi- bajar la temperatura, en 0,5 C/min, hasta alcanzar 100
tados invertido o papel aluminio, previamente lavado con C, descargando la presin hasta alcanzar la presin at-
agua bidestilada o desionizada. mosfrica;
abrir la autoclave solamente despus de alcanzar la
Colocarlos en la autoclave y someterlos al siguiente trata- temperatura de95 C;
miento: transferir los frascos para bao mara a 80 C. Aadir
promover el aumento de la temperatura del autoclave agua fra; tomando cuidado de evitar la contaminacin
despus de cerrar la vlvula de escape, entre 19 a 23 de la solucin de extraccin, siendo que el tiempo de
minutos, hasta alcanzar 121 C + 1 C; enfriamiento no debe exceder 30 minutos.
Despus de enfriamiento, combinar la solucin de extrac- Colocarlos en la autoclave y someterlos al siguiente trata-
cin de cada uno de los frascos. Medir el volumen conforme miento:
registrado en la Tabla 1 y transferir para matraz de 250 ml. promover el aumento de temperatura del autoclave
despus de cerrar la vlvula de escape, entre 19 a 23
Como blanco, utilizar matraz de 250 ml y aadir el mismo minutos, hasta alcanzar 121 C + 1 C;
volumen de agua bidestilada o desionizada. mantener en temperatura de 121 C + 1 C durante 60
minutos;
Tabla 1 - Volumen de solucin de extraccin de acuerdo descargar la presin en un perodo de 38 a 46 minutos,
con la capacidad volumtrica total del recipiente. hasta alcanzar la presin atmosfrica.
Capacidad volumtrica Volumen de solucin Combinar el volumen de solucin de extraccin de varios
del frasco (ml) de extraccin (ml) frascos, en probeta graduada y transferir 100,0 ml para ma-
3 25,0 traz de 250 ml. Aadir 5 gotas de la solucin de rojo de
De 3 a 30 50,0 metilo y titular, inmediatamente, con cido sulfrico 0,01
De 30 a 100 100,0 M. Completar la titulacin dentro de 60 minutos despus
100 100,0 de la abertura de la autoclave. Registrar el volumen de ci-
do sulfrico utilizado en la titulacin y corregir el valor en
Aadir 5 gotas de la solucin de rojo de metilo para cada relacin al volumen del blanco (100 ml de agua bidestilada
25 ml de solucin de extraccin y titular, inmediatamente, o desionizada en la misma temperatura y con la misma can-
con cido clorhdrico 0,01 M, utilizando una microbureta. tidad de indicador).
Registrar el volumen de cido clorhdrico 0,01 M utilizado
en la titulacin y corregir el valor en relacin al volumen Lmites
del blanco.
El valor de la alcalinidad mximo para el frasco de vidrio
Lmites tipo II es de 0,7 ml de H2SO4 0,01 M para frascos con hasta
100 ml de capacidad volumtrica.
El valor de alcalinidad mxima no debe exceder los valores
indicados en la Tabla 2. El valor de la alcalinidad mximo para el frasco de vidrio
tipo II es de 0,2 ml de H2SO4 0,01 M para frascos con ms
6
Tabla 2 - Alcalinidad mxima de acuerdo con el tipo de 100 ml de capacidad volumtrica.
de vidrio y la capacidad volumtrica del frasco.
PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO DE ATAQUE DE Lavar frascos, escogidos aleatoriamente, con agua bidesti-
AGUA A 121 C PARA CUALIFICAR EL VIDRIO DE lada, o desionizada y secarlos en corriente de aire limpio
TIPO II. y seco. Aadir volumen de agua bidestilada o desioniza-
da correspondiente a 90% de la capacidad total del frasco,
Enjuagar 3 o ms frascos, escogidos aleatoriamente, con determinada conforme descrito en Capacidad Volumtrica
agua bidestilada o desionizada por 2 veces y secarlos en Total (6.1.3). Cerrar los frascos con papel aluminio previa-
corriente de aire limpio y seco. Aadir volumen de agua mente lavado con agua bidestilada o desionizada y colo-
bidestilada o desionizada correspondiente a 90% de la ca- carlos en la autoclave. Someterlos al siguiente tratamiento:
pacidad total del frasco, determinada conforme descrito calentar la autoclave a 100 C, con la vlvula de escape
en Capacidad Volumtrica Total (6.1.3). Cerrar los fras- abierta, por 10 minutos;
cos con el uso de vaso de precipitados invirtiendo el pa- promover el aumento de la temperatura de la autoclave
pel aluminio, previamente lavado con agua bidestilada, o despus del cierre de la vlvula de escape, en 1 C/min,
desionizada. hasta alcanzar 121 C 1 C;
mantener en la temperatura de 121 C 1 C durante Determinar la temperatura del agua durante la realizacin
60 minutos; del ensayo, asegurar que la temperatura del agua no tenga
bajar la temperatura, en 0,5 C/min, hasta alcanzar 100 variacin arriba de 1 C.
C, descargando la presin hasta alcanzar la presin at-
mosfrica; Pesar el frasco lleno y determinar la masa de agua en el
abrir la autoclave solamente despus de alcanzar la contenida.
temperatura de 95 C;
transferir los frascos para bao mara a 80 C. Aadir Calcular el volumen del frasco dividiendo la masa del agua
agua fra, cuidadosamente, para evitar la contamina- por su densidad, en la temperatura del ensayo, con el uso
cin de la solucin de extraccin, siendo que el tiempo de los datos registrados en la Tabla 1 para agua destilada.
de enfriamiento no debe exceder 30 minutos.
Tabla 1 - Densidad del agua destilada
Despus de enfriamiento, combinar la solucin de extrac- en funcin de la temperatura.
cin de cada uno de los frascos para obtener 35 ml y trans-
ferir para matraz de 250 ml. Densidad Densidad
Temperatura Temperatura
del agua (g/ del agua (g/
(C) (C)
Proceder conforme descrito para Ensayos-lmite de arsni- ml) ml)
co (5.3.2.5). Lmite para arsnico es de 1 g/g. 10 0,99839 23 0,99660
11 0,99832 24 0,99638
6.1.3 CAPACIDAD 12 0,99823 25 0,99617
13 0,99814 26 0,99593
VOLUMTRICA TOTAL 14 0,99804 27 0,99569
15 0,99893 28 0,99544
Ensayo para determinar el volumen de producto lquido 16 0,99780 29 0,99518
que el frasco puede contener, cuando lleno, hasta la super- 17 0,99766 30 0,99491
ficie superior de la terminacin. 18 0,99751 31 0,99464
19 0,99735 32 0,99435
EQUIPOS Y MATERIALES
20 0,99718 33 0,99406
21 0,99700 34 0,99375
6
Balanza con resolucin mnima de 0,1 g;
22 0,99680 35 0,99345
termmetro de 0 C a 100 C, con resolucin de 0,5 C;
agua bidestilada. RESULTADOS
Las pruebas de extrables son planeadas para caracterizar identidad, la fuerza, la calidad y la pureza de la forma far-
los componentes extrados e identificar los posibles mi- macutica sean mantenidas durante el perodo de validez.
grantes. El grado o extensin de las pruebas para extraer
sustancias de un componente depende de la finalidad de ENSAYOS
uso y del grado de riesgo de impactar negativamente en
la eficacia del producto. En este captulo estn descritos Polietileno de Alta Densidad
las pruebas de extrables especficos para resinas de po-
lietileno, polipropileno, poli (tereftalato de etileno) y poli Espectroscopia de Infrarrojo. Utilizar el accesorio de re-
(tereftalato de etileno glicol). Todos los otros plsticos de- flexin total atenuada, conforme descrito en el tem Infrarro-
ben ser probados conforme descrito en los Pruebas Fsico jo medio (5.2.14). El espectro corregido de la muestra debe
Qumicas de Mtodos de Prueba (6.2.1.3). La prueba de presentar bandas de mayor absorcin apenas en los mismos
Capacidad Tamponante debe ser probada para recipientes largos de onda del espectro del estndar de referencia.
destinados a embalar un producto lquido.
Calorimetra Diferencial de Barrido. Proceder como
Los componentes plsticos utilizados para productos de alto descrito en la Anlisis Trmico de Mtodos de Pruebas
riesgo, tales como aquellos destinados a la inhalacin; pre- (6.2.1.3). El termograma de la muestra debe ser parecido
paraciones parenterales y oftlmicas son probados utilizan- con el del estndar de referencia, determinado de manera
do los Pruebas Biolgicas de Mtodos de Prueba (6.2.1.3). semejante, y la temperatura endotrmica (derretimiento) en
el termograma de la muestra no debe diferir en ms de 6,0
Los recipientes plsticos destinados al embalaje de produc- C de los estndares de referencia.
tos parenterales deben cumplir los requisitos de las Pruebas
Biolgicos y de las Pruebas Fsico Qumicas. Tambin, son Metales Pesados y Residuo No Voltil. Preparar extrac-
suministradas normas para los recipientes en polietileno tos de la muestra conforme descrito en las Pruebas Fsico
utilizados para embalar formas farmacuticas orales secas, Qumicas, en Mtodos de Pruebas (6.2.1.3), con porcin
no destinadas para constitucin en solucin. de 60 cm2, sin considerar el espesor, para cada 20,0 ml de
Medio de Extraccin.
6.2.1 RECIPIENTES Y
Metales Pesados. Los recipientes deben cumplir los requi-
RELACIONADOS PLSTICOS sitos para Metales Pesados en Pruebas Fsico Qumicas, en
6
Mtodos de Pruebas (6.2.1.3).
6.2.1.1 RECIPIENTES DE POLIETILENO
Residuo No Voltil. Proceder como descrito en Residuo
Polietilenos de alta y baja densidad son polmeros de ca- No Voltil en Pruebas Fsico Qumicas en Mtodos de
dena larga, sintetizados bajo condiciones controladas de Prueba (6.2.1.3), siendo que el Blanco debe ser el mismo
calor y presin, con el auxilio de catalizadores y a partir solvente utilizado en cada una de las condiciones de prue-
de, como mnimo, 85,0% de etileno y un total de 95,0% ba. La diferencia entre las cantidades obtenidas de la Pre-
de olefinas. Tanto el polietileno de alta densidad cuanto el paracin de la Muestra y del Blanco no debe exceder 12,0
de baja densidad tienen un espectro de absorcin de infra- mg cuando el agua mantenida a 70 C es utilizada como
rrojo especfico del polietileno y poseen propiedades tr- Medio de Extraccin; no exceder 75,0 mg cuando el alco-
micas caractersticas. El polietileno de alta densidad tiene hol mantenido a 70 C es utilizado como Medio de Extrac-
una densidad entre 0,941 y 0,965 g/cm3. El polietileno de cin; y no exceder 100,0 mg cuando el hexano mantenido
baja densidad tiene una densidad entre 0,850 y 0,940 g/ a 50 C es utilizado como Medio de Extraccin.
cm3. Otras propiedades que pueden afectar la adecuacin
del polietileno incluyen mdulo de elasticidad, ndice de Sustancias Utilizadas en Contacto con Lquidos Orales.
fluidez, resistencia a la quiebra bajo tensin ambiental y
grado de cristalinidad despus del moldeo. Proceder como descrito en la Capacidad Tamponante de
Pruebas Fsico Qumicas, Mtodos de Pruebas (6.2.1.3).
Las normas y ensayos descritos en esta seccin caracte-
rizan recipientes y componentes, producidos a partir del Polietileno de Baja Densidad
polietileno de baja o de alta densidad de resinas homopoli-
mricas o copolimricas. Espectroscopia de Infrarrojo. Utilizar el accesorio de re-
flexin total atenuada, conforme descrito en el tem Infrarro-
Todos los componentes de polietileno estn sujetos a jo medio (5.2.14). El espectro corregido de la muestra debe
pruebas de espectroscopia en el infrarrojo y calorimetra presentar bandas de mayor absorcin apenas en los mismos
diferencial de barrido. Cuando estudios de estabilidad largos de onda del espectro del estndar de referencia.
son realizados para determinar la fecha de validez de una
forma farmacutica especial en un recipiente de polietile- Calorimetra Diferencial de Barrido. Proceder como
no adecuado, cualquier otro recipiente de polietileno que descrito en la Anlisis Trmico, en Mtodos de Pruebas
cumpla esos requisitos puede ser igualmente utilizado para (6.2.1.3). El termograma de la muestra debe ser parecido
embalar la forma farmacutica en cuestin, siempre que con el del estndar de referencia, determinado de manera
los programas de estabilidad apropiados sean ampliados semejante, y la temperatura endotrmica (derretimiento) en
para incluir el recipiente alternativo para garantizar que la
el termograma de la muestra no debe diferir en ms de 8,0 mas farmacuticas orales secas slidas y lquidas. Conside-
C de los estndares de referencia. rndose que estudios adecuados de estabilidad tengan sido
realizados para determinar la fecha de validez de una forma
Metales Pesados, y Residuo No Voltil. Preparar extrac- farmacutica especfica en un recipiente apropiado en po-
tos de la muestra conforme descrito en Preparacin de la lipropileno, cualquier otro recipiente en polipropileno que
Muestra en Pruebas Fsico Qumicos de Mtodos de Prue- atienda a esos requisitos puede ser utilizado para embalar
bas, con porcin de 60 cm2, sin considerar el espesor, para la misma forma farmacutica, siempre que los programas
cada 20,0 ml de Medio de Extraccin. de estabilidad apropiados sean ampliados para incluir ese
recipiente alternativo, a fin de garantizar que la identidad,
Metales Pesados. Los recipientes deben cumplir los requi- la fuerza, la calidad y la pureza de la forma farmacutica
sitos para Metales Pesados de Pruebas Fsico Qumicas, en sean mantenidas durante el perodo de validez.
Mtodos de Pruebas (6.2.1.3).
ENSAYOS
Residuo No Voltil. Proceder conforme descrito en
Espectroscopia de Infrarrojo. Utilizar accesorio de re-
Residuo No Voltil de Pruebas Fsico Qumicas, en Mto- flexin total atenuada, conforme descrito en el tem
dos de Pruebas (6.2.1.3), siendo que el Blanco debe ser el
mismo solvente utilizado en cada una de las condiciones de Espectrofotometra de absorcin en el infrarrojo (5.2.14).
prueba. La diferencia entre las cantidades obtenidas de la El espectro corregido de la muestra debe presentar ban-
Preparacin de la Muestra y del Blanco no debe exceder das de mayor absorcin solamente en los mismos largos
12,0 mg cuando el agua mantenida a 70 C es utilizada de onda del espectro del respectivo estndar de referencia
como Medio de Extraccin; no exceder 75,0 mg cuando (homopolmero o copolmero de polipropileno) determina-
el alcohol mantenido a 70 C es utilizado como Medio de do de forma semejante.
Extraccin; y no exceder 350,0 mg cuando el hexano man-
tenido a 50 C es utilizado como Medio de Extraccin. Calorimetra Diferencial de Barrido. Proceder confor-
me descrito en la Anlisis Trmico de Mtodos de Pruebas
Sustancias Utilizadas en Contacto con Lquidos Orales. (6.2.1.3). La temperatura endotrmica (derretimiento) en
el termograma no debe diferir en ms que 6,0 C de los
Proceder conforme descrito en la Capacidad Tamponan- estndares de referencia para homopolmeros. La tempe-
6
te de Pruebas Fsico Qumicas, en Mtodos de Pruebas ratura endotrmica obtenida del termograma de la muestra
(6.2.1.3). de copolmero de polipropileno no debe diferir en ms que
12,0 C de los estndares de esa sustancia.
6.2.1.2 RECIPIENTES DE
POLIPROPILENO Metales Pesados y Residuo No Voltil. Preparar extrac-
tos de las muestras conforme descrito en Preparacin de
Los polmeros de polipropileno son polmeros de cade- la Muestra, de Pruebas Fsico Qumicas, en Mtodos de
na larga, sintetizados con el auxilio de catalizadores bajo Pruebas (6.2.1.3), con porcin de 60 cm2, sin considerar el
condiciones controladas de calor y presin. Factores como espesor, para cada 20,0 ml de Medio de Extraccin.
composicin del plstico, procesamiento y procedimientos
de limpieza, medios de contacto, colorantes, adhesivos, ab- Metales Pesados. Los recipientes deben cumplir los requi-
sorcin, adsorcin, permeabilidad de conservantes y con- sitos para Metales Pesados de Pruebas Fsico Qumicas, en
diciones de almacenamiento pueden afectar la adecuacin Mtodos de Pruebas (6.2.1.3).
de un plstico para un uso especfico. La adecuacin de un
polipropileno caracterstico debe ser establecida por medio Residuo No Voltil. Proceder conforme descrito en Resi-
de pruebas adecuadas. duo No Voltil de Pruebas Fsico Qumicas, en Mtodos
de Pruebas (6.2.1.3), siendo que el Blanco debe ser el mis-
El polipropileno tiene un espectro en el infrarrojo distinto mo solvente utilizado en cada una de las condiciones de
y propiedades trmicas caractersticas. Posee una densidad prueba. La diferencia entre las cantidades obtenidas de la
de 0,880 a 0,913 g/cm3. Las propiedades de permeabilidad Preparacin de la Muestra y del Blanco no debe exceder
de los recipientes en polipropileno moldados pueden ser 10,0 mg cuando el agua mantenida a 70 C es utilizada
alteradas cuando el polmero repulverizado es incorporado, como Medio de Extraccin; no exceder 60,0 mg cuando
dependiendo de su proporcin en el producto final. Otras el alcohol mantenido a 70 C es utilizado como el Medio
propiedades que pueden afectar la adecuacin de polipro- de Extraccin; y no exceder 225,0 mg cuando el hexano
pileno utilizado en recipientes para embalaje de medica- mantenido a 50 C es utilizado como Medio de Extraccin.
mentos incluyen permeabilidad al oxgeno y a la humedad, Los recipientes deben atender a los requisitos para Residuo
mdulo de elasticidad, ndice de fluidez, resistencia a la No Voltil para todos los medios de extraccin.
quiebra bajo tensin ambiental y grado de cristalinidad
despus del moldeo. Nota: hexano y alcohol son inflamables. Al evaporar esos
solventes, utilizar una corriente de aire con bao mara;
Las normas y ensayos suministrados caracterizan recipien- al secar el residuo, utilizar estufa a prueba de explosin.
tes en polipropileno, producidos a partir de homopolmeros
o copolmeros, que son adecuados para envasado de for-
Sustancias Utilizadas en Contacto con Lquidos Orales. y tereftalato de polietileno glicol (PETG) que son usados
Proceder conforme descrito en la Capacidad Tamponan- para embalar formas farmacuticas orales lquidas. Consi-
te de Pruebas Fsico Qumicas, en Mtodos de Pruebas derando que estudios adecuados de estabilidad hayan sido
(6.2.1.3). realizados para determinar la validez de una forma farma-
cutica lquida particular en un recipiente que atienda los
6.2.1.3 RECIPIENTES DE POLI requisitos para recipientes de PET o de PETG, cualquier
(TEREFTALATO DE ETILENO) Y POLI otro recipiente de esas sustancias que atienda a estos requi-
(TEREFTALATO DE ETILENO GLICOL) sitos puede ser utilizado para embalar la misma forma far-
macutica, siempre que programas de estabilidad apropia-
Resinas de poli (tereftalato de etileno) (PET) son polmeros dos sean ampliados para incluir ese recipiente alternativo,
cristalinos de cadena larga preparados por la condensacin para garantizar que la identidad, la fuerza, la calidad y la
del etilenoglicol con dimetil tereftalato o cido tereftlico. pureza de la forma farmacutica sean mantenidas durante
Las resinas de copolmero PET son preparadas de forma toda la validez. La adecuacin de un recipiente de PET o
semejante, excepto que, tambin, pueden contener una pe- de PETG especfico para ser usado en la dispensacin de
quea cantidad de cido isoftlico (inferior a 3% de mol una forma farmacutica oral lquida especfica debe ser es-
de la resina) o 1,4-ciclo-hexano-dimetanol (inferior a 5% tablecida por medio de pruebas adecuadas.
de mol de la resina). La polimerizacin es conducida bajo
condiciones controladas de calor y vaco; con el auxilio de ENSAYOS
catalizadores y estabilizadores.
Espectroscopia de Infrarrojo. Utilizar accesorio de re-
Las resinas de copolmero PET tienen propiedades fsicas flexin total atenuada, proceder conforme descrito en Es-
y espectrales semejantes al PET y, para efectos prcticos, pectrofotometra de absorcin en el infrarrojo (5.2.14). El
son tratadas como PET. Los ensayos y las especificacio- espectro corregido de la muestra presenta bandas de mayor
nes suministradas en esta seccin para caracterizar resinas absorcin apenas en los mismos largos de onda del espec-
y recipientes de PET, se aplican tambin a las resinas de tro de los estndares de referencia, determinados semejan-
copolmero y a los recipientes fabricados a partir de ellas. temente.
Generalmente, el PET y sus resinas de copolmero presentan Calorimetra Diferencial de Barrido. Proceder conforme
un grado elevado de orden en su estructura molecular. Como descrito en el tem Anlisis Trmico en Mtodos de Prue-
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resultado, presentan un comportamiento trmico caracters- bas. Para el tereftalato de polietileno, el termograma de la
tico dependiente de la composicin, incluyendo una tempe- muestra debe ser parecido con el del estndar de referencia,
ratura de transicin vtrea de cerca de 76 C y una tempe- determinado de forma semejante; el punto de derretimiento
ratura de fusin de aproximadamente 250 C. Estas resinas de la muestra (Tm) no debe diferir de los estndares de
tienen un espectro de absorcin de infrarrojo particular que referencia en ms de 9 C y la temperatura de transicin v-
permite la diferenciacin de otros materiales plsticos, como trea en ms de 4 C. Para el tereftalato de polietileno glicol,
policarbonato; poliestireno; polietileno y resinas poli (tere- el termograma de la muestra debe ser parecido con el del
ftalato de etileno glicol) (PETG). El PET y sus resinas de estndar de referencia, determinado de forma semejante; la
copolmero tienen una densidad entre 1,3 y 1,4 g/cm3 y una temperatura de transicin vtrea de la muestra (Tg) no debe
viscosidad intrnseca mnima de 0,7 dL/g, que corresponde a diferir en ms de 6 C de los estndares de referencia.
un peso molecular promedio de cerca de 23.000 Da.
Extraccin de Colorantes. Seleccionar tres recipientes
Las resinas PETG son polmeros de alto peso molecular para el ensayo. Cortar una parte relativamente plana de
preparadas por la condensacin del etilenoglicol con dimetil la pared lateral de un recipiente y apararla en la medida
tereftalato, o cido tereftlico y con 15 a 34% de 1,4-hexa- necesaria para ajustar la muestra al soporte del espectrofo-
no-dimetanol molar. Las resinas PETG son polmeros trans- tmetro. Realizar barrido (5.2.14) para obtener el espectro
parentes, amorfos, con una temperatura de transicin vtrea visible de 350-700 nm de la pared lateral. Con aproxima-
de cerca de 81 C y sin un punto de fusin cristalina, confor- cin de 2 nm, determinar el largo de onda de absorbancia
me determinado por la calorimetra diferencial de barrido. mxima. Llenar los dos recipientes restantes con 50% de
Las resinas PETG tienen un espectro de absorcin infrarrojo etanol para recipientes PET y 25% de etanol para PETG.
particular que posibilita la distincin entre otros materiales Preparar los recipientes con sellados impermeables, como
plsticos, inclusive el PET. Las resinas PETG tienen una una hoja de papel aluminio, y cerrar con las tapas. Llenar
densidad de aproximadamente 1,27 g/cm3 y una viscosidad con el solvente correspondiente un recipiente de vidrio de
intrnseca mnima de 0,65 dL/g, lo que corresponde a un misma capacidad que los recipientes a prueba, prepararlo
peso molecular medio de cerca de 16.000 Da. con sellado impermeable, como una hoja de papel alumi-
nio, y cerrar con una tapa. Incubar los recipientes a prueba
Las resinas PET y PETG no contienen ningn plastificante, y el recipiente de vidrio a 49 C por 10 das. Retirar los
apoyo de procesamiento o antioxidantes. Cuando coloran- recipientes y aguardar que alcancen temperatura ambiente.
tes son utilizados en la fabricacin de recipientes de PET y Concomitantemente, determinar las absorbancias (5.2.14)
de PETG, estos no deben migrar para el lquido. de las soluciones a prueba en clulas de 5 cm en el largo
de onda de absorbancia mxima, utilizando el solvente co-
Las normas y ensayos suministrados en esa seccin ca- rrespondiente del recipiente de vidrio como blanco. Para
racterizan recipientes de tereftalato de polietileno (PET)
ambas las soluciones a prueba, los valores de absorbancia, tracto no debe exceder 0,150, lo que corresponde, como
as, obtenidos no deben ser inferiores a 0,01. mximo, 1 ppm del total de tereftaloila del medio.
Metales Pesados; Total de Tereftalola y Etilenoglicol. Determinar la absorbancia del extracto de n-Heptano en
una clula de 1 cm, en el largo de onda de absorbancia
Medios de extraccin. mxima a cerca de 240 nm (5.2.14), utilizando como blan-
co el medio de extraccin de n-Heptano. La absorbancia
Agua purificada del extracto no debe exceder 0,150, lo que corresponde,
Etanol a 50%. Diluir 125 ml de etanol en agua para 238 como mximo, 1 ppm de tereftaloila del medio.
ml de solucin y homogeneizar.
Etanol a 25%. Diluir 125 ml de Etanol a 50% en agua Etilenoglicol.
para 250 ml de solucin y homogeneizar.
n-Heptano. Solucin de cido peridico. Disolver 125 mg de cido pe-
ridico en 10 ml de agua.
Procedimiento general. Utilizar un medio de extraccin
de Etanol a 50% para recipientes de PET y Etanol a 25% cido sulfrico diluido. Para 50 ml de agua, aadir lenta-
para PETG. Para cada medio de extraccin, llenar un n- mente y en constante agitacin, 50 ml de cido sulfrico y
mero suficiente de recipientes pruebas con 90% de su capa- aguardar que alcance la temperatura ambiente.
cidad nominal para obtener como mnimo 30 ml. Llenar un
nmero correspondiente de recipientes de vidrio con Agua Solucin de bisulfito de sodio. Disolver 0,1 g de bisulfito
purificada, la misma cantidad de recipientes con Etanol a de sodio en 10 ml de agua. Utilizar esa solucin dentro de
50%, o Etanol a 25% y el mismo nmero de recipientes de 7 das.
vidrio con n-Heptano para ser utilizado como blanco de los
medios de extraccin. Colocar en los recipientes sellados Solucin de cromotropato disdico. Disolver 100 mg de
impermeables, como hoja de aluminio, y taparlos. Incubar cromotropato disdico en 100 ml de cido sulfrico. Prote-
los recipientes pruebas y los recipientes de vidrio a 49 C por ger la solucin de la luz y utilizarla dentro de 7 das.
10 das. Retirar los recipientes pruebas con las muestras y
los blancos del medio de extraccin y almacenarlos en tem- Solucin estndar. Disolver una cantidad, precisamente
peratura ambiente. No transferir las muestras del medio de pesada, de etilenoglicol en agua y diluir, cuantitativamen-
6
extraccin para recipientes de almacenamiento alternativos. te, paso a paso, si necesario, para obtener una solucin con
una concentracin de cerca de 1,0 g/ml.
Metales Pesados. Pipetear 20 ml de Agua purificada ex-
trada de los recipientes pruebas, filtrada conforme necesa- Solucin prueba. Utilizar el extracto en Agua purificada.
rio, colocar en uno, o dos tubos de 50 ml para comparacin
de color y guardar el Agua purificada restante para utilizar Procedimiento. Transferir 1 ml de la Solucin estndar
en la prueba de Etilenoglicol. Ajustar el pH del extracto para un baln volumtrico de 10 ml. Transferir 1 ml de la
entre 3,0 y 4,0 con cido actico M o hidrxido de amonio Solucin prueba para un segundo baln volumtrico de 10
6 M, utilizando un papel indicador de corto intervalo de ml. Transferir 1 ml del medio de extraccin en Agua purifi-
pH. Diluir con agua hasta cerca de 35 ml y homogeneizar. cada para un tercer baln volumtrico de 10 ml. Para cada
uno de los tres balones, aadir 100 L de la Solucin de
Pipetear 2 ml de la Solucin estndar de plomo (10 ppm cido peridico, agitar para homogeneizar y dejar reposar
Pb) (5.3.2.3), preparada en el da del uso; transferir para por 60 minutos. Aadir en cada baln 1 ml de la Solucin
un segundo tubo de comparacin de color y aadir 20 ml de bisulfito de sodio y homogeneizar. Aadir 100 L de
de Agua purificada. Ajustar el pH entre 3,0 y 4,0 con cido la Solucin de cromotropato disdico para cada baln y
actico M o hidrxido de amonio 6 M, utilizando un papel homogeneizar. Todas las soluciones deben ser analizadas
indicador de corto intervalo de pH. Diluir con agua hasta hasta 1 hora despus de la adicin de la Solucin de cromo-
cerca de 35 ml y homogeneizar. tropato disdico. Aadir, cuidadosamente, 6 ml de cido
sulfrico cada baln, homogeneizar y esperar que las solu-
En cada tubo, aadir 1,2 ml de tioacetamida SR y 2 ml de ciones alcancen la temperatura ambiente.
Tampn acetato pH 3,5 (5.3.2.3) diluir con agua hasta 50
ml de solucin y homogeneizar. Cualquier color produci- Nota: la diluicin del cido sulfrico produce calor con-
do dentro de 10 minutos en el tubo que contiene el Agua siderable y puede causar la ebullicin de la solucin.
purificada extrada de los recipientes pruebas, no debe ser Realizar esa adicin cuidadosamente. El gas de dixido
ms intenso que el del tubo conteniendo la Solucin estn- de azufre ser liberado. La utilizacin de una cmara de
dar de plomo (10 ppm Pb), ambas visualizadas sobre una extraccin es recomendada.
superficie blanca (lmite 1 ppm).
Diluir cada solucin con cido sulfrico diluido hasta lle-
Total de tereftalola. Determinar la absorbancia del ex- nar el volumen y homogeneizar. Concomitantemente, de-
tracto de Etanol a 50% o de Etanol a 25% en una clula de terminar las absorbancias (5.2.14) de las soluciones a partir
1 cm, en el largo de onda de absorbancia mxima a cerca de la Solucin estndar y de la Solucin prueba en clulas
de 244 nm (5.2.14), utilizando como blanco aquel corres- de 1 cm, en el largo de onda de absorbancia mxima a cer-
pondiente al medio de extraccin. La absorbancia del ex- ca de 575 nm, utilizando como blanco la solucin retirada
del medio de extraccin en Agua purificada. La absorban- temperatura por 10 minutos, en seguida, enfriar para 50 C
cia de la solucin obtenida a partir de la Solucin de prue- abajo de la temperatura mxima de cristalizacin a una tasa
ba no es superior a la de la solucin obtenida a partir de la de 10 C a 20 C por minuto.
Solucin estndar, correspondiendo, como mximo, 1 ppm
de etilenoglicol. Para poli (tereftalato de etileno). Calentar la muestra de
la temperatura ambiente hasta 280 C a una tasa de calen-
MTODOS DE PRUEBAS tamiento de cerca de 20 C por minuto. Mantener la mues-
tra a 280 C por 1 minuto. Enfriar rpidamente la muestra
Reflectancia Interna Mltiple para la temperatura ambiente y recalentarla para 280 C a
una tasa de calentamiento de aproximadamente 5 C por
Equipos. Utilizar espectrofotmetro de infrarrojo capaz de minuto.
corregir para el espectro del blanco y equipado con un ac-
cesorio de reflexin total atenuada y una placa KRS-5 de Para poli (tereftalato de etileno) glicol. Calentar la mues-
reflexin interna. El cristal KRS-5 de 2 mm de espesor, con tra de la temperatura ambiente hasta 120 C a una tasa de
un ngulo de incidencia de 45 da un nmero suficiente de calentamiento de cerca de 20 C por minuto. Mantener la
reflexiones. muestra a 120 C por 1 minuto. Enfriar rpidamente la
muestra para temperatura ambiente y recalentarla para 120
Preparacin de la muestra. Cortar dos porciones pla- C a una tasa de calentamiento de aproximadamente 10 C
nas representativas de la espesor media de la pared del por minuto.
recipiente, y apararlas conforme necesario, para obtener
segmentos adecuados para montaje en el accesorio de re- Pruebas Biolgicas
flectancia interna mltiple. Para evitar rayar la superficie,
limpiar las muestras con papel seco o, si necesario, con un Las Pruebas biolgicas in vitro son realizadas de acuerdo
pao suave humedecido con metanol y aguardar el secado. con los procedimientos establecidos en Pruebas de reacti-
Encajar firmemente las muestras en ambos lados de la pla- vidad biolgica in vitro (6.2.5). Los componentes que satis-
ca de reflexin interna KRS-5, garantizando la superficie facen los requisitos de las Pruebas in vitro no precisan ser
de contacto adecuada. Antes de colocar las muestras sobre sometidos a pruebas adicionales. Ninguna designacin de
la placa, comprimirlas obteniendo pelculas finas unifor- clase de plstico es atribuida a esos materiales. Los materia-
mes para ser expuestas a temperaturas de cerca de 177 C, les que no cumplen los requisitos de las Pruebas in vitro no
6
bajo alta presin (15 000 psi o ms). son adecuados para uso como recipientes de medicamentos.
Procedimiento General. Colocar las partes encajadas de Si la designacin de clase fuese necesaria para plsticos y
la muestra en el accesorio de reflectancia interna mltiple y otros polmeros que atiendan a los requisitos previstos en
colocar el conjunto en el haz de luz del espectrofotmetro de
infrarrojo. Ajustar la posicin de la muestra y los espejos del Pruebas de reactividad biolgica in vitro (6.2.5), realizar la
equipo para permitir la transmisin mxima de luz por el haz prueba in vivo adecuado especificado para Clasificacin
de referencia no-atenuado. Completar los ajustes del acceso- de Plsticos en Pruebas de reactividad biolgica in vivo
rio, atenuar el haz de referencia para permitir la escala total (6.2.6).
de deflexin, durante el barrido de la muestra. Determinar
el espectro infrarrojo de 3500 a 600 cm-1 para polietileno y Pruebas Fsico Qumicas
polipropileno y de 4000 a 400 cm-1 para PET y PETG.
Las siguientes pruebas destinadas a determinar las pro-
Anlisis Trmico piedades fsicas y qumicas de plsticos y sus extractos,
estn basadas en la extraccin de material plstico, siendo
Procedimiento General. Cortar una seccin con peso esencial que la cantidad designada del plstico sea utiliza-
aproximado de 12 mg y colocarla en el compartimiento da. Adems de eso, el rea de superficie especificada debe
para la muestra. El contacto prximo entre el comparti- estar disponible para la extraccin en la temperatura deter-
miento y el termoelemento es esencial para la reproducti- minada.
bilidad de los resultados. Determinar el termograma bajo
nitrgeno, utilizando las condiciones de calentamiento y Parmetros de la prueba:
enfriamiento conforme especificadas para el tipo de resina
y utilizar un equipo capaz de realizar las determinaciones. Medio de Extraccin. A menos que realizada de otra for-
ma en una prueba especfica a continuacin, utilizar Agua
Para Polietileno. Determinar el termograma bajo nitrge- Purificada como medio de extraccin, manteniendo la
no en temperaturas entre 40 C y 200 C, a una tasa de temperatura a 70 C, durante la extraccin para la Prepa-
calentamiento entre 2 C y 10 C por minuto, seguido de racin de la muestra.
enfriamiento para 40 C, a una tasa entre 2 C y 10 C por
minuto. Blanco. Utilizar Agua Purificada donde el blanco es espe-
cificado en las Pruebas que siguen.
Para Polipropileno. Determinar el termograma bajo ni-
trgeno en temperaturas que varen entre la temperatura Equipos. Utilizar bao mara y Recipientes de extraccin,
ambiente y 30 C arriba del punto de fusin. Mantener la conforme descrito en Pruebas de reactividad biolgica in
vivo (6.2.6). Proceder conforme descrito en la Preparacin con agua hasta cerca de 35 ml y homogeneizar. En cada
de equipos en Pruebas de reactividad biolgica in vivo tubo, aadir 1,2 ml de tioacetamida SR y 2 ml de Tampn
(6.2.6). Los recipientes y equipos no precisan ser estriles. acetato pH 3,5 (5.3.2.3), diluir con agua hasta 50 ml de so-
lucin y homogeneizar. Cualquier color producido dentro
Preparacin de la Muestra. A partir de una muestra ho- de 10 minutos en la preparacin que contiene el Extracto
mognea de plstico, utilizar una alcuota para cada 20 ml de la Preparacin de la muestra extrado de los recipientes
de medio de extraccin, equivalente a 120 cm2 del rea pruebas, no debe ser ms intenso que en la Preparacin
de la superficie total (uniendo ambos lados), y subdividida estndar, ambas visualizadas sobre una superficie blanca
en bandas de, aproximadamente, 3 mm de ancho y prxi- (1 ppm en el extracto).
mo a 5 cm de largo. Transferir la muestra subdividida para
una probeta de vidrio tipo I, graduada, de 250 ml con tapa Capacidad Tamponante. Titular, potenciomtricamente,
y aadir cerca de 150 ml de Agua purificada. Agitar por, las alcuotas de 20 ml, previamente recopiladas, del Ex-
aproximadamente, 30 segundos, vaciar, descartar el lqui- tracto de la Preparacin de la muestra para un pH 7,0,
do y repetir un segundo lavado. utilizando cido clorhdrico 0,010 M o hidrxido de sodio
0,010 M, conforme necesario. Tratar, semejantemente, una
Extraccin para Preparacin de la Muestra. Transferir alcuota de 20 ml del Blanco. Si el mismo titulante fuese
la Preparacin de la muestra pronta para un frasco de ex- necesario para ambos los titulados, la diferencia entre los
traccin adecuado y aadir la cantidad solicitada de medio dos volmenes no debe ser superior a 10 ml; y si el cido
de extraccin. Extraer por 24 horas por calentamiento en fuese necesario o para el Extracto de la Preparacin de la
un bao mara en la temperatura especificada para el medio muestra, o para el Blanco, y el lcali para el otro, el total de
de extraccin. Enfriar para temperaturas no abajo de 20 C. los dos volmenes solicitados no debe ser superior a 10 ml.
Pipetear 20 ml del extracto preparado para un recipiente
adecuado. Utilizar esa parte en la prueba para Capacidad 6.2.2 TAPAS DE ELASTMERO
Tamponante. Decantar, inmediatamente, el extracto resi-
dual en un recipiente limpio adecuado y cerrarlo. Tapas de elastmero son fabricadas en materiales obteni-
dos a partir de la polimerizacin, poli adicin o poli con-
Residuo No Voltil. Transferir, en alcuotas adecuadas, 50 densacin de sustancias orgnicas. Los polmeros obteni-
ml del Extracto de Preparacin de la muestra para un cri- dos son, generalmente vulcanizados. Las formulaciones
sol adecuado tarado (preferencialmente un crisol de slice de las tapas contienen elastmeros naturales o sintticos y
6
fundida que haya sido limpiado con cido) y evaporar la aditivos inorgnicos y orgnicos para auxiliar o controlar
parte voltil en un bao a vapor. Evaporar de forma se- la vulcanizacin, proporcionar propiedades fsicas y qu-
mejante 50 ml del Blanco en otro crisol. Si se espera un micas, coloracin, o estabilizar la formulacin de la tapa.
residuo oleoso, examinar repetidamente el crisol durante
la evaporacin y el proceso de secado y reducir la canti- Para tapas formuladas con sustancias de elastmero natu-
dad de calor, si el aceite tiende a deslizar por la pared del rales o sintticas, utilizadas para almacenamiento de largo
crisol. Secar a 105 C por 1 hora. La diferencia entre las plazo. No se aplica a las tapas fabricadas en elastmero de
cantidades obtenidas del Extracto para la Preparacin de silicona, pero se aplica a las tapas tratadas con silicona,
la muestra y el Blanco no debe ser superior a 15 mg. como dimeticona, y tapas revestidas con otros materiales
lubricantes, como materiales ligados qumicamente, o me-
Residuo por incineracin (5.2.10). No es necesario reali- cnicamente a la tapa.
zar esta prueba cuando el resultado de la prueba de Residuo
No Voltil no exceda 5 mg. Proceder con la obtencin de Los comentarios a continuacin se refieren apenas a las
los residuos, a partir del Extracto para la Preparacin de tapas laminadas o revestidas con materiales destinados
la muestra y Blanco descrito en la prueba para Residuo No a suministrar o funcionar como una barrera a la base del
Voltil arriba, utilizando, si necesario, ms cido sulfrico elastmero, por ejemplo poli (tetrafluoretileno) (PTFE) o
para la misma cantidad en cada crisol. La diferencia entre revestimientos barnizados. No es permitida la utilizacin
las cantidades obtenidas de residuo de ignicin a partir del de un material con el intuito de transformar una tapa que no
Extracto para la Preparacin de la muestra y del Blanco se encuentra dentro de las exigencias especficas para una
no debe ser superior a 5 mg. que est en conformidad. Sin embargo, todas las Pruebas
fsico-qumicas se aplican a la frmula base de tales tapas,
Metales Pesados. Pipetear 20 ml del Extracto de la Prepa- as como a las tapas laminadas o revestidas. Las pruebas
racin de la muestra, filtrado, si necesario, para uno de los de funcionalidad deben ser realizadas utilizando tapas de
dos tubos de 50 ml para comparacin de color. Ajustar el elastmero laminadas o revestidas. Las pruebas biolgi-
pH entre 3,0 y 4,0 con cido actico M o hidrxido de amo- cas se aplican a los materiales revestidos o laminados, as
nio 6 M, utilizando un papel indicador de corto intervalo de como a la frmula base. Las pruebas biolgicas pueden ser
pH. Diluir con agua hasta cerca de 35 ml y homogeneizar. realizadas en tapas o materiales revestidos o laminados y
en tapas no laminadas y no revestidas, siendo que los re-
Pipetear 2 ml de Solucin estndar de plomo (10 ppm Pb) sultados deben ser reportados, separadamente. La frmula
(5.3.2.3), transferir para el segundo tubo para comparacin base, utilizada en las pruebas fsico- qumicas, o biolgicas
de color y aadir 20 ml del Blanco. Ajustar el pH entre 3,0 debe cumplir las especificaciones de una tapa con barrera
y 4,0 con cido actico M o hidrxido de amonio 6 M, uti- de revestimiento que debe ser similar al revestimiento de la
lizando un papel indicador de corto intervalo de pH. Diluir tapa en configuracin y tamao.
Las pruebas de esa seccin se limitan a las tapas de elas- cacin adecuadas. Ejemplos de algunas pruebas analticas
tmero de los Tipos I y II, siendo que las del Tipo I son que pueden ser empleadas incluyen densidad especfica,
utilizadas para preparaciones acuosas y las del Tipo II son anlisis de cenizas, determinacin del contenido de azufre,
normalmente destinadas a las preparaciones no acuosas. Si cromatografa en capa delgada del extracto, espectrofoto-
una tapa no atiende a todas las exigencias de la prueba del metra de absorcin ultravioleta del extracto, o espectrofo-
Tipo I, pero atiende a las exigencias para la prueba del Tipo tometra de absorcin.
II, la tapa recibe la clasificacin final del Tipo II.
PROCEDIMIENTOS DE PRUEBAS
En esa seccin se propone realizar una clasificacin inicial
para identificar tapas de elastmero que pueden ser apro- Las tapas de elastmero deben estar en conformidad con
piadas para el uso con preparaciones inyectables, con base las exigencias biolgicas; fsico-qumicas y funcionales.
en sus compatibilidades biolgicas; en las propiedades f-
sico-qumicas de sus extractos acuosos y en sus funcionali- Como las tapas de elastmero son procesadas por el pro-
dades. Todas las tapas de elastmero adecuadas para uso en veedor antes de la distribucin para el usuario final, el pro-
preparaciones inyectables cumplen tanto con los lmites de veedor debe demostrar la conformidad de las tapas expues-
la prueba del Tipo I como del Tipo II. Sin embargo, con esa tas a las etapas de procesamiento o esterilizacin. De modo
especificacin no se tiene el intuito de servir como un ni- anlogo, si las tapas de elastmero recibidas por el usuario
co criterio de evaluacin para la seleccin de tales tapas. final fueren procesadas, o esterilizadas, subsiguientemente,
el usuario final es responsable en comprobar la conformi-
Entre los requisitos para evaluacin de tapas que estn ade- dad continuada de las tapas subsiguientes a las condiciones
ms del mbito de esa seccin est el establecimiento de de procesamiento o esterilizacin. Eso es importante si las
pruebas de identificacin y especificaciones de la tapa, la tapas son expuestas a procesos o condiciones que puedan
verificacin de la tapa, compatibilidad fsico qumica del tener impacto significativo en las caractersticas biolgi-
producto, la identificacin y la determinacin de seguridad cas, fsico-qumicas o funcionales de la tapa, como la ra-
de tapas filtrables encontradas en el embalaje del producto, diacin gamma.
la verificacin de la funcionalidad del embalaje del pro-
ducto bajo condiciones reales de almacenamiento y condi- Para tapas que normalmente son lubricadas con silicona
ciones de uso. antes del uso, es permitido realizar la prueba fsico-qu-
mica en tapas no lubricadas para evitar interferencia po-
6
El usuario de las tapas debe obtener del proveedor una ga- tencial de mtodo y/o dificultades en la interpretacin de
ranta de que la composicin de la tapa no vara y de que es los resultados de la prueba. Para tapas suministradas con
la misma utilizada en la prueba de compatibilidad. Cuando otros lubricantes no oclusivos, todas las pruebas deben ser
el proveedor informa al usuario final sobre cambios en la realizadas utilizando la tapa revestida.
composicin, la prueba de compatibilidad debe ser repeti-
da, total o parcialmente, dependiendo de la naturaleza de Para tapas revestidas, o laminadas con revestimientos des-
los cambios. tinados a proporcionar una funcin de barrera, como PTFE,
o revestimientos barnizados, las Pruebas fsico-qumicas
CARACTERSTICAS sern aplicadas al elastmero con base no revestida, as
como a las tapas revestidas. La tapa no revestida sometida
Las tapas de elastmero son translcidas, u opacas y no a las Pruebas fsico-qumicas debe ser similar a la tapa re-
tienen coloracin caracterstica, dependiendo de los aditi- vestida en tamao y configuracin. Los usuarios finales de
vos utilizados. Son homogneas y prcticamente exentas tapas revestidas, tambin, son responsables en comprobar
de materiales luminosos y accidentales, como fibras, part- la conformidad de esas tapas con las de las especificacio-
culas extraas, y residuos de caucho. nes fsico- qumicas, procesadas o tratadas de una manera
que simula las condiciones normalmente empleadas por el
IDENTIFICACIN usuario final antes del uso.
Las tapas son fabricadas a partir de una amplia variedad de En todos los casos es adecuados documentar las condicio-
materiales elastomricos y revestimientos polimricos op- nes de procesamiento, pre-tratamiento, esterilizacin o lu-
cionales. Por tanto, en esa seccin no se especifica pruebas bricacin de la tapa cuando se relatan los resultados.
de identificacin envolviendo todas las posibles presenta-
ciones de las tapas. Es de responsabilidad del proveedor En la Tabla 1 estn resumidas las exigencias de las pruebas
de la tapa y del fabricante del producto acabado verificar de las tapas y las responsabilidades del proveedor y del
la formulacin de la tapa y cualquier material revestido, o usuario final.
laminado utilizado de acuerdo con las pruebas de identifi-
Tabla 1 - Exigencias de las pruebas de las tapas y las responsabilidades del proveedor.
Tipos de tapas (como
Pruebas Fsico qumicas Pruebas de Funcionalidad Pruebas Biolgicas
suministrados o Usados)
Tapas con o sin Las Pruebas deben ser Las Pruebas deben ser Las Pruebas deben ser
revestimiento de silicona realizadas El uso de realizadas realizadas El uso de
silicona es opcional El uso de silicona es silicona es opcional
Responsabilidad: proveedor opcional Responsabilidad: Responsabilidad: proveedor
y usuario final proveedor y usuario final y usuario final
Tapas con revestimientos Las Pruebas deben Las Pruebas deben Las Pruebas deben
lubricantes (Materiales no ser realizadas en tapas ser realizadas en tapas ser realizadas en tapas
oclusivos, no silicona) revestidas Responsabilidad: revestidas Responsabilidad: revestidas Responsabilidad:
proveedor y usuario final proveedor y usuario final proveedor y usuario final
Tapas con revestimientos Las Pruebas deben Las Pruebas deben Las Pruebas deben
oclusivos ser realizadas en tapas ser realizadas en tapas ser realizadas en tapas
revestidas Responsabilidad: revestidas Responsabilidad: revestidas
proveedor y usuario final proveedor y usuario final O:
Y: Las Pruebas deben ser
Las Pruebas deben ser realizadas en tapas no
realizadas en tapas no revestidas (frmula base)
revestidas (frmula base) y material laminado/
Responsabilidad: proveedor revestido (reportar los
resultados separadamente)
Responsabilidad: proveedor
y usuario final.
6
PRUEBAS BIOLGICAS las tapas y pesar. Cubrir la boca del frasco con un vaso de
precipitados de vidrio del Tipo I. Esterilizar en una autocla-
Son indicadas dos etapas de prueba. La primera etapa es ve, de modo que la temperatura de 121 C 2 C sea alcan-
la realizacin de la prueba in vitro. Los materiales que no zada dentro de 20 a 30 minutos y mantener esa temperatura
atienden las exigencias de la prueba in vitro son sometidos durante 30 minutos. Dejar enfriar hasta alcanzar tempera-
a la segunda atapa de pruebas in vivo, conforme descrito tura ambiente durante un perodo de aproximadamente 30
en Pruebas de reactividad biolgica in vivo (6.2.6). Los minutos. Aadir agua purificada o agua para inyectables
materiales que atienden las exigencias para las Pruebas in para volver a la masa original. Agitar, decantar inmedia-
vitro no necesitan ser sometidos a la prueba in vivo. tamente y recoger el lquido. Ese lquido debe ser agitado
antes de ser utilizado en cada una de las pruebas.
Las tapas Tipo I y Tipo II deben estar en conformidad con
las Pruebas de reactividad biolgica in vitro e in vivo. Preparacin del Blanco
Colocar las tapas enteras, no cortadas, correspondientes a Apariencia de la Preparacin (Turbidez y Coloracin)
un rea de superficie de (100 10) cm2 en un recipiente
de vidrio adecuado. Cubrir las tapas con 200 ml de agua Determinacin de la Turbidez
purificada o agua para inyectables. Se no es posible obte-
ner una tapa con el rea de superficie prescrita utilizando La determinacin de la turbidez puede ser realizada por
tapas no cortadas, seleccionar un nmero de tapas que irn medio de comparacin visual (Procedimiento A), o instru-
a aproximarse de 100 cm2, y ajustar el volumen de agua mentalmente utilizando un turbidmetro adecuado (Procedi-
utilizado para el equivalente a 2 ml para cada 1 cm2 del miento B). La evaluacin instrumental de la turbidez da una
rea de superficie real de la tapa utilizada. Hervir por 5 prueba que no depende de la acuidad visual del analista.
minutos y enjuagar cinco veces con agua purificada o agua
para inyectables fra. Solucin de Sulfato de Hidracina. Disolver 1,0 g de sul-
fato de hidracina en agua y diluir con agua a 100,0 ml.
Colocar las tapas lavadas en un frasco de vidrio de cuello Dejar en reposo durante 4 a 6 horas.
largo del Tipo I, aadir la misma cantidad de agua purifica-
da o agua para inyectables, inicialmente adicionada a
Procedimiento A. Comparacin Visual Utilizar tubos examinada es como descrito arriba, o si su opalescencia no
de ensayo idnticos, de vidrio incoloro; transparente y neu- es ms pronunciada del que la Suspensin de Referencia A
tro; con una base plana y un dimetro interno de 15 a 25 (consultar la Tabla 3).
mm. Llenar un tubo con largo de 40 mm con la Prepara-
cin S, un tubo de mismo largo con agua y cuatro otros tu- Procedimiento B. Comparacin Instrumental: Medir la
bos de mismo largo con las Suspensiones de Referencia A, turbidez de las Suspensiones de Referencia en un turbid-
B, C y D. Comparar las preparaciones a luz del da difusa 5 metro calibrado adecuado. El blanco debe ser probado y
minutos despus de la preparacin de las Suspensiones de los resultados corregidos para el blanco. Las Suspensiones
6
Referencia, visualizando, verticalmente, contra un fondo de Referencia A, B, C y D representan 3, 6, 18 y 30 Uni-
negro. Las condiciones de luz deben ser tales que la Sus- dades de Turbidez Nefelomtricas (UTN) respectivamente.
pensin de Referencia A pueda ser rpidamente distinguida Medir la turbidez de la Solucin S utilizando el turbidme-
del agua y que la Suspensin de Referencia B pueda ser tro calibrado.
rpidamente distinguida de la Suspensin de Referencia A.
Lmite. La turbidez de la Solucin S no debe ser mayor del
Lmite. La Preparacin S no debe ser ms opalescente que que aquella para la Suspensin de Referencia B (6 UTN)
la Suspensin de Referencia B para las tapas del Tipo I, y para las tapas del Tipo I, y no es mayor que la de la Sus-
no ms opalescente del que a Suspensin de Referencia C pensin de Referencia C (18 UTN) para las tapas del Tipo
para las tapas del Tipo II. La Preparacin S es considerada II (Tabla 3).
lmpida si la claridad es la misma que la del agua cuando
Procedimiento. Utilizar tubos idnticos, de vidrio neutro, Lmite. La Preparacin S no debe ser ms intensamente
incoloro, transparente, con un fondo plano y dimetro in- colorida que el Estndar de Color.
Solucin de Azul de Bromotimol. Disolver 50 mg de azul Procedimiento. Proceder como realizado para el Mtodo 1
de bromotimol en una mezcla de 4 ml de hidrxido de sodio en Metales Pesados. Usar 10,0 ml de la Preparacin S, en
a 0,02 M y 20 ml de alcohol. Diluir con agua para 100 ml. la preparacin problema.
Procedimiento. Aadir 0,1 ml de la solucin de azul de Lmite. 2 ppm de metales pesados como plomo.
bromotimol a 20 ml de la Preparacin S.
Zinc Extrable.
Si la preparacin se queda amarilla, titular con hidrxido
de sodio a 0,01 M hasta que el punto final azul sea alcan- Solucin Prueba. Preparar una Solucin Prueba por me-
zado. dio de la diluicin de 10,0 ml de la Preparacin S para 100
ml con cido clorhdrico a 0,1 M. Preparar el blanco de la
Si la preparacin se queda azul, titular con cido clorhdri- prueba similarmente, utilizando el blanco para la Prepa-
co a 0,01 M hasta que el punto final amarillo sea alcanzado. racin S.
Si la preparacin se queda verde, ella es neutra y no es Solucin Estndar de Zinc. Preparar una solucin (10
necesaria la titulacin. ppm de Zn) disolviendo sulfato de zinc en cido clorh-
drico 0,1 M
Correccin del Blanco. Probar 20 ml del blanco de modo
similar. Corregir los resultados obtenidos para la Prepara- Soluciones de Referencia. Preparar, como mnimo, 3 So-
cin S a travs de la sustraccin o adicin del volumen de luciones de Referencia por medio de la diluicin de la So-
titulante requerido para el blanco, como apropiado. lucin Estndar de Zinc con cido clorhdrico 0,1 M. Las
concentraciones de zinc en estas Soluciones de Referencia
Lmite. No ms que 0,3 ml de hidrxido de sodio a 0,01 M son la extensin del lmite esperado de la Solucin Prueba.
produce un color azul, o no ms que 0,8 ml de cido clor-
hdrico a 0,01 M produce un color amarillo, o la titulacin Procedimiento. Utilizar un espectrmetro de absorcin
no es necesaria. atmica; adecuado y equipado con una fuente de radiacin
electromagntica, adecuada y una llama de aire acetileno.
6
Absorbancia Un procedimiento alternativo como un anlisis por espec-
trometra de masa o espectrometra de emisin ptica con
Procedimiento. Realizar esta prueba en el espacio de tiem- plasma inductivamente acoplado, apropiadamente valida-
po de 5 horas despus de desarrollar la Preparacin S. Fil- do puede ser utilizado.
trar la Preparacin S a travs de un filtro con poro de 0,45
m, descartando el primer ml de lo filtrado. Medir la absor- Probar cada una de las Soluciones Referencia en largo de
bancia de lo filtrado en largos de onda entre 220 y 360 nm onda para Zinc seleccionado en 213,9 nm, por lo menos 3
en una clula de 1 cm utilizando el blanco en una clula de veces. Registrar las lecturas estables. Enjuagar el equipo
correspondencia en un haz de referencia. Si la diluicin del con la solucin blanco, toda vez para garantizar que la lec-
filtrado es necesaria antes de la medida de la absorbancia, tura retorna al valor inicial del blanco. Preparar una curva
corregir los resultados de la prueba para la diluicin. de calibracin a partir de la media de las lecturas obtenidas
para cada Solucin de Referencia. Registrar la absorban-
Lmite. Las absorbancias en todos esos largos de onda no cia de la Solucin Prueba. Determinar la concentracin de
deben exceder 0,2 para las tapas del Tipo I o 4,0 para las zinc en ppm de la Solucin Prueba utilizando la curva de
tapas del Tipo II. calibracin.
Solucin Estndar de Amonio. Preparar una solucin de nal. Ajustar las tapas que sern examinadas, cerrar con una
cloruro de amonio en agua (1 ppm de NH4). Mezclar 10 tapa y dejar en reposo por 16 horas.
ml de la solucin de 1 ppm de cloruro de amonio con 5 ml
de agua y 0,3 ml de solucin de tetrayodomercurato (II) de Tapas para Preparaciones Secas. Ajustar las tapas a ser
potasio alcalina. Cerrar el recipiente. examinadas en 12 frascos limpios y cerrar cada uno con
una tapa.
Lmite. Despus de 5 minutos, cualquier color amarillo en
la Solucin Prueba no debe ser ms oscuro que en la Solu- Procedimiento. Utilizando una aguja hipodrmica como
cin Estndar de Amonio (como mximo, 2 ppm de NH4 descrito anteriormente, ajustada a una jeringa limpia, in-
en la Preparacin S). yectar dentro de cada frasco 1 ml de agua, mientras se re-
mueve 1 ml de aire. Repetir ese procedimiento 4 veces para
Sulfuros Voltiles cada tapa, perforar cada vez en un local diferente. Utilizar
una nueva aguja para cada tapa, verificando si ella no se
Procedimiento. Colocar las tapas, cortar si necesario, con rompi durante la prueba. Filtrar el volumen total del l-
un rea de superficie total de (20 2) cm2 en un frasco de quido en todos los frascos a travs de un filtro simple con
100 ml, y aadir 50 ml de una solucin de cido ctrico a 20 tamao nominal de poro no mayor que 0,5 m. Contar los
g por L. De la misma manera y al mismo tiempo, preparar fragmentos de caucho en la superficie del filtro visibles a
una solucin control en un frasco de 100 ml separado por ojo.
medio de la disolucin de 0,154 mg de sulfuro de sodio
en 50 ml de una solucin de cido ctrico a 20 g por L. Lmite. No hay ms que 5 fragmentos visibles. Ese lmite
Colocar un pedazo de papel de acetato de plomo sobre la est basado en la asuncin de que los fragmentos con un
boca de cada frasco, y agarrar el papel en la posicin, co- dimetro superior a 50 m son visibles a ojo. En el caso
locndolo sobre un frasco de pesaje invertido. Caliente los de dudas o controversia, las partculas son examinadas mi-
frascos en autoclave a 121 C 2 C por 30 minutos. croscpicamente para verificar sus naturalezas y tamaos.
6
PRUEBAS FUNCIONALES tapar. Utilizando una nueva aguja hipodrmica como ante-
riormente para cada tapa, perforar cada tapa 10 veces, cada
Las muestras tratadas como descrito para obtener la Prepa- vez en un local diferente. Sumergir los 10 frascos en una
racin S y secas al aire deben ser utilizadas para las Prue- solucin de azul de metileno a 0,1% (1 g por L), y reducir
bas de Funcionalidad; de Penetrabilidad; Fragmentacin la presin externa por 27 kPa por 10 minutos. Restaurar la
y Capacidad Autosellante. Las Pruebas de Funcionalidad presin atmosfrica, y dejar los frascos inmersos por 30
son realizadas en tapas destinadas a ser penetradas por una minutos. Enjuagar la parte externa de los frascos.
aguja hipodrmica. La prueba de Capacidad autosellante
es necesaria apenas para tapas destinadas para recipientes Lmite. Ninguno de los frascos debe contener cualquier
de dosis mltiple. La aguja especificada para cada prueba trazo de solucin azul.
es una aguja hipodrmica lubricada con bisel largo (ngulo
del bisel 12 2)2. 6.2.3 1 RECIPIENTES DE
Penetrabilidad PLSTICO PRUEBAS DE
DESEMPEO
Procedimiento. Llenar 10 frascos adecuados al volumen
nominal, con agua, ajustar las tapas a ser examinadas y ce- En esa seccin estn propuestos estndares para las pro-
rrar los frascos con las respectivas tapas. Utilizando una piedades funcionales de recipientes plsticos y sus com-
nueva aguja hipodrmica, como ya descrito, para cada tapa, ponentes utilizados para acondicionar medicamentos. Las
perforar la tapa con la aguja perpendicular a la superficie. Pruebas a continuacin son establecidas para determinar
la permeabilidad a la humedad y transmisin de luz de los
Lmite. La fuerza para perforacin de cada tapa no debe recipientes plsticos aplicables a cada tipo de embalaje.
ser mayor que 10 N (1 kgf), determinada con una precisin
de 0,25 N (25 gf). Un recipiente destinado a suministrar proteccin a la luz,
o presentado como recipiente resistente a la luz debe sa-
Fragmentacin tisfacer la exigencia de Prueba de Transmisin de la luz
(6.2.3.5), donde la proteccin, o la resistencia es debido
Tapas para Preparaciones Lquidas. Llenar 12 frascos a las propiedades especficas del material de que el reci-
limpios con agua hasta 4 ml menos que la capacidad nomi- piente es compuesto, incluyendo cualquier revestimiento
aplicado a l. Un recipiente claro e incoloro, o translcido,
fabricado como resistente a la luz por medio de inclusin
2 Se refiere a la ISO 7864, agujas hipodmicas estrileis de uso nico con de compuesto opaco est exento de los requisitos del tem
un dimetro externo de 0,8 mm (calibre 21). Pruebas de Transmisin de luz (6.2.3.5). De la forma como
utilizado en ese captulo, el trmino recipiente se refiere al V es el volumen en ml del recipiente, (TF TI) es la dife-
sistema completo incluyendo el recipiente en s, el revesti- rencia en mg entre el peso final e inicial de cada recipiente
miento cuando utilizado, el cierre en el caso de recipientes prueba; (CF CI) es la diferencia en mg entre el promedio
de unidades mltiples y las tapas y blster en los casos de final y el promedio inicial de los pesos de los 2 controles.
recipientes de dosis unitaria.
Tabla 1 - Momento aplicable al recipiente con tapa tipo rosca.
6.2.3.1 RECIPIENTES DE MLTIPLES
Intervalo de apriete
UNIDADES PARA CPSULAS Y Dimetro de Cierre sugerido con momento
COMPRIMIDOS (mm) aplicado manualmente
Desecante. Colocar una cantidad de cloruro de calcio an- (pulgadas / libras)
hidro (1) de 4 a 8 mesh en un recipiente raso, teniendo el 8 5
cuidado de excluir cualquier polvo fino, secar a 110 C du- 10 6
rante una hora y enfriar en un desecador. 13 8
15 5-9
Procedimiento. Seleccionar 12 recipientes de tamaos y 18 7-10
tipo uniformes, limpiar las superficies de cierre con un pao 20 8-12
exento de fibras, cerrar y abrir cada recipiente 30 veces. Ta- 22 9-14
par firme y uniformemente toda vez que el recipiente es ce- 24 10-18
rrado. Tapar los recipientes con tapa de rosca con movimien- 28 12-21
to de momento que est dentro del intervalo especificado en 30 12-23
la Tabla 1. Aadir desecantes a 10 recipientes, designados 33 15-25
recipientes pruebas, llenar cada uno hasta 13 mm del cierre 38 17-26
si el volumen fuese de 20 ml o superior, o llenar cada uno 43 17-27
hasta dos tercios de la capacidad si el volumen del recipiente 48 19-30
fuese inferior a 20 ml. Si la parte interna del recipiente posee 53 21-36
ms de 63 mm de profundidad, un embudo inerte o separa- 58 23-40
dor debe ser colocado en el fondo para minimizar el peso 63 25-43
total del recipiente y del desecante; la capa de desecante en 66 26-45
6
tal recipiente no debe ser inferior a 5 cm en profundidad. 70 28-50
Cerrar cada uno, inmediatamente despus de la adicin del 83 32-65
desecante, aplicando el momento designado en la Tabla 1 en 86 40-65
el caso de recipientes con tapa de rosca. Para cada uno de los 89 40-70
2 recipientes remanentes, designados como controles, aadir 100 45-70
un nmero suficiente de esferas de vidrio para alcanzar un 110 45-70
peso aproximadamente igual a los de los recipientes pruebas 120 55-95
y cerrar aplicando el momento designado en la Tabla 1 en el 132 60-95
caso de recipientes con tapa a rosca. Registrar el peso de los a El momento designado para el prximo dimetro de cierre mayor debe
recipientes, individualmente, as, preparados hasta la apro- ser aplicado en los recipientes prueba que tengan un dimetro de cierre
intermedio a los dimetros listados.
ximacin de 0,1 mg si el volumen del recipiente es inferior
b utilizar equipamiento adecuado para medicin de momento.
a 20 ml, o hasta la aproximacin en mg ms prximo si el
volumen del recipiente es de 20 a 200 ml, o hasta a aproxi- Para recipientes utilizados en medicamentos concedidos
macin en centigramos (10 mg) si el volumen es de 200 ml bajo prescripcin, los recipientes as probados son del tipo
o superior. Almacenar a la humedad relativa de (75 3) % y recipientes sellados, si no ms que uno de los 10 recipien-
a la temperatura de 23 C 2 C. Un sistema saturado de 35 tes pruebas excede a 100 mg por da por L en permeabili-
g de cloruro de sodio para cada 100 ml de agua colocado en dad a la humedad, y ninguno excede a 200 mg por da por
el fondo del desecador mantiene la humedad especificada, L. Para recipientes utilizados para medicamentos dispen-
u otros mtodos pueden ser empleados para mantener esas sados bajo prescripcin, los recipientes son bien cerrados
condiciones. Despus de 336 h 1 h (14 das), registrar el si no ms que uno de los 10 recipientes pruebas excede a
peso de los recipientes individualmente de la misma forma. 2000 mg por da por L en permeabilidad a la humedad y
Llenar, completamente, 5 recipientes vacos del mismo ta- ninguno excede a 3000 mg por da por L.
mao y tipo de los recipientes pruebas con agua o un slido
no compresible, de flujo libre tal como esferas de vidrio pe- RECIPIENTES DE UNIDADES MLTIPLES PARA
queas bien acomodadas hasta nivel indicado por la superfi- CPSULAS Y COMPRIMIDOS (sin cierre)
cie del cierre. Transferir el contenido de cada recipiente para
una probeta graduada, y determinar el volumen promedio Recipiente de Polietileno. Cerrar los recipientes, con se-
del recipiente en ml. Calcular la tasa de permeabilidad a la llos impenetrables obtenidos por medio de sellado caliente
humedad, en mg por da, por L, por medio de la frmula: con una hoja de aluminio laminada con polietileno u otro
sellado adecuado. Probar los recipientes conforme descri-
(1000/14V)[(TF-TI)-(CF-CI)] to arriba. Los recipientes de polietileno de alta densidad,
en que probados atienden a los requisitos si la permeabilidad a la
humedad excede 10 mg por da por L, como mximo, en
1 de los 10 recipientes pruebas y no excede 25 mg por da la prueba y considerar vlida apenas las primeras determi-
por L en ninguno de ellos. Los recipientes de polietileno naciones. Retornar los recipientes a la cmara de humedad.
de baja densidad, as, probados atienden a los requisitos si Calcular la tasa de penetracin de humedad en mg por da
la permeabilidad a la humedad excede 20 mg por da por de cada recipiente utilizando a frmula:
L, como mximo, en 1 de los 10 recipientes pruebas y no
excede 30 mg por da por L en ninguno de ellos. (1/N) [ (WF WI) (CF CI) ]
6
embalaje utilizado deben ser determinadas. embalajes, como mnimo, 4 y un total de, como mnimo,
10 recipientes de dosis unitaria o blster llenados con una
Desecante. Secar las pastillas desecantes apropiadas a 110 pastilla en cada unidad a ser probada. Sellar un nmero co-
C durante 1 hora antes del uso. Utilizar pastillas con peso rrespondiente de embalajes vacos, cada uno conteniendo
aproximado de 400 mg cada una y con dimetro de, apro- el mismo nmero de recipientes de dosis unitaria o blster
ximadamente, 8 mm. Si necesario, debido a la dimensin iguales a los utilizados en los embalajes pruebas, como
limitada del recipiente de dosis unitaria, pueden ser utili- controles. Almacenar todos los recipientes en humedad re-
zadas pastillas pesando menos que 400 mg cada una y con lativa de (75 3) % y a la temperatura de 23 C 2 C. Un
dimetro inferior a 8 mm. sistema saturado de 35 g de cloruro de sodio para cada 100
ml de agua, colocado en el fondo del desecador mantiene
PROCEDIMIENTO la humedad requerida, u otros mtodos pueden ser emplea-
dos para mantener esas condiciones. Despus de 24 horas
Mtodo I. Sellar no menos que 10 recipientes de dosis uni- y cada 24 horas subsiguientes, retirar los embalajes de la
taria con una pastilla cada uno, y sellar 10 unidades adicio- cmara y dejar que se equilibren a temperatura ambiente
nales de recipientes de dosis unitaria vacos para control, durante aproximadamente 45 minutos. Registrar los pesos
utilizando dedos de guantes o una pinza almohadada para de los embalajes individuales y retornarlos a la cmara.
manipular los recipientes sellados. Numerar los recipientes Pesar los embalajes control como una unidad y dividir el
y registrar los pesos, individualmente, con la aproximacin peso total por el nmero de embalajes control para obte-
en mg ms prxima. Pesar los controles como una unidad y ner el peso promedio de los embalajes vacos. Si cualquier
dividir el peso total por el nmero de controles para obtener pastilla indicadora adquiere una coloracin rosa durante el
el promedio. Almacenar todos los recipientes a una hume- procedimiento o si el peso promedio de la pastilla excede
dad relativa de (75 3) % y a una temperatura de 23 C a 10% en cualquiera de los embalajes, finalizar la prueba
2 C. Un sistema saturado de 35 g de cloruro de sodio para y considerar vlidas apenas las primeras determinaciones.
cada 100 ml de agua colocado en el fondo de un desecador Calcular la tasa promedio de penetracin de humedad, en
mantiene la humedad especificada, u otros mtodos pueden mg por da para cada recipiente de dosis unitaria o blster,
ser empleados para mantener esas condiciones. Despus de en cada embalaje de acuerdo con la frmula:
un intervalo de 24 horas, y en cada uno de sus mltiplos,
retirar los recipientes de la cmara, y dejar equilibrar du- (1/NX) ([WF-WI) (CF CI) ]
rante 15 a 60 minutos en el rea de pesaje. Nuevamente
registrar el peso de los recipientes individualmente y los en que
controles combinados de la misma manera. Si ninguna pas- N es el nmero de das transcurridos dentro del perodo de
tilla indicadora se torna rosa durante los procedimientos, o la prueba (comenzando despus de las 24 horas iniciales de
si el aumento de peso de la pastilla excede 10%, finalizar perodo de equilibrio);
X es el nmero de unidades selladas separadamente por tapa). Seleccionar 10 recipientes de tipo y tamao unifor-
embalaje; mes y limpiar las superficies de sellado con un pao exento
(WF WI) es la diferencia en mg entre los pesos iniciales y de fibras. Montar cada recipiente con el tapn, si aplicable,
finales de cada embalaje prueba; y sistema de cierre. Numerar cada sistema de cierre y re-
(CF CI) es la diferencia en mg entre los pesos promedios gistrar el peso tarado.
finales e iniciales de los embalajes control, siendo esas ta-
sas calculadas hasta dos cifras significativas. Retirar los cierres y con el auxilio de una pipeta, llenar los
recipientes con agua hasta la capacidad mxima. Montar
Lmites. Los recipientes de dosis unitaria individuales, los recipientes con los sellados y aplicar los cierres. Si fue-
como probados en el Mtodo I, son clasificados como Cla- ren utilizadas tapas de rosca, aplicar el momento especifi-
se A si, como mximo, 1 de los 10 recipientes probados cado en la Tabla 1 en Recipientes de mltiples unidades
excede 0,5 mg por da en tasa de penetracin de humedad para cpsulas y comprimidos (6.2.3.1) y almacenar los re-
y ninguno excede 1 mg por da; son clasificados como Cla- cipientes cerrados a temperatura de 25 C 2 C y hume-
se B si, como mximo, 1 de los 10 recipientes probados dad relativa de (50 2)%. Despus de 168 h 1 h (7 das),
excede 5 mg por da y ninguno excede 10 mg por da; son registrar el peso de los recipientes individualmente. Retor-
clasificados como Clase C si, como mximo, 1 de los 10 nar los recipientes al local de almacenamiento durante 168
recipientes probados excede 20 mg por da y ninguno ex- h 1 h ms. Despus de transcurrido el segundo perodo
cede 40 mg por da y son clasificados como Clase D si los de 168 h 1 h, retirar los recipientes, registrar los pesos
recipientes probados no cumplen ninguno de esos requisi- de cada sistema de recipiente, individualmente, y calcular
tos de tasa de penetracin de humedad. la tasa de penetracin de vapor de agua, en porcentaje de
prdida de peso de agua, para cada recipiente por medio de
Los embalajes, de la forma como son probados en el M- la frmula:
todo II, son clasificados como Clase A si ningn embalaje
probado excede 0,5 mg por da de tasa de penetracin de (W7 W14) 365 x 100/(W7-Wt)7 = Porcentaje por ao
humedad promedio por blster; son clasificados como Cla-
se B si ningn embalaje probado excede 5 mg por da de En que
tasa de penetracin de humedad en promedio por blster; W7 es el peso en mg del recipiente a los 7 das; W14 es el
son clasificados como Clase C si ningn embalaje exce- peso en mg del recipiente a los 14 das;
de 20 mg de tasa de humedad en promedio por blster y WT es el peso de la tara en g;
6
son clasificadas como Clase D si ningn embalaje probado
cumple los requisitos de tasa de penetracin de humedad 7 es el tiempo de prueba en das, despus de 7 das de pero-
en promedio por blster arriba mencionados. do de equilibrio. Los recipientes as probados cumplen los
requisitos y son considerados como recipientes firmemente
Con el uso del desecante descrito en el Mtodo I y Mto- sellados si el porcentaje de prdida de peso de agua excede
do II, despus de cada 24 horas, los recipientes pruebas y 2,5% por ao, como mximo, en 1 de los 10 recipientes
controles son pesados; los intervalos de prueba adecuados probados y no excede a 5,0%, por ao, en ninguno de ellos.
para los pesajes finales, WF y CF, deben ser los siguientes:
24 horas para Clase D; 48 horas para Clase C; 7 das para Los recipientes de dosis unitaria para lquidos cumplen los
Clase B y, como mnimo, 28 das para Clase A . requisitos de un recipiente firmemente sellado si el peso
promedio en prdida de peso de agua es inferior o igual a
6.2.3.3 RECIPIENTES DE DOSIS 2,5% (p/p) por ao y 5% al final de 2 aos.
MLTIPLE Y DE DOSIS UNITARIA PARA
LQUIDOS Procedimiento para Pruebas de Recipientes de Dosis
Mltiples en Condiciones de Uso. Seleccionar 10 reci-
Los estndares y las pruebas presentados en esta seccin pientes de tipo y tamao uniformes. Se es utilizado un sella-
son usados para medir las caractersticas funcionales y de do interno, abrir los recipientes, cuidadosamente, y retirar
desempeo de recipientes plsticos utilizados para embalar los sellados internos de cada uno. Montar cada recipiente
productos acuosos por medio de la medida de la prdida de con tapn, si aplicable, y su sistema de cierre. Numerar
peso de agua lquida como un porcentaje de su contenido. cada sistema de cierre de recipiente y registrar el peso de
Esta prueba, tambin, puede ser utilizada para demostrar la tara. Abrir y cerrar los recipientes 30 veces, teniendo
una comparacin funcional y de desempeo. Durante todo cuidado para no perder lquido durante ese procedimiento.
el procedimiento, determinar los pesos de los sistemas in- Cerrar los recipientes con tapa de rosca dentro del intervalo
dividuales de cierre de los recipientes (recipiente, sellado de momento presentado en la Tabla 1 en Recipientes de
interno si utilizado, y cierre) ambos como pesos de tara y mltiples unidades para cpsulas y comprimidos (6.2.3.1)
pesos de envase, a una aproximacin de 0,1 mg si la ca- y almacenar los recipientes sellados a la temperatura de
pacidad mxima es inferior a 200 ml; una aproximacin 25 C 2 C y humedad relativa de (50 2)%. Despus
en mg si la capacidad mxima est entre 200 y 1000 ml o de 168 h 1 h (7 das), registrar el peso de los recipien-
una aproximacin en centigramos (10 mg) si la capacidad tes, individualmente. Retornar al local de almacenamiento
mxima es de 1000 ml o superior. durante de ms 168 h 1 h. Despus del segundo perodo
de 168 h 1 h, retirar los recipientes, registrar los pesos
Procedimientos para Pruebas de Recipientes Cerrados de cada sistema de recipiente, individualmente, y calcular
Comercializados (tapn si aplicable, sellado interno y la tasa de penetracin de vapor de agua, en porcentaje de
prdida de peso de agua, para cada recipiente por medio de Tabla 1 - Lmites para plsticos clases I-VI.
la frmula:
Porcentaje mximo de transmisin de
(W7 W14) 365 x 100/(W7-Wt)7 = Porcentaje por ao Tamao luz en cualquier largo de onda
Nominal entre 290 y 450 nm
en que (en ml) Recipientes Recipientes sellados
W7 es el peso en mg del recipiente a los 7 das;
termosellados hermticamente
W14 es el peso en mg del recipiente a los 14 das;
WT es el peso tarado en g y 7 es el tiempo de prueba en das, 1 50 25
despus de 7 das de perodo de equilibrio. 2 45 20
5 40 15
Los recipientes as probados cumplen los requisitos y son 10 35 13
considerados como recipientes firmemente sellados si el 20 30 12
porcentaje de prdida de peso de agua excede 2,5% por 50 15 10
ao, como mximo, en 1 de los 10 recipientes probados y
no excede a 5,0% en ninguno de ellos. Cualquier recipiente, con un tamao intermedio de los lis-
tados en la Tabla 1, presenta una transmisin no mayor
6.2.3.4 PRUEBA DE TRANSMISIN DE que el prximo tamao mayor, listado en la tabla. Para re-
LUZ cipientes mayores que 50 ml, se aplican los lmites para
50 ml.
Equipo. Utilizar un espectrofotmetro de sensibilidad y
precisin, adecuadas, adaptado, para medir la cantidad de La transmisin de luz observada para recipientes plsticos
luz transmitida por materiales plsticos, o de vidrio trans- para productos destinados a la administracin oral o tpica
lcidos, o transparentes, utilizados como recipientes far- no debe exceder a 10% en cualquier largo de onda en el
macuticos. Adicionalmente, el espectrofotmetro debe intervalo entre 290 a 450 nm.
medir y registrar la luz transmitida difusa as como rayos
paralelos. 6.2.4 BIOCOMPATIBILIDAD
Procedimiento. Seleccionar secciones para representar el En esta seccin hay orientaciones sobre procedimientos de
6
espesor promedio de la pared del recipiente. Cortar sec- evaluacin de la biocompatibilidad de recipientes plsticos
ciones circulares de dos o ms reas del recipiente y pre- para medicamentos, tapas de elastmero y relacionados.
parar lo necesario para suministrar segmentos de tamaos La biocompatibilidad se refiere a la tendencia de que estos
convenientes para su insercin en el espectrofotmetro. productos permanezcan, biolgicamente, inertes, cuando
Cortar, lavar y secar cada muestra, teniendo cuidado de estn en contacto con el cuerpo. En combinacin con los
evitar riesgos en la superficie. Si la muestra es muy peque- ensayos qumicos, los procesos biolgicos pueden ser uti-
a para cubrir la abertura en el soporte de muestra, cubrir lizados para detectar e identificar la toxicidad inherente o
la porcin descubierta de la abertura con un papel opaco o adquirida de relacionados, antes o durante su fabricacin y
cinta adhesiva, haciendo con que el largo de la muestra sea procesamiento.
mayor que la abertura en el espectrofotmetro. Inmediata-
mente antes de montar el soporte de la muestra, limpiar la Los procedimientos utilizados para evaluar la biocompa-
muestra con un tejido propio para limpiar lentes. Montar tibilidad de un relacionado o de sus constituyentes fueron
la muestra con el auxilio de una cera viscosa, o por medio clasificados en un panel de efectos biolgicos o procedi-
de otros medios convenientes, teniendo cuidado de no de- mientos de toxicidad como citotoxicidad, sensibilizacin,
jar impresiones digitales u otras marcas en las superficies irritacin o reactividad intracutnea, toxicidad sistmica
por las cuales la luz debe pasar. Colocar la seccin en el aguda, toxicidad subcrnica (toxicidad subaguda), geno-
espectrofotmetro con su eje cilndrico paralelo al plano toxicidad, implantacin, hemocompatibilidad, toxicidad
de abertura y aproximadamente centralizado con relacin crnica (prolonga en 10% la expectativa de vida del animal
a la abertura. Cuando colocado adecuadamente, el haz de prueba, o para ms de 90 das), carcinogenicidad, toxicidad
luz es normal a la superficie de la seccin y las prdidas por reproductiva o de desarrollo y biodegradacin.
reflexin son mnimas.
La pirogenicidad, en un rea de toxicidad especial, es eva-
Medir, continuamente, la transmitancia de la seccin con luada por la prueba de Endotoxinas Bacterianas (5.5.2.2)
referencia al aire en el largo de onda de inters, con un y Prueba de Pirognicos (5.5.2.1). Actualmente no hay ca-
equipo de registro o en intervalos de aproximadamente 20 ptulos que detallan sobre sensibilizacin, toxicidad sub-
nm con un equipo manual, en la amplitud de onda entre crnica, genotoxicidad, toxicidad crnica, carcinogenici-
290 a 450 nm. dad, hemotoxicidad, toxicidad reproductiva o requisitos de
prueba de biodegradacin.
Lmite. La transmisin de luz observada no debe exceder
a los lmites constantes en la Tabla 1 para recipientes des-
tinados al uso parenteral.
6.2.4.1 RECIPIENTES PLSTICOS Y ba pueden ser realizados con el material, o un extracto del
TAPAS DE ELASTMEROS material en prueba, salvo indicacin contraria.
Los recipientes plsticos pueden ser constituidos por pol- Preparacin de Extractos
meros que, por extraccin, no presentan toxicidad o no al-
teran la estabilidad del producto embalado. Los requisitos Normalmente la evaluacin de la biocompatibilidad de un
de prueba de biocompatibilidad de recipientes para medi- relacionado entero no es realista y la utilizacin de porcio-
camentos son relacionados a Recipientes Plsticos. El pls- nes representativas, o de extractos de materiales seleccio-
tico, u otras porciones polimricas de esos productos son nados puede ser una alternativa prctica para la realizacin
probados de acuerdo con los procedimientos establecidos de los ensayos. Cuando porciones o extractos son utiliza-
en Pruebas de reactividad biolgica in vitro (6.2.5), siendo dos, es importante considerar que la materia prima puede
que aquellos que no atienden a los requisitos de estas prue- sufrir alteraciones qumicas durante la fabricacin; el pro-
bas no son adecuados para un recipiente de medicamentos. cesamiento y la esterilizacin de un relacionado. Ensayos,
Los materiales que atienden a los requisitos in vitro se cali- in vitro, de materia prima pueden servir como un importan-
fican como materiales biocompatibles, sin la necesidad de te proceso de clasificacin, pero la evaluacin final de la
otras pruebas, y pueden ser utilizados en la fabricacin de biocompatibilidad del relacionado debe ser realizada con
un recipiente para medicamentos. Si fuese solicitada una partes del producto, acabado y esterilizado.
designacin de clase (clases I-VI) para plsticos u otros
polmeros, los procedimientos adecuados de prueba son Las extracciones pueden ser realizadas en varias tempera-
realizados conforme presentado en Pruebas de reactividad turas (121, 70, 50, o 37 C), en varios intervalos de tiempo
biolgica in vivo (6.2.6) y Designacin de Clase. (1, 24, o 72 horas) y en medios de extraccin diferentes.
La eleccin del medio de extraccin para pruebas in vitro
La biocompatibilidad de un material elastomrico es eva- incluye solucin de cloruro de sodio inyectable a 0,9%, o
luada en dos fases, conforme descrito en Procedimientos medio de cultivo de tejidos con o sin suero. Cuando el me-
de Prueba Biolgica en Tapas de Elastmero (6.2.2). dio con suero es utilizado, la temperatura de extraccin no
puede exceder 37 C. Al escoger las condiciones de extrac-
Al contrario de plsticos u otros polmeros, un material cin, seleccionar la temperatura, el solvente y las variables
elastomrico que no atiende a las exigencias de la primera de tiempo que mejor simulen las condiciones de uso del
fase de prueba in vitro, puede ser considerado un mate- producto. El desempeo de varias pruebas en diversas con-
6
rial biocompatible, si es aprobado en la segunda fase in diciones puede ser utilizado para simular las variaciones de
vivo, que consiste en la prueba de Inyeccin Sistmica y las condiciones en uso. Una evaluacin de biocompatibi-
la prueba Intracutnea en Pruebas de reactividad biol- lidad es realizada con el producto, acabado y esterilizado,
gica in vitro (6.2.5). Ninguna distincin de clase o tipo es a pesar de que, una seleccin cuidadosa de las condiciones
realizada entre los materiales elastomricos que atienden a de extraccin permita la simulacin de las condiciones de
los requisitos de la primera fase de prueba y aquellos que produccin y prueba de la materia prima.
cumplen la segunda etapa, calificndose como materiales
biocompatibles. Los materiales elastomricos no son clasi- Prueba in vitro
ficados en las clases de I-VI.
Cuando pruebas in vitro son realizadas, la muestra es bio-
6.2.4.2 RELACIONADOS compatible, si los cultivos de clulas no presentan reactivi-
dad mayor que la suave (grado 2), conforme descrito en las
La biocompatibilidad del plstico, de otros polmeros y Pruebas de reactividad biolgica in vitro (6.2.5).
partes elastomricas de esos productos son probadas de
acuerdo con los procedimientos descritos en Pruebas de Prueba in vivo y designacin de clase
reactividad biolgica in vitro (6.2.5). Si, tambin, es ne-
cesaria una designacin de clase para un plstico u otro De acuerdo con la definicin de inyeccin e implanta-
polmero, son realizados los procedimientos de pruebas cin descritas en Pruebas de reactividad biolgica in vivo
adecuados descritos en Pruebas de reactividad biolgica (6.2.6), plsticos y otros polmeros son clasificados en
in vivo (6.2.6). clases de I a VI. Para obtener designacin de plsticos, u
otros polmeros, los extractos de la sustancia prueba son
6.2.4.3 PRUEBAS IN VITRO, PRUEBAS IN producidos de acuerdo con los procedimientos descritos
VIVO Y DESIGNACIN DE CLASE PARA en diversos medios. Para evaluar la biocompatibilidad, los
PLSTICOS Y OTROS POLMEROS extractos son inoculados, por va sistmica y intracutnea,
en ratones y conejos. De acuerdo con los requisitos para
Los requisitos de pruebas in vitro e in vivo son elaborados inyeccin, un plstico u otro polmero puede ser clasifica-
para determinar la reactividad biolgica de las cultivos de do inicialmente como I, II, III, o V. Si adems de la prueba
clulas de mamferos y la respuesta biolgica de animales de inyeccin, es realizada la prueba de implantacin con el
a los materiales elastomricos, plsticos y otros polmeros, mismo material, el plstico o el polmero pueden ser clasi-
cuando en contacto directo o indirecto con el paciente. La ficados como clase IV o VI.
reactividad biolgica de esos materiales puede depender
tanto de sus caractersticas de superficie, como de sus com-
ponentes qumicos extrables. Los procedimientos de prue-
En las orientaciones internacionales hay indicacin de que Las orientaciones para la comparacin de un relacionado
la extensin de las pruebas ejecutadas para un relaciona- con productos comercializados anteriormente son suminis-
do depende de los siguientes factores: la semejanza y la tradas por el Fluxograma de Decisin de Biocompatibili-
exclusividad del producto con relacin a los productos dad (Figura 1).
anteriormente comercializados, como considerado en el
Inicio
El correlato entra
en contacto con el No
cuerpo directa o
inmdietamente?
Si
El material
existente es el Si El proceso de Si La composicin Si La forma de Si El mtodo Si
mismo de un contacto con el
fabricacin es el qumica es la de esterilizacin es
correlato cuerpo es
mismo? misma? semejante?
comercializado? semejante?
No
No No
No No
No Justificativa
o datos de
ensayo
aceptables?
Si
6
Contiene
El material es
El material del No un metal, aleacin Si algunas No
correlato es un sustancias txicas
metlica o
polmero? como Pb, Ni,
cermica?
Cd, Zr, etc?
Si No Si
No
Material txico
Figura 1 - Fluxograma de biocompatibilidad adaptado a partir del FDA Blue Book Memorandum # G95-1.
El objetivo con el fluxograma es determinar si los datos haya sido utilizado anteriormente en productos relaciona-
disponibles de relacionados anteriormente comercializa- dos. Las respuestas a las cuestiones colocadas en el fluxo-
dos son suficientes para garantizar la seguridad del rela- grama llevan a la conclusin de que los datos disponibles
cionado en cuestin. Como indicado en el fluxograma, la son suficientes, o que pruebas adicionales son necesarios
composicin del material y las tcnicas de fabricacin de para garantizar la seguridad del producto. Las orientacio-
un producto son comparadas con los relacionados ya co- nes cuanto a la identificacin de los procedimientos apro-
mercializados, que entran en contacto directo con el cuer- piados para pruebas adicionales son suministradas en la
po. Adems de eso, en el fluxograma hay exigencia de una seccin Matriz de Seleccin de Prueba.
evaluacin de la toxicidad de un material exclusivo que no
6 Comunicacin
extracorprea
Comunicacin con
Tejido, Hueso o
Relacionados y materiales
que se comunican
Laparoscopios, artroscopios, sistemas de
drenaje, cemento odontolgico, material de
Dentina Con tejido, hueso o llenado dentario y ganchos de piel.
sistema dentina/pulpa.
Circulacin sangunea Relacionados que entran en Catteres intravasculares, electrodos de
contacto con la circulacin marca-paso temporario, oxigenadores, tubo
sangunea. de oxigenador extracorpreo y accesorios,
dializadores, tubo de dilisis y accesorios,
hemoadsorbentes y inmunoadsorbentes
Implantables Tejido u hueso Relacionados que entran en Ejemplos de molde como pasadores
contacto principalmente con ortopdicos, placas, juntas de sustitucin,
el hueso, el tejido o con el prtesis de hueso, cementos y dispositivos
fluido de tejido. intraseos. Ejemplos de los ltimos son
marca-pasos, dispositivos de suministro de
medicamentos, sensores y estimuladores
neuromusculares, tendones de sustitucin,
implantes mamarios, laringes artificiales,
implantes subperiosteales y ganchos de
conexin.
Sangre Relacionados en contacto Electrodos de marca paso, fstula
principalmente con sangre. arteriovenosa artificial, vlvulas
cardacas, injerto de vlvula, catteres de
administracin interna de medicamentos y
dispositivos de asistencia ventricular.
Dispositivo de
Superficie
Piel
Superficie de
Mucosas
Superficies Rotas
o Comprometidas
6
Limitada Prolongada Permanente Limitada Prolongada Permanente Limitada Prolongada Permanente
Dispositivo de
Comunicacin
Extracorprea
Comunicacin con
Vaso Sanguneo, Circulacin
Tejido, hueso y
Indirecto Sangunea
Dentina
Duracin
Limitada* Prolongada Permanente Prolongada Permanente Limitada Prolongada Permanente
Limitada
Figura 2 - Requisitos de Clase de plsticos y otros polmeros para dispositivos de comunicacin extracorprea.
________________
Categorizacin basada en la duracin del contacto. Limita: menos de 24 horas; prolongada: de 24 horas a 30 das; permanente: ms de 30 das. De-
signacin de Clase de Plsticos.
El nmero de la clase indicada aumenta conforme la du- superiores de plsticos u otros polmeros. A pesar de que la
racin de contacto entre el dispositivo y el cuerpo (ries- designacin atribuida defina la clase numrica ms baja de
go). En la categora de Dispositivos Implantables, el uso plstico u otro polmero que puede ser utilizado en el re-
exclusivo de la clase VI es obligatorio. La designacin de lacionado correspondiente, el uso de una clase de plstico
clases de plstico est basada en las matrices de seleccin numricamente mayor es opcional. Cuando un relacionado
de pruebas ilustradas en las Tablas 1, 2 y 3. pertenece a ms de una categora, el plstico, u otros pol-
meros deben satisfacer las exigencias de la clase numrica
La atribucin de clase de un plstico u otro polmero a una ms alta.
subcategora no se destina a restringir el uso de categoras
A X X X
Piel B X X X
C X X X
A X X X
Dispositivos de
Mucosa B X X X O O O
Superfcie
C X X X O X X O O
A X X X O
Superficies Comprometidas
B X X X O O O
No integras
C X X X O X X O O
________________
a Legenda A: limitada (menos de 24 horas); B: prolongada (de 24 horas a 30 dias); C: permanente (ms de 30 dias).
b Legenda X: Exmenes de evaluacin ISO para cons ideracin; O: exmenes adicio nales que pueden ser aplicados.
* Adaptado do FDAs Blue Book Memorandum #G95-1(7(Tabla 1. Pruebas de Evaluacin Inicial para Consideracin y Tabla 2. Pruebas de Evaluacin Complementaria para Consideracin).
6
6
Tabla 2 - Matriz de Seleo de Testes para Dispositivos de Comunicao Extracorprea.*
310
A X X X X X
Vaso Sanguneo,
B X X X X O X
Indirecto
C X X O X X X O X X X
Dispositivos de A X X X O
Comunicacin con Tejido,
Comunicacin B X X O O O X X
Hueso o Dentina
Extracorprea C X X O O O X X X X
A X X X X O X
Circulacin Sangunea B X X X X O X O X
C X X X X X X O X X X
________________
a Legenda A: limitada (menos de 24 horas); B: prolongada (de 24 horas a 30 dias); C: permanente (ms de 30 dias).
b Legenda X: Exmenes de evaluacin ISO para cons ideracin; O: exmenes adicio nales que pueden ser aplicados.
* Adaptado do FDAs Blue Book Memorandum #G95-1(7(Tabla 1. Pruebas de Evaluacin Inicial para Consideracin y Tabla 2. Pruebas de Evaluacin Complementaria para Consideracin).
A X X X O
Tejido o Hueso B X X O O O X X
Dispositivos C X X O O O X X X X
Implantables A X X X X X X
Sangre B X X X X O X X X
C X X X X X X X X X X
________________
a Legenda A: limitada (menos de 24 horas); B: prolongada (de 24 horas a 30 dias); C: permanente (ms de 30 dias).
b Legenda X: Exmenes de evaluacin ISO para cons ideracin; O: exmenes adicio nales que pueden ser aplicados.
* Adaptado do FDAs Blue Book Memorandum #G95-1(7(Tabla 1. Pruebas de Evaluacin Inicial para Consideracin y Tabla 2. Pruebas de Evaluacin Complementaria para Consideracin).
Documento de la ISO 10993-1:1997 intitulado Biological Evaluation of Medical DevicesPart 1: Evaluation and Testing. [Evaluacin Biolg ica de Dispositivos Mdicos-Parte 1: Evaluacin y Pruebas],
* Adaptado del FDA s Blue BookMemorandum #G95-1 (Lisis of International Standard ISO-10993.Biological Evaluation of Medical Devices-Part 1: Evaluation and Testing. ) [(Liso de las Normas Internacionales
de la ISO-10993.Evaluacin Biolgica de Dispositivos Mdicos-Parte 1: Evaluacin y Pruebas.)
6
312 Farmacopea Brasilea, 5 edicin
6
realizada por ensayos especficos adicionales apropiados, el Procedimiento de Pruebas de reactividad biolgica in
antes de determinar que un producto producido por medio vivo (6.2.6), utilizando solucin de cloruro de sodio in-
de un material especfico, es adecuado para su intencin yectable (0,9% NaCl) o medio libre de suero para cultivo
de uso. de clulas de mamferos conforme descrito en Extraccin
de Solventes. Si la extraccin fuese hecha a 37 C por 24
Preparacin del Cultivo Celular. En un medio esencial m- horas en incubadora, utilizar medios de cultivo celular su-
nimo suplementado con suero de densidad de sembrado de plementados con suero. En ningn caso, las condiciones de
cerca de 105 clulas por ml, preparar cultivos mltiples extraccin deben causar cambios fsicos, tales como fusin
de clulas fibroblsticas L-929 (linaje celular ATCC CCL o derretimiento de las porciones del material, excepto una
1, NCTC clone 929). Incubar los cultivos a 37 C 1 C leve adherencia.
en una incubadora humidificada, con una atmsfera de (5
1) % de dixido de carbono, por como mnimo 24 horas PRUEBA DE DIFUSIN EN AGAR
hasta la obtencin de monocapa, con confluencia superior
a 80%. Examinar los cultivos preparados con un micros- Esta prueba fue elaborada para materiales elastomricos de
copio para asegurar un nivel uniforme de monocapas casi diversos modelos. La capa de agar acta como un soporte
confluentes. para proteger las clulas de daos mecnicos, posibilitando
la difusin de productos qumicos lixiviables de las mues-
Solventes de extraccin. Solucin de cloruro de sodio tras polimricas. En un pedazo de papel de filtro, son apli-
inyectable (ver monografa correspondiente). Alternativa- cados los extractos de materiales a ser probados.
mente pueden ser utilizados medios libres o suplementados
con suero para cultivo de clulas de mamferos. La suple- Preparacin de la Muestra. Utilizar extractos preparados
mentacin del suero es utilizada cuando la extraccin es conforme descrito o porciones de las muestras con superfi-
realizada a 37 C, por 24 horas. cies planas y no inferiores a 100 mm2.
tro. Despus de realizada la incubacin, aspirar el medio de Interpretacin de Resultados. La reactividad biolgica,
cultivo de las capas y sustituirlo por medio suplementado o sea, mala formacin y degeneracin celular, es descrita
con suero conteniendo cantidades de hasta 2% de agar. La y clasificada en una escala de 0 a 4 (Tabla 1). Medir las
calidad del agar debe ser adecuada para sustentar el creci- respuestas de los cultivos celulares de la muestra, control
miento celular. La capa de agar debe ser suficientemente negativo y control positivo. El sistema de ensayo de cul-
fina para posibilitar la difusin de los productos qumicos tivo de clulas es adecuado si las respuestas observadas
lixiviables. Colocar las superficies planas de la muestra, fueren clasificadas como 0 (sin reactividad) para el control
control negativo y control positivo, o sus extractos, en con- negativo y como mnimo 3 (moderada) para el control po-
tacto con la superficie solidificada de agar, en duplicado. sitivo. La muestra atiende a los requisitos de la prueba si
No utilizar ms que tres muestras en cada placa prepara- la respuesta no es superior a la clasificacin 2 (suavemente
da. Incubar todas los cultivos a 37 C 1 C, por, como reactiva). Repetir el procedimiento, si la adecuacin del
mnimo, 24 horas, en incubadora apropiada. Examinar, vi- sistema no est confirmada.
sualmente, o con un microscopio cada cultivo alrededor de
la muestra; control negativo y control positivo, utilizando
coloracin adecuada, si necesario.
Tabla 1 - Clasificacin de la reactividad para Prueba de Difusin en Agar y Prueba de Contacto Directo.
Clasificacin Reactividad Descripcin de la Zona de Reactividad
0 Ninguna Ninguna zona detectable alrededor o bajo la muestra
1 Leve Algunas clulas mal formadas o degeneradas bajo la muestra.
2 Suave Zona limitada al rea bajo la muestra
3 Moderada La zona se extiende de 0,5 a 1,0 cm por sobre la muestra.
4 Fuerte La zona se extiende ms que 1,0 cm por sobre la muestra
Esta prueba es definida para materiales en diversos forma- Este ensayo es definido para la evaluacin de extractos de
tos. El procedimiento posibilita extracciones simultneas materiales polimricos. El procedimiento posibilita la ex-
6
y prueba de productos qumicos lixiviables de la muestra traccin de muestras por intervalos de tiempo variados y
en un medio suplementado con suero. El procedimiento no en temperaturas fisiolgicas y no fisiolgicas. Es apropiado
es apropiado para materiales con densidad muy alta o muy para materiales de alta densidad y evaluaciones de dosis
baja, pues puede causar daos mecnicos a las clulas. respuesta.
Preparacin de la Muestra. Utilizar porcin de la mues- Preparacin de la Muestra. Preparar conforme descrito
tra con superficie plana no inferior a 100 mm2. en Preparacin de Extractos, utilizando solucin de cloruro
de sodio inyectable (0,9% NaCl) o medio libre de suero
Preparacin del Control Positivo. Proceder conforme para cultivo de clulas de mamferos conforme Solventes
descrito en Preparacin de la Muestra. de Extraccin. Si el tamao de la muestra no puede ser r-
pidamente medido, puede ser utilizada una masa de como
Preparacin del Control Negativo. Proceder conforme mnimo 0,1 g de material elastomrico o 0,2 g de plsti-
descrito en Preparacin de la Muestra. co o material polimrico, por ml de medio de extraccin.
Alternativamente, para simular condiciones ms prximas
Procedimiento. Utilizar 2 ml de la suspensin de clulas a las fisiolgicas, utilizar para la extraccin, un medio de
preparada conforme descrito en Preparacin del Cultivo cultivo de clulas de mamferos, suplementado con suero.
Celular, preparar las capas en placas de 35 mm de dimetro. Preparar los extractos por medio del calentamiento a 37 C
Despus de la incubacin, aspirar el medio de los cultivos 1 C por 24 horas, en una incubadora apropiada. Tem-
y sustituirlo por 0,8 ml de medio de cultivo fresco. Colocar peraturas superiores pueden causar la desnaturalizacin de
una nica muestra, control negativo y control positivo en las protenas del suero.
cada una de las duplicatas del medio de cultivo. Incubar
todos los cultivos a 37 C 1 C, por, como mnimo, 24 Preparacin del Control Positivo. Proceder conforme
horas, en incubadora apropiada. Examinar, visualmente, o descrito en Preparacin de la Muestra.
con un microscopio cada cultivo alrededor de la muestra;
del control negativo y del control positivo, utilizando colo- Preparacin del Control Negativo. Proceder conforme
racin adecuada, si necesario. descrito en Preparacin de la Muestra.
suplementados, o no con suero son probados en duplicado, Interpretacin de Resultados. Proceder conforme inter-
sin diluicin (100%). El extracto de la solucin de cloru- pretacin de resultados de la prueba de Difusin en Agar,
ro de sodio inyectable es diluido con clulas del medio de sin embargo utilizando la Tabla 2. La muestra atiende a
cultivo suplementado con suero y probado, en duplicado, los requisitos de la prueba, si la respuesta de la muestra
a una concentracin de 25%. Incubar todos los cultivos a no es superior a la clasificacin 2 (suavemente reactiva).
37 C 1 C por 48 horas, en una incubadora apropiada. Repetir el procedimiento si la adecuacin del sistema no es
Examinar con un microscopio cada cultivo despus de 48 confirmada. Para evaluaciones de dosis- respuesta, repetir
horas, utilizando coloracin adecuada, si necesario el procedimiento, utilizando diluiciones cuantitativas del
extracto de la muestra.
Las Pruebas a continuacin son elaboradas para determinar En este captulo se aplican las siguientes definiciones:
la respuesta biolgica de animales a materiales elastomri- muestra es el material a prueba, o el extracto preparado
cos, plsticos y otros materiales polimricos, que entran en a partir de un determinado material. El blanco consiste de
6
contacto directo, o indirecto con el paciente, o la respuesta la misma cantidad del medio que es utilizado para la ex-
a la inoculacin de extractos especficos elaborados a par- traccin de la muestra, siendo tratado de la misma forma
tir de los materiales a prueba. Es esencial disponer el rea que el medio que contiene la muestra analizada. El control
de superficie especfica para extraccin. Cuando el rea de negativo es una muestra que no presenta ninguna reaccin
superficie de la muestra no puede ser determinado, utilizar en las condiciones del ensayo.
0,1 g de elastmero o 0,2 g de plstico, u otro material,
para cada ml de fluido de extraccin. Clasificacin de Plsticos. Seis clases de plstico son defi-
nidas (Tabla 1), basadas en las respuestas para una serie de
Tres ensayos son descritos para clasificar plsticos y otros ensayos in vivo en el cual los extractos, materiales y vas de
polmeros, que son aplicables a materiales y relacionados, administracin son especificados. Estas pruebas estn, di-
basndose en ensayos de reactividad biolgica in vivo. rectamente relacionadas, con la utilizacin final de los art-
Prueba de Inyeccin Sistmica y Prueba Intracutnea son culos de plstico. En las preparaciones en que los plsticos
utilizados para materiales elastomricos, especialmente estn susceptibles a entrar en contacto con los vehculos, la
para materiales en que la prueba de reactividad biolgica eleccin de la solucin de extraccin es representativa. La
in vitro (6.2.5) adecuada indic reactividad biolgica sig- clasificacin registrada en la Tabla 1.
Con excepcin de la prueba de Implante, los procedimien- Estas pruebas son elaboradas para aplicacin en materiales
tos son basados en la utilizacin de extractos que, en fun- en las condiciones en que son utilizadas. Si, antes de su
cin de la resistencia trmica del material, son preparados utilizacin final, el material debe ser expuesto a cualquier
en una de las tres temperaturas estndar: 50, 70 y 121 C. proceso de limpieza o de esterilizacin, las pruebas deben
6
Por esa razn, la designacin de la clase de un plstico ser realizadas en una muestra sometida a tales procesos.
debe ser acompaada por una indicacin de la temperatura
de extraccin (por ejemplo IV-121 C, es la designacin Medios de Extraccin
de la clase IV, de un plstico extrado a 121 C; I-50 C,
es la designacin de la clase I, de un plstico extrado a 50 Solucin de cloruro de sodio inyectable. Ver monografa
C). Los plsticos pueden ser clasificados en las clases de correspondiente.
I a VI, con base en los criterios de respuesta registrados en
la Tabla 1. Solucin de Alcohol 1:20 en solucin de cloruro de sodio
inyectable.
Esa clasificacin no se aplica a los plsticos que son des-
tinados a ser utilizados como recipientes para productos Polietilenglicol 400. Ver monografa correspondiente.
tpicos u orales, o que puedan ser utilizados como parte
integrante de una formulacin de medicamento. Las infor- Aceite vegetal. Utilizar aceite de ssamo, aceite de semilla
maciones registradas en la Tabla 1 no se aplican a los elas- de algodn u otros aceites vegetales apropiados (ver mono-
tmeros naturales, que son probados solamente por medio grafa). Si posible, obtener aceites recin refinados. Utilizar
de solucin de cloruro de sodio inyectable y de aceites ve- tres animales debidamente preparados e inocular intercut-
getales. neamente en cada animal una dosis de 0,2 ml de aceite, en
cada uno de los 10 sitios, y observar los animales por 24, 48
La prueba de Inyeccin Sistmica y la prueba Intracutnea y 72 horas despus de la inoculacin. Clasificar las observa-
son elaboradas para determinar, respectivamente, las res- ciones de cada local, conforme a la escala numrica indicada
puestas biolgicas sistmicas y las locales; en animales ex- en la Tabla 2. En cualquier momento de observacin, la res-
puestos a los plsticos y otros polmeros, por la inoculacin puesta promedio en los 3 conejos (30 sitios de inoculacin)
de dosis nica de extractos especficos de la muestra. La no debe ser superior a 0,5 para eritema, debe ser inferior a
prueba de Implante es elaborada para evaluar la reaccin 1,0 para el edema, y en ninguno de los locales puede ocurrir
del tejido vivo al plstico y otros polmeros, por medio de una reaccin del tejido mayor que 10 mm de dimetro total.
la implantacin de la propia muestra en el tejido animal. El residuo de aceite en el local de la inoculacin no debe ser
La preparacin adecuada y la colocacin de las muestras interpretado como edema. Cuando presionado suavemente,
en condiciones de asepsia son importantes en la realizacin el edema del tejido queda blanquecino.
de la prueba de Implante.
Agua para inyectables. Ver monografa correspondiente.
Excluye el edema no inflamatorio (mecnico) a partir de zas sucesivas con acetona y cloruro de metileno. Limpiar
blanco o del fluido de extraccin. todos los otros equipos por medio de un lavado completo
con detergente adecuado y enjuague prolongado con agua.
Equipos Esterilizar y secar los recipientes y equipos utilizados para
extraccin, transferencia o administracin del material de
Autoclave. Emplear una autoclave capaz de mantener la ensayo, por medio de proceso adecuado. Si el xido de eti-
temperatura de 121 C 2 C y capaz de enfriar los reci- leno fuese utilizado como agente esterilizante, posibilitar
pientes de ensayo en torno de 20 C. tiempo
6
Recipientes de Extraccin. Utilizar apenas recipientes de Preparacin de la muestra. La prueba de Inyeccin Sist-
vidrio Tipo I, tales como tubo de ensayo de cultivo con mica y la prueba Intracutnea pueden ser realizadas con
tapa de rosca, o equivalente. La tapa de rosca debe tener re- el mismo extracto o con extractos distintos. Seleccionar y
vestimiento elastomrico apropiado. La superficie expues- subdividir en partes la muestra del tamao indicado en la
ta de ese revestimiento debe estar totalmente protegida con Tabla 3. Retirar el material particulado de cada muestra
un disco slido inerte de 50-75 m de espesor. subdividida, o del control negativo, colocando la muestra
en una probeta graduada de 100 ml, de vidrio de tipo I,
Preparacin de los Equipos. Limpiar completamente to- limpia y con tapa, y aadir cerca de 70 ml de agua para
dos los elementos de vidrio con solucin de limpieza de inyectables. Agitar por cerca de 30 segundos y drenar el
cido crmico y, si necesario, con cido ntrico caliente, agua, repetir esa etapa y secar las piezas preparadas para la
seguido de enjuague prolongado con agua. Antes de uti- extraccin con aceite en una estufa hasta 50 C. No limpiar
lizar en la subdivisin de la muestra, limpiar los equipos la muestra con pao seco o mojado o lavar y enjuagar con
cortantes por medio de un mtodo adecuado, como limpie- solvente orgnico, tensoactivo, etc.
6
por calentamiento, en una autoclave a 121 C, por 60 mi- Animal de prueba. Utilizar ratones albinos saludables,
nutos, y en el caso de un horno a 70 C, por 24 horas, o a no utilizados anteriormente, pesando entre 17 y 23 g. Para
50 C, por 72 horas. Posibilitar tiempo suficiente para que cada grupo de prueba, utilizar apenas los ratones del mis-
el lquido del recipiente alcance la temperatura de extrac- mo origen. Agua y alimentos de composicin conocidos,
cin. En ningn momento las condiciones de extraccin comnmente utilizados en animales de laboratorio, son
deben causar alteraciones fsicas, tales como fusin o de- permitidos a gusto.
rretimiento de las partes de muestra, para no resultar en
una disminucin de la superficie disponible. Una leve ad- Procedimiento. Antes de retirar la dosis de inoculacin,
herencia de las partes puede ser tolerada. Aadir siempre, agitar, vigorosamente cada extracto para asegurar la dis-
individualmente, las partes limpias al medio de extraccin. tribucin uniforme de la materia extrada. Las partculas
Si los tubos de cultivo son utilizados para extraccin de visibles no deben ser administradas por va intravenosa. En
aceite vegetal con autoclave, sellar adecuadamente las ta- un grupo de prueba, inocular en cada uno de los cinco ra-
pas de rosca con cinta adhesiva sensible a la presin. En- tones la muestra o el blanco, conforme descrito en la Tabla
friar hasta temperatura ambiente, sin embargo, no inferior 4, diluyendo cada g del extracto de la muestra preparada
a 20 C, agitar, vigorosamente, por varios minutos e, inme- con Polietilenglicol 400 y el blanco correspondiente, con
diatamente, decantar cada extracto de forma asptica, en 4,1 volmenes de solucin de cloruro de sodio inyectable,
un recipiente estril y seco. Almacenar los extractos a una para obtener una solucin con una concentracin de cerca
temperatura entre 20 C y 30 C y no utilizar para pruebas de 200 mg de Polietilenglicol por ml.
despus de 24 horas.
Velocidad de
Va de
Extracto o Blanco Dosis por kg Inoculacin, pL
Administracin*
por segundo
Solucin de alcohol 1:20 en solucin de cloruro de sodio 50 ml IV 100
inyectable
Polietilenglicol 400 10 g IP
Vehculo de medicamentos (cuando aplicable) 50 ml IV 100
50 ml IP
Oleo vegetal 50 ml IP
* IV = intravenosa (muestra acuosa y blanco); IP = intraperitoneal (muestra oleosa y blanco).
Observar los animales en los siguientes tiempos: inmedia- Tabla 5 - Prueba Intracutnea.
tamente despus de la inoculacin, despus de 4 horas y,
como mnimo despus de 24, 48 y 72 horas. Si durante Nmero de
Extracto o Dosis, pL
el perodo de observacin, ninguno de los animales trata- Locales (por
Blanco por sitio
dos con el extracto de la muestra presenta una reactividad animal)
biolgica significativamente mayor que los tratados con el Muestra 5 200
blanco, la muestra satisface los requisitos de esta prue- Blanco 5 200
ba. Si dos o ms ratones mueren o presentan un compor-
tamiento anormal, como convulsiones o postracin, o si Examinar los sitios de inoculacin para evidenciar cual-
hay prdida de peso corporal superior a 2 g en tres o ms quier reaccin del tejido, tales como eritema, edema y ne-
ratones, la muestra no atiende a los requisitos de la prueba. crosis. Si necesario, limpiar levemente la piel con alcohol
Si algn animal tratado con la muestra exhibe solamente diluido para facilitar la lectura de los locales de inocula-
leves seales de reactividad biolgica, y si apenas un ani- cin. Observar todos los animales 24, 48 y 72 h despus de
mal presenta sntomas graves de reactividad biolgica o la inoculacin. Clasificar las observaciones en una escala
muere, repetir la prueba utilizando grupos de 10 ratones. numrica para el extracto de la muestra y para el blanco,
En la prueba de repeticin, durante el perodo de obser- utilizando la Tabla 2. Si necesario, agarrar nuevamente
vacin, todos los 10 animales tratados con la muestra no el pelo durante el perodo de observacin. El promedio
deben presentar ninguna reactividad biolgica significativa de puntuaciones de eritema y edema para los locales de la
a ms que los tratados con el blanco. muestra y del blanco son determinadas para cada conejo y
cada intervalo de puntuacin despus de 24, 48 y 72 horas
PRUEBA INTRACUTNEA de inoculacin. Despus de la puntuacin referente a 72
horas, todas las puntuaciones de eritema, ms las de edema
Esta prueba fue elaborada para evaluar las respuestas loca- son totalizadas, separadamente, para cada muestra y blan-
les para los extractos de los materiales probados, despus co. Dividir cada total por 12 (2 animales x 3 perodos de
de inoculacin intracutnea en los conejos. puntuacin x 2 categoras de puntuacin) para determinar
el promedio total para cada muestra frente a cada blanco
Animal de prueba. Seleccionar conejos albinos saluda- correspondiente. Los requisitos de la prueba son cumplidos
bles, cuyo pelo posibilite ser preso al ras de la piel, siendo si la diferencia entre la puntuacin promedio de la mues-
esa, fina y libre de irritacin o trauma. Al lidiar con los tra y del blanco es inferior o igual a 1,0. Si en cualquier
6
animales durante los perodos de observacin, evitar to- perodo de observacin, el promedio para la reaccin de
car los locales de inoculacin, excepto para diferenciar un la muestra es cuestionable por ser mayor que el promedio
edema y un residuo de aceite. Los conejos anteriormente para la reaccin del blanco, repetir la prueba utilizando tres
utilizados en pruebas independientes, como la prueba de conejos adicionales. Los requisitos de la prueba son cum-
pirognico (5.5.2.1), y que reposaron el perodo previsto, plidos si la diferencia entre la puntuacin promedio de la
pueden ser utilizados para esta prueba, siempre que tengan muestra y del blanco es igual o inferior a 1,0.
piel limpia, utilizados para esta prueba, siempre que tengan
piel limpia, sin manchas. PRUEBA DE IMPLANTE
Procedimiento. Antes de retirar la dosis de inoculacin, La prueba de implante es elaborada para evaluacin de ma-
agitar, vigorosamente, cada extracto para asegurar la dis- teriales plsticos y otros polmeros cuando entran en con-
tribucin uniforme de la materia extrada. En el da de tacto directo con tejido vivo. La preparacin adecuada de
la prueba, prender, cuidadosamente, el pelo del lomo del las tiras de implante y su implantacin deben ser realizadas
animal, en ambos los lados de la columna vertebral, en- bajo condiciones de asepsia. Preparar para implantacin 8
cima de un rea de prueba suficientemente grande. Evitar tiras de la muestra y 4 tiras de estndar. Cada tira debe me-
la irritacin y el trauma. Retirar el pelo suelto por medio dir como mnimo 10 x 1 mm. Los bordes de las tiras deben
de vaco. Si necesario, antes de la inoculacin, limpiar ser lo ms suave posible, para evitar traumas mecnicos
levemente la piel con alcohol diluido y secar. Ms de un adicionales en la implantacin. Las tiras de tamao mni-
extracto de un determinado material puede ser utilizado mo especificado son implantadas por medio de una aguja
por conejo, se es determinado que los resultados no sern hipodrmica (calibre 15 a 19) con punta intravenosa y un
afectados. Para cada muestra, utilizar dos animales e ino- trcar estril. Utilizar una u otra aguja pre-esterilizada en
cular va intracutnea, utilizando un lado del animal para que las tiras estriles de plstico estn insertadas, asptica-
la muestra y el otro para el blanco, conforme descrito en la mente, o insertar cada tira limpia en una aguja cuya cnula
Tabla 5. Diluir cada g del extracto de la muestra preparada y el orificio central estn protegidos con una tapa adecuada
con polietilenglicol 400, y el blanco correspondiente con y, en seguida, sometidos al procedimiento de esterilizacin
7,4 volmenes de solucin de cloruro de sodio inyectable apropiado.
para obtener una solucin con concentracin de cerca de
120 mg de polietilenglicol por ml. Animal de prueba. Seleccionar conejos adultos saluda-
bles con peso mnimo de 2,5 kg, y que posean msculos
paravertebrales suficientemente grandes para posibilitar la
implantacin de las tiras de prueba. No utilizar ningn te-
jido muscular adems de aquel situado en el rea paraver-
tebral. Los animales deben ser anestesiados con un agente
anestsico comnmente utilizado para un grado de pro- implante. Utilizar un lente de aumento y una fuente de luz
fundidad suficiente para impedir movimientos musculares, auxiliar. Observar si hay hemorragias, necroses, descolora-
como espasmos. ciones e infecciones en los locales de implante de la mues-
tra y del control y registrar las observaciones. Si hubiere
Procedimiento. Realizar la prueba en un rea limpia. En encapsulamiento, medir y registrar el ancho de la cpsula,
el da de la prueba o hasta 20 horas antes, atar el pelo de arredondeando para el 0,1 mm ms prximo, a partir de la
los animales en ambos los lados de la columna vertebral. periferia del espacio ocupado por el implante del control
Retirar los pelos sueltos por medio de vaco. Antes de la o de la muestra hasta la periferia de la cpsula. Puntuar el
inoculacin, limpiar levemente la piel con alcohol dilui- encapsulamiento, conforme a Tabla 6.
do y secarla. Implantar cuatro tiras de la muestra en los
msculos paravertebrales, distantes cerca de 2,5 cm una Tabla 6 - Evaluacin de encapsulamiento
de la otra, en un lado de la columna de cada uno de los dos en la prueba de Implante.
conejos, de 2,5 a 5,0 cm de la lnea mediana y paralela a
la columna vertebral. De forma semejante, implantar dos Ancho de la Cpsula Puntuacin
tiras estndar en el msculo opuesto de cada animal. In- Ninguna 0
sertar un catter estril en la aguja para asegurar la tira de hasta 0,5 mm 1
implante en el tejido con la retirada de la aguja. Despus 0,6-1,0 mm 2
de la implantacin de una tira, si hay un sangrado excesivo, 1,1-2,0 mm 3
colocar otro pedazo en duplicado en otro local. Mantener Superior a 2,0 mm 4
los animales por un perodo mnimo de 120 horas, y sacrifi-
carlos en el final del perodo de observacin con una sobre- Calcular las diferencias entre el promedio de puntuacin
dosis de un agente anestsico o de otros agentes adecuados. para los sitios de muestra y de control. Los requisitos de
Posibilitar que transcurra un tiempo suficiente para cortar la prueba son cumplidos si la diferencia no es superior a
el tejido, sin sangrado. Examinar macroscpicamente el 1, o si la diferencia para ms de uno de los cuatro locales
rea del tejido alrededor de la parte central de cada tira de de implante, no excede a 1 en cualquiera de los animales.
formando los tomos irradiados en iones positivos o nega- El procedimiento para seleccin de la dosis de radiacin,
tivos. Cuando esas radiaciones atraviesan las clulas crean basado en la evaluacin de la resistencia de los microorga-
hidrgeno libre; radicales hidroxilos y algunos perxidos, nismos constituyentes de la carga microbiana del producto
que a su vez pueden causar diferentes lesiones intracelu- a ser esterilizado, posibilita una determinacin ms repre-
lares. Las principales fuentes de radiacin son: rayos alfa; sentativa de la resistencia de esa al trabajarse con microor-
beta; gama y rayos X. Los dos tipos de radiacin ionizante ganismos con diferentes susceptibilidades a la radiacin.
en uso son decaimiento de radioistopo (radiacin gama) Ese procedimiento exige la enumeracin de la poblacin
y radiacin por haz de electrones. Los productos son ex- microbiana en muestreo representativa de diferentes lotes
puestos a una radiacin ionizante en la forma de radiacin de producto. Con el conocimiento de la carga microbiana,
gama de una fuente radioisotpica adecuada (por ejemplo, la dosis de radiacin es establecida basndose en tabla dis-
cobalto 60) o de un haz de electrones energizados por me- ponible en la literatura. Otro mtodo que posibilita el esta-
dio de un acelerador de electrones. blecimiento de la dosis de radiacin se basa en el empleo
de incrementos de dosis de radiacin hasta obtener, como
Adems de la posibilidad del procesamiento a bajas tem- mximo, una muestra positiva en 100 unidades irradiadas.
peraturas, lo que posibilita la esterilizacin de productos Esa informacin provee la base para extrapolacin de esa
termosensibles, la esterilizacin por radiacin ionizante dosis y obtencin de la dosis de radiacin. Evaluaciones
posee ventajas como la baja reactividad qumica y el hecho peridicas deben ser hechas para garantizar que los valores
de que existen pocos parmetros a ser controlados, siendo establecidos continan siendo efectivos (referencia: ISO
imprescindible el control de la dosis de radiacin adsorbi- 11137-1: 2006 Sterilization of health care products Ra-
da. La dosis de radiacin establecida para la esterilizacin diation Part 1: Requirements for development, validation
debe garantizar el no comprometimiento de los materiales and routine control of a sterilization process for medical
a ser esterilizados. Para la radiacin gamma, la validacin devices).
del proceso incluye el establecimiento de la compatibilidad
del material, el establecimiento del modelo de cargamento La eficiencia del ciclo de esterilizacin debe ser evaluada,
del producto y el mapeo de dosis en el recipiente de esteri- peridicamente, por la determinacin de la carga microbia-
lizacin, identificando las zonas de dosis mxima y mni- na del producto, o por el empleo de indicador biolgico y
ma de radiacin, la definicin del tiempo de exposicin y por el uso de dosmetros calibrados.
la comprobacin de la aplicacin de la dosis de esteriliza-
cin requerida. Para irradiacin por haz de electrones, de- 7.1.1.1.3 Esterilizacin por filtracin
ben ser controlados, adems, voltaje, corriente, velocidad
de la cinta transportadora y dimensin de barrido del haz La filtracin es empleada para esterilizacin de soluciones
de electrones. Para ese proceso de esterilizacin, la dosis termosensibles por eliminacin fsica de los microorganis-
adsorbida de referencia es de 25 kGy, sin embargo en al- mos contaminantes. El material filtrante no puede liberar
gunas situaciones hay necesidad de seleccin de una dosis fibras o materiales extrables indeseables para la solucin
mayor o menor. La dosis escogida debe ofrecer un nivel de filtrada, lo que restringe la naturaleza del elemento filtrante
letalidad adecuado y reproductible cuando el proceso es a vidrio, metal, polmeros sintetizados y membranas poli-
operado rutinariamente dentro de las tolerancias estable-
cidas. Procedimientos y precauciones deben ser aplicados
para alcanzar un nivel de garanta de esterilidad de 10-6 o
mricas. El montaje de un filtro consiste de una matriz po-
rosa insertada en un abrigo impermeable. La eficiencia de
un medio, o sustrato filtrante depende del tamao del poro
7
mejor. del material, de la adsorcin de microorganismos sobre o
dentro de la matriz del filtro y del mecanismo de tamiz o
Para validar la eficacia de esa esterilizacin, especialmente exclusin. El efecto de exclusin por tamao es funcin de
cuando se utilizan dosis menores, es necesario determinar la abertura (dimetro) de los poros, y la adsorcin depende
la resistencia a la radiacin de la carga microbiana del pro- de la composicin, espesor del elemento filtrante y fluido
ducto. Estndares de cargamento de producto especfico que est siendo filtrado.
y la distribucin de dosis mnimas y mximas adsorbidas
deben ser establecidos. Las dosis adsorbidas son normal- El tamao de los poros de las membranas filtrantes es es-
mente medidas por medio de dosmetros especficos, como timado por valor nominal que refleja la capacidad de la
soporte plstico estandarizado que muestra intensificacin membrana del filtro de retener microorganismos repre-
del color proporcional a la cantidad de radiacin adsorbi- sentados por cepas especficas. La filtracin para fines de
da. El abordaje de ciclo fraccionado da los datos utilizados esterilizacin es, normalmente, realizada con membranas
para determinar el valor D10 del indicador biolgico, infor- de graduacin de tamao de poro nominal de 0,2 m, o
macin aplicada para extrapolar la cantidad de radiacin menor. Esas membranas de filtracin esterilizante, clasifi-
adsorbida, para establecer una probabilidad adecuada de cadas como 0,22 m o 0,2 m, dependiendo del fabrican-
supervivencia microbiana. Actualmente, la dosis se basa en te, son capaces de retener 100% de un cultivo conteniendo
la resistencia a la radiacin de la carga microbiana hetero- 107 microorganismos de Brevundimonas diminuta ATCC
gnea natural contenida en el producto a ser esterilizado. 19146, por cm2 de superficie de membrana filtrante, bajo
Los procedimientos de validacin pueden usar la exposi- una presin mnima de 30 psi (2,0 bar).
cin de producto inoculado, usando organismos resisten-
tes, como Bacillus pumilus, o exposicin de muestras de El usuario es responsable de la eleccin del filtro en funcin
producto acabado de la lnea de produccin a la dosis su- de la naturaleza del material a ser filtrado, que atienda a la
bletal de proceso. necesidad del proceso de esterilizacin, debiendo, tambin,
determinar si los parmetros empleados en la produccin ciertas mezclas con gases inertes. El proceso de esteriliza-
influenciarn la eficiencia de la retencin microbiana. Una cin es generalmente realizado en una cmara presurizada
vez que la eficiencia del proceso de filtracin, tambin, es proyectada de forma semejante a la autoclave, pero con ca-
influenciada por la biocarga de la solucin a ser filtrada, ractersticas especficas como sistema para desgasificacin
es importante la determinacin de la calidad microbiana despus de la esterilizacin y minimizacin de la exposi-
de las soluciones antes de la filtracin, as como el esta- cin de los operadores a gas.
blecimiento de parmetros como presin; tasa de flujo y
caractersticas de la unidad filtrante. El programa de calificacin del proceso de esterilizacin
con xido de etileno es ms amplio que de otros procesos
El valor de reduccin logartmica, tambin, puede ser uti- de esterilizacin, dado que adems de la temperatura, de-
lizado para evaluar la capacidad de retencin de la mem- ben ser controlados la humedad; vaco / presin positiva y la
brana filtrante. Por ejemplo, un filtro de 0,2 m, que puede concentracin de xido de etileno. Es importante determinar
retener 107 microorganismos de una cepa especfica, ten- y demostrar que todos los parmetros crticos del proceso
dr un valor de reduccin logartmica de, como mnimo, 7, estn adecuados en el interior de la cmara de esterilizacin
bajo condiciones declaradas. durante todo el ciclo. Como los parmetros de esterilizacin
aplicados a los productos a ser procesados son crticos, es
Las membranas filtrantes comercialmente disponibles inclu- recomendable el pre-condicionamiento de la carga para mi-
yen acetato de celulosa, nitrato de celulosa, fluorcarbona- nimizar el tiempo de exposicin a la temperatura requerida.
to, polmeros acrlicos, polister, policarbonato, cloruro de El programa de validacin es generalmente realizado em-
polivinilo, vinil, nylon, polytef y adems, membranas me- pleando el producto inoculado, o producto simulado inocu-
tlicas. Los filtros de membrana, por ser pelculas polimri- lado con preparaciones apropiadas como esporas de Bacillus
cos, ofrecen muchas ventajas y algunas desventajas cuando atrophaeus. Los indicadores biolgicos, normalmente, son
comparados a los filtros de profundidad como porcelana o empleados para establecer la probabilidad final de supervi-
material sinterizado. Como buena parte de la superficie de la vencia microbiana, usando el concepto de ciclo fraccionado,
membrana es un espacio vaco o abierto, el correcto montaje para proyectar un ciclo de esterilizacin con xido de etile-
y esterilizacin del filtro proporcionan la ventaja de una alta no, y deben ser usados en cargas del producto, o producto
tasa de flujo. Una desventaja es que, debido a la fragilidad simulado, con cmara llena.
de la membrana, se debe garantizar la ausencia de ruptura
durante el montaje, esterilizacin, o uso. El indicador biolgico debe ser empleado en el monitoreo
de ciclos de rutina, adems del planeamiento del ciclo de
El sistema de filtracin debe ser probado antes y despus esterilizacin por xido de etileno. Otro aspecto importan-
del proceso de filtracin para garantizar el mantenimiento te del planeamiento del proceso de esterilizacin es la de-
de su integridad durante el proceso de filtracin. Pruebas finicin del tipo de envasado del material a ser procesado
tpicas de uso incluyen la prueba del punto de burbuja, y su distribucin en la cmara de esterilizacin, debido a
la prueba de flujo de aire difusivo, la prueba de retencin la limitada capacidad de difusin del xido de etileno en
bajo presin y la prueba de flujo progresivo. La prueba de reas ms internas del producto.
La esterilizacin por gas puede ser el mtodo de eleccin Los principales elementos de la validacin son: Califica-
para materiales que no resisten a altas temperaturas como cin de Instalacin; Calificacin de Operacin y Califica-
en el procesamiento por calor seco o calor hmedo. El cin de Desempeo.
agente activo generalmente empleado en la esterilizacin
por gas es el xido de etileno. Entre las desventajas de ese 7.1.2.1 CALIFICACIN DE INSTALACIN
agente esterilizante estn sus propiedades mutgenas; la
posibilidad de residuos txicos en los materiales tratados La aplicacin del plano de calificacin de instalacin debe
y su naturaleza altamente inflamable, excepto cuando en suministrar evidencia documentada que el equipo y todos
los tems auxiliares fueron suministrados, instalados y fun- Para autoclaves y otros esterilizadores que emplean proce-
cionan de acuerdo con las especificaciones. Debe demos- so trmico, deben ser realizados estudios de distribucin
trarse que el equipo de esterilizacin, sus componentes, del calor en diferentes posiciones considerando el tamao
tems auxiliares y suministros, como vapor, agua y aire, de la cmara y la carga. Debe confirmarse que a cmara
fueron correctamente proyectados, instalados y calibrados. (vaca y llena) opera dentro de los parmetros crticos en
todos sus principales locales. El nmero y posicin de los
A fin de atender a los parmetros y lmites recomenda- termopares son determinados por el tipo y configuracin
dos para la esterilizacin, es necesario el empleo de ins- de la carga; tamao de equipo; tipo de instrumento y ciclo
trumentacin apropiada para monitorear y controlar los empleado. Una banda aceptable de temperatura en la c-
parmetros crticos como temperatura, tiempo, humedad, mara vaca es 1 C cuando la temperatura de la cmara es
concentracin del gas esterilizante o radiacin adsorbida. 121 C. Para esterilizadores a xido de etileno, la humedad
Esos instrumentos deben ser evaluados en la calificacin relativa; la concentracin del gas y la temperatura deben
de instalacin. ser monitoreadas por sensores distribuidos en posiciones
adecuadas. Sistemas de seguridad aplicables deben ser pro-
La calificacin de instalacin comprende los siguientes bados. Softwares de control deben ser validados y desafia-
elementos: equipo, instalacin y funcin. dos en condiciones de falla. La penetracin y distribucin
de la radiacin ionizante en la carga debe ser realizada y
En lo que se refiere al equipo e instalacin, las especifi- monitoreada por dosmetros. La operacin de calificacin
caciones del esterilizador; tems auxiliares y servicios; los de filtros esterilizantes est hecha por medio de la prueba
procedimientos operacionales; la localizacin de instala- de integridad de los filtros; medidas de presin diferencial
cin y la documentacin deben ser previamente definidos y velocidad de flujo. Como los fluidos esterilizados por
y verificados en la calificacin de instalacin, garantizada membranas filtrantes pueden ser expuestos al ambiente du-
su conformidad. Para garantizar la funcin, debe ser verifi- rante el procesamiento siguiente, el control ambiental y la
cado que el equipo y los sistemas de seguridad operacional calificacin y/o validacin del rea de manipulacin asp-
funcionan de acuerdo con sus especificaciones; los ciclos tica deben ser parte integrante del proceso de esterilizacin
de operacin estn de acuerdo con lo definido y que no hay por filtracin.
evidencia de fuga de las utilidades o esterilizador, cuando
aplicable. 7.1.2.3 CALIFICACIN DE DESEMPEO
En los procedimientos documentados para la calificacin En la calificacin de desempeo debe demostrarse que el
de instalacin debe estar especificado como cada elemento proceso de esterilizacin es capaz de alcanzar, repetida-
de la calificacin es planeado, realizado y revisado. La do- mente, el nivel de garanta de esterilidad pre-determinado
cumentacin que proporciona soporte a la calificacin de para las cargas definidas de productos; que el equipo opera
instalacin incluye descripcin de las caractersticas fsicas consistentemente de acuerdo con criterios pre-determina-
y operacionales del equipo; sus componentes y servicios. dos y que el producto atiende a los requisitos especificados
Dibujos y diagramas de proceso e instrumentacin deben de seguridad, calidad y desempeo.
ser verificados contra la configuracin propuesta y actuali-
zados, cuando necesario. Sistemas de seguridad aplicables
deben ser evaluados para garantizar desempeo; calidad y
La calificacin de desempeo comprende evaluaciones f-
sicas y microbiolgicas que demuestren la eficacia y repro-
7
seguridad de los equipos y operadores. ductibilidad del proceso de esterilizacin, manteniendo las
caractersticas especificadas del producto.
La calificacin de la instalacin es necesaria para nuevos
equipos, o cuando el esterilizador existente es sustituido En los estudios fsicos deben ser considerados: criterios
o transferido. La calificacin debe ser rehecha en interva- como carga prueba representativa del proceso; embalaje
los de tiempo definidos, y al menos parcialmente cuando idntico al producto; pre-condicionamiento; perfil de tem-
ocurren modificaciones que puedan alterar la eficacia del peratura y temperatura en el punto de referencia; respuesta
proceso de esterilizacin, como sustitucin o reforma de de indicadores qumicos; integridad de embalaje; docu-
equipos, o partes, modificaciones en los suministros de mentacin; entre otros. La carga para esterilizacin debe
proceso y alteracin en fuente radioactiva ser establecida y documentada, teniendo en consideracin
parmetros como configuracin, distribucin, orienta-
7.1.2.2 CALIFICACIN DE OPERACIN cin, densidad, dimensin, composicin del material, uso
y tipo de pallets. El producto o material con caractersti-
En la calificacin de operacin debe demostrarse que el cas similares al producto (producto simulado) usado para
equipo instalado es capaz de realizar el proceso de esteri- la calificacin debe tener embalaje idntico al producto y
lizacin especificado dentro de los intervalos definidos. El representar, como mnimo, el peor caso de la carga de ru-
intervalo de parmetros y los lmites de operacin deben tina de produccin, o sea, la configuracin ms difcil de
ser establecidos en la definicin del proceso. Antes de la esterilizar. Criterios para reutilizacin de carga deben ser
calificacin de operacin, el estado de calibracin de toda definidos, siendo que ella debe ser equilibrada a las condi-
instrumentacin usada para monitorear, controlar, indicar y ciones ambientales o aireadas antes de la reutilizacin. Con
registrar debe ser confirmado. los datos generados debe demostrarse la conformidad con
los parmetros fsicos y qumicos aplicables. La relacin
entre las condiciones de posiciones de monitoreo durante usado en la calificacin de desempeo del equipo de este-
la calificacin y la rutina debe ser establecida. rilizacin y en el desarrollo y establecimiento del proceso
de esterilizacin para un producto especfico. Los indica-
En la calificacin de desempeo fsico debe demostrarse dores biolgicos son usados en procesos de obtencin de
a reproductibilidad del proceso con mnimo de tres ciclos producto estril en su recipiente final y en la esterilizacin
consecutivos para verificar la atencin de todos los crite- de equipos; materiales y componentes de embalaje, em-
rios de aceptacin. pleados en el proceso asptico. Los indicadores biolgicos
pueden, adems, ser utilizados para monitorear ciclos de
En la calificacin microbiolgica deben seguirse requisitos esterilizacin en revalidaciones peridicas y para evaluar
especficos para cada agente esterilizante. Diferentes m- la capacidad del proceso usado en la descontaminacin de
todos pueden ser usados en la validacin del proceso de aisladores o salas limpias.
esterilizacin e incluyen tres categoras: proceso basado en
la inactivacin de la carga microbiana natural (biocarga); 7.2.1 TIPOS DE INDICADORES
proceso combinado con base en la inactivacin de microor-
ganismo referencia y conocimiento de la carga microbiana BIOLGICOS
(biocarga e indicador biolgico) y proceso basado en la
inactivacin de microorganismo referencia (sobremorte u Hay, por lo menos, tres tipos de indicadores biolgicos,
overkill). Se indica que el desafo microbiano sea ejecuta- siendo que cada tipo incorpora una especie microbiana con
do en los parmetros mnimos de proceso y debe atender resistencia conocida al proceso de esterilizacin.
el nivel de garanta de esterilidad para todas las combina-
ciones de carga, pudiendo usar el peor caso de producto Un tipo de indicador biolgico incluye las esporas que son
representante de las familias. Para cada tipo de carga a aadidos a un soporte o acarreador (disco, o tira de papel
ser esterilizada, la reproductibilidad del proceso debe ser de filtro, vidrio, plstico, u otro material) embalado para
demostrada emplendose, por lo menos, tres ciclos conse- mantener la integridad y viabilidad del material inoculado.
cutivos. Los indicadores biolgicos usados deben ser posi- Los acarreadores y embalajes primarios no deben contener
cionados en y/o sobre el producto en localizacin definida. cualquier tipo de contaminacin qumica, fsica o micro-
biolgica que pueda comprometer el desempeo y estabi-
La calificacin de desempeo debe ser repetida cuando al- lidad del indicador biolgico y no pueden sufrir alteracin
teraciones significativas fueren propuestas, como cambios en funcin del proceso de esterilizacin sometido. Los aca-
en diseo y embalaje del producto; configuracin o den- rreadores y embalajes primarios deben resistir al transporte
sidad de carga y equipo o proceso de esterilizacin. Los y manipulacin hasta el momento del uso y deben evitar la
efectos de esos cambios en las etapas de validacin del pro- prdida del inculo original durante el transporte, manipu-
ceso de esterilizacin deben ser evaluados. lacin y almacenamiento hasta el vencimiento del perodo
de validez.
7.1.3 REVISIN Y APROBACIN
Otro tipo de indicador biolgico consiste de una suspensin
DE LA VALIDACIN
7 La revisin documentada, de los datos de validacin, ge-
de esporas inoculada en unidades representativas del pro-
ducto a ser esterilizado. Cuando no sea posible el empleo
del producto real, puede inocularse un producto simulado,
nerados en las cualificaciones de instalacin, operacin y que difiere del producto real en algunas caractersticas,
desempeo debe ser hecha para confirmar la aceptabilidad pero se comporta de forma semejante cuando sometido a
del proceso de esterilizacin y definir la especificacin del las condiciones de prueba, o de esterilizacin. Una suspen-
proceso, incluyendo parmetros y tolerancia. sin de esporas de valor D conocido debe ser utilizada para
inoculacin del producto real o simulado, garantizando que
La etapa final del programa de validacin requiere la docu- al ser usado el producto simulado, ese no comprometa la
mentacin de los datos de apoyo desarrollados en la ejecu- resistencia del indicador biolgico. La configuracin fsica
cin de este programa. del producto a ser inoculado (real o simulado) puede afec-
tar la resistencia de la suspensin microbiana inoculada.
En el caso de productos lquidos es recomendable la de-
7.2 INDICADORES terminacin del valor D y valor Z del indicador biolgico
BIOLGICOS en el producto lquido especificado. La poblacin, valor D,
valor Z donde aplicable y tiempo de destruccin del mi-
El indicador biolgico es definido como una preparacin croorganismo deben ser determinados.
caracterizada de microorganismo especfico que da una re-
sistencia definida y estable a un determinado proceso de Valor Z es la elevacin de temperatura en grados, nece-
esterilizacin. Bacterias formadoras de esporas son los mi- saria para reducir el valor D en 90%, o producir la reduc-
croorganismos reconocidos como apropiados para empleo cin de un ciclo logartmico en la curva de resistencia
como indicadores biolgicos una vez que, con excepcin trmica. El tercer tipo es el indicador biolgico auto con-
de la radiacin ionizante, estos microorganismos son, sig- tenido, presentado de tal forma que el embalaje primario
nificativamente, ms resistentes a los procesos de esterili- destinado para incubacin despus de la esterilizacin
zacin del que los microorganismos de la carga microbia- contenga el medio de crecimiento requerido para la re-
na natural del producto. Un indicador biolgico puede ser cuperacin del microorganismo. En ese caso, el sistema
bles comercialmente como indicadores biolgicos. Otros Para monitorear los procesos de esterilizacin empleando
microorganismos formadores de esporas resistentes al radiacin ionizante, esporas de Bacillus pumilus han sido
calor hmedo como Clostridium sporogenes, Bacillus usados a pesar de no ser prctica usual. El mtodo de es-
atrophaeus y Bacillus coagulans, tambin, pueden ser uti- tablecimiento de la dosis de radiacin, ms empleado, no
lizados en el desarrollo y validacin de un proceso de este- usa indicadores biolgicos. Algunos microorganismos en
rilizacin por calor hmedo. la carga microbiana del material a ser esterilizado, pueden
presentar mayor resistencia al proceso de esterilizacin por
Para la validacin del proceso de esterilizacin, por va radiacin en comparacin con las esporas de Bacillus pu-
calor seco, pueden ser empleados esporas de Bacillus atro- milus.
phaeus. Durante la validacin pueden ser realizados estu-
dios para evaluacin de la despirogenizacin en el lugar Para el proceso de esterilizacin por xido de etileno son
de la inactivacin microbiana, una vez que la tasa de in- comnmente utilizadas esporas de subespecies de Bacillus
activacin de endotoxinas bacterianas es ms lenta que la atrophaeus var. niger, cuando se emplea xido de etileno
inactivacin de las esporas de Bacillus atrophaeus. En la 100%, o diferentes mezclas de gases.
prctica, una reduccin de la orden de por lo menos tres
ciclos logartmicos del nivel de endotoxina resulta en una
probabilidad de no esterilidad menor que 10-6.
de validez y a la estabilidad del indicador biolgico deben de desempeo del producto debe identificar los parme-
ser observadas y registradas. El usuario puede considerar tros ms importantes del proceso para inactivacin de los
la necesidad de auditar el valor D antes de la aceptacin microorganismos en los locales ms difciles de esterilizar.
del lote de indicador biolgico. Para almacenamiento por La supervivencia del indicador biolgico es consecuencia
largo perodo, es importante verificar el valor D y la es- de la resistencia y tamao de la poblacin microbiana. Por
tabilidad del conteo. En el caso de almacenamiento de la tanto, ni siempre un indicador biolgico con poblacin de
suspensin de esporas, por perodo superior a 12 meses, 106 es necesario para confirmar un nivel de garanta de
bajo condiciones documentadas, la confirmacin del con- esterilidad de 10-6. El uso apropiado de los indicadores
teo y la comprobacin de la resistencia de las esporas de- biolgicos es para confirmar que los parmetros estable-
ben ser realizadas, a menos que el desempeo de un cultivo cidos en el proceso de esterilizacin garantizan el nivel de
anterior haya sido validado despus de largo perodo de seguridad de esterilidad deseado. En la esterilizacin por
almacenamiento. Los resultados de los ensayos de resis- calor hmedo, el empleo del indicador biolgico confirma
tencia y conteo de esporas deben estar dentro de la banda la letalidad determinada por parmetros fsicos. Indicado-
de aceptacin establecida durante la aprobacin del lote de res biolgicos con valor D relevante y poblaciones sustan-
suspensin de esporas. cialmente menores que 106 son adecuados para validar
muchos procesos de esterilizacin y descontaminacin. Es
PRODUCTOS NO COMERCIALES importante que los usuarios estn capacitados para justifi-
car, cientficamente, la eleccin de un indicador biolgico.
El usuario puede decidir cultivar microorganismos para
desarrollo de indicadores biolgicos a ser empleados en el
desarrollo o en la validacin de un proceso de esteriliza-
7.3 PROCESO ASPTICO
cin. En el caso de que el usuario se torne un productor,
las exigencias de desempeo del indicador biolgico deben A pesar de que la esterilizacin terminal de un producto
ser satisfechas. Si un sistema de indicador biolgico es em- embalado sea el procedimiento que garantice riesgos m-
pleado para el desarrollo de un nuevo proceso de esterili- nimos de contaminacin microbiana en la produccin de
zacin o validacin de un proceso ya existente, los mismos un lote, existen clases de productos que no pueden ser es-
criterios de desempeo para productos comerciales deben terilizados en su envasado final y que deben ser preparados
ser cumplidos. empleando proceso asptico. Ese proceso es proyectado
para prevenir la contaminacin de los componentes est-
7.2.4.3 PREPARACIN DE LA riles por microorganismos viables, o adems, en la fase
SUSPENSIN DE ESPORAS intermediaria de la produccin, cuando algn componen-
te debe ser suministrado exento de microorganismos. Un
Los registros de la identificacin de las suspensiones de producto definido como procesado aspticamente consiste
esporas deben ser mantenidos por productores comercia- de componentes que fueron esterilizados por uno de los
les o no comerciales y deben incluir informaciones sobre procesos de esterilizacin como, por ejemplo, la filtracin,
la fuente del cultivo inicial de microorganismos; la iden- en el caso de tratarse de un lquido. En el caso de material
tificacin; la rastreabilidad del cultivo madre de esporas,
la frecuencia de subcultivo; el medio de cultivo utilizado
para la esporulacin; los cambios ocurridos en la prepara-
de envasado constituido por vidrio, puede ser empleado el
calor seco y, cuando se trata de material de envasado poli-
mrico, como tapas, puede ser utilizada la autoclavacin u
7
cin del medio; las observaciones sobre contaminacin de xido de etileno.
la suspensin; los datos anteriores y posteriores al choque
trmico; los registros del uso de la suspensin de esporas y En el proceso asptico, el ambiente donde los insumos
la resistencia a la esterilizacin (particularmente, valores D son manipulados y a etapa de llenado asptico son consi-
y Z, donde aplicable). derados puntos crticos. Las exigencias para un proyecto
adecuadamente validado y que mantenga las condiciones
7.2.5 USO DE INDICADOR necesarias para el proceso asptico abarcan un ambiente
libre de microorganismos viables, donde la calidad del aire
BIOLGICO PARA VALIDACIN sea garantizada por equipos adecuados, por personal en-
trenado y paramentado de acuerdo con las exigencias del
Independiente del proceso de esterilizacin a ser emplea- ambiente y por operacin a ser realizada. El ambiente de-
do, la poblacin inicial de microorganismos, su resistencia seado puede ser obtenido por medio de la tecnologa de
al proceso esterilizante y el local de inoculacin del pro- filtracin del aire que propicia el suministro del aire con la
ducto pueden influenciar la tasa de inactivacin del indi- calidad microbiana exigida. El planeamiento de la planta
cador biolgico. Durante el proceso de validacin, en va- debe proporcionar un sistema de cascada de flujo de aire
rios locales del producto deben ser inoculados el indicador con presin positiva mayor, de las reas ms crticas (asp-
biolgico, garantizando el desafo tanto del embalaje como ticas) para aquellas de exigencia intermediaria (reas de
del producto en l contenido, para que se asegure un nivel preparacin) y finalmente, aquellas de menor exigencia de
de garanta de esterilidad de 10-6 para el producto y para el control; y adems, debe permitir el cambio frecuente del
embalaje. Puede ser necesario, por medio de estudios de la- aire, adems del empleo de flujo de aire unidireccional en
boratorio, determinar si los componentes del producto son la rea inmediata del producto o componentes expuestos y
ms difciles de esterilizar que, por ejemplo, una solucin, el control de la temperatura y humedad (cuando aplicable).
o medicamento en l contenidos. La fase de calificacin Las instalaciones deben incluir sistemas de aislamiento
primario (prximo al producto) y secundario (donde el pro- procesamiento y, por tanto, la prevencin de la entrada de
ceso asptico es realizado) por medio de barreras fsicas. los microorganismos en recipientes abiertos durante el en-
Las superficies, como paredes y techo, deben ser lisas po- vase y la carga microbiana del producto y del ambiente de
sibilitando la sanitizacin frecuente. Los vestuarios deben fabricacin son factores importantes relacionados al nivel
tener espacio adecuado para el personal y almacenamiento de garanta de esterilidad de estos productos.
de las vestimentas estriles. El entrenamiento del personal
cuanto a la paramentacin, debe abarcar el uso correcto de 7.4.1 CLASIFICACIN DE
las vestimentas como, delantales, guantes y otros tems que
propicien la cobertura de la superficie del cuerpo. Todo el SALAS LIMPIAS Y AMBIENTES
proceso de sanitizacin debe ser documentado. La certifi- CONTROLADOS ASOCIADOS
cacin y la validacin del proceso e instalaciones aspticas
son realizadas por medio de la confirmacin de la eficien- Sala limpia es la sala en la cual la concentracin de part-
cia de los sistemas de filtracin; por los procedimientos de culas en suspensin en el aire es controlada; es construida
monitoreo microbiolgico del ambiente y por la simula- y utilizada de manera que minimice a introduccin, gene-
cin de llenado asptico del producto, empleando medio de racin y retencin de partculas dentro de la sala, en la cual
cultivo estril. El monitoreo de la instalacin asptica debe otros parmetros relevantes, como, por ejemplo, tempera-
incluir el examen peridico de filtro ambiental, el monito- tura; humedad y presin, son controlados conforme nece-
reo de rutina de material particulado y viable y el llenado sario.
simulado con medio de cultivo estril.
La clasificacin de limpieza del aire de salas y zonas lim-
pias, por medio del anlisis de concentracin de partculas
7.4 SALAS LIMPIAS Y en suspensin en el aire, es regulada por la norma ABNT
AMBIENTES CONTROLADOS NBR ISO 14644-1 Salas limpias y ambientes controlados
asociados Parte 1: clasificacin de la limpieza del aire.
ASOCIADOS Ese documento se aplica a partculas suspendidas en el aire
dentro de un ambiente controlado, pero no pretende carac-
En esa seccin estn incluidos algunos aspectos relacio- terizar la naturaleza viable o no viable de las partculas.
nados al procesamiento asptico de productos con el esta-
blecimiento; mantenimiento y control de la calidad micro- La aplicacin de esa norma ha sido usada por fabricantes
biolgica de salas y zonas limpias. Incluye la clasificacin de salas y zonas limpias para orientar la construccin, la
de esos ambientes controlados con base en los lmites de preparacin y el mantenimiento de esas instalaciones. Sin
conteo de partculas; en el programa de evaluacin micro- embargo, no da relacin entre el nmero de partculas no
biolgica para ambientes controlados; en el entrenamiento viables y la concentracin de microorganismos viables.
de funcionarios; en los factores crticos en el proyecto e
implementacin de un programa de evaluacin microbio- La industria farmacutica se preocupa con el conteo de
lgica; en el desarrollo de un plan de muestreo; en el esta- partculas viables y, en el caso de productos inyectables,
Media fill es una prueba para simulacin de las operacio- En la Tabla 1 estn descritas las clases de limpieza de aire
nes aspticas en que el producto es sustituido por un medio de acuerdo con la norma ABNT NBR ISO 14644-1, que
de cultivo y sirve para asegurar que los procesos utilizados est basada en lmites de partculas con tamaos de 0,1 a
sean capaces de conducir a productos estriles. 5 m. En la Tabla 2 est la relacin entre los diferentes
sistemas de clasificacin de salas limpias.
Hay mtodos alternativos para evaluar y controlar el esta-
do microbiolgico de salas y zonas limpias, con variedad Es aceptable que, si un menor nmero de partculas est
de equipos y mtodos para muestreo microbiolgico. La presente en la sala limpia o ambiente controlado, el con-
aplicacin impropia de muestreo y anlisis microbiolgi- teo microbiano bajo condiciones operacionales ser menor,
cos puede causar variabilidad significativa y potencial para siempre que no haya cambios en el flujo de aire, en la tem-
contaminacin inadvertida. Un gran nmero de productos peratura y en la humedad. Salas limpias son mantenidas
estriles es fabricado por procesamiento asptico, que de- bajo un estado de control operacional con base en datos
pende de la exclusin de microorganismos de la lnea de dinmicos (operacionales).
Tabla 1 - Clases de limpieza del aire para partculas en suspensin, seleccionadas para salas y zonas limpias.
Lmites mximos de concentracin (partculas/m3 de aire)
Nmero de Clasificacin ISO
para partculas iguales o mayores que los tamaos considerados
(N) 0,1 m 0,2 m 0,3 m 0,5 m 1 m 5 m
ISO Clase 1 10 2
ISO Clase 2 100 24 10 4
ISO Clase 3 10.000 237 102 35 8
ISO Clase 4 100.000 2.370 1.020 352 83
ISO Clase 5 1.000.000 23.700 10.200 3.520 832 29
ISO Clase 6 237.000 102.000 35.200 8.320 293
ISO Clase 7 352.000 83.200 2.930
ISO Clase 8 3.520.000 832.000 29.300
ISO Clase 9 35.200.000 8.320.000 293.000
El monitoreo de partculas totales en suspensin en el aire El monitoreo microbiolgico de salas y zonas limpias debe
en salas y zonas limpias no da informacin sobre el con-
tenido microbiolgico del ambiente. La limitacin bsica
de los contadores de partculas es que normalmente miden
incluir la cuantificacin del contenido microbiano del aire
ambiental; del aire comprimido que entra en el rea crtica;
de las superficies; de los equipos; de los recipientes; de los
7
partculas de 0,5 m o mayores y los microorganismos car- pisos; de las paredes y de las vestimentas de las personas.
gados por el aire no son clulas que fluctan libremente, El objetivo pretendido con el programa es obtener estima-
no estn solas y frecuentemente se asocian con partculas cin representativa de la carga microbiana del ambiente y,
de 10 a 20 m. Conteos de partculas, as como, conteos una vez compilada y analizada, cualquier tendencia debe
microbianos dentro de salas y zonas limpias, varan con las ser evaluada por personas entrenadas. Es importante rever
actividades conducidas durante el muestreo y su localiza- resultados ambientales con base en frecuencia especifica-
cin. El monitoreo del ambiente para partculas no viables da, as como rever resultados por perodos prolongados
y microorganismos es importante porque ambos son ne- para determinar si hay tendencias presentes. Tendencias
cesarios para alcanzar las exigencias relativas al material pueden ser visualizadas por medio de cuadros de control
particulado y esterilidad establecidas para los productos. estadstico que incluyen niveles de alerta y de accin. El
control microbiolgico de ambientes controlados, tambin,
Programas de monitoreo microbiolgico para salas y zo- puede ser evaluado con base en los datos de tendencia. In-
nas limpias deben evaluar la efectividad de las prcticas de formes o resmenes peridicos deben ser emitidos para
limpieza y desinfeccin que pueden tener impacto sobre alertar el responsable del rea.
la carga microbiana del ambiente. El monitoreo microbio-
lgico, normalmente, no identifica y cuantifica todos los Cuando el nivel microbiolgico especificado para un am-
contaminantes microbianos en los ambientes; sin embargo, biente controlado es excedido, revisin de la documenta-
el monitoreo de rutina debe suministrar informacin sufi- cin e investigacin deben ocurrir. La investigacin debe
ciente para certificarse de que el ambiente est operando incluir la revisin de la documentacin de mantenimiento
dentro del estado de control adecuado. del rea; de la documentacin de desinfeccin; de los pa-
rmetros fsicos u operacionales inherentes, tales como,
El monitoreo microbiolgico ambiental y el anlisis de da- cambios en la temperatura ambiental y humedad relativa y
tos realizados por personas calificadas posibilitan que el la etapa de entrenamiento de los funcionarios involucrados.
Luego de la investigacin, las acciones adoptadas pueden Barreras: dispositivo que restringe el contacto entre el
incluir el refuerzo en el entrenamiento de las personas para operador y el campo asptico. Barreras no pueden ser es-
enfatizar el control microbiolgico del ambiente; el mues- terilizadas y ni siempre poseen sistemas de transferencia
treo adicional en frecuencia aumentada; la desinfeccin que permiten el paso de materiales para dentro o fuera del
adicional; las pruebas adicionales de producto; la identifi- sistema sin exposicin al ambiente alrededor. Hay diferen-
cacin del contaminante microbiano y su posible fuente y tes tipos de barreras, desde cortinas de plstico en zonas
la reevaluacin y revalidacin de los actuales procedimien- crticas hasta barreras rgidas en equipos, que pueden in-
tos operacionales estandarizados, si necesario. Con base en corporar elementos como soporte de guantes y puerta de
la revisin de la investigacin y en los resultados de las transferencia.
pruebas, el significado del nivel microbiolgico excedido
y la aceptabilidad de las operaciones o productos proce- Soplo/Llenado/Sellado (Blow/Fill/Seal): ese sistema com-
sados bajo aquella condicin pueden ser definidos. Toda bina el montaje del recipiente con el envase del producto y
investigacin y justificativa de las acciones deben ser do- el sellado en un nico equipo. Del punto de vista microbio-
cumentadas y formar parte del sistema de gerenciamiento lgico, la secuencia de formacin del recipiente, envase del
de la calidad. producto estril y la formacin y aplicacin del sellado son
obtenidos, aspticamente, en una operacin ininterrumpida
Sala y zona limpia son definidas por certificacin de acuer- con exposicin mnima al ambiente. Esos sistemas existen
do con la norma aplicable, siendo que los parmetros eva- hace muchos aos y las tasas de contaminacin son meno-
luados incluyen integridad de filtros, diferenciales de pre- res que 0,1%.
sin y velocidad, estndares y cambios del aire. Un ejemplo
de mtodo para conducir la prueba de desafo de partculas Aisladores: tecnologa usada para doble propuesta, de pro-
para el sistema consiste en aumentar la concentracin de teger el producto de la contaminacin del ambiente y de
partculas en el ambiente por medio de humo en el entorno personas durante envasado y cierre y de proteger personas
de reas de trabajo crticas y visualizar los movimientos de productos txicos o nocivos durante su produccin. Esa
del aire. La presencia de vrtices y zonas turbulentas pue- tecnologa est basada en el principio de colocar materiales
den ser visualizados y el estndar de flujo de aire puede previamente esterilizados, como recipientes, productos y
ser finamente ajustado para eliminar o minimizar efectos tapas, en un ambiente estril, que permanecen estriles du-
indeseables. Esa evaluacin est hecha bajo condiciones rante toda operacin, una vez que personas o componentes
de produccin simuladas; sin embargo, con equipos y fun- no estriles no estn dentro del aislador. La barrera del ais-
cionarios en el local. lador es una barrera absoluta que no permite cambios entre
ambientes protegidos y no protegidos. Aisladores pueden
La prueba y la optimizacin apropiados de las caracters- ser fsicamente sellados contra la entrada de contaminantes
ticas fsicas de la sala limpia o ambiente controlado son externos o pueden ser efectivamente sellados por la aplica-
esenciales antes de concluir la validacin del programa de cin continua de sobrepresin. Manipulacin de material
monitoreo microbiolgico. La garanta de que el ambiente por funcionarios es realizada por medio de guantes o vesti-
est operando adecuadamente y de acuerdo con sus especi- mentas completas o parciales. El aire que entra en el aisla-
nes, los requisitos para el ambiente adyacente pueden va- tambin, es importante para las personas responsables
riar. Las estrategias de diseo y operacin para el ambiente del programa de monitoreo microbiolgico, una vez que
donde circulan esos sistemas deben ser desarrolladas por la contaminacin del rea de trabajo puede ocurrir inad-
los productores usando un criterio lgico y racional y la ca- vertidamente durante el muestreo microbiolgico, por uso
pacidad del sistema de suministrar productos estriles debe de tcnicas impropias. En operaciones altamente automa-
ser validada de acuerdo con criterios pre-establecidos. tizadas, el monitoreo puede ser realizado por personas que
tienen contacto ms directo con zonas crticas dentro del
En aisladores, el aire entra a travs de los filtros integrales rea de procesamiento. El monitoreo de los funcionarios
de calidad HEPA, o mejor, y su interior es, tpicamente, debe ser conducido antes y despus del trabajo en el rea
esterilizado con un nivel de garanta de esterilidad de 10-6. de procesamiento.
Por tanto, aisladores que contienen aire estril no intercam-
bian aire con el ambiente alrededor y son libres de opera- El gerenciamiento de la instalacin debe garantizar que to-
dores humanos. No obstante, cuando el aislador est en un das las personas involucradas en operaciones en las salas
ambiente controlado, el potencial de producto contamina- y zonas limpias conozcan principios microbiolgicos re-
do es reducido en la eventualidad de un fuga en los guantes levantes, incluyendo principios bsicos del procesamiento
o vestimentas. asptico y la relacin de los procedimientos de fabricacin
y manipulacin con fuentes potenciales de contaminacin
La extensin y alcance del monitoreo microbiolgico am- del producto. Tambin, deben tener conocimiento sobre
biental dependen del sistema utilizado. Productores deben principios bsicos de microbiologa; fisiologa microbiana;
balancear la frecuencia del muestreo ambiental que requie- limpieza, desinfeccin y esterilizacin; seleccin y pre-
re intervencin humana, con los beneficios acumulados paracin de medios de cultivo; de acuerdo con el envol-
por los resultados del monitoreo. Una vez que barreras son vimiento de los funcionarios en el proceso. Las personas
diseadas para reducir la intervencin humana, sistemas involucradas en la identificacin microbiana requieren en-
de muestreo remotos deben ser usados en sustitucin a la trenamiento especializado en los mtodos de laboratorio
intervencin de personas. En general, una vez que la va- aplicables. Entrenamiento adicional en el gerenciamiento
lidacin estableci la eficacia de la barrera, la frecuencia de los datos ambientales colectados debe ser suministrado.
de muestreo para monitorear el estado microbiolgico del Conocimiento y comprensin de los procedimientos ope-
rea de procesamiento asptico puede ser reducida cuando racionales estndar aplicables son crticos, especialmente
comparada a la frecuencia de un sistema clsico de proceso aquellos relacionados con las medidas correctivas que son
asptico. tomadas cuando las condiciones ambientales lo exigen. La
comprensin de las polticas de adhesin a las exigencias
Sistemas de aisladores requieren frecuencia menor de mo- regulatorias y la responsabilidad de cada individuo, relati-
nitoreo microbiolgico. El monitoreo continuo de part- vas a las Buenas Prcticas de Fabricacin deben ser parte
culas totales puede suministrar garanta de que el sistema integrante del programa de entrenamiento, as como entre-
de filtracin de aire dentro del aislador est funcionando namiento sobre cmo conducir investigaciones y analizar
adecuadamente. Mtodos tradicionales para muestreo mi- datos.
crobiolgico cuantitativo del aire pueden no ser suficientes
para probar el ambiente dentro del aislador. Experiencias
con aisladores indican que, bajo condiciones normales de
El control de la contaminacin microbiana asociada con
las personas es uno de los elementos ms importantes del
7
operacin, fuga o rompimiento en los guantes representan programa de control ambiental. La contaminacin puede
el mayor potencial para contaminacin microbiolgica, lo ocurrir a partir de la diseminacin de microorganismos por
que requiere pruebas frecuentes de integridad de los guan- individuos, particularmente aquellos con infecciones acti-
tes y monitoreo de sus superficies. El monitoreo no fre- vas y, por tanto, apenas individuos saludables deben ser
cuente de superficies dentro del aislador debe ser evaluado autorizados a acceder a ambientes controlados. La buena
y puede ser benfico. higiene personal y atencin cuidadosa en los detalles de
los procedimientos de paramentacin asptica son tems
7.4.4 ENTRENAMIENTO DE importantes. Los funcionarios apropiadamente paramenta-
dos deben ser cuidadosos en mantener la integridad de sus
FUNCIONARIOS guantes y delantales durante todo el perodo de permanen-
cia en los ambientes controlados.
Productos procesados aspticamente exigen mucha aten-
cin a los detalles, disciplina rigurosa y supervisin estric- Como el programa de monitoreo ambiental no es capaz de
ta de las personas, a fin de mantener el nivel de calidad detectar todos los eventos del procesamiento asptico que
ambiental apropiado para la garanta de esterilidad del pro- podran comprometer la calidad microbiolgica del am-
ducto final. biente, estudios peridicos de envase de medio de cultivo
o simulacin de proceso son necesarios para garantizar que
El entrenamiento de todos los funcionarios que trabajan los controles operacionales apropiados y entrenamiento
en salas y zonas limpias es crtico. Ese entrenamiento, sean efectivamente mantenidos.
cha una vez que los medios apropiados hayan sido selec- El indicativo de accin en monitoreo microbiolgico am-
cionados. Tpicamente, temperaturas de incubacin en los biental, cuando excedido, requiere acompaamiento inme-
intervalos de 22,5 C 2,5 C y 32,5 C 2,5 C han sido diato y, si necesario, accin correctiva.
usadas con tiempos de incubacin de 72 y 48 h, respecti-
vamente. Niveles de alerta se basan normalmente en informaciones
histricas obtenidas de operaciones de rutina del proceso
El programa de control ambiental debe incluir identifica- en un ambiente controlado especfico.
cin y evaluacin de los locales de muestreo y validacin
de los mtodos de muestreo microbiolgica del ambiente. En una instalacin nueva, esos niveles generalmente se ba-
san en la experiencia anterior de instalaciones y procesos
7.4.6 PLAN Y LOCALES DE similares; y, en datos obtenidos en el paso de varias se-
manas. Esos niveles son normalmente re-examinados para
MUESTREO adecuacin a una frecuencia establecida. Tendencias a un
deterioro de la calidad ambiental requieren atencin para
Durante la fase inicial de actividades, as como, en la pre- determinar la causa y para instituir un plan de accin co-
paracin de una sala limpia, u otro ambiente controlado, rrectiva, a fin de traer las condiciones de vuelta a los nive-
locales especficos para muestreo de aire o de superficies les esperados. Una investigacin debe ser implementada, y
deben ser determinados. Debe considerarse la proximidad la evaluacin del impacto potencial sobre el producto debe
del producto, si el aire y las superficies existentes en la sala ser efectuada.
microbiana mnima, informacin adicional en la evalua- Puntos crticos en la realizacin del media fill son nmero
cin del estado microbiolgico del ambiente puede ser ob- de recipientes para cualificar el proceso asptico; nme-
tenida por medio de la prueba de envase asptico de medio ro de unidades llenadas para el media fill; interpretacin
de cultivo (media fill). La prueba de media fill es empleada de resultados e implementacin de acciones correctivas.
para evaluar el procesamiento asptico usando medio de Normalmente tres trayectos de media fill son usados para
cultivo estril en el lugar del producto. Resultados satis- calificacin inicial, o inicio de un rea para demostrar con-
factorios de media fill demuestran la adecuacin de la lnea sistencia en la lnea de envase asptico. El nmero mnimo
para la fabricacin del producto. No obstante, otros facto- para demostrar la tasa de contaminacin de no ms que
res son importantes, como construccin de las reas; moni- 0,1%, criterio de aceptacin para trayecto de media fill, es
toreo ambiental y entrenamiento de personas. de, como mnimo, 3000 unidades. Plantas pilotos que pre-
paran pequeos lotes pueden usar nmero menor de uni-
Cuando un proceso asptico es desarrollado e instalado, es dades.
necesario cualificar el estado microbiolgico del proceso,
realizando, como mnimo, tres media fill consecutivos. Los Una vez que los funcionarios son una fuente crtica de con-
problemas en el desarrollo del programa de media fill a ser taminacin en salas limpias, documentacin visual puede
considerados comprenden procedimientos del envase del ser til para verificar correlacin de actividades de produc-
medio; seleccin del medio; volumen de envase; tiempo cin con eventos de contaminacin.
y temperatura de incubacin; inspeccin de unidades en-
vasadas; interpretacin de resultados y posibles acciones
correctivas requeridas.
7.5 PROCEDIMIENTOS DE
LIBERACIN
Una vez que el media fill es realizado para simular el pro-
cesamiento asptico de un producto, es importante que Debe ser establecido un programa de garanta de la calidad
sea realizado en condiciones normales de produccin. que describa en detalles los pasos y la documentacin re-
Eso incluye nmero mximo de personas y uso de todas querida para la liberacin de la carga o lote. La liberacin
las etapas y materiales usados en el proceso de produccin de los productos esterilizados depender de liberacin que
normal. Durante el desarrollo del media fill, intervenciones puede ser convencional o paramtrica.
pre-documentadas conocidas deben ser planeadas duran-
te las corridas normales de produccin, como cambio de LIBERACIN PARAMTRICA DE PRODUCTOS
picos de envase, componentes de fijacin, etc. Alternati- CON ESTERILIZACIN TERMINAL
vamente, para aadir un margen de seguridad, una combi-
nacin de condiciones posibles puede ser usada y ejemplos La liberacin paramtrica es definida como la liberacin
incluyen paradas frecuentes; reparaciones no esperadas; de cargas o lotes de productos sometidos a la esterilizacin
cambio de filtros, etc. terminal por medio del cumplimiento de parmetros crti-
cos del proceso de esterilizacin sin la necesidad de reali-
La calificacin de un proceso asptico debe ser hecha en zacin de la prueba de esterilidad. La liberacin paramtri-
Cuatro procesos de esterilizacin pueden ser calificados nocimiento de la carga microbiana del producto y datos
para la liberacin paramtrica: calor hmedo, calor seco, relativos a su resistencia al proceso de esterilizacin. La
xido de etileno y radiacin ionizante. Los productos so- resistencia relativa del indicador biolgico seleccionado
metidos a la esterilizacin terminal representan la cate- debe ser establecida por la inoculacin de las esporas mi-
gora de menor riesgo entre los productos farmacuticos crobianas en el producto. Normalmente son usados indica-
estriles. Al contrario de productos estriles obtenidos por dores biolgicos con 106 esporas y valor D mayor que 1
produccin asptica en ambientes controlados, productos minuto. Ciclos fraccionados son usados para determinar la
sometidos a la esterilizacin terminal presentan nivel de resistencia (valor D) relativa entre producto inoculado con
garanta de esterilidad mensurable. los microorganismos del indicador biolgico y con aque-
llos, frecuentemente, encontrados en la carga microbiana.
Los productos estriles obtenidos por esterilizacin ter- Ese proceso es empleado generalmente para desarrollo de
minal deben atender a un nivel de garanta de esterilidad ciclos de esterilizacin de productos parenterales emplean-
de 10-6, o sea, no ms que una unidad contaminada en un do esterilizacin terminal y esterilizacin de relacionados
milln de unidades producidas. La aplicacin apropiada de por xido de etileno.
los mtodos usados para desarrollo de proceso terminal re-
quiere amplio conocimiento cientfico del mtodo de este- El proceso de sobremorte es usado cuando el producto a
rilizacin seleccionado, dentro de tres categoras, para uso ser esterilizado no es deletreamente influenciado por el
con producto especfico: agente esterilizante o condiciones del proceso de esteriliza-
cin. Cuando se emplea ese proceso, es importante conocer
a) proceso basado en la carga microbiana (biocarga); la carga microbiana del producto y la prevalencia de los
b) proceso combinado: indicador biolgico y biocarga; microorganismos formadores de esporas. En ese caso, los
c) proceso de sobremorte. datos sobre la carga microbiana no necesitan ser minucio-
sos como para los otros dos procesos (biocarga e indicador
El proceso basado en la biocarga requiere amplio cono- biolgico / biocarga). Generalmente los indicadores bio-
cimiento de la carga microbiana del producto. Debe ser lgicos son resistentes al proceso. La sobremorte es de-
observado que diversos procedimientos de establecimiento mostrada por la reduccin logartmica de las esporas del
de dosis en el proceso de esterilizacin por radiacin uti- indicador biolgico, calibrado en un proceso que posibilita
lizan el conocimiento de la carga microbiana del producto obtener F0 mnimo de 12 minutos.
y su resistencia a la radiacin. Ese mtodo exige, tambin,
un nivel de garanta de esterilidad de por lo menos 10-6. El VALIDACIN DEL PROCESO DE ESTERILIZACIN
mtodo basado en la determinacin de la biocarga necesita
que sean desarrollados puntos crticos de control del pro- La liberacin paramtrica requiere que el proceso de es-
ceso cuanto a la carga microbiana del producto. Procedi- terilizacin escogido sea desarrollado y consistentemente
mientos de anlisis de riesgo, como Anlisis de Peligros y validado, para inactivacin de la carga microbiana y la
Puntos Crticos de Control (HACCP), son tiles para esta- atencin a un nivel de garanta de esterilidad de 10-6. La
blecer condiciones de control de manufactura y parmetros validacin de la mayora de los procesos de esterilizacin
apropiados de control en proceso.
8 PROCEDIMIENTOS ESTADSTICOS
APLICABLES A LOS ENSAYOS BIOLGICOS
8
w coeficiente de ponderacin
x log dosis tambin usado con ndice para indicar una preparacin particular.
x promedio de los log dosis
y respuesta individual o respuesta individual transformada.
y respuesta calculada para sustituir un valor perdido.
yp... yz promedios de las respuestas para las preparaciones estndar y muestra.
A.Z muestras ensayadas
A.Z suma de las respuestas para las muestras A...Z
A1A2A3 suma de las respuestas para las dosis menor, media y mayor de la muestra A. para un ensayo con dos
niveles de dosis, A2 representa la respuesta para la dosis mayor. Similarmente para otras muestras
ensayadas
B1B2n suma de las respuestas para cada sujeto (1 a 2n) en ensayo doble cruzado
B total incompleto de las respuestas en fila o bloque que tiene un valor perdido
C estadstica usada en el clculo de los lmites de confianza (Frmula 14)
C1.Cn suma de respuestas en cada columna (1 a n) en delineamiento cuadrado latino
C` suma incompleta de las respuestas en una columna de delineamiento en cuadrado latino con un valor
perdido
CV coeficiente de variacin.
x2 constante estadstica de la Tabla 18
Smbolo Definicin
Xm2
constante estadstica para probar homogeneidad de estimacin individuales de logaritmo de la
potencia
E suma de cuadrados para regresin (Tabla 10)
F razn de dos estimacin de varianzas independientes (Tablas 4 y 5)
FI` FII suma de las respuestas en la fase I o fase II en un ensayo cruzado
F 1 Fn suma de las respuestas en cada una de las filas 1 a n en delineamiento de cuadrado latino, o en cada
bloque de un delineamiento en bloques al azar
G1,G2,G3 estadstica utilizada en la prueba de valores aberrantes
G total incompleto de las respuestas en un ensayo con exclusin del valor perdido
I intervalo entre log dosis adyacentes, en el ensayo de rectas paralelas
K trmino de correccin utilizado en el anlisis de varianza K = (Ee)2/N
L intervalo de confianza en logaritmos
Lc intervalo de confianza en logaritmos para promedio semiponderado
Lp.Lz contrastes lineares para las preparaciones estndar y muestra
M estimativa del log de la potencia o del log de la razn de potencia usada con una letra ndice en un
ensayo mltiple, para denotar una preparacin particular (M = log R)
M1, M5 lmites de confianza de la estimativa del log de la potencia
M promedio de varias estimaciones independientes de M
M estimativa del log de la potencia de la muestra A o del log de la razn de potencias antes de corregir
por la potencia supuesta (M' = log R')
Ms, Mi lmites superior y inferior de la estimativa del log de la potencia, antes de corregir por la potencia
supuesta
N nmero total de respuestas del ensayo
Np NA nmero total de respuestas para las preparaciones P y A
P preparacin estndar
P suma de las respuestas para la preparacin estndar
P1,P2,P3 suma de las respuestas para las dosis inferior, media y superior de la preparacin estndar P. Para
ensayo de solamente dos niveles de dosificacin, P2 representa las respuestas para la dosis mayor
Q suma de cuadrados para linealidad en la misma direccin (Tabla 10).
QM suma de cuadrados debido a una fuente de variacin dividido por el respectivo grado de libertad
Qp.Qz contraste cuadrtico para las preparaciones estndar y muestra (Tabla 9)
R estimativa de la potencia de la muestra
Ri, Rs lmites de confianza inferior y superior de la estimativa de potencia
R estimativa de la razn de potencias antes de la correccin por la potencia supuesta
R+ constante especfica para probar valores atpicos (Tabla 2)
SA potencia supuesta para la muestra A, cuando se preparan las dosis
SQ suma de cuadrados debido a una fuente de variacin
T total incompleto de las respuestas para un tratamiento excluyendo el valor perdido
V=1/W varianza del logaritmo de potencia individual
X
W
diferencias en las respuestas comparadas entre muestra y estndar, divididas por el coeficiente de
regresin (bj), en el delineamiento 5 x 1
ponderacin estadstica usada en la combinacin de varias estimaciones independientes del log
8
potencia
W semi-ponderacin de cada logaritmo de potencia en una serie de ensayos
X2 estadstica qui-cuadrada (Tabla 18)
Nota: las Tablas de 1 a la 20 se encuentran en la seccin 8.9 TABLAS ESTADSTICAS. Las Tablas de 21 a la 47 se
encuentran en la seccin 8.10 EJEMPLOS DE ENSAYOS ESTADSTICOS.
8
RESULTADOS bla 1 para el valor correspondiente de n, existe base esta-
dstica para la eliminacin del valor sospechoso.
Expresar los resultados de evaluacin biolgica como esti-
mativa de la potencia supuesta para una muestra (R), que Criterio que contempla a amplitud de una serie K = 2 o ms
ser la expresin de la verdadera potencia relativa de la grupos de igual tamao
muestra en relacin al estndar (p). Esa ltima es imposible
de ser calculada con precisin debido a la variabilidad de los Los grupos pueden recibir diferentes tratamientos, sin em-
reactivos biolgicos. Tal estimativa de la potencia supuesta bargo todas las n respuestas dentro de cada grupo tienen
(R) debe ser acompaada por los lmites de confianza infe- del mismo tratamiento. En esta prueba, se estudia la varia-
rior y superior (Ri, Rs), o intervalo que abarca la verdadera cin de los valores para cada tratamiento que es obtenida
potencia relativa de la muestra (p). En las monografas estn por la diferencia entre el mayor y menor valor. El valor ob-
establecidas especificaciones para la amplitud aceptable de tenido con mayor diferencia debe ser dividido por la suma
esos intervalos con relacin a la potencia estimada. Esas es- de todas las diferencias y no debe exceder el valor en la
pecificaciones tienen en cuenta la dificultad de los mtodos y tabla de (R+) en la Tabla 2 para k = nmero de dosis y n =
la necesidad prctica de estimarse la verdadera potencia con nmero de rplicas. Si el valor calculado excede el valor en
determinada precisin. Para alcanzar los lmites de confian- la tabla, la columna sospechosa debe ser investigada para
za especificados debe, a veces, realizarse ms de un ensayo. detectar el valor discrepante. Si k fuese menor o igual a
Para obtener una estimativa de la potencia con intervalo de 10, usar los valores presentados en la Tabla 2; si mayor,
confianza reducido, deben combinarse, estadsticamente, los multiplicar R+ por (k + 2) e interpolar, si necesario, entre
resultados de esos ensayos independientes. los valores presentados en la Tabla 2a.
8
calculados para las dos preparaciones. Calcular los lmites rencialmente, del estndar y de la muestra para determinar
de confianza como: la posicin y la inclinacin de la recta. Proceder en cada
ensayo de esa manera, pues, dependiendo de la sensibi-
(4) lidad de los reactivos biolgicos utilizados, puede variar
tanto la posicin cuanto la inclinacin de la recta.
Obtener el valor apropiado de t en la Tabla 3, de acuerdo Cada tratamiento consiste de una dosis fija del estndar (p1,
con los grados de libertad (gl) dados por el denominador p2, p3 etc.) o de la muestra (a1, a2, a3, etc.) y es administrada
de la ecuacin (3). a un cierto nmero (n) de unidades experimentales (anima-
les, rganos, cultivos, tubos etc.). Registrar n respuestas, o
Calcular la potencia relativa de la muestra y los lmites de
sea, una para cada unidad experimental. Para que los m-
confianza, teniendo en consideracin la potencia supuesta
todos presentados en ese captulo sean vlidos, se deben
de la muestra (SA) utilizada para preparar las diluiciones:
cumplir las siguientes condiciones:
R = anti log M (5) 1. las unidades experimentales correspondientes a cada
em que tratamiento deben ser seleccionadas casualmente;
M = M + log SA (6) 2. para cada tratamiento, las respuestas o sus transforma-
ciones utilizada en el clculo (e) constituyen muestra
con lmites de confianza de distribucin normal;
3. el desvo estndar de la respuesta o de su transforma-
cin es independiente del nivel de respuesta, o sea, es
igual para todos los tratamientos, slo diferendo por los 8.5.1 TIPOS DE
errores de muestreo;
4. la respuesta, o su transformacin utilizada en los clcu- DELINEAMIENTO
los (e), tiene re1acin lineal con el logaritmo de la dosis
(x) en el intervalo de dosis utilizadas; CASUALMENTE
5. la lnea recta correspondiente a una o ms muestras
debe ser paralela a la del estndar. Cuando las unidades experimentales fueren, en su totali-
dad, razonablemente homogneas y no hubiere indicacin
A partir de estudios preliminares del mtodo de ensayo, de que la variabilidad de la respuesta podr ser menor en
es posible suponer el cumplimiento de las condiciones 2 ciertos subgrupos, proceder a la distribucin de las unida-
y 3. Teniendo de los resultados de cada ensayo, se puede des experimentales para los diferentes tratamientos casual-
probar las condiciones 4 y 5. La condicin 4 (linealidad) mente.
slo puede ser verificada en ensayos en que se aplican por
lo menos tres diluiciones de cada preparacin. Cuando se Habiendo posibilidad de que algunos subgrupos como,
realiza ensayo con solamente dos diluiciones, se presume por ejemplo, capas, posiciones en estantes o das de ex-
que la linealidad del sistema fue, previamente, estableci- perimento, sean ms homogneos que la totalidad de las
da. La condicin 5 (paralelismo) debe ser probada en cada unidades, la precisin del ensayo puede ser aumentada in-
ensayo. En ese, nunca deben ser utilizadas menos de dos troducindose una o ms restricciones en el delineamiento
diluiciones de cada preparacin. experimental.
8
Para simplificar los clculos del anlisis estadstico presen- aquel de tres dosis de cada preparacin. Proceder al ensayo
tado en este captulo, es necesario imponer las siguientes en dos fases conforme el perodo de tiempo definido en el
restricciones al delineamiento de los ensayos: mtodo. Distribuir los animales en cuatro o seis grupos y
realizar un tratamiento en cada grupo en la primera fase.
a) probar cada preparacin, estndar y muestra, con el En la segunda fase, los animales que recibieron una pre-
mismo nmero de diluiciones. Se presentan frmulas paracin recibirn otra; los animales que recibieron dosis
para ensayos farmacopeicos, utilizando dos y tres nive- menores, en esa etapa recibirn las mayores. Seguir el es-
les de dosis para cada preparacin as como el delinea- quema de la Tabla 6.
miento 5 x 1;
b) mantener constante en cada ensayo la razn de dosis CUADRADO LATINO
consecutivas para todos los tratamientos y
c) obtener el mismo nmero de respuestas para cada tra- Adecuado cuando la respuesta puede ser afectada por dos
tamiento. fuentes de variacin, cada cual pudiendo tener k niveles
diferentes. Por ejemplo, se realiza el experimento en k das
Caso alguna respuesta est perdida, esa puede ser estimada diferentes y por k experimentadores, o se realiza un en-
por los mtodos apropiados cada delineamiento presentado sayo de antibiticos por difusin en placa, en el cual los
en ese captulo; si hubiere prdida de un tratamiento, aten- tratamientos pueden ser aplicados en un esquema de k x k,
der a lo especificado en la seccin de Ensayos parcialmen- donde cada tratamiento slo ocurre una vez en cada fila y
te balanceados. en cada columna. Utilizar solamente cuando el nmero de
columnas, filas y tratamientos fueren iguales.
8
res de las Tablas 8 o 9. K representa el cuadrado de la suma un desvo significativo de paralelismo, eso puede ser
de todas las respuestas obtenidas en el ensayo dividido por debido a la utilizacin de alguna preparacin que dio
el nmero total de ellas: lnea dosis-respuesta con una inclinacin diferente con
relacin a las otras muestras. En ese caso, calcular el
k = { y )2/N} valor de t para cada preparacin A...Z, usando la ecua-
cin t=(LP-LA)/(2sn)
Calcular el error residual del ensayo substrayendo las va- L LA
riaciones controladas en el delineamiento de la variacin t= P (9)
2sn
total en las respuestas (Tabla 11). En esa tabla, y2 re-
presenta la suma de los cuadrados de todas las respuestas Cada t calculada debe ser comparada con el valor de la Ta-
registradas en el ensayo. Conviene sealar que la suma de bla 12, donde g11 = h -1 y g12 es igual al nmero de grados
cuadrados, reducida, correspondiente, al tem tratamientos de libertad asociado con s2. Si se encuentra un valor de t
es igual a la suma de las sumas de cuadrados reducidas significativo para alguna muestra, todos los datos relati-
(Tabla 10) y que, para el cuadrado latino, el nmero de res- vos a esa preparacin deben ser eliminados del ensayo y el
puestas replicadas (n) es igual al nmero de filas, columnas anlisis repetido desde el inicio.
o tratamientos (k).
En ensayos con error residual muy grande, una razn F
significativa para el trmino preparaciones puede indi-
car que la suposicin de potencia que sirvi de base para
la preparacin de las diluiciones no fue correcta. Eso no
es condicin de invalidad. Llegndose a esa conclusin, En el ensayo cruzado, la prueba de paralelismo no es muy
la potencia estimada en el ensayo puede ser usada como sensible, pues depende de la variacin entre bloques (ani-
potencia supuesta en ensayos posteriores. males).
En las pruebas de paralelismo y cuadrticos pueden darse Establecida la validez estadstica de los ensayos hechos con
por casualidad valores de F muy bajos, menores que 1. Si cualquier delineamiento, calcular la potencia y los lmites
pasa eso, repetidamente, puede ser indicacin de que no de confianza por los mtodos descritos a continuacin.
se cumplieron las condiciones supuestas, lo que debe ser
investigado ms profundamente. 8.5.4 ESTIMATIVA DE LA
Delineamiento 5 x 1 POTENCIA Y LMITES DE
CONFIANZA
La validez se establece cuando:
Clculos para delineamiento de rectas paralelas (3 x 3 o
1. regresin significativa, o sea, F calculado debe ser ma- 2 x 2)
yor que el valor en la tabla para nivel de significancia
= 0,01. Indica que la inclinacin de la lnea dosis-res- Calcular primero la respuesta promedio para cada prepara-
puesta es satisfactoria; cin (yP, yA,...,yZ)
2. desvo de linealidad no significativo. La relacin entre P
ambas variables (logaritmo de la dosis y halo de inhibi- yP =
NP
(10)
cin) debe ser lineal. El valor de F calculado debe ser
menor que aquel en la tabla para nivel de significancia y, anlogamente, para otras preparaciones.
= 0,05. Otra medida a ser realizada es el coeficiente de
correlacin de Pearson (r) que debe ser mayor que 0,98; Llamndose de I el intervalo en logaritmo de las concentra-
3. coeficiente de variacin (CV) menor que 5% es apro- ciones, para cada preparacin, en los ensayos con dos dosis
piado. La variabilidad de la respuesta en la curva de se obtiene la inclinacin comn (b), a partir de la ecuacin
calibracin debe ser constante. LP + LA + ... Lz
b= (11)
En el caso de ensayos cruzados, con esquema de clculo Inh
especial, las frmulas a utilizar se encuentran en las Tablas Para ensayos con tres dosis de cada preparacin, el deno-
13 y 14. minador Inh debe ser sustituido por 2 Inh.
Existen tres trminos de interacciones debido a las rplicas El logaritmo de la razn de potencia de la muestra A (MA),
dentro de cada grupo: Fases X Preparaciones, Fases X Re- antes de corregir por el valor de SA, es
gresin y Fases X Paralelismo.
yA yP
MA = (12)
Como en los delineamientos anteriormente discutidos, b
cada suma de cuadrados reducida debe ser dividida por el La potencia calculada es la estimativa de la verdadera po-
nmero correspondiente de grados de libertad para obtener tencia de cada muestra. Los lmites de confianza (con 5%
los cuadrados medios. de probabilidad de excluir la verdadera potencia o = 0,05)
pueden ser calculados como el antilogaritmo de la frmula
En el caso del delineamiento doble cruzado, se obtiene dos
MAs (yA yP)2
8
cuadrados medios correspondientes a los errores I y II, que tsC 1 1
b
+
NP NA
+
E-s2t2
(13)
se denominan s2I y s2II. Dividir el Cuadrado promedio de MAI
cada fuente de variacin por el s2 apropiado para obtener
la razn F. en que
C = E/(E s2t2) (14)
Para las fuentes Paralelismo, Fases X Preparaciones, Fases
X Regresin, se utiliza s2 I. Para las otras fuentes, se utiliza Obtener E de la Tabla 10. El s2 es el error residual de la
s2 II. Tabla 11 dividido por sus grados de libertad y t se encuen-
tra en la Tabla 3 de acuerdo con los grados de libertad de
Calcular La significancia de la fuente utilizando las Tablas s2.
4 y 5. SI F calculado es mayor que el valor en la tabla, para
los grados de libertad de la fuente ensayada (g11) y del s2 Para ensayos balanceados de 2 y 3 dosis por preparacin,
correspondiente (g12), la fuente de variacin es considera- la frmula para los lmites de la ecuacin 13 puede sim-
da significativa para el nivel de significancia utilizado ( plificarse:.
= 0,05 o = 0,01). MAs
(C-1) (CM2A + cI2) (15)
Para que el ensayo sea vlido, la regresin debe ser signi- MAI
ficativa y el paralelismo y las tres interacciones no deben en que c es el coeficiente obtenido en la Tabla 15 y C es
ser significativos. a medida de significancia de la regresin. En ensayo con
Procedimiento para construccin de la curva dosis-res- La varianza es calculada sobre los f valores de X para el
puesta En el mtodo turbidimtrico, medir la turbidez en total de muestras ensayadas como
los tubos con medio lquido. X2 (Tx2 /f)
SM2 = (19)
n
En el mtodo por difusin en agar, medir los halos de in-
hibicin para cada una de las concentraciones del estndar donde Tx = X para una nica muestra en n = f h y
(P1, P2, P3, P4, y P5) en los 4 conjuntos de placas. El pro- h es el nmero de muestras ensayadas.
medio de las 36 lecturas de la concentracin intermediaria
del estndar (P3) es utilizado para corregir los promedios El logaritmo del intervalo de confianza de cada muestra es
de cada una de las otras concentraciones del estndar P1, 2sMt
P2, P4, P5 L= (20)
k
La correccin se efecta de la siguiente manera: medir las 36 donde s es el desvo estndar para el total de diferencias
lecturas de P3 en todas las placas y calcular el promedio. Me- X, t se encuentra en la Tabla 3 con los grados de libertad
dir las 9 lecturas de P3 en el conjunto de placas (3) para las de s2M y k es el nmero de diferencias comparadas por
otras concentraciones (P1, P2, P4 y P5) y calcular el promedio. muestra ensayada.
Calcular la diferencia entre el promedio total y el promedio
en las 3 placas de cada concentracin, la cual debe ser suma- Los lmites de confianza (con 5% de probabilidad de ex-
da a las medidas de las otras concentraciones. cluir la verdadera potencia) pueden ser calculados con el
antilogaritmo de la frmula
Ejemplo: MAs
= MA 1/2L (21)
valor promedio de P3 en las 36 lecturas: 18,2 mm MAI
valor promedio de P3 en las placas con P1: 18,0 mm Obtener la razn de potencia (RA) y los lmites de confian-
valor de P1 en la primera lectura de las 9 placas: 17,3 mm za (Rs, Ri) tomando los antilogaritmos de los valores obte-
valor corregido en el primer punto P1: (18,2 18,0) + 17,3 nidos a partir de las frmulas 12 y 15 (delineamiento rectas
= 17,5 mm paralelas 3 x 3 o 2 x 2) y 17 y 21 (delineamiento 5 x 1),
despus de sumar log SA a ambos:
valor de P1 en la segunda lectura de las 9 placas: 16,9 mm
valor corregido en el segundo punto P1: (18,2 18,0) + MA = MA + log SA (22)
16,9 = 17,1 mm
RA = antilog MA (23)
Construir la tabla con las respuestas corregidas para las res-
pectivas concentraciones (P1 a P5) de acuerdo con a Tabla M As = M As + log SA (24)
19 y efectuar el anlisis de varianza. Confirmada la validez
de los resultados, calcular la diferencia en las respuestas M Ai = M Ai + log SA (25)
comparadas entre muestra y estndar en el punto central de
8
la curva por la ecuacin R As = antilog M As R Ai = antilog M Ai
X = (yA-yP)/b1 (16)
Valores perdidos
en que yA es una de las respuestas de la muestra entre las f
repeticiones, yP es la respuesta pareada del estndar y b1 es En ensayos balanceados se requiere el mismo nmero de
el coeficiente de regresin dado por la Tabla 20. observaciones para cada concentracin. Si alguna respues-
ta estuviese perdida por causa no relacionada con los trata-
El logaritmo de la razn de potencia es mientos aplicados, como la muerte de un animal o la ruptu-
ra de algn tubo de ensayo, el anlisis estadstico se torna
MA = X/f (17)
mucho ms complejo. Se puede restablecer el equilibrio de
donde f es el nmero de diferencias en las respuestas com- dos modos:
paradas entre la muestra y el respectivo estndar.
1. reducir el nmero de observaciones en los grupos ma-
Cuando un nmero de ensayos de la misma muestra es ob- yores hasta que el nmero de respuestas sea el mismo
tenido a travs de la misma curva, calcule el coeficiente de para cada tratamiento. Si el delineamiento fuese total-
variacin (CV) para los resultados de las muestras. mente al azar, se puede substraer el promedio de cada
desvi padrn (s) grupo mayor, tantas veces como fueren necesarias, o
CV = x 100 (18) eliminar una o ms respuestas de cada grupo mayor, se-
promedio y de cada muestra) leccionndolas al azar. Para ensayo de bloques al azar,
conservar solamente los bloques completos;
2. alternativamente, un grupo, casualmente, menor puede En ese caso, las respuestas a la dosis mayor o menor de la
ser recompuesto al tamao original, cuando el nmero muestra pueden ser rechazadas, calculndose un valor de
de respuestas perdidas no fuese mayor que uno en cual- potencia relativa a partir de los datos remanentes. Esa po-
quier tratamiento o 5% en el total del ensayo. En ese tencia puede ser toma como potencia supuesta para selec-
caso, calcular la sustitucin del valor perdido. Se pierde cionar dosis de muestra para otro ensayo, con el objetivo
un grado de libertad en la varianza del error s2 para de obtener respuestas similares al estndar y, de ese modo,
cada valor sustituido: aumentar la precisin del resultado. La ecuacin que se
a) si el delineamiento es totalmente al azar, sustituir el emplea para calcular la potencia es:
valor perdido por la media de las respuestas restan-
yA yP I
tes del grupo incompleto; MA = (28)
b) si el delineamiento es de bloques al azar, sustituir el b 2
valor perdido aplicando la frmula Esa frmula es similar a la frmula 12, sin embargo, se
nB + kT G substrae la mitad del intervalo log dosis cuando se omiten
y =
(n 1) (k 1)
(26) las respuestas de la dosis menor y se adiciona el mismo
intervalo cuando se descarta la dosis mayor.
en que B es el total incompleto de las respuestas en el blo-
que que contiene el valor perdido, T es el total incompleto Las respuestas promedio yA y yP son obtenidas de la misma
de las respuestas en el tratamiento que contiene el valor frmula que en los ensayos totalmente balanceados (fr-
perdido, G es la suma total de las respuestas obtenidas en mula 10), sin embargo se debe introducir modificacin en
el ensayo. Como se defini anteriormente, n es el nmero el clculo de la inclinacin (b) de acuerdo con el delinea-
de bloques y k es el nmero de tratamientos o dosis; miento del ensayo.
si el ensayo est basado en delineamiento de cuadrado lati- Para ensayos mltiples, que, obligatoriamente, tendran
no, el valor perdido (y) se obtiene por la ecuacin dos dosis de cada preparacin, los contrastes lineares (LP
k(B + C + T) 2G ... LZ) deben formarse excluyendo LA (como las respuestas
y =
(k 1) (k 2)
(27) para a1 o a2 fueron eliminadas, no es posible formar un con-
traste LA ). Calcular la inclinacin a partir del promedio de
en que By C son las sumas de las respuestas en las filas los valores de L dividida por In
y columnas, respectivamente, que contienen el valor perdi- LP + ... + Lz
do. En ese caso, k = n. b= (29)
In(h+1)
Se hubiere prdida de ms de un valor, sustituir, tempora- Para ensayos con una simple muestra:
riamente, por la media del tratamiento respectivo, todos los LP
lugares vacos, excepto uno. Sustituir ese lugar con el valor b= (30)
In
y, calculado por la ecuacin 27. Sustituir uno por uno los
valores que haban sido colocados, temporariamente, por Para ensayos mltiples con tres dosis de cada preparacin,
el promedio hasta que se obtenga conjunto estable de valo- obtener LA y los dems contrastes de la Tabla 9. La ecua-
res para todas las respuestas perdidas. cin para la inclinacin es:
2(LP + ... + Lz) + LA
Si el nmero de valores sustituidos es pequeo en relacin b= (31)
In(4h3)
al nmero total de observaciones en el ensayo (menor que
5%), la aproximacin derivada de las sustituciones descri- Si existe una muestra nica, la ecuacin se reduce a:
8
tas y de la reduccin de los grados de libertad, equivalen- 2LP + LA
te al nmero de valores sustituidos, es generalmente sa- b= (32)
51n
tisfactoria. Sin embargo, el anlisis debe ser interpretado
con cuidado, sobretodo si existe predominancia de valores
perdidos en un tratamiento o bloque particular. El mismo 8.6 MEDIAS MOVILES
es vlido para el caso de valores perdidos en los planea-
mientos cruzados. En el caso particular del ensayo biolgico de la heparina,
el intervalo entre la dosis que posibilita la coagulacin y
Ensayos parcialmente balanceados aquella que la inhibe es tan pequea que la curva dosis-res-
puesta no puede ser determinada explcitamente. Para in-
Si la potencia presumida de las muestras (usada para cal- terpolar el logaritmo de la dosis correspondiente a 50% de
cular las dosis del ensayo) fuese muy diferente de la ver- la coagulacin, tanto para el estndar cuanto para la mues-
dadera potencia, es posible que la dosis mayor proporcione tra, se utilizan las medias mviles.
respuesta mxima o que la dosis menor proporcione res-
puesta muy baja o nula. Esas respuestas estarn fuera de Clculo de la potencia
la zona lineal de la curva log dosis-respuesta y las pruebas
de validez indicarn curvatura y/o desvo de paralelismo Transformar en logaritmo los volmenes de la preparacin
significativo. estndar usados en 5 o 6 tubos que constituyen la serie,
de modo que 2 o 3 tubos presenten grados de coagulacin
iguales o menores que 0,5 y 2 o 3 tubos tengan grados igua- (logit o probit). Para cada valor de y, se debe obtener un
les o mayores que 0,5. valor de coeficiente de ponderacin (w) en la Tabla 17.
Confeccionar tabla correlacionando los tubos numerados, Las frmulas de las sumas de cuadrados para los pruebas de
consecutivamente, con el grado de coagulacin observado. validez son las mismas utilizadas en los ensayos indirectos
cuantitativos (Tabla 10), tomando n = 1, con excepcin del
Denominar x los logaritmos de los volmenes utilizados
e y los grados de coagulacin correspondientes. Calcular trmino error (s2), que tiene grados de libertad iguales a
los promedios realizados xi e yi de los tubos 1, 2 y 3; de infinito, y se calcula como:
los tubos 2, 3 y 4 y de los tubos 3, 4 y 5, y cuando la serie k
consista de 6 tubos, de los tubos 4, 5 y 6, respectivamente. s2 =
nw
(35)
Si para uno de esos pares de promedios el grado de coagu-
lacin medio yi es exactamente 0,50, el correspondiente xi en que k = nmero de tratamientos, n = nmero de anima-
es la mediana del logaritmo del volumen de la preparacin les utilizados en cada tratamiento.
estndar xp. En el caso de que eso no ocurra, interpolar el xp
a partir de los valores realizados de yi, xi e yi+1, xi+1 que ocu- Calcular la potencia y los lmites de confianza usando las
rran, inmediatamente abajo y arriba del grado 0,50, como: frmulas 12 y 25. Ese mtodo aproximado es til cuan-
do el ensayo es delineado de modo que las respuestas en
xp = xi + (yi 0,5) (xi+1 xi) / (yi yi+1) (33)
porcentaje correspondientes a las dosis menores y mayores
A partir de los datos obtenidos en los tubos de la muestra, estn uniformemente espaciadas alrededor de 50%. Si una
calcular del mismo modo la mediana del logaritmo del vo- de las dosis probadas suministra respuestas cero o 100%,
lumen xA. El logaritmo de la potencia de la muestra es: esas pueden ser descartadas. En ese caso, obtener la esti-
mativa de potencia por los mtodos descritos en la seccin
MA = xp xA+ logSA (34)
Ensayos parcialmente balanceados.
en que SA es a suposicin de la potencia de la muestra he-
cha en la preparacin de la solucin correspondiente de los
tubos de la muestra.
8.8 COMBINACIN DE
ESTIMACIN DE POTENCIA
Repetir el ensayo, independientemente, y calcular el pro-
medio de dos o ms valores de M para obtener M . En Cuando se realizan n ensayos independientes para cada
el caso que la segunda determinacin de M difiera de la muestra, los resultados pueden ser combinados a fin de
primera ms que 0,05, continuar realizando ensayos hasta obtener una potencia estimada con intervalo de confianza
que el logaritmo del intervalo de confianza, calculado con- reducido, que cumpla los lmites establecidos en cada mo-
forme final de la seccin Combinacin de estimacin de nografa. Existen varios mtodos para combinar ensayos
potencia, no exceda 0,20. repetidos.
La potencia de la heparina sdica es: Adoptar simplificaciones, tenindose en cuenta dos aspec-
tos:
R = anti log M
a) corregir estimacin del log de la potencia (M) por la
potencia supuesta (SA) antes de realizar las combina-
8.7 ENSAYOS INDIRETOS ciones (M = M + log sA);
TODO O NADA
8
b) las estimaciones deben ser independientes, o sea, obte-
nidas en ensayos separados.
En algunos ensayos no es posible ni conveniente medir el
efecto en cada unidad experimental (por ejemplo, animal) 8.8.1 POTENCIA MEDIA
en escala cuantitativa. En ese caso, pueden medirse efectos
de todo o nada, como muerte u ocurrencia de sntoma pre- PONDERADA Y LMITES DE
establecido. La proporcin de unidades experimentales que CONFIANZA
presentan el sntoma constituye el resultado. Esos ensayos
son llamados quantales. En este captulo ser presentado Suponer que fueron analizados resultados de n ensayos
un clculo aproximado. En el caso de disponer de facili- para dar n valores de M con lmites de confianza (en loga-
dades de computacin, se puede recurrir al clculo terico ritmos) asociados a cada valor de M, obtenidos segn las
exacto. Se debe registrar, para cada dosis, el porcentaje de ecuaciones 13 a 15 y 22 a 25. Para cada ensayo, obtener
animales con efecto positivo. Ejemplo: porcentaje de rato- el intervalo de confianza logartmico (L), substrayendo el
nes en convulsin. Transformar los porcentuales en probit, lmite inferior del superior. Calcular, tambin, una ponde-
utilizando la Tabla 16. Cada probit ser considerado como racin (W) para cada valor de M a partir de la ecuacin
el valor de la respuesta transformada (y). El mtodo a con- 36, donde t es el mismo valor empleado en el clculo del
tinuacin es utilizado cuando no ocurren respuestas equi- intervalo de confianza
valentes a porcentuales cero o 100. En ese caso, emplear 4t2
mtodos estadsticos completos de mxima probabilidad W=
L2
(36)
L2
Para cada ensayo, calcular el producto WM y dividir su V = 1/W =
4t2
(42)
suma por la suma de todas las ponderaciones a fin de obte-
ner el logaritmo de la potencia media ponderada (M), con- y v es la varianza de la heterogeneidad entre ensayos y se
forme la ecuacin 37: calcula por la ecuacin:
Calcular los lmites de confianza aproximados ( = 0,05), a Para calcular el promedio semi-ponderado (M), sustituir en
partir del antilogaritmo de los valores obtenidos por medio la ecuacin 31 los valores de W y W por los respectivos
de la frmula 39: valores de W y W:
M ts (39) M=
n
WM/
n
W (44)
Se obtiene el valor de t en la Tabla 3, con grados de liber- Se puede considerar ese valor de M prximo al centro de
tad equivalentes a la suma de los grados de libertad de la un intervalo de confianza de tamao aproximado Lc que es
varianza del error de los ensayos individuales. la raz cuadrada de:
Lc2 = 4t2 / W (45)
Ese mtodo aproximado de combinacin da resultados sa-
tisfactorios cuando: en que t, de la Tabla 3, tiene grados de libertad iguales a la
suma de grados de libertad de la varianza del error de los n
a) C es menor que 1,1 para cada uno de los n ensayos; ensayos individuales.
b) las estimacin individuales de la potencia forman un
conjunto homogneo de acuerdo con la prueba de ho- En el caso especial del ensayo de heparina, todos los lo-
mogeneidad realizada, aplicando la estadstica x2 Esa garitmos de potencia (M) tienen la misma ponderacin y el
calculada elevndose al cuadrado la diferencia entre intervalo de confianza de logaritmo de la estimativa de la
cada valor de M en re1acin al promedio ponderado M potencia M se determina como a continuacin:
, multiplicndose ese cuadrado por la ponderacin co-
rrespondiente (W) y sumndose los valores para todos Clculo de la varianza del error con n 1 grados de liber-
tad:
los ensayos:
s2 = {M2 (M)2/n}/n 1 (46)
x M=
2
n
W (M M) (40) Determinar el lmite de confianza en logaritmos (L)
Si el valor de 2M calculado es menor que el correspon- 2st
diente en la Tabla 18 para (n 1) grados de libertad, se L= (47)
considera que no hay elementos para sospechar de la hete- n
rogeneidad de potencias. En ese caso, la potencia media y en que
los lmites calculados son correctos.
s = s2, t (Tabla 3) con n 1 grados de libertad, n = n-
Si el valor de es mayor que el de la Tabla 18, se consi-
2
M
mero de estimacin individuales de la potencia.
8
dera que las potencias son heterogneas, o sea, que la dis-
persin de los valores individuales de M es mayor que la Calcular los lmites de confianza:
esperada, de acuerdo con los respectivos lmites de confian-
za. En ese caso, no aplicar las frmulas 37 y 39, averiguar el Ms=M+1/2L (48)
origen de esa heterogeneidad y, en el caso que se considere
adecuado, calcular M usando semi-ponderaciones W: Mi=M-1/2L (48)
W = 1/(V + v) (41) Rs=antilogMs (49)
en que
Ri=antilogMi (50)
1 0,158 0,325 0,510 0,727 1,000 1,376 1,963 3,078 6,314 12,706 31,821 63,657 636,619
2 0,142 0,289 0,445 0,617 0,816 1,061 1,386 1,886 2,920 4,303 6,965 9,925 31,598
3 0,137 0,277 0,424 0,584 0,765 0,978 1,250 1,638 2,353 3,182 4,541 5,541 12,924
4 0,134 0,271 0,414 0,569 0,741 0,941 1,190 1,533 2,132 2,776 3,747 4,604 8,610
5 0,132 0,267 0,408 0,559 0,727 0,920 1,156 1,476 2,015 2,571 3,365 4,032 6,869
6 0,131 0,265 0,404 0,553 0,718 0,906 1,134 1,440 1,943 2,447 3,143 3,707 5,959
7 0,130 0,263 0,402 0,549 0,711 0,896 1,119 1,415 1,895 2,365 2,365 3,499 5,408
8 0,130 0,262 0,399 0,546 0,706 0,889 1,108 1,397 1,860 2,306 2,896 3,355 5,041
9 0,129 0,261 0,398 0,543 0,703 0,883 1,100 1,383 1,833 2,262 2,821 3,250 4,781
10 0,129 0,260 0,397 0,542 0,700 0,879 1,093 1,372 1,812 2,228 2,764 3,169 4,587
11 0,129 0,260 0,396 0,540 0,697 0,876 1,088 1,363 1,796 2,201 2,718 3,106 4,437
12 0,128 0,259 0,395 0,539 0,695 0,873 1,083 1,356 1,782 2,179 2,681 3,055 4,318
13 0,128 0,259 0,394 0,538 0,694 0,870 1,079 1,350 1,771 2,160 2,650 3,012 4,221
14 0,128 0,258 0,393 0,537 0,692 0,868 1,076 1,345 1,761 2,145 2,624 2,977 4,140
15 0,128 0,258 0,393 0,536 0,691 0,866 1,074 1,341 1,753 2,131 2,602 2,947 4,073
16 0,128 0,258 0,392 0,535 0,690 0,865 1,071 1,337 1,746 2,120 2,583 2,921 4,015
17 0,128 0,257 0,392 0,534 0,689 0,863 1,069 1,333 1,740 2,110 2,567 2,898 3,965
18 0,127 0,257 0,392 0,534 0,688 0,862 1,067 1,330 1,734 2,101 2,552 2,878 3,922
19 0,127 0,257 0,391 0,533 0,688 0,861 1,066 1,328 1,729 2,093 2,539 2,861 3,883
20 0,127 0,257 0,391 0,533 0,687 0,860 1,064 1,325 1,725 2,086 2,528 2,845 3,850
21 0,127 0,257 0,391 0,532 0,686 0,859 1,063 1,323 1,721 2,080 2,518 2,831 3,819
22 0,127 0,256 0,390 0,532 0,686 0,858 1,061 1,321 1,717 2,074 2,508 2,819 3,792
23 0,127 0,256 0,390 0,532 0,685 0,858 1,060 1,319 1,714 2,069 2,500 2,807 3,767
24 0,127 0,256 0,390 0,531 0,685 0,857 1,059 1,318 1,711 2,064 2,492 2,797 3,745
25 0,127 0,256 0,390 0,531 0,684 0,856 1,058 1,316 1,708 2,060 2,485 2,787 3,726
26 0,127 0,256 0,390 0,531 0,684 0,856 1,058 1,315 1,706 2,056 2,479 2,779 3,707
27 0,127 0,256 0,389 0,531 0,684 0,855 1,057 1,314 1,703 2,052 2,473 2,771 2,690
8
28 0,127 0,256 0,389 0,530 0,683 0,855 1,056 1,311 1,699 2,045 2,462 2,756 3,674
29 0,127 0,256 0,389 0,530 0,683 0,854 1,055 1,310 1,697 2,042 2,457 2,750 3,659
30 0,127 0,255 0,389 0,530 0,683 0,854 1,055 1,310 1,697 2,042 2,457 2,750 3,646
40 0,126 0,254 0,388 0,529 0,681 0,851 1,050 1,303 1,684 2,021 2,423 2,704 3,551
60 0,126 0,254 0,387 0,527 0,679 0,848 1,046 1,296 1,671 2,000 2,390 2,660 3,460
120 0,126 0,253 0,386 0,526 0,677 0,845 1,041 1,289 1,658 1,980 2,358 2,617 3,373
0,126 0,256 0,385 0,524 0,674 0,842 1,036 1,282 1,645 1,960 2,326 2,576 3,291
8
27 7,68 5,49 4,60 4,11 3,78 3,56 3,26 2,93 2,56 2,10
28 7,64 5,45 4,57 4,07 3,75 3,53 3,23 2,90 2,52 2,06
29 7,60 5,42 4,54 4,04 3,73 3,50 3,20 2,87 2,49 2,03
30 7,56 5,39 4,51 4,02 3,70 3,47 3,17 2,84 2,47 2,01
40 7,31 5,18 4,31 3,83 3,51 3,29 2,99 2,66 2,29 1,80
60 7,08 4,98 4,13 3,65 3,34 3,12 2,82 2,50 2,12 1,60
120 6,85 4,79 3,95 3,48 3,17 2,96 2,66 2,34 1,95 1,38
6,64 4,60 3,78 3,32 3,02 2,80 2,51 2,18 1,79 1,00
a2 1 a1 2
2 a1 1 a2
a1 a2 2 1
1 2 a2 a1
P2 + A2 + ... + Z2 P2 + A2 + ... + Z2
Preparaciones h1 K K
2n 3n
Grados de
Fuente de variacin Suma de cuadrados reducida
libertad (gl)
L2P + L2A
Paralelismo 1 E
2n
L2I + L2II
Fases X Regresin 1 E
2n
P2 + A2
Preparaciones 1 K
2n
(LP + LA)2
Regresin 1 E
N
F2I + F2II
Fases 1 K
2n
8 TOTAL N1 y2 K
K = (y)2/N
N = nmero total de respuestas
n = nmero total de rplicas por dosis incluidas las dos fases
bl = nmero de bloques (animales)
B = suma de las dos repuestas para cada bloque (animal)
gl 2 gl 2
1 3,84 9 16,92
2 5,99 10 18,31
3 7,81 11 19,67
4 9,49 12 21,03
5 11,07 13 22,36
6 12,59 14 23,69
7 14,07 15 25,00
8 15,51 20 31,41
25 37,65
Estndar Muestra
P1 P2 P3 P4 P5 A B C
y11 y21 y31 y41 y51 A31 B31 ...
y12 y22 y32 y42 y52 A32 B32 ...
y13 y23 y33 y43 y53 A33 B33 ...
y14 y24 y34 y44 y54 A34 B34 ...
Respostas y15 y25 y35 y45 y55 A35 B35 ...
y16 y26 y36 y46 y56 A36 B36 ...
y17 y27 y37 y47 y57 A37 B37 ...
y18 y28 y38 y48 y58 A38 B38 ...
y19 y29 y39 y49 y59 A39 B39 ...
Total y1. y2. y3. y4. y5. A3. B3.
ynz: n es la concentracin (P1 a P5) y z es la respuesta (de 1 a 9)
Anz: n es la concentracin mediana (P3) y z es la respuesta (de 1 a 9)
Tabla 20 - Tabla de Anlisis de varianza para el modelo de regresin lineal simples delineamiento 5 x 1.
y = b0 + b1x
(x x)(y y)
(x x)(y y) r=
b1 = b0 = y b1 x (x x)2 (y y)2
(x x)2 (N 1)
N1 N1
Fuente de
gl Suma de cuadrados Cuadrado promedio F calculado
variacin
SQres
QMres = 2
Error residual N2 SQres = y b1xy b0y
2
N ---
SQep
QMep = 5
Error puro (ep) N5 SQep = y2 (yi)2/k N ---
(x x)2
N 1 = Sxx = desvo estndar de la variable (x)
(y y)2
N 1 = Syy = desvo estndar de la variable respuesta (e)
Las respuestas se encuentran en la Tabla 19. La estimativa media de la potencia de la muestra de digital
es 1,27 UI/100 mg. Los lmites de confianza (p = 0,05)
Clculo de la estimativa de potencia y lmites de para la verdadera potencia son 1,12 UI/100 mg y 1,43 UI/
confianza l00 mg.
De la ecuacin 1:
Estndar P Muestra A
Dosis letal Log dosis letal Dosis letal Log dosis letal
mL/kg xp mL/kg xA
27,57 1,4404 34,02 1,5317
25,97 1,4145 21,90 1,3404
27,74 1,4431 28,33 1,4523
8
30,94 1,4905 24,87 1,3957
28,31 1,4519 27,56 1,4403
27,29 1,4360 24,73 1,3932
22,13 1,3450 21,67 1,3359
23,63 1,3735 21,30 1,3284
21,39 1,3302 29,10 1,4639
22,13 1,3450 25,54 1,4072
20,97 1,3216
29,23 1,4658
23,78 1,3762
21,40 1,3304
x 19,5641 14,0890
x 1,3974 1,4089
x2 27,3829 19,8879
s2 0,003331 0,004211
N 14 10
8 TOTAL 47 379,95
*Retirado un grado de libertad por haber sido sustituido un valor perdido.
Las sumas de cuadrados fueron obtenidas emplendose las frmulas de las Tablas 9, 10 y 11.
[5,96 + (-15,6)]2
Cuadrtico = = 0,67 = Q
N = 48 96
Diferencia de = 5,96 +(-15,6) 0,97 = 4,84
2 2
n=8 cuadrticos 48
K = (y)2/N = 7 651,25
8
28 confianza
53,72 + 53,12
Paralelismo = 407,3657 = 0,0129
14 Utilizar frmulas 10 a 15.
[-1,5 + (-1,9)]2
Cuadrtico = = 0,1376 = Q
84 I= log l,00-log 0,50 = 0,301 t =
Diferencia de = -1,52 +(-1,9)2
cuadrticos 0,1376 = 0,0019
42 t = 2,04 con 30 gl de la Tabla 3.
53,7 + 53,1
b= = 12,67
28 x 0,301
398,6
yA = = 13,98
Total = 15 535,96 15 101,261 = 434,7 21
M = M+ log 1650 = 0,003157 + 3,217480 = 3,2206 Ejemplo 4: ensayo con dos dosis, delineamiento cuadra-
do latino.
R = anti log 3,2206 = 1662
Ensayo de oxitocina mtodo de la contraccin del tero
C = 407,3657/[407,3657 0,17 (2,04)2] = 1,0017 aislado de rata
Logaritmo de los lmites de confianza de la potencia Tabla 28 - Ejemplo 4: orden de adicin de las dosis.
Dosis menor
Dosis mayor
P1 = 142
P2 = 166
A1 = 150
A2 = 174 8
Preparacin P = 308 A = 324
Contraste lineal LP = 24 LA = 24
Total 15 256,0
Las sumas de cuadrados fueron obtenidas emplendose las frmulas de las Tablas 8, 10 y 11.
N =16 324
yA = = 40,5
n =4 8
8
El ensayo cumple con las condiciones de validez: Mi= 0,0324 + 1=0,9676
a) regresin significativa, F calculada 14,9 es mayor que
el valor crtico de la Tabla 5 para = 0,01, gl1 = 1 y Lmites de confianza de la potencia
gl2 = 6; Rs= anti log 1,1402 = 13,81 UI/ml
b) desvo de paralelismo no significativo, F calculado 0,0
Ri= anti log 0,9676 = 9,28 UL/ml
es menor que el valor crtico de la Tabla 4 para =
0,05, g11 = 1 y gl2 = 6. Ejemplo 5: Ensayo doble cruzado
Clculo de la estimativa de potencia y lmites de
Ensayo de insulina en ratones
confianza
Utilizar frmulas 10 a 15 Las dosis utilizadas del estndar fueron p1=60m UL/ml y
p2=120 m UL/ml. Fueron preparadas dosis equivalentes de
I = log 0,25 - log 0,20 = 0,0969
las muestras de a1=60m UL/ml y a2=120 m UL/ml.
t = 2,45 com 6 gl da Tabela 3
24 + 24
b= = 61,9
0,0969 x 4 x 2
Los ratones fueron inyectados con 0,1 ml de la solucin respectiva para cada 10 g de peso medio, de acuerdo con a Tabla
6.
Tabla 32 - Ejemplo 5: concentracin de glucosa sangunea (mg/100 ml), cuarenta minutos despus de inyeccin.
Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4
p1 a2 total p2 a1 total a1 p2 total a2 p1 Total
37,1 16,6 53,7 32,4 32,4 80,8 36,8 17,0 53,8 30,9 52,1 83,0
35,2 40,1 75,3 35,2 35,2 103,0 53,2 24,9 78,1 27,8 59,4 87,2
43,1 33,9 77,0 35,3 35,3 108,4 71,2 58,2 129,4 35,4 39,1 74,5
41,3 16,2 57,5 32,9 32,9 78,1 37,1 24,8 61,9 49,8 79,0 128,8
54,2 33,2 87,4 31,9 31,9 65,0 45,9 22,7 68,6 28,2 37,3 65,5
41,4 13,1 54,4 51,2 51,2 113,6 82,2 42,7 124,9 49,9 51,1 101,0
48,6 32,7 81,3 38,2 38,2 114,4 64,8 33,9 98,7 28,3 59,5 87,8
57,8 50,4 108,2 39,7 39,7 89,8 49,1 37,6 86,7 39,6 55,8 95,4
71,1 47,3 118,4 37,0 37,0 110,8 44,1 10,4 54,5 32,2 40,6 72,8
60,8 26,1 86,9 38,9 38,9 103,5 64,7 34,7 99,4 55,1 68,2 123,3
78,2 50,9 129,1 42,6 42,6 97,2 88,0 61,6 149,6 40,6 61,4 102,0
76,1 54,4 130,5 30,4 30,4 80,0 90,1 60,3 150,4 43,5 52,8 96,3
Fase I
Dosis menor P1l = 644,9 A1l = 727,2
Dosis mayor P2l = 445,7 A2l = 461,3
Total Pl = 1090,6 Al =1188,5 Fl = 2279,1
Fase II
Dosis menor P1ll = 656,3 A1ll = 704,9
Dosis mayor P2ll = 428,8 A2ll = 414,9
Total Pll = 1085,1 All =1119,8 Fll = 2204,9
Preparacin Contraste P = 2175,7 A = 2308,3 y = 4484,0
Lineal
Fase I LPl = -199,2 LAl = -256,9 Ll = -465,1
Fase II LPll = -227,5 LAll = -290,0 Lll =-517,5
Total Lp =-426,7
Resultados obtenidos con las frmulas de la Tabla 13
LA = -555,9 L = -982,6
8
Tabla 34 - Ejemplo 5: anlisis de varianza.
Fuente de variacin gl Suma de cuadrados Cuadrado promedio F
Paralelismo 1 173,88 173,88 0,53 > 0,05
Fases Preparaciones 1 41,61 41,61 0,13 > 0,05
Fases Regresses 1 28,60 28,60 0,09 > 0,05
Error I 44 14 545,64 330,58
Blocos 47 14 789,73 314,67
Preparaciones 1 183,15 183,15 3,01 > 0,05
Regresin 1 10 057,32 10 057,32 165,52 < 0,01
Fases 1 57,35 57,35 0,94 > 0,05
Fases Paralelismo 1 0,19 0,19 0,00 > 0,05
Error II 44 2 673,39 60,76
TOTAL 95 27 761,13
Las sumas de cuadrados fueron obtenidas empleando las frmulas de las Tablas 13 y 14.
N = 96 48,09 45,33
M = = 0,0406
n = 24 -68,01
b1 = 48
SA = 27,4 log SA = 1,4377
K = (y)2/N = 4 484,02/96 = 209 440,17
M = - 0,0406 + 1,4377 = 1,3791
y2 = 237 201,30
Total = 237 201,30 209 440,17 = 27 761 Potncia estimada: R = antilog 1,3971 = 24,95 UI/mL
448459,8
Bloques = 209440,17 = 14789,73 10057,32
2
C= = 1,025
2175,72+2308,32 [10057,32 60,76(2,01)2]
Preparaciones = 209440,17 = 183,15
48
2279,12+2204,92 c = 1 da Tabla 15
Fase = 209440,17 = 57,35
48
[(-426,7) + (-555,9)]2
Regresin = = 10057,32 = E
96
(-426,7)2 + (-555,9)2
Paralelismo = = 10057,32 = 17
48 Ms = 0,0064
(-465,1)2 + (-517,5)2 Mi = - 0,0064
Fase x Regresin = = 10057,32 = 28
48
Logaritmo de los lmites de confianza
Ms = 0,0064+1,4377 = 1,4441
Mi. = -0,0896+1,4377 = 1,3481
El ensayo cumple las condiciones de validez: Las dosis utilizadas del estndar, en ml, fueron: = p1 = 0,78;
p2 = 0,76; p3 = 0,74; p4 = 0,72; p5 = 0,70 y p6 = 0,68. Dosis
a) regresin significativa, F calculada 165,52 es mayor equivalentes (a) de la muestra fueron preparadas a partir de
que el valor crtico de la Tabla 5, para = 0,01, g11 = la potencia supuesta SA = 140,6 UI/mg.
1 y g12 = 44;
b) paralelismo no significativo, F calculado 0,53 es menor El ensayo fue desarrollado conforme est descrito en el
que el valor crtico de la Tabla 4, para = 0,05, g11 = mtodo de evaluacin de heparina en ese volumen.
8
1 y gl2 = 44; y
c) ninguna de las tres interacciones fue significativa los Fueron realizados tres ensayos. A ttulo de ejemplo del cl-
tres valores de F calculados: 0,13, 0,09 y 0,00 fueron culo de M, solamente se desarrollar el ensayo No. 1.
menores que el valor crtico de la Tabla 4 para = 0,05,
g11 = 1 y gl2 = 44. Los grados de coagulacin se encuentran en la Tabla 35.
2175,7
yP = = 45,33
2 x 24
Suponiendo que otros dos ensayos realizados con la misma L/2 = 0,0784
muestra dan las estimaciones:
Ms = 2,1731 + 0,0784 = 2,2515
M2 = 2,1995 y M3 = 2,1805, calcular M Mi = 2,1731 0,0784 = 2,0947
Rs = 178,4
M = (2,1392 + 2,1995 + 2,1805)/3 = 2,1731 Ri = 124,4
Tubo Log dosis Promedios Promedios grado log dose Promedios Promedios grado
(mL 10) log dosis coagulacin (mL 10) log dosis coagulacin
xP xiP yiP xA xiA yiA
1 0,8921 - - 0,8921 - -
2 0,8808 0,8807 0,167 0,8808 0,8807 0,333
3 0,8692 0,8491 0,417 0,8692 0,8691 0,667
4 0,8572 0,8572 0,750 0,8573 0,8572 0,917
5 0,8450 0,8450 0,917 0,8451 0,8450 1,000
6 - - - 0,8325 - -
P1 P3 P2 P3 P4 P3 P5 P3
13,87 19,88 16,24 19,54 23,47 19,21 27,41 19,32
12,95 20,60 16,35 19,85 23,04 18,97 27,62 19,61
13,08 20,43 16,88 19,86 23,19 19,39 26,67 19,72
Dimetro de 12,86 19,85 15,34 18,49 23,04 19,68 27,50 19,65
los halos de
inhibicin 13,24 20,07 15,98 19,06 22,65 19,14 27,41 19,27
13,08 20,06 15,50 19,20 23,01 19,65 26,53 20,04
12,88 19,75 16,26 19,96 23,99 19,81 27,30 19,25
13,39 20,30 16,70 19,70 23,85 19,72 27,49 19,53
13,31 20,30 16,70 19,95 23,82 19,55 27,27 19,90
Promedio 13,184 20,138 16,217 19,512 23,340 19,458 27,244 19,588
Promedio de P3 (36 lecturas): 19,674
P1 P2 P3 P4 P5
x1 = 0,82391 x2 = 0,52288 x3 = 0,22185 x4 = 0,079181 x5 = 0,380211
13,406 16,402 19,674 23,686 27,496
12,486 16,512 19,674 23,256 27,706
Dimetro de 12,616 17,042 19,674 23,406 26,756
los halos de 12,396 15,502 19,674 23,256 27,586
inhibicin
12,776 16,142 19,674 22,866 27,496
12,616 15,662 19,674 23,226 26,616
12,416 16,422 19,674 24,206 27,386
12,926 16,862 19,674 24,066 27,576
12,846 16,862 19,674 24,036 27,356
(yi)2 13106,59 21729,12 31352,37 44945,7 60503,21
x = concentracin del antibitico en logaritmo
Tabla 41 - Tabla 41 Ejemplo 7: diferencias en las respuestas comparadas o X = (yA yP) / b1 (frmula 16).
X1 X2 X3 X4
- 0,0099256 0,0694789 0,0099256 - 0,0198511
0,0033085 - 0,0173697 0,0124069 - 0,0256410
0,0363937 - 0,0562448 0,0132341 0,0330852
- 0,0248139 - 0,0115798 0,0198511 - 0,0281224
- 0,0016543 - 0,0049628 - 0,0148883 0,0066170
- 0,0024814 - 0,0157155 0,0099256 0,0016543
0,0239868 0,0066170 0,0479735 - 0,0281224
0,0090984 - 0,0173697 - 0,0099256 0,0645161
0,0107527 0,0016543 0,0000000 - 0,0264682
Tx = 0,044665
Tx2/9 = 0,000222
Tx = 0,04549
Tx2/9 = 0,00023
Tx = 0,088503
Tx2/9 = 0,00087
Tx = 0,02233
Tx2/9 = 0,0000554 8
X2 = 0,024058 (Tx 2/9) = 0,001377
t = 2,042 k = 9 f = 9 n = 32
0,024058 0,001377
SM2 = = 0,00071 (frmula 19)
32
s = 0,02662
Tabla 42 - Ejemplo 7: logaritmo de la razn de potencia y lmites de confianza para las muestras A1, A2, A3 y A4.
A1 A2 A3 A4
Logaritmo de la razn
0,004963 - 0,00505 0,009833 - 0,00248
de potencia (log)
MAS e MAI 0,02308 - 0,01316 0,01307 0,01564 0,01564 0,02795 0,01564 - 0,02060
A1 A2 A3 A4
Desvo estndar (s) 0,269 0,232 0,356 0,229
Promedio 19,62 19,35 19,24 19,26
Coeficiente de variacin (CV) 1,37 1,20 1,85 1,19
Ejemplo 8: Ensayo dicotmico de dos dosis, mtodo de Los ratones fueron inyectadas subcutneamente con 0,25
probit simplificado ml/ratn de la respectiva solucin. Previamente fueron di-
vididos cuatro grupos al azar, que recibieron respectiva-
Ensayo de insulina por el mtodo de convulsin en mente,
ratones
Suma de Cuadrado
Fuente de variacin gl F p
cuadrados promedio
Preparacin 1 0,1056 0,1056 1,71 > 0,05
Regresin 1 0,7482 0,7482 12,15 < 0,01
Paralelismo 1 0,0056 0,0056 0,09 > 0,05
Error Infinito s2 = 0,0616
Las sumas de cuadrados fueron obtenidas emplendose las frmulas de la Tabla 10, tomando n = 1.
t = 1,96 con gl=infinito y p=0,05 de (la Tabla 3) Logaritmo de los lmites de confianza
8 L
t2
gl
0,29097
4,1209
34
0,90082
4,1209
33
0,11555
4,2025
27
Clculo de la potencia media ponderada Como 2 calculado es menor que el valor crtico, no se tie-
ne elementos para sospechar de heterogeneidad.
MW 2058,6174
M = = = 13966
W 1474,0148 Clculo de los lmites de confianza
9 RADIOFRMACOS
Concentracin radioactiva: la concentracin radioactiva Material de Partida: todos los constituyentes que son uti-
de la solucin es la radioactividad del radionclido conte- lizados en la preparacin de radiofrmacos.
nida en el volumen unitario y generalmente referida como
actividad por 1 ml. Como ocurre con todas las especifica- Media vida biolgica: tiempo necesario para que un orga-
ciones envolviendo radionclidos, es necesario declarar la nismo retire, por eliminacin biolgica, mitad de la canti-
fecha y, en el caso de radionclidos con media vida corta, dad de una sustancia administrada.
la hora en la cual la concentracin radioactiva fue deter-
minada. Media vida efectiva: tiempo necesario para que un ra-
dionclido en un organismo disminuya su actividad por
Acarreador: istopo estable del radionclido en cues- la mitad como un resultado combinado de la eliminacin
tin, adicionado a la preparacin radioactiva en la forma biolgica y del decaimiento radioactivo. La media vida
qumica idntica a aquella en la cual el radionclido est efectiva es importante para el clculo de la dosis ptima
presente. del radiofrmaco a ser administrada y en el monitoreo de
la cantidad de exposicin a la radiacin.
8
Decaimiento radiactivo: los ncleos de los elementos
radioactivos radionclidos sufren prdida de partcu- Puede ser calculado a partir de la frmula:
las y/o de energa segn sus caractersticas propias. Esas
T1/2p x T1/2b
caractersticas incluyen la velocidad de decaimiento y el T1/2e =
tipo de emisin. La emisin de partculas por los ncleos T1/2p + T1/2b
determina modificacin de su nmero de masa. Cuando la
partcula emitida es portadora de carga positiva o negativa en que:
el ncleo sufre cambio de nmero atmico y, consecuente-
mente, el nmero de electrones en la electrosfera del tomo T1/2e = tiempo de media vida efectiva del radiofrmaco;
que le corresponde, determinando cambio en las propieda- T1/2p = tiempo de media vida fsica del radionclido;
des qumicas del tomo. La radioactividad decae en razn T1/2b = tiempo de media vida biolgica del radiofrmaco.
exponencial, que es caracterstica para cada radionclido.
La actividad en cualquier tiempo puede ser calculada por Media vida fsica: tiempo necesario que para mitad de una
la expresin poblacin de tomos de un radionclido decaiga para otra
forma nuclear. La media vida est relacionada a la constan-
A = A0e-t te de decaimiento (1) por la ecuacin:
0,693
en que: T1/2 =
A = actividad en el tiempo t;
A0 = actividad inicial;
Neutrino: partcula de difcil deteco, com massa des- radioactividad total de la preparacin radio farmacutica.
prezvel, neutra, porm dotada de energia, emitida simul- Las impurezas radioqumicas relevantes estn listadas, con
tneamente a la emisin de partcula beta. La suma de las sus lmites, en las monografas individuales.
energas de la partcula beta y del neutrino corresponde a
valor cuantificado para cada proceso de desintegracin beta. INTRODUCCIN
Nucledos: especies de tomos caracterizados por la consti- Radiofrmacos son preparaciones farmacuticas con finali-
tucin de su ncleo, en particular por su nmero de protones dad diagnstica o teraputica que, cuando estn listas para
y neutrones y, tambin, por su estado de energa nuclear. el uso , contienen uno o ms radionuclidos.
Precursores o materia prima para sntesis: generalmen- Los radiofrmacos comprenden, tambin, los componen-
te, esos precursores no son producidos en larga escala. tes no-radioactivos para marcacin y los radionuclidos,
Algunos precursores son sintetizados por el laboratorio incluyendo los componentes extrados de los generadores
de produccin de radiofrmacos, otros son suministrados de radionuclidos.
por laboratorios productores especializados. Pruebas para
identidad, para pureza qumica y ensayo deben ser realiza- La produccin de los radiofrmacos deber atender los re-
dos por medio de procedimientos validados. Cuando lotes quisitos de las Buenas Prcticas de Fabricacin (BPF) de
de precursores son aceptados utilizndose los certificados Radiofrmacos, adems de atender a las especificaciones
de anlisis, evidencias adecuadas deben ser establecidas farmacopeicas. Los radiofrmacos tienen su produccin,
para demostrar la confiabilidad del anlisis del proveedor suministro, almacenamiento, uso y volteo reglamentados
y por lo menos una prueba de identidad debe ser realizada. por la legislacin nacional vigente.
Se recomienda probar materiales precursores antes de su
uso en la rutina de produccin del radiofrmaco, para ga- El radiofrmaco contiene el radionuclidos en una de las
rantizar que bajo condiciones de produccin especificadas, siguientes formas:
el precursor posibilita la preparacin del radiofrmaco en
la cantidad y calidad especificada. como un elemento atmico o molecular;
como un ion;
Pureza Radionuclidica: es la razn, expresada en por- incluido o ligado las molculas orgnicas, por proceso
centaje, de la radioactividad del radionclido con relacin de quelacin o por conexin covalente.
a la radioactividad total del radiofrmaco. Las impurezas
radionuclidicas relevantes estn listadas, con sus lmites, Las formas de obtencin de radionuclidos, usados en la
en las monografas individuales. produccin de radiofrmacos son:
9
aos) y por la naturaleza y energa de su radiacin. La ener- cionales sobre manipulacin de sustancias radioactivas.
ga puede ser expresada en electronvoltios (eV), kilo-elec-
tronvoltios (keV) o mega-electronvoltios (MeV). ESTABILIDAD
Pureza qumica: puede ser entendida como la razn expre- Las preparaciones de radiofrmacos tienden a ser menos es-
sada en porcentaje de la masa de la molcula del compues- tables que sus correspondientes inactivos, ocurriendo su des-
to de inters en su estado qumico indicado, con relacin composicin por radilisis y, por eso, deben ser utilizadas en
a la masa total de la preparacin. Las impurezas qumicas corto plazo. Los efectos de la radiacin primaria incluyen la
relevantes estn listadas con sus lmites en las monografas desintegracin del tomo radioactivo y la descomposicin
individuales. de molculas cuando la fraccin de energa de partcula emi-
tida o del rayo gama es adsorbida por esas molculas.
Pureza Radioqumica: puede ser entendida como la razn
expresada en porcentaje de radioactividad del radionclido La estabilidad de los radiofrmacos depende de muchos
de inters en su estado qumico indicado, con relacin a la factores, incluyendo la energa y la naturaleza de la ra-
9
la preparacin. En caso de radiofrmacos inyectables de- El lmite de endotoxinas bacterianas es indicado en las mo-
ben ser utilizados soluciones y materiales estriles, libres nografas de los radiofrmacos. La validacin de la prueba
de partculas y de trazos de materia orgnica. es necesaria para excluir cualquier interferencia debido a
la naturaleza del radiofrmaco. Niveles de radioactividad
La cantidad de material radioactivo presente en la prepara- deben ser estandarizados ya que algunos tipos de radiacin
cin es frecuentemente muy pequea para ser medida por y radionuclidos, especialmente altos niveles de actividad,
los mtodos qumicos o fsicos disponibles. pueden interferir con la prueba. El pH de algunas prepa-
raciones radiofarmacuticas deber ser ajustado a pH 6,5
Considerando la frmula 7,5 para promover resultados ptimos.
1,16 x 1020 Bq g-1 Cuando la naturaleza de la preparacin radiofarmacutica
Smax =
W x T1/2 resulte en una interferencia por inhibicin o potencializa-
cin y no fuese posible eliminar el factor interferente, la
En que: conformidad con la prueba para endotoxinas bacterianas
La emisin de partculas cargadas puede ser acompaa- Cualquiera que sea el equipo usado es esencial que se tra-
da de rayos gama, los cuales, tambin, son emitidos en baje en condiciones geomtricas extremamente bien defi-
el proceso de transicin isomrica. Esa emisin de rayos nidas, de modo que la fuente radioactiva est siempre en
gama puede ser parcialmente sustituida por la expulsin la misma posicin en el aparato y, consecuentemente, su
de electrones, conocidos como electrones de conversin distancia del dispositivo de medicin sea constante y per-
interna. Ese fenmeno, as como el proceso de captura de manezca la misma, mientras la muestra es sustituida por el
electrones, causa emisin secundaria de rayos X, debido a estndar.
la reorganizacin de electrones en el tomo. Esa emisin
secundaria causa, tambin, la expulsin de electrones de Todas las medidas de radioactividad deben ser corregidas
baja energa conocidos como electrones Auger. Rayos X, por la sustraccin de la actividad de la radiacin de fondo,
eventualmente acompaados por los rayos gama, son emi- debido a la radiactividad del medio y a las seales espurias
tidos en el proceso de captura de electrones. Partculas +1 generadas en el propio aparato. En ciertos equipos, en los
son aniquiladas en contacto con otro electrn (-1e) presente cuales el conteo est hecho en altos niveles de actividad, la
en la materia, siendo ese proceso acompaado por la emi- correccin puede ser necesaria en razn de las prdidas por
sin de dos fotones gama, cada uno con energa de 511 coincidencia, debidas al tiempo de resolucin del detector
9
keV, generalmente emitidos a 180 uno del otro y que se y del equipo electrnico asociado.
denomina radiacin de aniquilacin.
Para sistema de conteo con tiempo muerto fijo (), despus
El poder penetrante de cada radiacin vara considerable- de cada conteo la correccin est dada por la ecuacin:
mente de acuerdo con su naturaleza y energa. Partculas
alfa son completamente absorbidas por espesores de sli- N0
N=
dos o lquidos que varan de algunos a decenas de micr- 1 N0
metros; partculas beta son absorbidas completamente en
el espesor de algunos milmetros a varios centmetros. Ra- N = tasa de conteo real por segundo;
yos gama no son completamente absorbidos, sino solamen- N0 = tasa de conteo medida por segundo;
te atenuados, y una reduccin de diez veces puede requerir, t = tiempo muerto en segundos.
por ejemplo, algunos centmetros de plomo. Cuanto ms
denso es el absorbente, menor es el alcance de partculas
alfa y beta y mayor la atenuacin de rayos gama.
En ciertos equipos, la correccin est hecha automticamen- cantidad de radioactividad, consideradas las condiciones
te. Correcciones de la prdida por coincidencia deben ser experimentales, debe ser suficientemente alta para permitir
hechas antes de las correcciones para radiacin de fondo. la deteccin durante varias medias-vidas presumibles, sin
embargo no alta dems, para evitar el fenmeno de prdida
En las determinaciones de radioactividad hay variaciones por coincidencia debida, por ejemplo, al tiempo muerto del
estadsticas porque estn relacionadas a la probabilidad de equipo.
desintegracin nuclear. Un nmero suficiente de conteos
deben ser hechos para compensar variaciones en el nmero La fuente radioactiva es preparada para evitar prdidas du-
de desintegraciones por unidad de tiempo. Por lo menos 10 rante su manipulacin. Muestras lquidas deben estar conte-
000 conteos son necesarios para obtener desvo estndar de nidas en frascos o tubos sellados. Productos slidos deben
no ms de 1%. ser protegidos por capa de hoja adhesiva de acetato de celu-
losa, u otro material cuya masa por unidad de rea sea insig-
La actividad decae en razn exponencial, que es caracte- nificante para evitar la atenuacin de cantidad significativa
rstica de cada radionclido. Su determinacin solamente de la radiacin en estudio. La misma fuente es medida en
es verdadera en el tiempo de referencia especificado. La condiciones geomtricas idnticas y en intervalos que co-
actividad en otros tiempos puede ser calculada a partir de rresponden usualmente a la mitad de la media vida y por el
la ecuacin exponencial o por la tabla de decaimiento o, tiempo correspondiente a aproximadamente tres medias-vi-
adems, puede ser obtenida grficamente de la curva esta- das. El funcionamiento correcto del equipo es verificado por
blecida para cada radionclido. Todas las determinaciones medio del uso de una fuente permanente y las variaciones
de actividad deben ser acompaadas de declaracin de la del conteo son corregidas, si necesario, conforme descrito en
fecha y, si necesario, de la hora en que las medidas fueron Medida de la radioactividad. Se traza una curva lanzndose
hechas. La medida de la actividad de muestra en solucin el tiempo en el eje de las abscisas y en el eje de las ordenadas,
es calculada en relacin a su volumen original y expresada el logaritmo del nmero de conteos por unidad de tiempo, o
por unidad de volumen concentracin radioactiva. la corriente elctrica, conforme el tipo del equipo usado. La
media vida calculada a partir de esa curva debe atender a la
Unidades de Radioactividad especificacin descrita en la respectiva monografa.
9
3,7 x 107 37 MBq 1 (mCi) conteo de la fuente es, entonces, medido. Entre la fuente y
3,7 x 1010 37 GBq 1 Ci el contador son colocados por lo menos seis absorbentes de
aluminio, de masa creciente por unidad de rea, hasta que la
Identificacin de radionuclidos tasa de conteo no sea afectada por la adicin de absorbentes
adicionales. Los absorbentes son insertados de modo tal que
El radionclido es, generalmente, identificado por la me- las condiciones geomtricas sean mantenidas constantes.
dia- vida fsica o por la naturaleza y energa de su radiacin
o radiaciones, o por ambos. Se construye una curva colocando en abscisas la masa por
unidad de rea del absorbente expresada en mg cm-2 y,
Medida del tiempo de media vida en ordenadas, el logaritmo del nmero de conteos por uni-
dad de tiempo para cada uno de los absorbentes utilizados.
La media vida es medida con auxilio de aparatos de de- Curva idntica es elaborada utilizndose el estndar. El co-
teccin tales como cmara de ionizacin, contador Geiger- eficiente de atenuacin de masa es calculado con relacin
Mller, contador de centelleo o detector semiconductor. La a la parte mediana, prcticamente rectilnea, de las curvas.
El coeficiente de atenuacin de la masa, expresado en cm2 el nmero del canal puede ser fcilmente establecida utili-
mg-1, depende de la energa de la emisin beta y de las zndose fuentes de rayos gama de energa conocida. El sis-
propiedades fsicas y qumicas del absorbente. Eso posi- tema de deteccin debe ser calibrado, pues la eficiencia del
bilita la identificacin de emisin beta y el coeficiente es detector es funcin de la energa de la radiacin gamma, de
calculado, a partir de curvas construidas como descrito an- la forma de la fuente y de la distancia de la fuente al de-
teriormente, por la expresin: tector. La eficiencia de la deteccin puede ser medida con
auxilio de fuente calibrada del radionclido en cuestin o,
2,303 para trabajo ms genrico, puede ser construida una curva
m = (logA1 logA2)
m2 m1 de eficiencia contra energa gama a partir de una serie de
fuentes calibradas de varios radionclidos.
en que:
La utilizacin de detector de baja resolucin podr traer
m1 = masa por unidad de rea, del absorbente ms leve; alguna dificultad en identificar las impurezas, pues, los pi-
m2 = masa por unidad de rea, del absorbente ms pesado cos en el espectro pueden no estar bien resueltos. En ese
(medir m1 y m2 dentro de la parte rectilnea de la curva); caso, es recomendable la determinacin de la media vida
A1 = tasa de conteo para masa por unidad de rea ml; por medidas repetidas de la muestra.
A2 = tasa de conteo para masa por unidad de rea m2.
Si, en una fuente, la impureza radioactiva de media vida
El coeficiente de atenuacin as calculado no debe dife- diferente est presente, ella es fcilmente detectable por la
rir en ms de 10% del coeficiente obtenido en condiciones identificacin de picos caractersticos, cuyas amplitudes
idnticas con el estndar del mismo radionclido. decrecen en tasas diferentes de aquellas del radionclido
esperado. La determinacin de la media vida de picos in-
La espectrometra gama es usada para identificar radionu- terferentes por medidas repetidas de la muestra ayudar en
clidos por la energa e intensidad de los rayos X o gama. la identificacin de la impureza. Es posible establecer la
Se basa en la propiedad de que ciertas sustancias (cente- tasa de decaimiento de la radioactividad usando espectro-
lladores) tienen de emitir luz cuando interactan con ra- metra gama desde que los picos disminuyan en amplitud
diacin electromagntica. El nmero de fotones producido en funcin de la media vida.
es proporcional a la energa adsorbida por el centellador.
La luz es transformada en impulsos elctricos de amplitud Informaciones sobre las caractersticas fsicas de los radio-
aproximadamente proporcional a la energa disipada por nuclidos de relevancia en la produccin de radiofrmacos
los fotones gama. son suministradas en la Tabla 2.
9
las cantidades de cada uno de ellos. Posibilita, tambin, purezas radionuclidicas especficas (por ejemplo, molib-
evaluar el grado de impurezas presentes, por la deteccin dnio-99 en tecncio-99m). Esas exigencias son necesarias
de los picos extraos a aquellos esperados. a pesar de que ellas por s solas no sean suficientes para
asegurar que la pureza radionuclidica de la preparacin
El detector preferido para a espectrometra de rayos gama sea adecuada para uso humano. El fabricante debe analizar
es un detector semiconductor de germanio activado con li- sus productos, especialmente las preparaciones de radio-
tio. Los detectores de centelleo de yoduro de sodio activa- nuclidos de media- vida corta, cuanto a la presencia de
dos con talio, a pesar de que presenten resolucin menor, impurezas de media vida larga, despus de perodo conve-
tambin, pueden ser usados. La salida de cada uno de esos niente de decaimiento. De esa manera, pueden ser obteni-
detectores ocurre en la forma de pulsos elctricos, cuya das informaciones sobre la adecuacin de los procesos de
amplitud es proporcional a la energa de los rayos gama fabricacin y de los procedimientos de control.
detectados. Despus de amplificacin, esos pulsos son
analizados en analizador multicanal, que da el espectro de Debido a las diferencias en las medias vidas de los diferen-
energa gama de la fuente. La relacin entre energa gama y tes radionuclidos presentes en la preparacin farmacu-
tica, la pureza radionuclidica cambia con el tiempo. La Las posiciones de las manchas o reas permiten identi-
especificacin de pureza radionuclidica debe ser garan- ficacin qumica por comparacin con soluciones de las
tizada durante todo el plazo de validez. A veces es difcil mismas sustancias qumicas (no radioactivas), visualizadas
realizar esta prueba antes de la liberacin para uso de un por reaccin de color o examen bajo luz ultravioleta. La
lote producido, cuando la media vida del radionclido en la visualizacin por la reaccin de color directo de la muestra
preparacin es corta. La prueba se constituye, en ese caso, radioactiva no siempre es posible o deseable, ya que la re-
un control de calidad de produccin. velacin puede causar difusin de la sustancia radioactiva
para ms all de las manchas o reas identificadas.
PUREZA RADIOQUMICA
Medidas de radioactividad pueden ser hechas por integra-
La determinacin de la pureza radioqumica requiere la se- cin, utilizndose equipo automtico o contador digital.
paracin de las sustancias qumicas diferentes conteniendo Las proporciones de las reas abajo de los picos dan las re-
el radionclido y la estimativa del porcentaje de la radioac- laciones de las concentraciones radioactivas de las sustan-
tividad asociada a la sustancia qumica declarada. cias qumicas. Cuando las cintas son cortadas en porciones,
las razones de las cantidades de radioactividad medidas
En la determinacin de la pureza radioqumica pueden ser dan las proporciones de las concentraciones de especies
usados mtodos analticos de separacin, tales como m- qumicas radioactivas.
todos cromatogrficos (cromatografa en papel, en camada
delgada, de exclusin molecular, cromatografa gaseosa o Como la pureza radioqumica puede cambiar con el tiem-
cromatografa a lquido de alta eficiencia), electroforesis y po, principalmente por causa de la descomposicin por
extraccin por solventes. radiacin, el resultado de la prueba debe indicar que el pro-
ducto presenta valores especificados durante todo el plazo
En la cromatografa, el volumen de la muestra a ser utili- de validez del radiofrmaco.
zado depende de la tcnica adoptada. Es preferible no di-
luir la preparacin en anlisis, pero es importante utilizar ACTIVIDAD ESPECFICA
cantidad de radioactividad tal que prdidas de conteo por
coincidencia no vengan a ocurrir durante la medida de la La actividad especfica es calculada relacionndose la
radioactividad. concentracin radioactiva (radioactividad por unidad de
volumen) con la concentracin de la sustancia qumica en
Considerando las masas muy pequeas del material ra- anlisis, despus de verificacin de que la radioactividad es
dioactivo aplicado a los cromatogramas, el uso de acarrea- debida solamente al radionclido (pureza radionuclidica)
dores es, a veces, necesario y ellos pueden ser aadidos y a la especie qumica (pureza radioqumica) en cuestin.
cuando la monografa as lo prescriba.
La actividad especfica cambia con el tiempo, debiendo
Despus del desarrollo de la cromatografa en papel o en estar expresada teniendo como referencia la fecha y, si
camada delgada, el soporte es seco y las posiciones de las necesario, la hora. La especificacin debe ser garantizada
reas radioactivas son detectadas o por la autorradiografa durante todo el perodo de validez del radiofrmaco.
o por la medida de la radioactividad a lo largo del cromato-
grama, con auxilio de contadores debidamente colimados,
o por el corte de las cintas y conteo de cada porcin.
Transiciones
Media vida Tipo de Energia Probabilidad de
Radionucldeo Energia del Fton (MeV) Fotones Emitidos (%) Internamente
fsica Decaimiento (MeV) transicin (%)
Convertidas (%)
Csio- 137 30,1 a b+ 0,512 94,6 Via 2,6 min 137mBa 85,1 9,5
1,174 5,4 0,662 8 (Ba K Raio-X)
0,032-0,038
Carbono-11 1223,1s b+ 0,960 99,76 0,511 Proveniente de aniquilacin
Carbono-14 5730 a b- 0,158 100 - -
Cromio-51 27,7d c.e. 100 0,320 9,83
Farmacopea Brasilea, 5 edicin
Transiciones
Media vida Tipo de Energia Probabilidad de
Radionucldeo Energia del Fton (MeV) Fotones Emitidos (%) Internamente
fsica Decaimiento (MeV) transicin (%)
Convertidas (%)
Galio-67 78,3h c.e. 100 0,091 3,6 0,3
0,185 23,5 0,4
0,209 2,6 0,02
0,300 16,7 0,06
0,394 4,4 0,01
0,494 0,1
0,704 0,02
0,795 0,06
0,888 0,17
0,008-0,010 43 (Zn Raio-X)
via 9,2 ms 67mZn
0,093 37,6 32,4
0,008-0,010 13 (Zn Raio-X)
Holmio-166 27,3h b-, g 0,191 0,2 0,007 7,6
0,394 1 0,048 2,8
1,773 48 0,049 5,0
1854 51 0,055 2,0
0,080 6,2
1,379 0,9
1,581 0,18
0,12
0,529 1,05
0,539 0,27
0,027-0,032 ~86 (Te K Raio-X)
381
9
9
Tabla 2 (continuacin)
382
Transiciones
Media vida Tipo de Energia Probabilidad de
Radionucldeo Energia del Fton (MeV) Fotones Emitidos (%) Internamente
fsica Decaimiento (MeV) transicin (%)
Convertidas (%)
Iodo-124 4,1d b-, g, K 1,53 0,511 and Proveniente de aniquilacin
2,13 0,605 66
0,644 12
0,730 14
1,320 1,0
1,510 4,2
Farmacopea Brasilea, 5 edicin
1,695 14
2,09 2,0
2,26 1,5
Iodo-125 60,0d c.e. 100 0,035 7 93
0,027-0,032 138 (Te K Raio-X)
Iodo-131 8,06d b- 0,247 1,8 0,080 2,4 3,8
0,304 0,6 0,284 5,9 0,3
0,334 7,2 0,364 81,9 1,7
0,606 89,7 0,637 7,2
0,806 0,7 0,723 1,8
1,3% de 131I decaem via
12d 131mXe
100
(Xennio-131m) t.i. (porcentagem relativa 0,164 2 98
desintegrao do
131m
Xe)
Transiciones
Media vida Tipo de Energia Probabilidad de
Radionucldeo Energia del Fton (MeV) Fotones Emitidos (%) Internamente
fsica Decaimiento (MeV) transicin (%)
Convertidas (%)
Molibdnio-99 66,2h b- 0,454 18,3 0,041 1,2 4,8
0,866 1,4 0,141 5,4 0,7
1,232 80 0,181 6,6 1,0
outros 0,3 0,366 1,4
0,412 0,02
0,529 0,05
0,621 0,02
0,740 13,6
0,778 4,7
0,823 0,13
0,961 0,1
1,13 0,7
1,306 0,01
383
9
9
Tabla 2 (continuacin)
384
Transiciones
Media vida Tipo de Energia Probabilidad de
Radionucldeo Energia del Fton (MeV) Fotones Emitidos (%) Internamente
fsica Decaimiento (MeV) transicin (%)
Convertidas (%)
Rubdio-81 4,7h b+, g, K 0,33 0,253
0,58 0,450
filha 81mKr 1,05 1,10
Samrio-153 47h b-, g 0,26 0,1 0,0058 11,8
0,632 34,1 0,0409 17,2
0,702 44,1 0,0415 31,2
Farmacopea Brasilea, 5 edicin
Transiciones
Media vida Tipo de Energia Probabilidad de
Radionucldeo Energia del Fton (MeV) Fotones Emitidos (%) Internamente
fsica Decaimiento (MeV) transicin (%)
Convertidas (%)
Tlio-201 73,5h c.e. 100 0,031 0,29 10,1
0,032 0,25 9,6
0,135 2,9 8,9
0,166 0,13 0,2
0,167 8,81 16
Alumnio-113 115d c.e. 100 0,255 21 0,1
0,024-0,028 73 (em K Raio-X)
filha 131mIn
Trtio (3H) 12,35a b- 0,0186 100
Tungstnio-188 69,5d b-, 0,3 0,227
0,291
filhas 188m+188Re
Xennio-131m 11,9d t.i. 100 0,164 2 98
0,029-0,035 ~52 (Xe K Raio-X)
Xennio-133 5,25d b- 0,266 0,9 0,080 0,4 0,5
0,346 99,1 0,081 36,6 63,3
0,160 0,05
0,030-0,036 ~46 (Cs K Raio-X)
Xennio-133m 2,26d t.i. 100 0,233 8 92
0,029-0,035 ~59 (Xe K Raio-X)
filha 133Xe
Ytrbio-169 32,0d c.e. 100 0,021 0,21 12,3
0,261 1,74
0,308 11,04 0,7
Ytrio-90 64,5h b- 2,281 100 - -
385
9
Esta traduccin no sustituye la versin en portugus.
Farmacopea Brasilea, 5 edicin 387
10 EQUIVALENCIA FARMACUTICA Y
BIOEQUIVALENCIA DE MEDICAMENTOS
Los mtodos analticos empleados para evaluacin de la La BDA se aplica a medicamentos innovadores que son
calidad de los medicamentos presentan importancia consi- desarrollados como formas farmacuticas para administra-
derable en el estudio de Equivalencia Farmacutica. Deben cin por vas extravasculares. En general, corresponde a un
ser utilizados, preferencialmente, los mtodos analticos ensayo cruzado, realizado en voluntarios sanos, constitui-
descritos en la monografa individual del medicamento pre- do por dos perodos separados por un intervalo de tiempo
sente en la Farmacopea Brasilea, siendo que, en ausencia denominado washout. En el primer perodo, los voluntarios
de esta, se permite la utilizacin de mtodos incluidos en son distribuidos aleatoriamente en dos grupos (A y B). Los
otras farmacopeas autorizadas por la legislacin vigente. voluntarios del grupo A reciben el medicamento a prueba
Cuando no hubiere monografas para el producto en farma- por va extravascular, mientras que a los voluntarios del
copeas oficiales, el estudio debe ser realizado utilizndose grupo B se les administra, si es posible, la misma dosis del
mtodos analticos validados, complementndose con los medicamento por va intravascular. Las recolecciones de
ensayos descritos en mtodos generales de la Farmacopea lquido biolgico son realizadas de acuerdo con los proce-
Brasilea. En el caso en que el mtodo analtico es sumi- dimientos establecidos previamente y, despus del interva-
nistrado por el fabricante del medicamento, los parmetros lo de washout, se inicia el segundo perodo repitindose los
de precisin, exactitud y linealidad deben ser determinados procedimientos con los mismos voluntarios, invirtindose
por el laboratorio autorizado por la Anvisa donde el estudio los grupos. Las concentraciones del frmaco en las mues-
est siendo realizado. tras son cuantificadas emplendose mtodo bioanaltico
validado, lo que permite la construccin de las curvas de
Los pruebas de Equivalencia Farmacutica deben ser rea- concentraciones contra tiempo para la realizacin de los
lizadas, simultneamente, en el medicamento candidato a clculos de los parmetros farmacocinticos relativos a la
genrico, o medicamento similar, y en el respectivo medi- biodisponibilidad.
camento referencia, y se basan en la comparacin de los
resultados obtenidos con ambos. Cuando determinada para una forma farmacutica admi-
nistrada por va oral, por ejemplo, la BDA corresponde a
Es importante resaltar que el medicamento a prueba no la fraccin sistmica calculada con relacin a la dosis ad-
debe ser desarrollado y formulado para ser superior al me- ministrada por va intravascular, cuya biodisponibilidad es,
dicamento de referencia, pero si para presentar las mismas por definicin, igual a 100%. En el caso de que sea posible
caractersticas relacionadas a la liberacin del frmaco y administrar la misma dosis del medicamento por las vas
a la calidad ya establecidas para el medicamento de refe- oral e intravascular y la BDA calculada sea igual a 80%,
rencia. La demostracin de la Equivalencia Farmacutica eso significa que el aprovechamiento de la dosis por va
entre los dos medicamentos es un indicativo de que el can- oral no es completo, habiendo prdida de 20% que puede
didato a genrico, o similar, podr presentar la misma efi- estar relacionada a las caractersticas del frmaco (elimina-
cacia y seguridad del medicamento de referencia. cin pre- sistmica) o de la formulacin.
10
11
Esta traduccin no sustituye la versin en portugus.
Farmacopea Brasilea, 5 edicin 391
La estructura qumica del agua es peculiar, con un momen- La mayora de los compuestos orgnicos puede ser retira-
to dipolo y gran facilidad en formar conexiones de hidr- da por smosis reversa, no obstante, aquellos con bajo peso
geno. Esas propiedades tornan el agua un excelente medio molecular demandan tcnicas adicionales, como la resina de
para solubilizar, absorber, adsorber o suspender diversos cambio inico, carbn activado u oxidacin por ultravioleta
compuestos, inclusive para carrear contaminantes y sus- u ozono, para ser retirados.
tancias indeseables, que van a alterar la pureza y eficacia
de un producto farmacutico. Los lmites establecidos para los parmetros de los conta-
minantes qumicos orgnicos e inorgnicos se destinan a
En vista de sus caractersticas, los procesos de purifica- proteger la salud y evitar que compuestos qumicos crticos
cin; almacenamiento y distribucin deben garantizar que puedan interferir en la fase de pre-tratamiento de los siste-
las especificaciones farmacopeicas sean atendidas, mante- mas de agua, considerando que, posteriormente, pueden ser
nidas y controladas adecuadamente. de difcil eliminacin.
El control de la contaminacin del agua es crucial, una vez El conteo de bacterias es reportado en unidades formadoras
que el agua tiene gran capacidad de agregar compuestos di- de colonias por mililitro (UFC/ml) y, en general, aumen-
versos y, tambin, de contaminarse nuevamente despus de ta con el tiempo de almacenamiento del agua. Los con-
la purificacin. Los contaminantes del agua son represen- taminantes ms frecuentes son bastones gram- negativos,
tados por dos grandes grupos: qumico y microbiolgico. principalmente de los gneros Alcaligenes, Pseudomonas,
Escherichia, Flavobacterium, Klebsiella, Enterobacter,
Contaminantes qumicos Aeromonas y Acinectobacter.
Los contaminantes orgnicos e inorgnicos tienen orgenes
diversos: de la fuente de alimentacin; de la extraccin de El estndar microbiolgico es especificado, en paralelo a
materiales con los cuales el agua entra en contacto; de la los contaminantes qumicos, y consiste en la ausencia de
absorcin de gases de la atmsfera; de residuos contaminan- coliformes totales y termotolerantes (microorganismos pa-
tes, o residuos de productos utilizados en la limpieza y sa- tognicos de origen fecal), adems de enterovirus, quistes
nitizacin de equipos, entre muchos otros. Se incluyen aqu y ooquistes de protozoarios, como Giardia sp y Cryptospo-
las endotoxinas bacterianas, resultantes de microorganismos ridium sp en muestra de 100 ml.
11
Esta traduccin no sustituye la versin en portugus.
392 Farmacopea Brasilea, 5 edicin
Para atender a esos lmites, las estaciones de tratamiento uti- biolgicos y radioactivos, para un determinado estndar de
lizan procesos de desinfeccin con sustancias qumicas con- potabilidad y, por tanto, no posee monografa especfica en
teniendo cloro u otros oxidantes, empleadas hace dcadas, y ese compendio.
consideradas relativamente seguras para los seres humanos.
No obstante, esos oxidantes pueden reaccionar con el mate- El agua potable es empleada, normalmente, en las etapas
rial orgnico de origen natural y generar productos secun- iniciales de procedimientos de limpieza y como fuente de
darios de la desinfeccin, como trihalometanos, cloraminas obtencin de agua de ms alto grado de pureza. Puede ser
o adems dejar residuos de los propios desinfectantes. Esos utilizada, tambin, en la climatizacin trmica de algunos
productos indeseables requieren atencin especial, por parte aparatos y en la sntesis de ingredientes intermediarios.
de los legisladores y usuarios.
El control rigoroso y el mantenimiento de conformidad de
Las cloraminas, en particular, pueden daar irreversible- los parmetros de potabilidad del agua son fundamentales,
mente un equipo de decloracin integrante de un sistema crticos y de responsabilidad del usuario del sistema de pu-
de purificacin, adems de presentar riesgo de formacin y rificacin que ser alimentado. El control debe ser peridico
liberacin de amonaco. para garantizar que el sistema de purificacin utilizado est
apropiado para las condiciones de la fuente de alimentacin
Adems de esos dos grupos fundamentales de contaminan- y que no hubo alteracin en la calidad del agua suministra-
tes, existen los particulados, constituidos por slice, residuos da. Sin embargo, la mayora de las aplicaciones requiere
de la tubera o coloides y que, adems de ser un riesgo a la tratamiento adicional del agua potable, sea por destilacin,
calidad del agua purificada, pueden provocar tapones y per- desionizacin, cambio inico, smosis reversa, aislados
judicar gravemente el proceso de purificacin, por reducir o acoplados, u otro proceso adecuado para producir agua
su desempeo, o hasta tambin causar daos irreversibles a purificada, libre de la interferencia de contaminantes que
los equipos. Pueden ser detectados por filtracin, combinada puedan afectar la calidad de los medicamentos producidos.
con gravimetra o microscopa. Pero en general no es nece- Otra variante del agua potable es el agua reactiva, descrita a
sario identificar el tipo de partcula, apenas removerla. continuacin, con carcter informativo, pues no posee mo-
nografa especfica.
En ese captulo son abordadas algunas consideraciones acerca
de los principales sistemas de purificacin normalmente uti- Agua reactiva
lizados en la produccin del agua para uso farmacutico; sus Es producida por uno o ms procesos, como destilacin sim-
principales aplicaciones; monitoreo y mantenimiento. Abarca, ple, desionizacin, filtracin, decloracin u otro, adecuado
tambin, los parmetros de pureza establecidos para aquellos a las caractersticas especficas de su uso. Generalmente el
tipos de agua que no son cubiertos por la legislacin vigente. agua reactiva es empleada en la limpieza de materiales y de
algunos equipos y en la fase final de la sntesis de ingre-
TIPOS DE AGUA dientes activos y de excipientes. Tambin, tiene aplicacin
en el abastecimiento de equipos, autoclaves, bao- mara y
Bsicamente, hay tres tipos de agua para uso farmacutico: en histologa. Deben ser adoptadas medidas para evitar la
el agua purificada (AP); el agua para inyectables (API) y el proliferacin microbiana en los puntos de circulacin, distri-
agua ultrapurificada (AUP), cuyas monografas se encuen- bucin y almacenamiento. Los principales parmetros que
tran en esta Farmacopea. Compendios oficiales de otros caracterizan el agua reactiva son: conductividad de 1,0 a 5,0
pases o internacionales especifican, adems de estos, otros S/cm (resistividad > 0,2 M -cm) y carbono orgnico total
tipos de agua, como: envasadas en frascos, estriles o bacte- (COT) < 0,20 mg/L.
riostticas, para irrigacin o inhalacin. Sin embargo, todas
poseen caractersticas de pureza semejante a los tipos funda- Agua purificada (AP)
mentales ya mencionados. El agua purificada es producida a partir del agua potable o
del agua reactiva y debe atender a las especificaciones esta-
Adems de eso es importante comentar, tambin, sobre el blecidas en la respectiva monografa. No contiene cualquier
agua potable y el agua reactiva, que son ampliamente uti- otra sustancia adicionada. Es obtenida por una combinacin
lizadas y tienen aplicacin directa en instalaciones farma- de sistemas de purificacin, en una secuencia lgica, tales
cuticas, principalmente en procedimientos generales de como mltiple destilacin; cambio inico; smosis reversa;
limpieza. As, son considerados los cinco tipos de agua a electrodeionizacin; ultra filtracin, u otro proceso capaz de
continuacin, con relacin a sus caractersticas principales y atender, con la eficiencia deseada, a los lmites especificados
las sugerencias de aplicacin. Las monografas especficas, para los diversos contaminantes.
cuando disponibles, detallan los parmetros de pureza esta-
blecidos para cada tipo. Es empleada como excipiente en la produccin de formas
farmacuticas no parenterales y en formulaciones magistra-
Agua potable les, siempre que no haya ninguna recomendacin de pureza
Como directriz fundamental, el punto de partida para cual- superior en su uso o que no necesite ser pirognica. Tam-
quier proceso de purificacin de agua para fines farmacu- bin, puede ser utilizada en el lavado de material, preparado
ticos es el agua potable. Esa es obtenida por tratamiento del de soluciones reactivas, medios de cultivo, tampones, di-
agua retirada de manantiales, por medio de procesos ade- luiciones diversas, microbiologa en general, anlisis clni-
cuados para atender a las especificaciones de la legislacin cos, tcnicas por Elisa o radioinmunoensayo, aplicaciones
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brasilea relativa a los parmetros fsicos, qumicos, micro- diversas en la mayora de los laboratorios, principalmente
en anlisis cualitativos o cuantitativos menos exigentes (de- El agua ultrapurificada se caracteriza por conductividad de
terminaciones en porcentaje). Es utilizada en los ensayos y 0,055 a 0,1 a S/cm a 25,0 oC 0,5 oC (resistividad > 18,0
determinaciones que indiquen el empleo de agua, a no ser M-cm), COT < 0,05 mg/L (algunos casos < 0,03 mg/L),
que haya especificacin al contrario cuanto al nivel de pure- endotoxinas < 0,03 UI de endotoxina/ml y conteo total de
za requerido, como por ejemplo, algunos mtodos analticos bacterias < 1 UFC/100 ml.
instrumentales y anlisis que exijan agua pirognica o de pu-
reza qumica superior. Puede ser empleada en cromatografa Agua para Inyectables (API)
a lquido de alta eficiencia, cuando confirmado que su em- Agua para Inyectables es utilizada como excipiente en la
pleo no afecta la exactitud ni la precisin de los resultados. preparacin de productos farmacuticos parenterales de
pequeo y gran volumen, en la fabricacin de principios
Dependiendo de la aplicacin, puede ser esterilizada, sin ne- activos de uso parenteral, de productos estriles, dems
cesariamente alcanzar el lmite de endotoxinas bacterianas productos que requieran el control de endotoxinas y no son
establecido para el Agua para Inyectables. sometidos a la etapa posterior de eliminacin, as como en
la limpieza y preparacin de procesos, equipos y compo-
Necesita monitoreo de conteo del total de organismos aerbi- nentes que entran en contacto con las formas parentera-
cos viables, en la produccin y almacenamiento, dado que no les en la produccin de frmacos. Esa modalidad engloba,
posee ningn inhibidor de crecimiento adicionado. Mnima- tambin, el agua esterilizada para inyeccin, utilizada en la
mente, est caracterizada por conductividad de 0,1 a 1,3 S/ administracin parenteral y el agua estril para inyeccin,
cm a 25,0 C (resistividad > 1,0 M-cm) y COT < 0,50 mg/L, que es embalada en frasco hermtico y esterilizada por tra-
endotoxinas < 0,25 UI de endotoxina/ml y conteo total de bac- tamiento de calor.
terias < 100 UFC/ml, a no ser que especificado de forma dife-
rente. Todo el sistema de obtencin; almacenamiento y distri- El proceso de purificacin de primera eleccin es la des-
bucin debe ser debidamente validado y monitoreado cuanto tilacin, en equipo cuyas paredes internas sean fabricadas
a los parmetros de conductividad y conteo microbiano. en metal apropiado, como el acero inoxidable AISI 316L,
vidrio neutro o cuarzo Alternativamente, el API, tambin,
Aunque sea especificado un conteo microbiano mximo de puede ser obtenida por proceso equivalente o superior a
100 UFC/ml en la monografa, cada instalacin o instalacin la destilacin para la eliminacin de contaminantes qumi-
productiva deber establecer su lmite de alerta o de accin, cos y microorganismos, siempre que sea validado y moni-
caso las caractersticas especficas de utilizacin sean ms toreado cuanto a los parmetros establecidos. El agua de
restrictivas, y definir lmites apropiados. alimentacin debe ser, como mnimo, potable y, en gene-
ral, necesitar ser pre-tratada para alimentar los equipos.
Agua ultrapurificada (A UP) El proceso es as especificado en razn de la robustez que
El agua ultrapurificada posee baja concentracin inica, tales equipos presentan cuanto a la operacin y al desem-
baja carga microbiana y bajo nivel de COT. Esa modalidad peo.
de agua es requerida en aplicaciones ms exigentes, prin-
cipalmente en laboratorios de ensayos, para diluicin de El sistema de obtencin, distribucin y almacenamiento
sustancias de referencia, en control de calidad y en la lim- del agua debe ser validado y apropiado, para impedir la
pieza final de equipos y utensilios utilizados en procesos contaminacin microbiana y la formacin de endotoxinas
que entren en contacto directo con la muestra que requiera bacterianas. Debe atender los requisitos establecidos en la
agua con ese nivel de pureza. Es ideal para mtodos de monografa especfica. El control ser ms riguroso cuando
anlisis que exigen mnima interferencia y mxima pre- la aplicacin sea para inyectables, que no permiten la ocu-
cisin y exactitud. La utilizacin de agua ultrapurificada rrencia de contaminacin microbiana, ni de endotoxinas. La
en anlisis cuantitativos de bajos contenidos de analito es adicin de uno o ms agentes antimicrobianos al agua pu-
esencial para obtencin de resultados analticos precisos. rificada estril origina a agua bacteriosttica estril, que es
Otros ejemplos de aplicacin del agua ultrapurificada son: empleada como diluyente de algunas preparaciones parente-
anlisis de residuos, entre ellos los trazos de elementos rales, embaladas en dosis individuales.
minerales, endotoxinas, preparaciones de calibradores,
controles, sustancia qumica de referencia, espectrome- Otra variedad de agua es el agua de hemodilisis, que es
tra de absorcin atmica en general, ICP/IOS, ICP/ MS, tratada para obtener la mxima reduccin de contaminantes
espectrometra de masa, procedimientos enzimticos, cro- qumicos y microbiolgicos. Posee reglamento propio, con
matografa a gas, cromatografa a lquido de alta eficiencia especificaciones de calidad y periodicidad especficas para
(determinacin de residuos en ppm o ppb), mtodos en bio- el control, y no es contemplada en esta farmacopea.
loga molecular y con cultivo celular etc. Debe ser utilizada
en el momento en que es producida, o en el mismo da de El agua para inyectables debe atender a los ensayos fsico
la recoleccin. qumicos aconsejados para el agua purificada, adems de
las pruebas de conteo total de bacterias < 10 UFC/ 100 ml,
El laboratorio debe utilizar el mismo tipo de agua requeri- esterilidad, particulados y de endotoxinas bacterianas, cuyo
da para la lectura final del anlisis en la preparacin de las valor mximo es de 0,25 UI de endotoxina/ml.
muestras, en la obtencin de la curva estndar, de controles,
preparado de soluciones, blancos, lavado final del material Algunos parmetros de calidad y sugerencias de aplicacio-
y en todos los elementos de vidrio que estarn en contacto nes son registrados, en la Tabla 1, para cada tipo de agua
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directo con la muestra, siempre que sea apropiado. para uso farmacutico.
SISTEMAS DE PURIFICACIN DE AGUA TECNO- proteger las tecnologas subsiguientes, utilizando filtros de
LOGAS DE PURIFICACINLos proyectos, instala- arena o combinacin de filtros.
ciones y operacin de sistemas para produccin de agua
purificada, agua para inyectables y el agua ultrapurificada Adsorcin por carbn vegetal activado
poseen componentes, controles y procedimientos simi-
lares. La diferencia reside en la presencia del parmetro Esa tecnologa emplea la capacidad de adsorcin del car-
endotoxinas bacterianas en el agua para inyectables y en bn vegetal activado en contacto con compuestos org-
sus mtodos de preparacin, especficamente en la ltima nicos o contaminantes, como las cloraminas. Adems de
etapa. Esas similitudes de parmetros de calidad posibili- eso, remueve agentes oxidantes por reduccin qumica, en
tan establecer una base comn para el proyecto de sistemas especial el cloro libre, que afecta otras tecnologas basadas
destinados a la obtencin de AP, API o AUP, siendo el pun- en membrana, como la smosis reversa o la ultrafiltracin.
to diferencial crtico, el grado de control del sistema y las
etapas finales de purificacin necesarias para retirar bacte- La retirada de agentes desinfectantes propicia el crecimien-
rias, endotoxinas bacterianas y reducir la conductividad. to bacteriano y la formacin de biopelcula, lo que implica
en la necesidad de sanitizacin del propio carbn activado,
Los procesos de obtencin emplean operaciones unitarias con vapor directo o agua caliente, por ejemplo, y del con-
secuenciales las etapas de purificacin que estn centra- trol de partculas y conteo microbiano de su efluente.
das en la eliminacin de determinados contaminantes y en
la proteccin de etapas de purificacin subsiguientes. N- Tratamiento con aditivos qumicos
tese que la operacin unitaria final para obtencin de agua
para inyectables es limitada a la destilacin u otro proceso El uso de aditivos qumicos se refiere aquellos que se desti-
equivalente o superior, en la eliminacin de contaminantes nan a ajustar el pH o a retirar carbonatos y amonaco, para la
qumicos, as como microorganismos y sus componentes. proteccin de otras tecnologas, entre ellas la smosis reversa.
La tecnologa de destilacin es consagrada por su largo his-
trico de confiabilidad y puede ser validada para produccin Como aditivos qumicos pueden ser empleados: el ozono,
de agua para inyectables. Sin embargo, otras tecnologas o comnmente usado en el control de microorganismos y el
combinacin de tecnologas pueden igualmente ser efectivas metabisulfito, aplicado como agente reductor para cloro li-
y validadas para esa finalidad. La ultrafiltracin colocada bre, en sustitucin al carbn vegetal activado.
en una secuencia despus de otras tecnologas de purifica-
cin de contaminantes qumicos puede ser adecuada para Los aditivos qumicos son, necesariamente, retirados en
la produccin de agua para inyectables demostrar la misma alguna etapa posterior de purificacin y no pueden dejar
eficacia y confiabilidad de la destilacin, en la validacin. residuo en el agua final.
Actualmente, con la disponibilidad de nuevos materiales
para tecnologas como smosis reversa y ultrafiltracin, lo Tratamiento con ablandadores
que permite operar y sanitizar en temperatura ms elevada,
para la reduccin microbiana, surgen nuevas y promisoras En los casos en que el agua de alimentacin es dura, se
aplicaciones validables para producir agua para inyectables. torna necesario usar los ablandadores. Esa tecnologa em-
plea resinas regeneradoras de cambio inico, que capturan
El proyecto de instalacin de un sistema de purificacin de los iones calcio y magnesio, y liberan iones sodio en la agua.
agua debe tener en cuenta la calidad del agua de suministro El ablandamiento es utilizado en la proteccin de tecnolo-
y del agua deseada al final, el caudal necesario, la distan- gas sensibles a la incrustacin, como la smosis reversa.
cia entre el sistema de produccin y los puntos de uso, la
disposicin (layout) de la tubera y conexiones, el material Aqu, tambin, existe la preocupacin con la formacin de
empleado, facilidades de asistencia tcnica y mantenimien- biopelcula y es necesario controlar el conteo microbiano,
to y los instrumentos adecuados para el monitoreo. con regeneracin frecuente, recirculacin u otras formas de
reduccin de conteo microbiano.
Las tecnologas de purificacin aqu descritas se destinan a
la eliminacin de contaminantes en las diversas etapas de Desionizacin y electrodeionizacin continua
la secuencia de purificacin. La eleccin y la orden en que
son aplicadas dependern principalmente de la calidad del La desionizacin y la electrodeionizacin continua son tec-
agua potable de entrada, que determinar cuales etapas se- nologas eficaces para la eliminacin de sales inorgnicas di-
rn necesarias efectivamente. Las principales tecnologas sueltas. Los sistemas de desionizacin, tambin, conocidos
son presentadas a continuacin en una orden secuencial l- como desionizacin convencional, producen agua purifica-
gica, sin embargo ni todas son necesariamente obligatorias da de uso rutinario, por medio de resinas de cambio inico
y son utilizadas conforme a la calidad del agua de entrada especficas para cationes o para aniones. Son polmeros or-
y el tipo de agua que se busca obtener. gnicos, generalmente sulfonados, en la forma de pequeas
partculas. Las resinas catinicas capturan los iones liberan-
Pre-filtracin do el ion H+ en la agua y las aninicas liberan OH-. Son re-
generables con cidos y bases, respectivamente. Ese proceso
Tambin, conocida como filtracin de profundidad o filtra- aislado no produce agua de alta pureza, por haber fuga de
cin inicial, se destina a retirar contaminantes particulados pequeos fragmentos de la resina, facilidad de crecimiento
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en la banda de tamao entre 5 y 10 m, esencialmente para microbiano y por haber baja eliminacin de orgnicos.
Los sistemas de electrodeionizacin continua combinan re- Filtracin con carga electrosttica
sinas catinicas y aninicas con membranas semipermea-
bles y la aplicacin de un campo elctrico, promoviendo Ese tipo de filtracin emplea cargas positivas en la super-
as la eliminacin de iones de forma continua, eso es, sin ficie de las membranas y se destina a reducir los niveles
necesidad de parada para regeneracin. de endotoxinas que poseen naturaleza elctrica negativa.
Presentan una capacidad marginal de eliminacin de mi-
En ambos los casos es necesario tener un control sobre la croorganismos, sin embargo su mayor eficiencia es debido
generacin de partculas derivado de las regeneraciones a la eliminacin de endotoxinas. Presenta una limitacin
sucesivas, adems de microorganismos. Eso puede ser rea- importante: cuando las cargas estn totalmente neutraliza-
lizado, controlndose las regeneraciones, en el caso de la das, por saturacin por la captura de las endotoxinas, la
desionizacin, utilizndose recirculacin del agua y apli- eliminacin se paraliza. Por esa razn, filtros con carga
cndose radiacin UV para el control de microorganismos electrosttica son extremamente difciles de validar, dada
en la salida, cuya eficacia precisa ser comprobada. esa imprevisibilidad, cuanto al momento en que efectiva-
mente no ms retiene esos contaminantes.
smosis reversa
Microfiltracin retencin de microorganismos
La smosis reversa es una tecnologa de purificacin ba-
sada en membranas semi permeables y con propiedades Esa tecnologa utiliza membranas microporosas, con una
especiales de eliminacin de iones; microorganismos y especificacin de tamao de poro de 0,2, o 0,22 m. Deben
endotoxinas bacterianas. Remueve 90 a 99% de la mayo- ser validadas cuanto a la retencin, por medio de una prue-
ra de los contaminantes. No obstante, diversos factores, ba bacteriolgica, que determina el valor de la reduccin
como pH; presin diferencial a lo largo de la membrana; logartmica de los microorganismos en las membranas. El
temperatura; tipo del polmero de la membrana y la propia modelo usado actualmente emplea una suspensin de Bre-
construccin de los cartuchos de smosis reversa pueden vundimonas diminuta a 107 UFC/cm2 de rea filtrante, y
afectar significativamente esa separacin. prueba la esterilidad del filtrado. Aunque la membrana sea
especificada como 0,2 o 0,22 m de tamao de poro, no
Las membranas de smosis reversa deben ser debidamente necesariamente ser esterilizante, si no produce un filtrado
controladas cuanto a la formacin de incrustaciones pro- estril por medio de esa prueba, o sea, un valor de reduc-
venientes de sales de calcio, magnesio y otros, y de bio- cin logartmica igual a 7. En el caso que la reduccin lo-
pelcula, fuente crtica de contaminacin microbiana y de gartmica obtenida no sea de siete, la membrana puede ser
endotoxinas. Por eso es imprescindible instalar un sistema utilizada para reducir la flora microbiana, sin embargo no
de pre-tratamiento antes de la smosis reversa, que retire sirve para esterilizar.
partculas y agentes oxidantes, y, en paralelo, debe hacerse,
peridicamente, la sanitizacin del sistema. Esa prctica La microfiltracin es aplicada, igualmente, en la filtracin
ayuda a aumentar la vida til de las membranas y reduce la de gases, o ventilacin de tanques de almacenamiento, para
frecuencia de su regeneracin. evitar contaminacin del agua en ellos contenida. En esos
casos, se utilizan membranas hidrofbicas, para que el fil-
Existen, tambin, los sistemas de smosis reversa de do- tro opere sin acumulacin de agua condensada, a partir de
ble paso, en que el agua purificada por la primera etapa la humedad del propio aire.
alimenta la segundo etapa, incrementando y complemen-
tando la purificacin. Radiacin ultravioleta (UV)
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mantener la calidad del agua conforme lo establecido. potencia y tiempo de uso de la fuente de radiacin.
Destilacin Almacenamiento
En instalaciones industriales puede haber destiladores sim- Las condiciones de almacenamiento deben ser adecuadas
ples, de mltiples efectos y los de compresin de vapor, que a la calidad del agua. El agua ultrapurificada no debe ser
son usados, en general, para sistemas de produccin de gran- almacenada por perodo superior a 24 horas.
des volmenes. El agua de alimentacin para esos equipos
requiere controles diferentes de aquellos usados en smosis La directriz fundamental para el almacenamiento del agua
reversa. En ese caso, la concentracin de silicatos es crtica, purificada, del agua ultrapurificada, o del agua para inyec-
como en cualquier sistema de generacin de vapor. Otro as- tables es tener en cuenta que, cuanto mayor el grado de
pecto importante es la posibilidad de acarreamiento de com- purificacin del agua, ms rpidamente ella tiende a recon-
puestos voltiles en el condensado. Eso es especialmente taminarse.
importante en lo que se refiere a impurezas orgnicas, como
trihalometanos y gases disueltos en la agua, como dixido Siendo as, el agua debe ser mantenida en recirculacin
de carbono y amonaco. As, el control del agua potable de constante, por medio de su sistema de distribucin, siem-
entrada, conforme mencionado sobre el agua de alimenta- pre que sea aplicable. Las primeras porciones de agua pro-
cin para sistemas de purificacin, es fundamental. ducida por un sistema de purificacin que haya quedado
inactivo por ms de cuatro horas deben ser descartadas,
DISTRIBUCIN, SANITIZACIN, proporcionalmente al volumen muerto del recipiente. Esas
ALMACENAMIENTO Y VALIDACIN variables deben ser validadas, para las condiciones espec-
ficas de cada sistema, as como, establecidos los parme-
Distribucin tros a ser evaluados en la validacin.
El diseo del sistema de distribucin debe tener en cuenta El depsito utilizado para su mantenimiento debe ser apro-
la recirculacin constante del agua purificada y el manteni- piado a los fines a que se destina, compuesto por material
miento de la temperatura del agua contenida en el tanque. inerte, limpio y no servir de fuente de contaminacin al
Caso necesario, deber contar con un regulador de calor contenido. El material de construccin debe presentar ca-
para suministrar agua ms fra a los puntos de uso. ractersticas y rugosidad apropiadas para dificultar la ad-
herencia de residuos, la formacin de biopelcula y corro-
Tuberas, vlvulas, instrumentos y otros dispositivos deben sin por los agentes sanitizantes. El acero inoxidable 316L
tener construccin y acabado sanitario, para no contribuir electropulido, con rugosidad menor que 0,5 microRA, es la
para que ocurra la contaminacin microbiana y ser saniti- eleccin ms frecuente para atender a esas exigencias. El
zados. depsito debe estar protegido de fuentes de luz y calor im-
propios y la geometra debe permitir su agotamiento total
No deben ser utilizados filtros de retencin microbiolgica por el fondo, sin volmenes muertos.
en la salida, o en el retorno de los sistemas de distribucin,
pues son repositorios de microorganismos retenidos y, por Procedimientos adecuados deben ser adoptados para evitar
tanto, una fuente crtica para la formacin de endotoxinas. la contaminacin por particulados, orgnicos o microorga-
nismos. Debe poseer un filtro de respiracin / ventila-
Los puntos de uso deben ser proyectados para evitar vol- cin para evitar que haya contaminacin del volumen del
menes muertos y posibilitar que el agua recircule totalmen- tanque por la admisin de aire / humedad, contaminados y
te en ellos cuando estn cerrados. evitar una recontaminacin por esa va.
11
que el sistema funcione sin exceder el lmite de alerta.
a) conocer el estndar de calidad de la fuente de alimen- parada(s) con la(s) de la sustancia en examen. Poseen un
tacin; grado de pureza adecuado al uso al cual se destinan.
b) establecer el estndar de calidad del agua purificada;
c) definir las tecnologas de purificacin y su secuencia, a El PRef es establecido y distribuido por autoridades far-
partir de la calidad del agua de entrada; macopeicas, cuyo valor atribuido a una o ms de sus pro-
d) seleccionar los materiales de construccin de los sis- piedades es aceptado sin necesitar comparacin con otro
temas de produccin, almacenamiento, distribucin y estndar, destinado al uso en ensayos especficos descri-
monitoreo de los puntos de uso; tos en las monografas farmacopeicas. Incluyen sustancias
e) desarrollar los protocolos de calificacin de proyecto, qumicas de referencia, productos biolgicos, extractos y
instalacin, operacin y desempeo; polvos vegetales, radiofrmacos, entre otros. La expresin
f) establecer los parmetros crticos, niveles de alerta y de relacionada ms usada es: Sustancia Qumica de Referen-
accin y la periodicidad de sanitizacin y de monitoreo; cia Farmacopeica. Es establecida y distribuida por autori-
g) establecer un plan de mantenimiento de la validacin, dades respectivo cumpla con los requisitos y procedimien-
que incluir mecanismos para el control de cambios en tos definidos.
los sistemas de agua y proporcionar subsidios para un
programa de mantenimiento preventivo. Los datos obtenidos son comparados con las especificacio-
nes tpicas y los lmites de alerta y de accin. Esos son es-
Los protocolos de calificacin deben estar previamente tablecidos por el usuario, que conoce tanto el histrico del
aprobados antes de su ejecucin. sistema de purificacin y distribucin, como las exigencias
de calidad para una determinada aplicacin, y basado en la
MONITOREO DE LA CALIDAD DEL AGUA validacin.
El proceso empleado en la produccin de agua para uso En la mayora de las aplicaciones, el monitoreo del agua
farmacutico debe ser validado y, sistemticamente, los pa- de uso farmacutico se basa en el control microbiolgico
rmetros establecidos en la legislacin y en las monogra- y en los parmetros que aseguren el mantenimiento de la
fas especficas de cada tipo de agua deben ser verificados. calidad del agua deseada. En general, no es necesario iden-
tificar los microorganismos presentes, pero si, proceder al
El monitoreo de la calidad del agua debe envolver todos conteo total de bacterias, por medio de mtodo adecuado
los puntos crticos y representativos del sistema, de acuer- para cubrir una amplia gama de organismos. Muestras con-
do con el planeamiento establecido, de forma consistente teniendo agentes sanitizantes deben ser neutralizadas antes
y continua. de proceder al anlisis. Los ensayos microbiolgicos deben
ser realizados despus de corto intervalo de tiempo de la
As, deben ser establecidos procedimientos operacionales recoleccin de la muestra, o esa deber ser refrigerada ade-
y de sanitizacin, un programa de monitoreo completo, cuadamente y por tiempo determinado, para preservar las
con mantenimiento preventivo y un sistema de control de caractersticas originales.
cambios, que determine cuidadosamente si el sistema ne-
cesitar ser revalidado despus de cualquier modificacin. El monitoreo fsico-qumico acompaa, principalmente,
la conductividad y el carbono orgnico total, que tambin
Las cuestiones temporales que pueden afectar la calidad pueden ser medidos en lnea. Esos ensayos abarcan una
del agua de la fuente de suministro deben ser consideradas amplia gama de contaminantes inorgnicos. En el caso que
en la elaboracin del plan. La frecuencia de recoleccin de la muestra no sea analizada luego de la recoleccin, debe
las muestras es definida en la validacin del sistema, as ser preservada y almacenada en condiciones que garanti-
como los ensayos necesarios para garantizar el manteni- cen su integridad y conservacin y por perodo adecuado.
miento de la calidad del agua requerida. Cualquier altera- Dependiendo de la aplicacin requerida los parmetros cr-
cin en el plan original debe ser re evaluada. ticos a ser monitoreados pueden variar.
Los equipos y aparatos utilizados en las verificaciones de- El usuario debe definir los lmites de alerta y de accin,
ben ser capaces de suministrar la lectura en la banda re- para evitar la utilizacin del producto con especificacin
querida para la pureza establecida. Los equipos utilizados de calidad inferior a la requerida para una dada aplicacin.
deben estar debidamente calibrados. Las verificaciones El lmite de alerta indica un aviso de desvo de la calidad y
realizadas deben ser registradas en formulario propio, en no necesariamente requiere una medida correctiva. Puede
que conste, por lo menos, el(los) parmetro(s) medido(s), ser establecido con base en un anlisis estadstico del his-
la fecha de la medicin, el valor obtenido, la banda de trico de tendencias, utilizando dos desvos-estndar, por
aceptacin y el responsable de la lectura. El personal que ejemplo, o cerca de 70% del lmite de accin, o a 50%
realiza esa tarea debe conocer el plan de muestreo y los del conteo del nmero de unidades viables, lo que fuese
mtodos utilizados, as como los lmites de alerta y de ac- menor. El lmite de accin indica que el desvo de la cali-
cin establecidos. Caso el usuario externalice ese control, dad excedi los parmetros tolerables y requiere interrup-
debe garantizar que el De acuerdo con definicin de la cin de la actividad para la correccin farmacopeicas, y es
OMS, estndares de referencia farmacopeicos (PRef) son ampliamente reconocida como teniendo grado de pureza
productos de uniformidad reconocida, destinados al uso en apropiado, dentro de un contexto especfico y cuyo valor,
ensayos donde una o ms de sus propiedades ser(n) com- cuando utilizado como referencia analtica, es aceptado sin
11
requerir comparacin con otra sustancia qumica.
a
12
Farmacopea Brasilea, 5 edicin
De acordo com definio da OMS, padres de referncia MR) de la Farmacopea Brasilea, en consonancia con
farmacopeicos (PRef) so produtos de uniformidade re- las directrices de la Comisin de la Farmacopea Brasilea.
conhecida, destinados ao uso em ensaios onde uma ou mais
de suas propriedades ser(o) comparada(s) com a(s) da Las SQR-FB son establecidas y monitoreadas de acuer-
substncia em exame. Possuem um grau de pureza adequa- do con los principios de la OMS, con la colaboracin de
do ao uso ao qual se destinam. laboratorios pblicos y privados, por medio de estudios
interlaboratoriales que utilizan un protocolo analtico pre-
O PRef estabelecido e distribudo por autoridades farma- viamente desarrollado y validado, originando un producto
copeicas, cujo valor atribudo a uma ou mais de suas pro- de elevada calidad, cuyo valor atribuido a una o ms de sus
priedades aceito sem necessitar comparao com outro propiedades fsicas y/o qumicas no necesita comparacin
padro, destinado ao uso em ensaios especficos descritos con otra SQR.
nas monografias farmacopeicas. Incluem substncias qu-
micas de referncia, produtos biolgicos, extratos e ps Mtodos analticos utilizan, frecuentemente, equipos so-
vegetais, radiofrmacos, entre outros. A expresso rela- fisticados para facilitar la precisin y rapidez del proce-
cionada mais usada : Substncia Qumica de Referncia dimiento utilizado, basndose en medidas relativas, que
Farmacopeica. estabelecida e distribuda por autoridades necesitan de estndares de referencia para obtencin de los
farmacopeicas, e amplamente reconhecida como tendo resultados.
grau de pureza apropriado, dentro de um contexto especfi-
co e cujo valor, quando utilizado como referncia analtica, Las SQR-FB son desarrolladas para auxiliar en la ejecu-
aceito sem requerer comparao com outra substncia cin de ensayos descritos en las monografas de la FB. Su
qumica. grado de pureza puede variar de acuerdo con el ensayo al
cual se destina. El valor declarado es especfico para el en-
SUSTANCIA QUMICA DE REFERENCIA DE LA sayo descrito en la FB.
FARMACOPEA BRASILEA (SQR-FB)
Las SQR-FB deben ser almacenadas y manipuladas ade-
Es establecida y distribuida por la Direccin de la Far- cuadamente a fin de obtener resultados confiables cuando
macopea Brasilea, siguiendo los principios de la OMS, utilizadas. Deben ser almacenadas en los frascos origina-
y oficializada por la Anvisa, siendo su uso obligatorio en les, cerrados y en condiciones de temperatura y humedad
todo territorio nacional. En la ausencia de una SQR-FB es de acuerdo con las especificaciones constantes en el rtulo
permitido el uso de SQR establecida por otras farmacopeas y/o certificado de anlisis.
reconocidas, conforme legislacin vigente.
Las cantidades suministradas en cada frasco de SQR-FB
SUSTANCIA QUMICA DE TRABAJO son adecuadas para un determinado nmero de anlisis,
a fin de evitar problemas con la exposicin excesiva del
Es establecida por comparacin con una SQR Farmacopei- material. Sin embargo, las cantidades y su valor destinan
ca, por medio de ensayos farmacopeicos, o debidamente estimular el uso directo de SQR-FB, sin la necesidad del
validados, y registrados por el propio laboratorio que ir establecimiento de estndares derivados.
a utilizarla. En esa situacin, debern ser mantenidos los
registros analticos y realizados controles peridicos, em- Cuando indicada a secado del material antes del uso, ese
plendose una SQR Farmacopeica. procedimiento nunca ser realizado en su embalaje origi-
nal, pero s transfiriendo parte del material para otro reci-
SUSTANCIA QUMICA CARACTERIZADA piente. Despus del uso, el material desecado no debe ser
retornado al frasco original, evitando posibles contamina-
SQR utilizada en la inexistencia de una SQR Farmacopei- ciones.
ca. Esa SQR debe ser caracterizada por medio de ensayos
adecuados y los valores obtenidos deben ser debidamente La validez de determinado lote debe ser acompaada por
documentados. el usuario a travs de la pgina web de la Farmacopea Bra-
silea en internet, que informar el lote vigente, la retirada
ASPECTOS GENERALES DE LAS SUSTANCIAS de lotes en uso y la disponibilidad de nuevos lotes. En esta
QUMICAS DE REFERENCIA DE LA FARMACOPEA pgina web constan, tambin, las informaciones para la
BRASILEA (SQR-FB) adquisicin de los estndares de referencia farmacopeicos.
13 SUSTANCIAS COLORANTES
Referecia
Color Referencia
Color Sustancia CAS Sinnimo Denominacin en ingls Descripcin (IUPAC) Unin Usos, restricciones y requisitos
index 21 CFR
Europea
AMARILLO AMARILLO 2783-94-0 AMARILLO 6 FD&C YELLOW #6 DISODIUM (5E)-6-OXO-5- 15985 741706 E110 Utilizado en alimentos, cosmticos
CREPSCULO INS 110 [(4-SULFONATOPHENYL) y medicamentos en general. No
HYDRAZINYLIDENE] permitida la utilizacin en el rea
NAPHTHALENE-2-SULFONATE de los ojos, en suturas quirrgicas y
formas farmacuticas inyectables.
AMARILLO AMARILLO 15790-07-5 AMARILLO 6 LACA DE FD&C YELLOW #6 ALUMINUM 6-OXIDO-5- 15985:1 741706 E110 Utilizado en alimentos, cosmticos
CREPSCULO, ALUMINIO ALUMINUM LAKE (4-SULFONATOPHENYL) y medicamentos en general. No
Farmacopea Brasilea, 5 edicin
AMARILLO AMARILLO DE 8004-92-0 AMARILLO 10 D&C YELLOW #10; 2-(2-QUINOLYL)-l,3- INDANDIONE 47005 741710 E104 Utilizado en cosmticos y
QUINOLINA QUINOLINE YELLOW DISULFONIC ACID DISODIUM medicamentos en general. No
SALT permitida la utilizacin en el rea
de los ojos, en suturas quirrgicas y
formas farmacuticas inyectables.
AMARILLO AMARILLO DE 68814-04-0 AMARILLO 10 LACA D&C YELLOW #10 ALUMINUM ;2-(2-QUINOLYL 47005:1 741710 E104 Utilizado en cosmticos y
QUINOLINA, DE ALUMINIO ALUMINUM LAKE; )- 1,3-INDANDIONE DISULFONIC medicamentos en general. No
LACA DE QUINOLINE YELLOW ACID DISODIUM SALT permitida la utilizacin en el rea
ALUMINIO ALUMINUM LAKE de los ojos, en suturas quirrgicas y
formas farmacuticas inyectables.
AMARILLO AMARILLO DE 92874-95-8 AMARILLO 11 D&C YELLOW # 11 2-QUINOLIN-2-YLINDENE- 4700 741711 N/C Utilizado en cosmticos y
QUINOLINA 1,3-DIONE medicamentos de aplicacin tpica.
SOLUBLE No permitida la utilizacin en el rea
de los ojos, en suturas quirrgicas y
formas farmacuticas inyectables.
Referecia
Color Referencia
Color Sustancia CAS Sinnimo Denominacin en ingls Descripcin (IUPAC) Unin Usos, restricciones y requisitos
index 21 CFR
Europea
AMARILLO CURCUMINA 458-37-7 AMARILLO TURMERIC (1E,6E)-1,7-BIS(4-HYDROXY-3- 75300 73615 E100 Permitidas para todos los tipos de
CURCUMINA; OLEORESIN METHOXYPHENYL) HEPTA- l,6- productos, incluyendo alimentos
CRCUMA DIENE-3,5-DIONE
AMARILLO XIDO DE 51274-00-1 XIDO DE YELLOW IRON XIDOS DE HIERRO OBTENIDOS 77492 731200 E172 Utilizado en medicamentos de
HIERRO HIERRO OXIDE POR SNTESIS, INCLUSIVE administracin oral (no excediendo
AMARILLO AMARILLO SUS FORMAS HIDRATADAS O dosis diaria de 5 mg de Fe) y uso
COMBINACIONES DE MS DE UN tpico No permitido en el rea de los
DE ESTOS XIDOS ojos, en suturas quirrgicas y formas
farmacuticas inyectables.
AMARILLO RIBOFLAVINA 83-88-5 VITAMINA B2 RIBOFLAVIN 7,8-DIMETHYL-10-[(2S,3S,4R)- N/C 73450 E101 Permitidas para todos los tipos de
LACTOFLAVINA 2,3,4,5-TETRAHYDROXYPENTYL] productos, incluyendo alimentos
BENZO[G]PTERIDINE-2,4-DIONE
AMARILLO TARTRAZINA 1934-21-0 AMARILLO DE FD&C YELLOW #5 TRISODIUM (4E)-5-OXO-l- 19140 741705 E102 Utilizado en alimentos, cosmticos
TARTRAZINA; (4-SULFONATOPHENYL) y medicamentos de uso externo e
AMARILLO 5 -4-[(4-SULFONATOPHENYL) interno. No permitido en el rea de
INS 102 HYDRAZINYLIDENE] PYRAZOLE los ojos, en suturas quirrgicas y
-3-CARBOXYLATE formas farmacuticas inyectables.
AMARILLO TARTRAZINA, 12225-21-7 AMARILLO DE FD&C YELLOW #5 ALUMINUM; 4-[[3-CARBOXY- 19140:1 741705 E102 Utilizado en alimentos, cosmticos
LACA DE TARTRAZINA LACA ALUMINUM LAKE 5-OXO-1 -(4-SULFOPHENYL)- y medicamentos de uso externo e
1-YLIDENE] METHYL]
BENZENESULFONATE
403
13
13
Tabla 1 (continuacin)
404
Referecia
Color Referencia
Color Sustancia CAS Sinnimo Denominacin en ingls Descripcin (IUPAC) Unin Usos, restricciones y requisitos
index 21 CFR
Europea
AZUL AZUL 68921-42-6 AZULN.l LACA DE FD&C BLUE #1 3-[[ETHYL-[4-[[4-[ETHYL-[(3- 42090:2 741101 E133 Utilizado en medicamentos de uso
BRILLANTE, ALUMINIO INS 133 ALUMINUM LAKE SULFOPHEN YL )METHYL] externo e interno cosmticos y
LACA DE AMINO]PHENYL]-(2- alimentos. No permitido en suturas
ALUMINIO SULFOPHENYL) METHYLIDENE] quirrgicas y formas farmacuticas
CYCLOHEXA-2,5-DIEN-l- inyectables.
YLIDENE] AZANIUMYL]
METHYL] BENZENESULFONATE
AZUL AZUL DE 860-22-0 AZULN. 2; FD&C BLUE #2 DISODIUM (2E)-3-OXO-2- (3-OXO- 73015 741102 E132 Utilizado en alimentos, cosmticos y
Farmacopea Brasilea, 5 edicin
AZUL AZUL DE 16521-38-3 AZULN. 2 LACA DE FD&C BLUE #2 ALUMINUM (2E)-3-OXO-2- 73015 741102 E132 Utilizado en alimentos, cosmticos y
INDIGOTINA, ALUMINIO INS 132 ALUMINUM LAKE (3-OXO-5-SULFO-1H-INDOL- medicamentos de administracin por
LACA DE 2-YLIDENE)-1H-INDOLE- va oral
ALUMINIO 5-SULFONIC ACID
AZUL AZUL PATENTE, 3536-49-0 AZUL PATENTE V; ACID BLUE 3 ETHANAMINIUM, N-[4- 42051 1356 E131 Permitido para todos los tipos de
SAL DE CALCIO ACID BLUE 3; [[4-(DIETHYLAMINO) productos.
PHENYL](5-HYDROXY-2,4-
AZUL AZUL PATENTE, 129-17-9 ACID BLUE 1; FOOD ACID BLUE 1 ETHANAMINIUM, N-[4-[[4- 42045 1355 E131 Permitido para todos los tipos de
Referecia
Color Referencia
Color Sustancia CAS Sinnimo Denominacin en ingls Descripcin (IUPAC) Unin Usos, restricciones y requisitos
index 21 CFR
Europea
BLANCO CARBONATO 72608-12-9 CARBONATO DE CALCIUM CALCIUM CARBONATE 72220 731070 N/C Utilizado en medicamentos.
DE CALCIO CALCIO CARONATE Permitido para uso general, no siendo
permitida la utilizacin en el rea
de los ojos, en suturas quirrgicas y
formas farmacuticas inyectables.
BLANCO DIXIDO DE 13463-67-7 DIXIDO DE TITNIO TITANIUM DIOXOTITANIUM 77891 731575 E171 Utilizado en medicamentos.
TITNIO DIOXIDE Permitido para uso general
incluyendo el rea de los ojos, no
siendo permitida la utilizacin
en suturas quirrgicas, formas
farmacuticas inyectables.
NARANJA ANNATTO 8015-67-6 NARANJA N. 4 ANNATTO (2E,4E,6E,8E, 10E, 12E, 14E, 16Z, 75120 731030 E160B Utilizado en medicamentos de uso
18E)- 4,8,13,17-TETRAMETHYLI externo (incluyendo rea de los ojos)
COSA-2,4,6,8,10,12,14,16,18- e interno (excluyendo rea de los
NONAENEDIOIC ACID ojos). No permitida la utilizacin
en suturas quirrgicas y formas
farmacuticas inyectables.
NARANJA BETA CAROTENO 9000-07-1 NARANJA BETACAROTENE 1,3,3-TRIMETH YL-2- [( 48800 731095 E160E Utilizado en medicamentos de uso
ALIMENTO 5 1E,3E,5E,7E,9E, 11E ,13E ,15E externo (incluyendo rea de los ojos)
,17E)- 3,7,12,16-TETRAMETHYL-18- y interno (excluyendo rea de los
(2,6,6-TRIMETHYLCYCLOHEXEN- ojos). No permitida la utilizacin
1-YL) en suturas quirrgicas y formas
OCTADECA-1,3,5,7,9,11,13,15,17- farmacuticas inyectables
NONAENYLJCYCLOHEXENE
NARANJA BETA-APO- 4172-46-7 INS 160E ALL-TRANS-BETA- (2E,4E,6E,8E,10E,12E,14E,16E)- 40820 N/C E160E Utilizado en medicamentos de uso
13
13
Tabla 1 (continuacin)
406
Referecia
Color Referencia
Color Sustancia CAS Sinnimo Denominacin en ingls Descripcin (IUPAC) Unin Usos, restricciones y requisitos
index 21 CFR
Europea
MARRON CARAMELO 8028-89-5 MARRON CARAMEL EN LA E150A Utilizado en medicamentos de uso
NATURAL 10 tpico y de administracin oral. No
permitida la utilizacin en la rea
de los ojos, en suturas quirrgicas y
formas farmacuticas inyectables
NEGRO OXIDO DE 12227-89-3 OXIDO DE BLACK IRON OXIDOS DE HIERRO OBTENIDOS 40800 731095 E160E Utilizado en medicamentos de uso
HIERRO NEGRO HIERRO NEGRO OXIDE POR SNTESIS, INCLUSIVE tpico y de administracin oral (no
Farmacopea Brasilea, 5 edicin
Referecia
Color Referencia
Color Sustancia CAS Sinnimo Denominacin en ingls Descripcin (IUPAC) Unin Usos, restricciones y requisitos
index 21 CFR
Europea
VERDE VERDE 2353-45-9 VERDE ALIMENTO 3 FD&C GREEN # 3 DISODIUM 2-[[4-[ETHYL-[(3- 42053 741203 N/C Utilizado en alimentos y
SOLIDO SULFON ATOPHENYL )METH medicamentos de uso externo
YL] AMINO] PHENYL]-[4-[ETHYL (incluyendo rea de los ojos). No
[(3SULFONATOPHENYL) permitida la utilizacin en suturas
METHYL] AZANIUMYLIDENE] quirrgicas y formas farmacuticas
CYCLOHEXA-2,5-DIEN- 1 inyectables.
-YLIDENE]METHYL]-5-
HYDROXYBENZENESULFONATE
VERDE VERDE SOLUBLE 128-80-3 VERDE D&C GREEN # 6 1,4-BIS(4-METHYLANILINO) 61565 741206 N/C Utilizado en cosmticos y
ANTRAQUINONA ANTHRACENE-9JO-DIONE medicamentos de uso externo
(incluyendo rea de los ojos). No
permitida la utilizacin en suturas
quirrgicas y formas farmacuticas
inyectables.
VERDE VERDE 6358-69-6 VERDE PIRANINA D&C GREEN # 8 TRISODIUM 59040 741208 N/C Utilizado en cosmticos y
SOLVENTE 8-HYDROXYPYRENE- medicamentos de uso externo
1,3,6-TRISULFONATE (incluyendo rea de los ojos). No
permitida la utilizacin en suturas
quirrgicas y formas farmacuticas
inyectables. No ms que 0,01% de
la dosis.
ROJO AMARANTO 915-67-3 BORDEAU S INS 123 AMARANTH; D&C TRISODIUM (4Z)-3-OXO-4-[(4- 16185 N/C E123 Permitido para todos los tipos de
RED 2; ACID RED 27, SULFONATONAPHTHALEN- productos.
TRISODIUM SALT 1-YL) HYDRAZINYLIDENE]
NAPHTHALENE-2,7-
DISULFONATE
13
13
Tabla 1 (continuacin)
408
Referecia
Color Referencia
Color Sustancia CAS Sinnimo Denominacin en ingls Descripcin (IUPAC) Unin Usos, restricciones y requisitos
index 21 CFR
Europea
ROJO AZORRUBINA, 84041-67-8 CARMOISINA LACA CARMOISINE SAL DISDICO DEL CIDO 2-(4 14720 N/C E122 Permitido para todos los tipos de
LACA DE DE ALUMINIO ALUMINUM LAKE -SULFO-1 -NAFTILAZO)- 1 productos.
ALUMINIO -NAFTOL-4-SULFNICO
ROJO ERITROSINA 16423-68-0 ERITROSINA; ROJO FD&C RED #3; DISODIUM 2-(2,4,5,7-TETRAIODO- 450430 741303 E127 Utilizado en alimentos, cosmticos y
N. 3; ERITROSINA ERYTHROSINE 45430 741303 E127 3-OXIDO-6- medicamentos de administracin oral
Farmacopea Brasilea, 5 edicin
ROJO ERITROSINA, 12227-78-0 ERITROSINA LACA DE FD&C RED #3 DIALUMINUM; l,3,6,8- 45430 741303 E127 Utilizado en alimentos, cosmticos y
LACA DE ALUMINIO; ROJO N. 3 ALUMINUM LAKE TETRAIODO-3- OXOSPIRO[2- medicamentos de administracin oral
ALUMINIO LACA DE ALUMINIO; BENZOFURAN- 1,9-XANTHENE]
ERITROSINA SDICA -2,7-DIOLATE; l,3,6
LACA DE ALUMINIO ,8-TETRAIODO-3-OXOSPIRO[2-
INS 127 BENZOFURAN-1,9-XANTHENE]-
2,7-DIOLATE
ROJO OXIDO DE 1309-37-1 XIDO DE HIERRO RED IRON OXIDE XIDOS DE HIERRO OBTENIDOS 77491 73.1200 E172 Utilizado en medicamentos de
HIERRO ROJO ROJO POR SNTESIS, INCLUSIVE administracin oral (no excediendo
SUS FORMAS HIDRATADAS O dosis diaria de 5 mg de Fe) y uso
COMBINACIONES DE MS DE UN tpico. No permitido en el rea de los
DE ESTOS XIDOS ojos, en suturas quirrgicas y formas
farmacuticas inyectables.
ROJO ROJO PIGMENTO 74336-37-1 ROJO 34 D&C RED # 34 CALCIUM (4Z)-3-OXO-4-[(l- 15880 741334 N/C Utilizado en cosmticos y
ROJO ROJO PONCEAU 4548-53-2 ROJO 4 FD&C RED #4 DISODIUM (3E)-3-[(2,4-DIMETHYL- 14700 741304 N/C Utilizado en alimentos, cosmticos
SX 5-SULFONATOPHENYL) y medicamentos de uso externo.
HYDRAZINYLIDENE]-4- No permitido en el rea de los ojos,
OXONAPHTHALENE-1- en suturas quirrgicas y formas
SULFONATE farmacuticas inyectables
Tabla 1 (continuacin)
Referecia
Color Referencia
Color Sustancia CAS Sinnimo Denominacin en ingls Descripcin (IUPAC) Unin Usos, restricciones y requisitos
index 21 CFR
Europea
ROJO ROJO 27 13473-26-2 ROJO PHLOXINE El D&C RED #27 DISODIUM 2,4, 5,7-TETRAB 45410:2 741327 N/C Utilizado en cosmticos y
ROMO-4,5,6,7- TETRACHLOR medicamentos en general. No
0-3-0X0SPIR0[2-BENZ0FURAN-l,9- permitido en el rea de los ojos,
XANTHENE]-3,6-DIOLATE en suturas quirrgicas y formas
farmacuticas
ROJO ROJO 30 2379-74-0 ROJO 30 D&C RED #30; (2Z)-6-CHLORO-2-(6- 73360 741330 N/C Utilizado en cosmticos y
INDANTHREN CHLORO-4-METHYL-3-OXO-1 medicamentos en general. No
BRILLIANT PINK R BENZOTHIOPHEN-2- permitido en el rea de los ojos,
YLIDENE)-4-METHYL-1- en suturas quirrgicas y formas
BENZOTHIOPHEN-3-ONE farmacuticas
ROJO ROJO 33 3567-66-6 ROJO ESPANICO D&C RED #33 DISODIUM (3E)-5-AMINO-4-OXO- 17200 741333 N/C Utilizado en cosmticos y
3-(PHENYLHYDRAZINYLIDENE) medicamentos de administracin oral
NAPHTHALENE-2,7- y tpico. No permitido en el rea
DISULFONATE de los ojos, en suturas quirrgicas y
formas farmacuticas inyectables. No
exceder ms que 0,75 mg de la dosis
diaria de la dosis cuando utilizado en
medicamentos odontolgicos.
ROJO ROJO 40 25956-17-6 FD&C ROJO N. 40; FD&C RED #40 DISODIUM (5E)-5-[(2- METHOXY-5- 16035 741340 E129 Utilizado en alimentos. cosmticos
ROJO ALURAAC INS METHYL-4-SULFONATOPHENYL) y medicamentos en general. No
129 HYDRAZINYLIDENE]-6- permitido en el rea de los ojos,
OXONAPHTHALENE-2- en suturas quirrgicas y formas
SULFONATE farmacuticas
ROJO ROJO 40, LACA DE 68583-95-9 ROJO 40 LACA DE FD&C RED #40 LACA DE ALUMINIO O DE 16035:1 741340 E129 Utilizado en alimentos, cosmticos
13
13
Tabla 1 (continuacin)
410
Referecia
Color Referencia
Color Sustancia CAS Sinnimo Denominacin en ingls Descripcin (IUPAC) Unin Usos, restricciones y requisitos
index 21 CFR
Europea
ROJO ROJO BETERABA, 7659-95-2 ROJO DE BETERABA; BEET POWDER (2S)-4-[2-[(2S)-2-CARBOXY-6- N/C N/C E162 Utilizado en alimentos
BETANINA BETANINA IN S 162 BEETROOT RED HYDROXY-5-[(2S,3R,4S,5S,6R)-
3A5-TRIHYDROXY-6-
(HYDROXYMETHYL)OXAN-2-YL]
OXY-2,3-DIHYDROINDOL-1
-YL] ETHENYL]-2,3-D
IHYDROPYRIDINE-2,6-
DICARBOXYLICACID
Farmacopea Brasilea, 5 edicin
ROJO ROJO DE 1390-65-4 CARMIN DE CARMINE 3,5,6,8-TETRAHYDROXY- 1 75470 731100 E120 Permitido para todos los tipos de
COCHINILLA COCHINILLA; -METH YL-9,10-DIOXO- productos.
CARMIN; NATURAL 7-[3,4,5-TRIHYDROXY-6-
RED 4 INS 120 (HYDROXYMETHYL) OXAN-2-YL]
ANTHRACENE-2-CARBOXYLIC
ACID)
ROJO ROJO EOSINA 62342-51-2 ROJO 21 D&C RED # 21 2,4,5\7-TETRABROMO- 45380:2 741321 N/C Utilizado en cosmticos y
3,6-DIHYDROXYSPIRO[2- medicamentos en general. No
BENZOFURAN-3,9-XANTHENE]- permitido en la rea de los ojos,
l-ONE en suturas quirrgicas y formas
farmacuticas
ROJO ROJO EOSINA 95917-83-2 ROJO 22 D&C RED # 22 DISODIUM 45380 741322 N/C Utilizado en cosmticos y
PURA 2-(2,4,5,7-TETRABROMO-3- medicamentos en general. No
OXIDO-6-OXOXANTHEN- 9-YL) permitido en la rea de los ojos,
BENZOATE en suturas quirrgicas y formas
farmacuticas
Referecia
Color Referencia
Color Sustancia CAS Sinnimo Denominacin en ingls Descripcin (IUPAC) Unin Usos, restricciones y requisitos
index 21 CFR
Europea
ROJO ROJO PONCEAU 15876-47-8 PONCEAU 4R LACA PONCEAU 4R LACA DE ALUMINIO O DE 16255 N/C E124 Permitido para todos los tipos de
4R LACA DE ALUMINIO; ROJO 2 ALUMINUM LAKE CALCIO Y ALUMINIO, EN productos.
ALUMINIO LACA DE ALUMINIO SUSTRATO DE SAL TRISDICO
DEL CIDO 1 -(4 -SULFO-1
-NAFTILAZO)-2- NAFTOL-6,8-
DISSULFNICO
ROJO ROJO RUBI 5858-81-1 ROJO 6 D&C RED # 6 DISODIUM (4E)-4-[(4-METHYL- 15850 741306 N/C Utilizado en cosmticos y
2-SULFONATOPHENYL) medicamentos en general. El total
HYDRAZINYLIDENE] de D&C Red n. 7 no debe ser ms
-3-OXONAPHTHALENE- que 0,01% en 5mg/ dosis diaria de
2-CARBOXYLATE medicamento
ROJO ROJO SCARLET 85-86-9 ROJO 17 D&C RED # 17 (lZ)-l-[(4- 26100 741317 N/C Utilizado en medicamentos de uso
PHENYLDIAZENYLPHENYL) externo. No permitido en el rea de
HYDRAZINYLIDENE] los ojos, en suturas quirrgicas y
NAPHTHALEN-2-ONE formas farmacuticas inyectables.
VIOLETA VIOLETA 81-48-1 VIOLETA 2 D&C VIOLET # 2 1 -HYDROXY-4-(4- 60725 741602 N/C Utilizado en medicamentos de uso
ALIZARINA METHYLANILINO) externo. No permitido en el rea de
ANTHRACENE-9, O-DIONE los ojos, en suturas quirrgicas y
formas farmacuticas inyectables.
13
412 Farmacopea Brasilea, 5 edicin
14
14 REACTIVOS
14
to final de un anlisis volumtrico o para evaluar el pH
de soluciones no coloreadas. Los indicadores de uso ms Solubilidad Poco soluble en agua y prcticamente insolu-
frecuente estn en la Tabla 1, en orden creciente del lmite ble en etanol a 96% (v/v).
inferior de su banda transicin de pH. En seguida, estn
descritos los indicadores y las soluciones indicadoras (SI) Naranja de metilo SI
utilizadas en la Farmacopea. Preparacin Disolver 0,1 g en 100 ml de etanol a 20%
(v/v).
Tabla 2 - Tabla 1 Indicadores de uso ms frecuente
Banda de pH 2,9 4,0
Banda de
Indicador Cambio de color Cambio de color Da coloracin roja en medio modera-
transicin
damente cido y coloracin amarilla en medio levemente
Verde de malaquita 0,0 a 2,0 Amarillo a verde cido y alcalino.
Rojo de cresol 0,2 a 1,8 Rojo a amarillo
Prpura de Ensayo de sensibilidad La mezcla de 0,1 ml de solucin
0,5 a 2,5 Rojo a amarillo indicadora con 100 ml de agua exenta de dixido de carbo-
metacresol
Tropeolina OO 1,0 a 2,8 Rojo a amarillo no presenta color amarillo. Son necesarios no ms que 0,1
Azul de timol 1,2 a 2,8 Rojo a amarillo ml de cido clorhdrico 0,1 M para determinar el cambio
Amarillo naftol 2,0 a 3,2 Incoloro a amarillo de color para rojo.
Amarillo de dimetilo 2,8 a 4,6 Rojo a amarillo
Naranja de metilo, solucin
Amarillo a azul-
Azul de bromofenol 2,8 a 4,6
violeta Preparacin Disolver 20 mg de naranja de metilo y 0,1
Naranja de metilo 2,9 a 4,0 Rojo a amarillo g de verde de bromocresol en 1 ml de hidrxido de sodio
Rojo de metilo 3,0 a 4,4 Rojo a amarillo 0,2 M y completar con agua hasta el volumen de 100 ml.
Rojo congo 3,0 a 5,0 Azul a rojo Banda de pH 3,0 4,0
Verde de
3,6 a 5,2 Amarillo a azul Cambio de color Da coloracin naranja en soluciones
bromocresol
Resazurina 5,0 a 7,0 Rosa a violeta moderadamente cidas y coloracin verde-oliva en solu-
ciones levemente cidas y alcalinas.
Tornasol 5,0 a 8,0 Rojo a azul
Prpura de Amarillo a azul-
5,2 a 6,8 Anaranjado de xilenol
bromocresol violeta
Azul de bromotimol 6,0 a 7,6 Amarillo a azul CAS [3618-43-7]
Rojo de fenol 6,8 a 8,4 Amarillo a rojo Frmula y masa molecular C31,H28,N2,Na4,O13,S 760,59
Rojo de cresol 7,2 a 8,8 Amarillo a rojo
Descripcin Polvo cristalino marrn-rojizo.
Prpura de
7,5 a 9,2 Amarillo a violeta
metacresol Solubilidad Soluble en agua y etanol
Azul de timol 8,0 a 9,6 Amarillo a azul
Incoloro a violeta Anaranjado de xilenol SI
Fenolftalena 8,3 a 10,0
intenso Preparacin Disolver 0,1 g en 100 ml de etanol. Cambio
Azul Nilo A 9,0 a 13,0 Azul a roja de color En medio cido presenta color amarillo- pli-
Timolftalena 9,3 a 10,5 Incoloro a azul do. Reaccionando con ciertos metales (tales como plomo y
Amarillo alizarina Amarillo plido a zinc), forma complejo de color rojo intenso. En presencia
10,0 a 12,0
GG marrn de exceso de edetato disdico adquiere color amarillo.
Tropeolina O 11,0 a 12,7 Amarillo a naranja
Amarillo titn 12,0 a 13,0 Amarillo a rojo Alizarina
CAS [130-22-3]
Frmula y masa molecular C14H7NaO7S.H2O 360,26
Descripcin Polvo amarillo-anaranjado.
Solubilidad Fcilmente soluble en agua y en etanol. Ali-
zarina SI
Preparacin Disolver 0,1 g en 100 ml de agua. Ensayo de sensibilidad Disolver 0,1 ml de amarillo de
metanilo SI en 50 ml de cido actico glacial anhidro.
Amarillo de alizarina GG (CI 14025) Esta solucin debe presentar coloracin rojo-rosada. Aa-
dir 0,05 ml de cido perclrico 0,1 M. La coloracin debe
CAS [584-42-9]
cambiar para violeta.
Frmula y masa molecular C13H8N3NaO5 309,21
Descripcin Polvo amarillo. Amarillo naftol (CI 10315)
Solubilidad Poco soluble en agua fra y soluble en agua CAS [887-79-6]
caliente. Frmula y masa molecular C10H5N2NaO5 256,16
Descripcin Polvo o cristales amarillo-anaranjados.
14
Amarillo de alizarina GG SI
Solubilidad Fcilmente soluble en agua y poco soluble en
Preparacin Disolver 0,1 g en 100 ml de agua.
etanol a 96% (v/v).
Banda de pH 10,0 12,0
Banda de pH 2,0 3,2
Cambio de color Da coloracin amarilla-plida en solu-
Cambio de color Da solucin incolora en medio fuer-
ciones levemente alcalinas y coloracin marrn en solucio-
temente cido y coloracin amarilla en soluciones menos
nes fuertemente alcalinas.
cidas.
Amarillo de dimetilo (CI 11020)
Amarillo titn (CI 19540)
CAS [60-11-7]
CAS [1829-00-1]
Frmula y masa molecular C14H15N3 225,29
Frmula y masa molecular C28H19N5Na2O6S4 695,72
Descripcin Cristales amarillos.
Descripcin Polvo marrn-amarillento.
Solubilidad Insoluble en agua, soluble en etanol, ben-
Solubilidad Fcilmente soluble en agua y en etanol.
ceno, cloroformo, ter etlico y cidos minerales diluidos.
Amarillo titn SI
Amarillo de dimetilo SI
Preparacin Disolver 0,05 g en agua y completar el vo-
Preparacin Disolver 0,2 g en 100 ml de etanol a 90%
lumen para 100 ml.
(v/v).
Banda de pH 12,0 13,0
Banda de pH 2,8 4,6
Cambio de color En soluciones cidas y moderadamente
Cambio de color Da coloracin roja en soluciones mo-
alcalinas da coloracin amarilla. En soluciones fuertemen-
deradamente cidas y coloracin amarilla en soluciones
te alcalinas presenta color rojo.
levemente cidas y alcalinas.
Ensayo de sensibilidad Preparar mezcla de 10 ml de
Ensayo de homogeneidad Preparar solucin a 0,01%
agua, 0,2 ml de solucin estndar de magnesio (10 ppm
(p/v) en cloruro de metileno y aplicar 0,01 ml de esta solu-
de Mg) y 10 ml de hidrxido de sodio M. Aadir 0,1 ml
cin en cromatoplaca de gel de slice G. Usar como eluyen-
de amarillo titn SI. Preparar prueba en blanco de manera
te el cloruro de metileno. El cromatograma debe mostrar
anloga, sin embargo omitiendo el estndar de magnesio.
una nica mancha.
Comparar las dos soluciones: coloracin rosa intensa se
Ensayo de sensibilidad Preparar solucin de 2 g de clo- desarrolla en comparacin a la prueba en blanco.
ruro de amonio en 25 ml de agua exenta de dixido de car-
bono. Esta solucin, adicionada de 0,1 ml de amarillo de Amarillo titn, papel
dimetilo SI, debe presentar color amarilla. La coloracin
Preparacin Impregnar papel de filtro comn con solu-
pasa a roja por la adicin de no ms que 0,1 ml de cido
cin de amarillo titn SI. Secar al aire a temperatura am-
clorhdrico 0,1 M.
biente.
Amarillo de metanilo (CI 13065)
Almidn (Almidn soluble)
CAS [587-98-4]
CAS [9005-84-9]
Frmula y masa molecular C18H14N3NaO3S 375,38
Frmula molecular (C6H10O5)x
Descripcin Polvo amarillo amarronado.
Descripcin Polvo blanco o casi blanco.
Solubilidad Soluble en agua y en etanol.
Almidn SI
Amarillo de metanilo SI
Especificacin Solucin de almidn soluble a 2% (p/v)
Preparacin Disolver 0,1 g en 100 ml de metanol. en agua caliente. La solucin puede presentar pequea
opalescencia.
Cambio de color En titulaciones desarrolladas en medio
no acuoso cambia la coloracin de amarilla (medio bsico) Ensayo de sensibilidad Mezclar 1 ml de almidn SI, 20
para carmn (medio cido). ml de agua, aproximadamente 50 mg de yoduro de potasio
y, finalmente, 0,05 ml de yodo 0,01 M. Hay desarrollo de bono presenta coloracin amarilla. La coloracin cambia
color azul. para azul por la adicin de no ms que 0,1 ml de solucin
de hidrxido de sodio 0,02 M.
Almidn yodado SI
Azul de hidroxinaftol
Preparacin Impregnar papel de filtro con almidn SI,
recin preparado, enriquecido con 0,5 g de yoduro de po- CAS [63451-35-4]
tasio. Frmula y masa molecular C20H11N2Na3O11S3 620,47
Solubilidad Muy poco soluble en agua, poco soluble en Preparacin Disolver 0,5 g en cido actico glacial anhi-
etanol y fcilmente soluble en soluciones de hidrxidos al- dro y completar el volumen para 100 ml.
calinos. Cambio de color Cuando utilizado en titulaciones en me-
dio no acuoso cambia de coloracin azul (medio bsico)
Azul de bromofenol SI para prpura (medio neutro) y para rosa (medio cido).
Preparacin Disolver, calentando suavemente, 0,2 g de
azul de bromofenol en 3 ml de hidrxido de sodio 0,1 M y Azul de timol
10 ml de etanol a 96% (v/v). Dejar enfriar y completar el CAS [76-61-9]
volumen para 100 ml con etanol a 96% (v/v).
Frmula y masa molecular C27H30O5S 466,60
Banda de pH 2,8 4,6
Descripcin Polvo cristalino verde-amarronado o azul-
Cambio de color Da color amarillo en soluciones mode- verdoso.
radamente cidas y color azul-violeta en soluciones leve-
Solubilidad Poco soluble en agua, soluble en etanol a
mente cidas y alcalinas.
96% (v/v) y en soluciones diluidas de hidrxidos alcalinos.
Azul de bromotimol
Azul de timol SI
CAS [76-59-5]
Preparacin Calentar 0,1 g del indicador con 4,3 ml de
Frmula y masa molecular C27H28Br2O5S 624,38 hidrxido de sodio a 0,05% (p/v) y 5 ml de etanol a 90%
Descripcin Polvo marrn o rojo claro. (v/v). Despus de disolucin, completar el volumen a 250
ml con etanol a 20% (v/v).
Solubilidad Prcticamente insoluble en agua, soluble en
etanol y soluciones diluidas de hidrxidos alcalinos. Banda de pH 1,2 2,8 y 8,0 9,6
Cambio de color Presenta coloracin roja en soluciones
Azul de bromotimol SI fuertemente cidas (banda de pH: 1,2 2,8), coloracin
Preparacin Calentar 1 g de azul de bromotimol con 3,2 amarilla en soluciones levemente cidas y alcalinas y co-
ml de hidrxido de sodio 0,05 M y 5 ml de etanol. Despus loracin azul en soluciones ms alcalinas (banda de pH:
de disolucin, completar el volumen a 250 ml con etanol. 8,0 9,6).
Banda de pH 6,0 7,0 Ensayo de sensibilidad La mezcla de 0,1 ml de azul de
timol SI, 100 ml de agua exenta de dixido de carbono y
Cambio de color Da coloracin amarilla en soluciones 0,2 ml de hidrxido de sodio 0,02 M presenta color azul.
levemente cidas y coloracin azul en soluciones levemen- La coloracin cambia para amarilla por la adicin de no
te alcalinas. En medio neutro da coloracin verde. ms que 0,1 ml de cido clorhdrico 0,2 M.
Ensayo de sensibilidad La mezcla de 0,3 ml de azul de
bromotimol SI y 100 ml de agua exenta de dixido de car-
Azul Nilo A (CI 51180) Solubilidad Soluble en agua y en etanol a 96% (v/v).
CAS [3625-57-8]
Cloruro de metilrosanilina SI
Frmula y masa molecular C40H40 N6 O6 S 732,85
Preparacin Disolver 0,5 g en 100 ml de cido actico
Descripcin Polvo cristalino verde con brillo de bronce. glacial anhidro.
Solubilidad Ligeramente soluble en etanol, en cido ac- Cambio de color En titulaciones en medio no acuoso la
tico glacial y en piridina. coloracin cambia de violeta (medio bsico) para azul-
verdosa (medio neutro) y para verde-amarillenta (medio
Azul Nilo A SI cido).
Preparacin Disolver 1 g en cido actico glacial anhi-
14
Ensayo de sensibilidad La mezcla de 0,1 ml de cloruro
dro para 100 ml. de metilrosanilina SI con 50 ml de cido actico glacial
Banda de pH 9,0 13,0 anhidro muestra coloracin prpura azulada. La adicin de
0,1 ml de cido perclrico 0,1 M en cido actico altera la
Cambio de color Otorga coloracin azul a soluciones le- coloracin para verde.
vemente alcalinas y coloracin roja a soluciones levemente
alcalinas. Cloruro frrico
Ensayo de sensibilidad La mezcla de 0,25 ml de Azul CAS [10025-77-1]
Nilo A SI en 50 ml de cido actico glacial anhidro pre-
Sinonimia Cloruro de hierro.
senta color azul. La coloracin pasa a azul-verdosa por la
adicin de no ms que 0,1 ml de cido perclrico 0,1 M en Frmula y masa molecular FeCl3.6H2O 270,30
cido actico glacial.
Descripcin Masa cristalizada amarillo-naranja, frgil.
Ensayo de identificacin La solucin a 0,0005% (p/v) en
Solubilidad Muy soluble en agua y soluble en etanol y
etanol a 50% (v/v) presenta mximo de absorcin (5.2.14)
ter etlico. La sal y sus soluciones, expuestas a la luz, su-
en 640 nm.
fren reduccin parcial.
Chalcona
Cloruro frrico SI (aproximadamente 0,4 M)
CAS [2538-85-4]
Especificacin Contiene 10,5 g en agua para 100 ml.
Frmula y masa molecular C20H13N2NaO5S 416,4
Conservacin En recipientes bien cerrados.
Descripcin Polvo pardo-negro con tonos violceos.
Almacenamiento Proteger de la luz.
Solubilidad Muy soluble en agua y fcilmente soluble en
etanol y acetona. Colorante BVF
Difenilcarbazona SI Ferroina
Preparacin Disolver 0,1 g en 100 ml de etanol. Almace- CAS [14634-91-4]
nar al abrigo de la luz. Frmula y masa molecular C36H24FeN6O4S 692,52
14
aadir 0,15 ml de tetrxido de osmio SR y 0,1 ml de fe-
rrona SI. Despus de la adicin de 0,1 ml de sulfato crico
Eosina Y SI
amoniacal 0,1 M SV, el color pasa de rojo-anaranjado para
Preparacin Disolver 1 g en 100 ml en agua. verde plido.
Cambio de color La adicin de 20 ml de hidrxido de Conservacin En recipientes bien cerrados.
sodio a 40% (p/v) sobre 10 ml de eosina Y SI a 1% (p/v)
forma precipitado rojo. Magneson
CAS [74-39-5]
ster etlico de tetrabromofenolftalena
Frmula y masa molecular C12H9N3O4 259,22
CAS [1176-74-5]
Descripcin Polvo castao-rojizo.
Nombre qumico ster etlico del cido 2-[(3,5-dibromo-
4-hidroxifenil)(3,5-dibromo-4-oxo-2,5-cicloexadien-1-ili-
Magneson SI
deno)metil]-benzoico
Preparacin Disolver 0,2 g en 100 ml en tolueno.
Sinonimia Bromofenolftalena magenta Y
Cambio de color En titulaciones de medio no acuoso
Frmula y masa molecular C22H14Br4O4, 661,96
muda la coloracin naranja (medio cido) para azul (medio
bsico), pasando por la coloracin rosa.
ster etlico de tetrabromofenolftalena SI
Preparacin Disolver 0,1 g de ster etlico de tetrabro- Magneson, reactivo
mofenolftalena en 90 ml de cido actico glacial y com-
Preparacin Solubilizar 0,1 g de magneson en 100 ml de
pletar el volumen para 100 ml con el mismo solvente. Pre-
hidrxido de sodio a 1% (p/v).
parar inmediatamente antes del uso.
1-Naftolbencena
Fenolftalena
CAS [6948-88-5]
CAS [77-09-8]
Sinonimia Fenilbis (4-hidroxinaftil) metanol.
Frmula y masa molecular C20H14O4 318,33
Frmula y masa molecular C27H20O3 392,50
Descripcin Polvo cristalino o amorfo, blanco o leve-
mente amarillento. Inodoro. Descripcin Polvo marrn-rojizo.
Solubilidad Insoluble en agua y soluble en etanol Solubilidad Insoluble en agua; soluble en benceno, en
ter etlico y en cido actico glacial.
Fenolftalena SI
1-Naftolbencena SI
Preparacin Disolver 0,1 g en 100 ml de etanol a 80%
(v/v). Banda de pH 8,3 10,0 Preparacin Disolver 0,2 g de 1-naftolbencena en 100
ml de cido actico glacial.
Cambio de color Da soluciones incoloras en medio cido
y levemente alcalino. Presenta coloracin violeta intensa Cambio de color Cuando utilizado en titulaciones no-
en soluciones alcalinas ms fuertes. Ensayo de sensibili- acuosas, cambia la coloracin azul o verde-azulada (medio
dad La mezcla de 0,1 ml de fenolftalena SI en 1000 ml bsico) para naranja (medio neutro) y para verde-oscura
en de agua exenta de dixido de carbono es incolora. Son (medio cido).
necesarios no ms que 0,2 ml de hidrxido de sodio 0,02 M
Ensayo de sensibilidad Aadir 0,25 ml de solucin de
para el aparecimiento de coloracin rosa.
1-naftolbencena SI a 50 ml de cido actico glacial anhi-
dro. Son necesarios no ms que 0,05 ml de cido perclrico
Fenolftalena, papel
0,1 M en cido actico glacial para efectuar el cambio de la
Preparacin Sumergir tiras de papel de filtro comn en coloracin amarilla-marrn para verde.
fenolftalena SI por algunos minutos y secar al aire a tem-
peratura ambiente. 1-Naftolftalena
CAS [596-01-0]
Descripcin Cristales o polvo cristalino incoloro o ama- Cambio de color Da coloracin roja con los cidos y azul
14
rillo plido; expuesto a la luz y al aire, adquiere coloracin con los lcalis.
rosa.
Tornasol azul, papel
Solubilidad Soluble en agua y etanol.
Preparacin Hervir 10 partes de tornasol, finamente pul-
Resorcinol SI verizado, con 100 partes de etanol a 96% (v/v), bajo reflu-
jo, por una hora. Decantar y descartar el etanol, aadir al
Preparacin Disolver 0,2 g de resorcinol en 100 ml de residuo mezcla de 45 partes de etanol y 15 partes de agua.
benceno. Dejar decantar. Dejar macerando por dos das. Decantar el sobrenadante e
impregnar tiras de papel de filtro comn con el extracto.
Timolftalena Secar a temperatura ambiente.
CAS [125-20-2] Ensayo de sensibilidad Sumergir tira de papel de tornasol
Frmula y masa molecular C28H30O4 430,54 azul, midiendo 10 mm x 60 mm, en 100 ml de mezcla de 10
Descripcin Polvo blanco o amarillo claro. ml de cido clorhdrico 0,02 M y 90 ml de agua. Agitar. El
papel adquiere color rojo al fin de 45 segundos.
Solubilidad Prcticamente insoluble en agua, soluble en
etanol y en soluciones de hidrxidos alcalinos. Tornasol rojo, papel
Cambio de color Es incoloro en medio cido y levemente Ensayo de sensibilidad Sumergir tira de papel de tornasol
alcalino. Da coloracin azul en soluciones alcalinas ms rojo en 100 ml de hidrxido de sodio 0,002 M. Agitar. El
intensas. papel debe quedar azul al final de 45 segundos.
Frmula y masa molecular C18H14N3NaO3S 375,38 Cambio de color En solucin de cido sulfrico presen-
ta color amarillo. Por la diluicin retorna a la coloracin
Descripcin Polvo amarillo o amarillo anaranjado.
verde.
Solubilidad Soluble en agua. Banda de pH 1,0 2,8
Rojo cresol
Cambio de color Da coloracin roja en soluciones fuer-
temente cidas y coloracin amarilla en soluciones menos CAS [1733-12-6]
cidas. Frmula y masa molecular C21H18O5S 382,43
Rojo cresol SI
Solubilidad Poco soluble en agua, soluble en etanol y Preparacin Calentar 50 mg de rojo cresol con 2,65 ml
soluciones diluidas de hidrxidos alcalinos. de hidrxido de sodio 0,05 M y 5 ml de etanol a 90%. Des-
pus de disolucin, aadir etanol a 20% hasta completar
Verde de bromocresol SI 250 ml.
Preparacin Calentar 0,1 g del colorante con 2,9 ml de Banda de pH 0,2 1,8 y 7,2 8,8
hidrxido de sodio 0,05 M y 5 ml de etanol a 90% (v/v).
Cambio de color Da, coloracin roja en soluciones fuer-
Despus de disolucin, aadir etanol a 20% (v/v) hasta el
temente cidas (banda de pH: 0,2 1,8), coloracin ama-
volumen de 250 ml.
rilla en soluciones menos cidas y neutras; en soluciones
Banda de pH 3,6 5,2 moderadamente alcalinas presenta color roja (banda de
pH: 7,2 8,8).
Cambio de color Da coloracin amarilla en soluciones
moderadamente cidas y azul en soluciones levemente ci- Ensayo de sensibilidad La mezcla de 0,1 ml de rojo cre-
das y alcalinas. sol SI y 1000 ml de agua, exenta de dixido de carbono,
adicionada de 0,15 ml de hidrxido de sodio 0,02 M pre-
Ensayo de sensibilidad La mezcla de 0,2 ml de verde
senta coloracin roja prpura. La coloracin cambia para
de bromocresol SI y 100 ml de agua exenta de dixido de
amarilla por la adicin de no ms que 0,15 ml de cido
carbono presenta color azul. Son necesarios no ms que 0,2
clorhdrico 0,02 M.
ml de cido clorhdrico 0,02 M para alterar la coloracin
para amarilla.
Rojo congo (CI 22120)
Verde de malaquita, oxalato CAS [573-58-0]
CAS [2437-29-8] Frmula y masa molecular C32H22N6NA2O6S2 696,67
Frmula y masa molecular C48H50N4O42HC2O4 927,10 Descripcin Polvo rojo amarronado.
Descripcin Slido cristalino verde. Solubilidad Soluble en agua.
Solubilidad Muy soluble en agua.
Rojo congo SI
Verde de malaquita SI Preparacin Disolver 0,25 g de rojo congo en 50 ml de
etanol a 90% (v/v) y agua hasta completar 250 ml.
Preparacin Disolver 1 g de oxalato de verde de mala-
quita en 100 ml de cido actico glacial. Banda de pH 3,0 5,0
Banda de pH 0,0-2,0 Cambio de color Presenta coloracin azul en soluciones
moderadamente cidas y coloracin roja en soluciones le-
Cambio de color Da coloracin amarilla en soluciones
vemente cidas y alcalinas.
cidas y verde en soluciones menos cidas y alcalinas.
Ensayo de sensibilidad La mezcla de 0,2 ml de rojo con-
Verde de metilo (CI 42590) go SI, 100 ml de agua exenta de dixido de carbono y 0,3
CAS [14855-76-6] ml de cido clorhdrico 0,1 M posee coloracin azul. Son
necesarios no ms que 0,3 ml de hidrxido de sodio 0,1 M
Frmula y masa molecular C27H35BrClN3 516,94 para alterar la coloracin para rosa.
Descripcin Polvo verde. Normalmente, se presenta en la
forma de sal con ZnCl2. Rojo congo, papel
Solubilidad Soluble en agua. Preparacin Sumergir tiras de papel de filtro comn en
rojo congo SI y dejar secar a temperatura ambiente.
Verde de metilo SI
Rojo de fenol
Preparacin Disolver 0,1 g en 100 ml de agua.
CAS [143-74-8]
14
completar 250 ml. Banda de pH 6,8-8,4
Cambio de pH Da coloracin amarilla en medio neutro y Descripcin Lquido incoloro, lmpido y voltil.
roja en solucin levemente alcalina. Caractersticas fsicas Densidad (20 C): cerca de 0,824.
Ensayo de sensibilidad La mezcla de 0,1 ml de rojo de ndice de refraccin (20 C): cerca de 1,382. Temperatura
fenol SI y 100 ml de agua exenta de dixido de carbono de ebullicin: cerca de 103 C.
presenta color amarillo. Son necesarios no ms que 0,1 Miscibilidad Miscible en agua y en etanol.
ml de hidrxido de sodio 0,02 M para alterar la coloracin
para violeta-rojiza. Acetaldehdo
Descripcin Cristales violetas o polvo rojo oscuro. Descripcin Lquido incoloro y lmpido.
Solubilidad Prcticamente insoluble en agua y soluble Caractersticas fsicas Densidad (20 C): cerca de 0,788.
en etanol. ndice de refraccin (20 C): cerca de 1,332. Temperatura
de ebullicin: cerca de 21 C.
Rojo de metilo SI
Miscibilidad Miscible en agua y en etanol.
Preparacin Calentar 0,1 g de rojo de metilo con 1,85 ml
de hidrxido de sodio 0,2 M y 5 ml de etanol a 90% (v/v). Seguridad Inflamable!
Despus de disolucin, completar el volumen de 250 ml
Acetanilida
con etanol a 50% (v/v).
CAS [103-84-4]
Banda de pH 3,0 4,4
Nombre qumico N-Fenilacetamida
Cambio de color Da coloracin roja en soluciones le-
vemente cidas y coloracin amarilla en soluciones muy Frmula y masa molecular C8H9NO 135,17
levemente cidas y alcalinas. Descripcin Polvo blanco cristalino, inodoro.
Ensayo de sensibilidad La mezcla de 0,1 ml de rojo de Caracterstica fsica Banda de fusin: 114 C a 116 C.
metilo SI, 100 ml de agua exenta de dixido de carbono y
0,05 ml de cido clorhdrico 0,02 M presenta color rojo. Solubilidad Poco soluble en agua, fcilmente soluble en
Son necesarios no ms que 0,1 ml de hidrxido de sodio cloroformo y etanol, soluble en agua hirviendo, ter etlico
0,02 M para cambiar la coloracin para amarilla. y glicerina.
Conservacin En recipientes cerrados.
Rojo de quinaldina
CAS [117-92-0] Acetato de amonio
Frmula y masa molecular C21H23IN2 430,33 CAS [631-61-8]
Descripcin Polvo azul oscuro. Frmula y masa molecular C2H7NO2 77,08
Solubilidad Ligeramente soluble en agua y fcilmente Especificacin Contiene, como mnimo, 98,0% (p/p).
soluble en etanol. Descripcin Cristales incoloros, muy frgiles, de suave
olor actico.
Rojo de quinaldina SI
Solubilidad Muy soluble en agua y en etanol.
Preparacin Disolver 0,1 g en 100 ml de metanol.
Conservacin En recipientes bien cerrados.
Cambio de color Ocurre cambio de coloracin carmn
para casi incoloro. Utilizado en titulaciones de bases con Almacenamiento Proteger de la humedad.
cido perclrico.
Descripcin Lquido incoloro y inflamable con olor dul- Seguridad Txico. Contaminante.
ce de fruta.
Acetato de clorhexidina
Caractersticas fsicas Densidad (20 C): cerca de 0,88.
CAS [56-95-1]
ndice de refraccin (20 C): cerca de 1,395. Banda de ebu-
llicin: 125 C a 126 C. Frmula y masa molecular C26H38Cl2N10O4 625,58
Miscibilidad Poco soluble en agua. Miscible en etanol y Descripcin Cristales o polvo cristalino blanco a crema
ter etlico. plido; inodoro.
Descripcin Cristales incoloros levemente amarillentos o Descripcin Cristales pequeos o polvo cristalino blanco
polvo cristalino blanco o casi blanco. Inodoro; inicialmen- o color crema, brillante.
te inspido, despus amargo.
Caracterstica fsica Banda de fusin: 149 C a 153 C.
Caractersticas fsicas Temperatura de fusin: aproxima-
Conservacin En recipientes bien cerrados.
damente 240 C. Rotacin ptica: + 209 a + 219 (deter-
minar en solucin a 1,0% (p/v) en dioxano). Almacenamiento Proteger de la luz.
Conservacin En recipientes bien cerrados. Seguridad Txico. Contaminante.
Almacenamiento Proteger de la luz.
Acetato de indofenol SR
Categora Corticosteroide.
14
Sinonimia 2,6-Diclorofenolindofenol sdico en tampn
acetato.
Acetato de cortisona, inyectable
Preparacin Diluir 12 ml de la solucin estndar de
Descripcin Consiste de una suspensin en medio acuo-
2,6-diclorofenol-indofenol sdico en 100 ml de agua. A
so adecuado, con pH entre 5,0 y 7,0.
esta solucin juntar 100 ml de tampn acetato pH 7,0.
Especificacin Contiene, como mnimo, 90,0% (p/p).
Conservacin En recipientes bien cerrados.
Conservacin En ampollas de dosis nica.
Estabilidad Utilizar en como mximo dos semanas.
Acetato de desoxicortona Almacenamiento Mantener bajo refrigeracin.
CAS [56-47-3]
Acetato de magnesio
Sinonimia Acetato de desoxicorticosterona.
CAS [16674-78-5]
Frmula y masa molecular C23H32O4 372,50
Frmula y masa molecular C4H6MgO4.4H2O 214,45
Especificacin Contiene, como mnimo, 96,0% (p/p),
Descripcin Cristales incoloros y delicuescentes.
calculado sobre la sustancia desecada.
Solubilidad Fcilmente soluble en agua y en etanol.
Descripcin Cristales incoloros o polvo cristalino blanco.
Conservacin En recipientes bien cerrados.
Inodoro.
Caractersticas fsicas Banda de fusin: 157 C a 161 C. Acetato de mentilo
Rotacin ptica: +171 a +179 (determinar en solucin a CAS [2623-23-6]
1,0% (p/v) en dioxano). Frmula y masa molecular C12H22O2 198,30
Conservacin En recipientes bien cerrados. Descripcin Lquido incoloro.
Almacenamiento Proteger de la luz. Caractersticas fsicas Densidad (20 C): cerca de 0,92.
Categora Corticosteroide. ndice de refraccin (20 C): cerca de 1,447. Temperatura
de ebullicin: cerca de 228 C.
Acetato de etilo Miscibilidad Poco soluble en agua y miscible en etanol.
CAS [141-78-6]
Acetato de mercurio
Frmula y masa molecular C4H8O2 88,11
CAS [1600-27-7]
Especificacin Contiene, como mnimo, 99,9% (p/v).
Sinonimia Acetato mercrico.
Descripcin Lquido lmpido, incoloro, voltil, de olor
caracterstico. Frmula y masa molecular C4H6HgO4 318,68
Caractersticas fsicas Densidad: aproximadamente Descripcin Cristales o polvo cristalino blanco, o casi
0,90. Temperatura de ebullicin: aproximadamente 77 C. blancos, con suave olor actico.
ndice de refraccin (20 C): 1,371 a 1,373. Caracterstica fsica Banda de fusin: 178 C a 180 C
Conservacin En recipientes bien cerrados. (sobrecalentamiento resulta en descomposicin).
Acetato de potasio
Acetato de uranilo y zinc SR
Preparacin Disolver 10 g de acetato de uranilo en 50 ml
CAS [127-08-2] de agua caliente y 5 ml de cido actico 30% (p/v). Disol-
Frmula y masa molecular C2H3KO2 98,14 ver 30 g de acetato de zinc en 30 ml de agua caliente y 3
ml de cido actico 30% (p/v). Mezclar las preparaciones
Especificacin Contiene, como mnimo, 99,0% (p/p), anteriores. Dejar enfriar. Filtrar.
calculado sobre la sustancia desecada.
Conservacin En recipientes bien cerrados.
Descripcin Cristales incoloros o polvo cristalino blan-
co, inodoro o de olor actico suave. Delicuescente. Almacenamiento Proteger de la luz.
14
Conservacin En recipientes bien cerrados.
CAS [140-10-3]
cido bromhdrico Frmula y masa molecular C9H8O 148,16
CAS [10035-10-6] Descripcin Cristales incoloros.
Frmula y masa molecular HBr 80,91
Caracterstica fsica Temperatura de fusin: 133 C.
Especificacin Contiene 48,0% (p/v).
Solubilidad Muy poco soluble en agua y fcilmente so-
Descripcin Lquido incoloro o levemente amarillo, de luble en etanol.
olor fuerte e irritante. Oscurece lentamente por la exposi-
cin al aire y a la luz. cido ctrico, monohidratado
Conservacin En recipientes bien cerrados. CAS [5949-29-1]
Almacenamiento Proteger del aire y de la luz. Frmula y masa molecular C6H8O7.H2O 210,14
Caractersticas fsicas Temperatura de ebullicin: 100,5 Solubilidad Soluble en agua caliente y en etanol.
C. Densidad: aproximadamente 1,22. ndice de refraccin
(20 C): 1,3714. Solidifica a 70 C. cido glico
14
Frmula y masa molecular C7H6O5H2O 188,14
Seguridad Custico.
Descripcin Agujas largas o polvo cristalino incoloro o
cido fosfomolbdico amarillo claro.
CAS [51429-74-4] Caractersticas fsicas Pierde agua de cristalizacin a
Sinonimia cido molibdofosfrico. temperatura de 120 C y se funde en cerca de 206 C, con
descomposicin.
Frmula molecular Aproximadamente 12MoO3.H3PO4.
xH2O. Solubilidad Soluble en agua, fcilmente soluble en agua
caliente, en etanol y en glicerol.
Descripcin Cristales levemente amarillentos.
Conservacin En recipientes bien cerrados. cido p-hidroxibenzoico
CAS [99-96-7]
cido fenoldisulfnico SR
Frmula y masa molecular C7H6O3 138,13
CAS [96-77-5]
Descripcin Cristales incoloros.
Frmula y masa molecular C6H6O7S2 254,24
Caracterstica fsica Banda de fusin: 213-214 C.
Descripcin Lquido lmpido a marrn claro.
Conservacin En recipientes bien cerrados.
cido fosfomolbdico SR
cido hipofosforoso
Preparacin Disolver 4 g de cido fosfomolbdico en 40
ml de agua bajo calentamiento. Despus de enfriamiento CAS [6303-21-5]
aadir 60 ml de cido sulfrico. Sinonimia cido hipofosforoso diluido.
Frmula y masa molecular H3PO2 66,00
cido fosfrico
Especificacin Contiene, como mnimo, 48% (p/v) de
CAS [7664-38-2]
H3PO2
Sinonimia cido ortofosfrico
Descripcin Lquido incoloro o ligeramente amarillo.
Frmula y masa molecular H3PO4 98,00
Miscibilidad Miscible en agua y etanol.
Especificacin Contiene, como mnimo, 85,0% (p/p).
Descripcin Lquido lmpido, incoloro, inodoro. Higros- cido yodhdrico
copio; consistencia de jarabe. CAS [10034-85-2]
Caracterstica fsica Densidad: aproximadamente 1,7. Frmula y masa molecular HI 127,91
Conservacin En recipientes hermticos. Descripcin Solucin acuosa de cido yodhdrico. Cuan-
do recin preparado, es incoloro, pero con la exposicin al
Seguridad Corrosivo! Evitar contacto con piel, mucosas,
aire y a la luz, presenta color amarillento a marrn.
membranas.
Conservacin En recipientes bien cerrados.
cido fosfrico SR
Almacenamiento Proteger de la luz y del contacto con el
Preparacin Mezclar cantidad correspondiente a 15 g de aire. Mantener en temperaturas menores que 30 C.
cido fosfrico concentrado con agua hasta alcanzar 100
ml. cido lctico
Caracterstica fsica Densidad: aproximadamente 1,15. CAS [50-21-5]
Sinonimia cido 2-hidroxipropanoico
cido fosfotngstico SR
Frmula y masa molecular C3H6O3 90,08
Preparacin Calentar bajo reflujo por 3 horas, la mezcla
de 10 g de tungstato de sodio con 8 ml de cido fosfrico y Especificacin Mezcla del cido 2-hidroxipropanoico y
75 ml de agua. Dejar enfriar y diluir para 100 ml con agua. sus productos de condensacin. El equilibrio entre el cido
lctico y los cidos polilticos es dependiente de la concen-
Almacenamiento Proteger del calor. Solubilidad Poco soluble en agua, fcilmente soluble en
etanol a 96% (v/v), ligeramente soluble en cloruro de me-
Seguridad Irritante. Puede explotar en contacto con me-
tileno.
tales, sus xidos, sustancias reductoras, o en la destilacin.
Conservacin En recipientes bien cerrados.
cido peridico
cido selenioso
CAS [10450-60-9]
Frmula y masa molecular H5IO6 227,94 CAS [7783-00-8]
Frmula y masa molecular H2SeO3 128,97
Descripcin Cristales blancos a incoloros.
Especificacin Contiene, como mnimo, 93% (p/p) de
Caractersticas fsicas Temperatura de fusin: 122 C.
Especificacin Contiene, como mnimo 95,0% (p/p). Descripcin Lquido cido, lmpido, incoloro, de olor
sofocante de dixido de azufre. Al aire se oxida paulatina-
Descripcin Lquido incoloro, custico, de consistencia mente a cido sulfrico.
oleosa, muy higroscpico.
Conservacin En recipientes casi llenos, bien cerrados,
Caracterstica fsica Densidad: 1,834 a 1,839. en local fro.
Conservacin En recipientes bien cerrados.
14
cido tartrico
Seguridad Irritante. Corrosivo!
CAS [87-69-4]
cido sulfrico diluido Sinonimia cido L-(+)-tartrico.
Usar cido sulfrico SR. Frmula y masa molecular C4H6O6 150,09
Especificacin Cumple la siguiente prueba: en 5 ml de Caractersticas fsicas Banda de fusin: 168 C a 170 C.
agua, aadir, cuidadosamente, 45 ml de cido sulfrico, es- Densidad (20 C): 1,756.
perar enfriar para 40 C y aadir 8 mg de difenilbencidina. Solubilidad Muy soluble en agua y fcilmente soluble
La solucin resultante es levemente rosa o un azul plida. en etanol.
Agarosa, gel
absoluto.
CAS [9012-36-6]
Preparacin Mezclar 10 ml de la Solucin A con 40 ml
Especificacin Polisacrido lineal, neutro, componente
de la Solucin B.
del agar.
cido trifluoractico Descripcin Polvo blanco o casi blanco.
CAS [76-05-1] Solubilidad Prcticamente insoluble en agua fra y muy
Sinonimia cido trifluoroactico. poco soluble en agua caliente.
Descripcin Lquido incoloro, voltil, de olor irritante y Agarosa-DEAE para cromatografa de cambio inico
caracterstico.
Especificacin Agarosa reticulada conteniendo agrupa-
Caractersticas fsicas Temperatura de ebullicin: 72,4 mientos dietilaminoetilo. Se presenta en forma de esferas.
C. Densidad: 1,535.
Miscibilidad Miscible en acetona, benceno, etanol, ter Agua de bromo SR
etlico, hexano y tetracloruro de carbono. Preparacin Mezclar 3 ml de bromo con 100 ml de agua
Conservacin En recipientes bien cerrados. hasta saturacin. Agitar antes del uso. Despus de decanta-
cin, usar la solucin sobrenadante lmpida.
Seguridad Corrosivo. Inflamable. Proteger ojos, piel y
mucosas. Conservacin En recipientes hermticos.
Almacenamiento Conservar con exceso de bromo y al
Acrilamida abrigo de la luz.
CAS [79-06-1] Seguridad Txico.
Sinonimia 2-Propenamida.
Agua de cloro SR
Frmula y masa molecular C3H5NO 71,08
Especificacin Solucin saturada de cloro en agua.
Especificacin Calidad apropiada para electroforesis.
Conservacin En recipientes bien cerrados.
Descripcin Polvo cristalino blanco, o casi blanco, o es-
camas incoloras o blancas. Almacenamiento Proteger de la luz y del aire. Mantener
en local fro y oscuro.
Caracterstica fsica Temperatura de fusin: cerca de 84
C.
Agua exenta de dixido de carbono
Solubilidad Muy soluble en agua y en metanol, fcilmen-
Especificacin Agua hervida vigorosamente por 5 minu-
te soluble en etanol.
tos o ms y protegida de la atmsfera, durante enfriamiento
Conservacin En recipientes bien cerrados. y conservacin.
Seguridad Altamente txico e irritante. Causa parlisis Conservacin Proteger del aire (de la absorcin de CO2).
del sistema nervioso central. Puede ser adsorbido por la
piel ntegra. Agua exenta de amonaco
Preparacin Transferir 0,1 ml de cido sulfrico 96%
Acrilamida/bisacrilamida (29:1) a 30% (p/v) SR
(p/p) para 100 ml de agua y destilar empleando equipo con
Preparacin Preparar una solucin conteniendo 290 g de paredes exentas de amonaco.
acrilamida y 10 g de metilenbisacrilamida por 1000 ml de
agua caliente. Filtrar.
Conservacin En recipientes bien cerrados.
14
Conservacin En recipientes bien cerrados.
CAS [9048-46-8]
Seguridad Inflamable.
Sinonimia Albmina srica de origen bovina.
Descripcin Polvo blanco o marrn amarillento claro. Alcohol n-amlico
CAS [67-63-0]
Caractersticas fsicas Densidad relativa (20 C): cerca Almidn exento de yoduro SR
de 0,81. Temperatura de fusin: cerca de -8 C. Temperatu-
Usar almidn exento de yoduro SI.
ra de ebullicin: 102 C.
Miscibilidad Fcilmente miscible en agua. Miscible en Almidn soluble
etanol y en glicerol. Sinonimia Amilodextrina, amilogenio.
Conservacin En recipientes bien cerrados. Descripcin Polvo blanco, fino, inodoro, inspido.
Almacenamiento Proteger de la luz. Conservacin En recipientes bien cerrados.
Seguridad Inflamable. Almacenamiento Proteger de la humedad.
14 Alcohol terc-butlico
CAS [75-65-0]
Almidn SR
Usar almidn SI.
Sinonimia 2-Metil-2-propanol.
Frmula y masa molecular C4H10O 74,12 Almidn
Descripcin Lquido incoloro y lmpido, o masa cristali- Descripcin Extrados de cariopses maduras de Zea mays
na de olor alcanforado. L., Triticum aestivum L. u oryza sativa L. (fam. Grami-
niae). Polvo blanco, fino, inodoro, inspido y que produce
Caractersticas fsicas Densidad (25 C): 0,778 a 0,782. ligera crepitacin cuando es comprimido.
Temperatura de fusin: 25,7 C. Temperatura de ebulli-
cin: 82,5 C a 83,5 C. Conservacin En recipientes bien cerrados.
Miscibilidad Soluble en agua, miscible con etanol y ter Almacenamiento Proteger de la humedad. Informacin
etlico. adicional El etiquetado debe indicar el origen botnico.
Descripcin Metal blanco o casi blanco a azulado, ma- Frmula y masa molecular C11H13N3O 203,24
leable, flexible. Disponible en barra, polvo, tiras o hilos. Descripcin Cristales o polvo cristalino, amarillo-claro.
Anetol Anisaldehdo
CAS [4180-23-8] CAS [123-11-5]
Sinonimia trans-Anetol. Sinonimia Aldehdo ansico y p-metoxibenzaldehdo.
Descripcin Masa cristalina blanca o casi blanca en tem- Frmula y masa molecular C8H8O2 136,14
peratura entre 20 C y 21 C, lquido en temperatura arriba Descripcin Lquido oleoso, incoloro y amarillento, de
de 23 C. olor aromtico.
Caractersticas fsicas Densidad: aproximadamente 1,12. Solubilidad Poco soluble en agua, prcticamente insolu-
Temperatura de ebullicin: aproximadamente 248 C. ble en etanol y en cloruro de metileno.
Miscibilidad Poco soluble en agua, miscible con etanol.
Azida sdica
Conservacin En recipientes bien cerrados.
CAS [26628-22-8]
Almacenamiento Proteger de la luz. Frmula y masa molecular NaN3 65,01
14 cido sulfrico.
Anisaldehdo SR
en etanol.
Azul cido 83
Solubilidad Poco soluble en agua, fcilmente soluble en Conservacin En recipientes bien cerrados, inertes (tipo
cloroformo, etanol y metanol, insoluble en acetona y ter polietileno).
etlico.
Benceno
Blsamo de Canad
CAS [71-43-2]
CAS [8007-47-4] Sinonimia Benzol.
Descripcin Lquido oleoso amarillo o verdoso, extrado
Frmula y masa molecular C6H6 78,11
de la Abies balsames L., Pinaceae. Con olor agradable de
pino. Si es expuesto al aire, se solidifica gradualmente en Descripcin Lquido lmpido, incoloro, refractivo, vol-
masa no cristalina. til, de olor caracterstico.
Caractersticas fsicas Densidad: 0,987 a 0,994. ndice
de refraccin: 1,53.
Caractersticas fsicas Banda de ebullicin: 79 C a 81
C. Densidad: 0,878 a 0,880. ndice de refraccin: 1,5016. 14
Miscibilidad Miscible en agua, benceno, cloroformo y Miscibilidad Prcticamente insoluble en agua y miscible
xileno. en etanol.
Informacin adicional Usado para fijar de lminas para Conservacin En recipientes bien cerrados.
microscopio.
Almacenamiento Proteger del calor.
Barbalona Seguridad Altamente inflamable. Cancergeno. Informa-
cin adicional Siempre que posible usar tolueno.
CAS [1415-73-2]
Sinonimia Alona. Bencenosulfonaminda
Descripcin Agujas amarillas o polvo cristalino amarillo CAS [98-10-2]
a amarillo oscuro. Oscurece con la exposicin al aire y a
Frmula y masa molecular C6H5SO2NH2 157,19
la luz.
Descripcin Cristales blancos o beige plidos.
Solubilidad Ligeramente soluble en agua y en etanol,
soluble en acetona, en amonaco y soluciones hidrxido- Caracterstica fsica Banda de fusin: 150 C a 153 C.
alcalinas.
Bencilo
Barbital CAS [134-81-6]
CAS [57-44-3] Nombre qumico Difeniletanodiona
Frmula y masa molecular C8H12N2O3 184,19 Frmula y masa molecular C14H10O2 210,23
Especificacin Contiene, como mnimo, 99,0% (p/p), Descripcin Polvo cristalino amarillo.
calculado con relacin a la sustancia desecada.
Caracterstica fsica Temperatura de fusin: en torno de
Descripcin Cristales incoloros o polvo cristalino blan- 95 C.
co, inodoro, de sabor levemente amargo.
Solubilidad Prcticamente insoluble en agua y soluble en
Caracterstica fsica Temperatura de fusin: aproxima- etanol, acetato de etilo y tolueno.
damente 190 C.
Solubilidad Poco soluble en agua, soluble en agua hir- Benzoato de bencilo
viendo y en etanol. CAS [120-51-4]
Barbital sdico Descripcin Lquido oleoso, lmpido e incoloro. Por el
enfriamiento, forma cristales incoloros.
CAS [144-02-5]
Caractersticas fsicas Temperatura de congelamiento:
Frmula y masa molecular C8H11N2NaO3 206,18 cerca de 17 C. Temperatura de ebullicin: cerca de 324
Especificacin Contiene, como mnimo, 99,0% (p/p), C.
calculado con relacin a la sustancia desecada. Miscibilidad Prcticamente insoluble en agua y glicerol,
Descripcin Cristales incoloros o polvo cristalizado miscible en etanol, ter etlico y cloroformo.
blanco, inodoro, de sabor amargo y levemente custico.
Benzoato de colesterilo
Solubilidad Fcilmente soluble en agua y poco soluble
en etanol. CAS [604-32-0]
Conservacin En recipientes bien cerrados. Frmula y masa molecular C34H50O2 490,76
Descripcin Slido blanco.
Bario SRA 1 mg/ml
Solubilidad Insoluble en agua.
Especificacin Contiene 1,775 g de cloruro de bario en
agua a 1000 ml
14
cpicos.
CAS [518-67-2]
Caracterstica fsica Banda de fusin: 188 C a 190 C,
Frmula y masa molecular C20H18BrN3 380,28
con descomposicin.
Descripcin Cristal rojo-oscuro.
Solubilidad Soluble en agua, ligeramente soluble en eta-
nol, muy poco soluble en el ter etlico. Solubilidad Poco soluble en agua a 20 C, ligeramente
soluble en agua a 60 C y en etanol.
Conservacin En recipiente cerrado.
Bromuro de dimidio-azul de disulfina SR
Biuret, reactivo
Preparacin Disolver, separadamente, 0,5 g de bromuro
Preparacin Disolver 1,5 g de sulfato cprico pentahi-
de dimidio y 0,25 g de azul de disulfina en 30 ml de una
dratado y 6 g de tartrato de sodio y potasio en 500 ml de
mezcla en caliente de etanol y agua (1:9) (v/v) y agitar.
agua. Aadir 300 ml de solucin de hidrxido de sodio a
Mezclar las dos soluciones y completar a 250 ml con la
10% (p/v) exenta de carbonato, completar 1000 ml con la
misma mezcla de solventes. Mezclar 20 ml de esta solu-
misma solucin y mezclar.
cin con 20 ml de una solucin de cido sulfrico a 14 %
(v/v), diluida previamente con cerca de 250 ml de agua y
Boldina
completar a 500 ml con agua.
CAS [476-70-0]
Conservacin En recipientes cerrados.
Frmula y masa molecular C19H21NO4 327,37
Almacenamiento Proteger de la exposicin a la luz.
Descripcin Polvo cristalino blanco, o casi blanco.
Caracterstica fsica Temperatura de fusin: cerca de 163 Bromuro de hexadimetrina
C. CAS [28728-55-4]
Solubilidad Muy poco soluble en agua, soluble en etanol Frmula molecular (C13H30Br2N2)n
y en soluciones cidas diluidas.
Descripcin Polvo blanco, o casi blanco. Higroscpico.
Conservacin En recipientes cerrados. Polmero amorfo.
Solubilidad Soluble en agua.
Borneol
Conservacin En recipientes cerrados.
CAS [507-70-0]
Frmula y masa molecular C10H18O 154,25 Bromuro de yodo
Descripcin Cristales incoloros, subliman rpidamente. CAS [7789-33-5]
Caracterstica fsica Temperatura de fusin: cerca de 208 Frmula y masa molecular IBr 206,81
C.
Descripcin Cristales marrones oscuros o azules oscuros.
Solubilidad Prcticamente insoluble en agua, fcilmente
Caractersticas fsicas Temperatura de ebullicin: cerca
soluble en etanol y en ter de petrleo
de 116 C. Temperatura de fusin: cerca de 40 C.
Bromuro de potasio Solubilidad Fcilmente soluble en agua, en etanol y en
cido actico glacial.
CAS [7758-01-2]
Frmula y masa molecular KBrO3 167,00 Conservacin En recipientes cerrados.
Descripcin Cristales incoloros o polvo cristalino blan- Almacenamiento Proteger del calor.
Descripcin Lquido incoloro, de olor amoniacal. Partculas gruesas Aadir 5 g de la muestra en una pro-
beta con tapn (de 160 mm de largo y 35 mm de dimetro
Caracterstica fsica Temperatura de ebullicin: en torno
interno) y junte 60 ml de solucin de pirofosfato de sodio a
de 78 C.
1% (p/v). Agitar vigorosamente y dejar en reposo durante
Miscibilidad Miscible en agua y etanol. Informacin adi- 5 minutos. Utilizando una pipeta, retirar 50 ml del lquido
cional Destilar y utilizar en, como mximo, 30 das. sobrenadante, a partir de una posicin en torno de 5 cm
abajo de la superficie de la preparacin. Al lquido restante
Butilparabeno junte 50 ml de agua, agitar, dejar en reposo durante 5 minu-
CAS [94-26-8] tos y retire 50 ml del lquido en las condiciones prescritas
anteriormente. Repetir el proceso hasta retirar un total de
Frmula y masa molecular C11H14O3, 194,23 400 ml. Transferir la suspensin para una cpsula de por-
Descripcin Polvo cristalino blanco.
Caracterstica fsica Banda de fusin: de 68 C a 69 C.
celana, evaporar hasta sequedad en bao mara y desecar a
100-105 C hasta masa constante. La masa del residuo no
es superior a 25 mg (0,5%). Partculas finas Esparcir 5 g
14
Solubilidad Muy poco soluble en agua y fcilmente solu- de la muestra en 250 ml de agua, agitar vigorosamente du-
ble en acetona, ter etlico y cloroformo. rante 2 minutos y transferir, inmediatamente, para una pro-
beta de vidrio (de 50 mm de dimetro interno). Utilizando
Conservacin En recipientes cerrados.
una pipeta, transferir 20 ml del lquido para un vidrio de
reloj. Evaporar hasta sequedad en bao mara y desecar a
Calciferol
100-105 C hasta masa constante (m). Dejar en reposo a
CAS [50-14-6] 20 C durante 4 horas la suspensin restante. Retirar 20
Sinonimia Ergocalciferol, vitamina D2. Frmula y masa ml del lquido, a partir de una posicin en torno de 5 cm
molecular C28H44O 396,65 abajo de la superficie de la preparacin, evitando dispersar
el sedimento. Transferir para un vidrio de reloj, evaporar
Especificacin Un gramo corresponde en actividad anti- hasta sequedad en bao mara y desecar a 100-105 C hasta
raqutica a 40 millones de Ul. masa constante (m2). El valor de m2 no es inferior a 70% del valor de m1.
Descripcin Cristales incoloros o polvo cristalino blanco.
Carbonato de amonio
Solubilidad Prcticamente insoluble en agua, fcilmente
soluble en etanol, soluble en aceite grasos. CAS [506-87-6]
Conservacin En recipientes hermticos, bajo gas inerte. Frmula y masa molecular (NH4)2CO3 96,09
Almacenamiento Proteger del calor y de la luz. Especificacin Mezcla en proporciones variables de bi-
carbonato de amonio (NH4HCO3 79,06) y carbamato de
Calcio SRA 400 g/ml amonio (H2NCOONH4 78,07). Contiene, como mnimo,
30,0% de NH3 (MM 17,3) (p/p).
Especificacin Contiene 1,001 g de carbonato de calcio
en 25 ml de cido clorhdrico M. Hervir. Completar con Descripcin Masas cristalinas blancas, translcidas, de
agua a 1000 ml. olor amoniacal fuerte.
Conservacin En recipientes bien cerrados, inertes (tipo Solubilidad Soluble en agua. Se descompone en agua
polietileno). hirviendo.
Conservacin En recipientes bien cerrados.
Canfeno
Almacenamiento Proteger de la luz y del calor.
CAS [79-92-5]
Frmula y masa molecular C10H16 136,23 Carbonato de amonio SR
Especificacin Contiene 15,8 g de carbonato de amonio
Alcanfor
en agua a 100 ml.
CAS [76-22-2]
Conservacin En recipientes bien cerrados.
Frmula y masa molecular C10H16O 152,23
Almacenamiento Proteger de la luz y del calor.
Caoln leve
Carbonato de calcio
CAS [1332-58-7]
CAS [471-34-1]
Especificacin Silicato de aluminio natural, hidratado,
purificado. Contiene un agente dispersante apropiado. Frmula y masa molecular CaCO3 100,09
Descripcin Polvo blanco, poco denso, exento de part- Especificacin Contiene, como mnimo, 98,5% (p/p),
culas granulosas, untuoso al tacto. calculado en sustancia seca.
Solubilidad Prcticamente insoluble en la agua y en los Descripcin Polvo blanco, inodoro e inspido.
cidos inorgnicos. Solubilidad Prcticamente insoluble en agua.
Conservacin En recipientes bien cerrados.
14
Frmula y masa molecular Li2CO3 73,89 Frmula y masa molecular Na2CO3.H2O 124,00
Especificacin Contiene, como mnimo, 98,5%, calcula- Especificacin Contiene, como mnimo, 83,0% (p/p)
do en base seca.
Descripcin Cristales incoloros o polvo cristalino blan-
Descripcin Polvo blanco, leve, inodoro. co; inodoro, de sabor alcalino y salado.
Solubilidad Ligeramente soluble en agua y muy Solubilidad Fcilmente soluble en agua, y prcticamente
poco soluble en etanol. insoluble en etanol.
Conservacin En recipientes bien cerrados. Conservacin En recipientes bien cerrados.
Informacin adicional Cuando prescrito carbonato de so-
Carbonato de potasio, anhidro dio para mezcla en polvo, usar Na2CO3.H2O .
CAS [584-08-7]
Frmula y masa molecular K2CO3 138,21 Carbonato de sodio SR
Descripcin Polvo granulado o grnulos blancos o casi Especificacin Contiene 10,6 g de carbonato de sodio
blancos. Higroscpico. anhidro en 100 ml de agua.
14
sodio a 0,9 % (p/v). Los solventes utilizados para prepa-
rar este reactivo contienen un antioxidante apropiado, tal Descripcin Lquido incoloro o amarillo plido.
como el Butilhidroxianisol a 0,002% (p/v).
Caractersticas fsicas Densidad (25 C): 1,056. Banda
Conservacin Utilizar en hasta 3 meses, despus de con- de ebullicin: 205 C a 209 C, con descomposicin.
gelamiento o liofilizacin.
Miscibilidad Poco soluble en agua y miscible en etanol
Celulosa cromatogrfica y ter etlico.
Especificacin Contiene 0,16 g de nitrato de plomo (II) Caractersticas fsicas Temperatura de ebullicin: apro-
en 5 ml de cido ntrico. Completar con agua a 1000 ml. ximadamente 80 C. Densidad: aproximadamente 0,78.
ndice de refraccin (20 C): 1,426 a 1,427.
Conservacin En recipientes bien cerrados, inertes (tipo
polietileno). Miscibilidad Prcticamente insoluble en agua. Miscible
en solventes orgnicos.
Cianuro de potasio Conservacin En recipientes bien cerrados.
CAS [151-50-8] Seguridad Inflamable.
Frmula y masa molecular KCN 65,12
Cinamato de bencilo
Especificacin Contiene, como mnimo, 96,0% (p/p),
calculado sobre la sustancia desecada. CAS [103-41-3]
Descripcin Polvo cristalino, masas o grnulos blancos; Frmula y masa molecular C16H14O2 238,28
delicuescente. Descripcin Cristales incoloros o amarillentos.
Caracterstica fsica Temperatura de fusin: 634 C. Caracterstica fsica Temperatura de fusin: cerca de 39
Conservacin En recipientes hermticos. C.
Caractersticas fsicas Poder rotatorio especfico (20 Solubilidad Fcilmente soluble en agua y prcticamente
C): +225 a +230, determinado en una solucin a 5% insoluble en etanol.
(p/v) en etanol a 96% (v/v). Temperatura de fusin: cerca
Conservacin En recipientes bien cerrados.
de 263 C.
Conservacin En recipientes cerrados. Citronelal
Almacenamiento Proteger de la exposicin a la luz. CAS [106-23-0]
Frmula y masa molecular C10H18O 154,25
1,8-Cineol
Descripcin Lquido incoloro o amarillo claro.
CAS [470-82-6]
Caractersticas fsicas Densidad (20 C): 0,848 a 0,856.
14 Sinonimia Eucaliptol.
Frmula y masa molecular C10H18O 154,25
ndice de refraccin (20 C): cerca de 1,446.
Miscibilidad Muy poco soluble en agua y soluble en eta-
Descripcin Lquido incoloro. nol.
Caractersticas fsicas Densidad (20 C): 0,922 a 0,927.
Citronelol
ndice de refraccin (20 C): 1,456 a 1,459.
CAS [106-22-9]
Miscibilidad Prcticamente insoluble en agua y miscible
en etanol. Frmula y masa molecular C10H20O 156,26
Descripcin Lquido incoloro y lmpido.
Citral
Caractersticas fsicas Densidad (20 C): 0,857. ndice
CAS [5392-40-5] de refraccin (20 C): 1,456. Banda de ebullicin: 220 C
Frmula y masa molecular C10H16O 152,24 a 222 C.
Descripcin Lquido amarillo claro. Miscibilidad Prcticamente insoluble en agua y miscible
en etanol.
Miscibilidad Prcticamente insoluble en agua y miscible
en etanol y glicerol.
Cloramina-T
Citrato de amonio SR CAS [7080-50-4]
Preparacin Disolver 40 g de cido ctrico en 90 ml de Sinonimia Sal sdica trihidratada de la N-cloro-p- tolue-
agua destilada. Aadir dos o tres gotas de rojo de fenol a nosulfonamida.
0,1% (p/v) en etanol. Aadir, cuidadosamente, hidrxido Frmula y masa molecular C7H7ClNNaO2S.3H2O
de amonio hasta que la solucin adquiera coloracin roji- 281,69
za. Retirar cualquier plomo presente por la extraccin con
porciones de 20 ml de solucin extractora de ditizona hasta Descripcin Cristales eflorescentes blancos o levemente
que la coloracin verde anaranjada en la solucin de diti- amarillentos o polvo cristalino.
zona sea mantenida. Caracterstica fsica Banda de fusin: 167 C a 170 C.
Especificacin Contiene, como mnimo, 99,0% (p/p), Conservacin En recipientes bien cerrados.
calculado sobre la sustancia desecada. Seguridad Evitar el contacto con materiales orgnicos u
otras sustancias oxidables.
Descripcin Cristales o polvo cristalino blanco, inodoro,
de sabor salado, refrescante. Delicuescente. Cloruro cobaltoso
CAS [7791-13-1]
Caracterstica fsica Temperatura de fusin: cerca de 163 Frmula y masa molecular CsCl 168,36
C.
Descripcin Polvo blanco o casi blanco.
Solubilidad Soluble en agua y etanol.
Solubilidad Muy soluble en agua, fcilmente soluble en
Conservacin En recipientes cerrados. metanol y prcticamente soluble en acetona.
Almacenamiento Proteger de la exposicin a la luz.
Cloruro de estao (II) SR
Cloruro de bencilo Preparacin Calentar 20 g de estao con 85 ml de cido
clorhdrico hasta que no haya ms liberacin de hidrgeno.
CAS [100-44-7]
Sinonimia Clorometilbenceno
14
Cloruro de magnesio
Frmula y masa molecular C7H7Cl 126,58 CAS [7791-18-6]
Descripcin Lquido incoloro. Frmula y masa molecular MgCl2 6H2O 203,30
Caractersticas fsicas Densidad (20 C): 1,100. Tempe- Especificacin Contiene, como mnimo, 98,0 % (p/p).
ratura de ebullicin: 179 C. Banda de fusin: -48 C a
Descripcin Cristales incoloros, de sabor amargo. Hi-
-43 C.
groscpico.
Miscibilidad Insoluble en agua. Miscible en etanol, clo-
Solubilidad Muy soluble en agua y fcilmente soluble
roformo y ter etlico.
en etanol.
Conservacin En recipientes hermticos.
Conservacin En recipientes bien cerrados.
Almacenamiento Proteger del calor.
Almacenamiento Proteger de la humedad.
Cloruro de calcio
Cloruro de mercurio (II)
CAS [10035-04-8]
CAS [7487-94-7]
Frmula y masa molecular CaCl2.2H2O 147,02
Sinonimia Cloruro mercrico.
Especificacin Contiene, como mnimo, 96,0% (p/p).
Frmula y masa molecular HgCl2 271,50
Descripcin Polvo cristalino o grnulos blancos, inodo-
Especificacin Contiene, como mnimo, 99,0%(p/p), cal-
ro, de sabor salado y fuertemente amargo. Higroscpico.
culado sobre la sustancia desecada.
Solubilidad Fcilmente soluble en agua y soluble en eta-
Descripcin Cristales incoloros o polvo cristalino blanco
nol.
o casi blanco, o masa cristalizada; inodoro.
Conservacin En recipientes bien cerrados.
Caracterstica fsica Temperatura de fusin: 277 C (vo-
Almacenamiento Proteger de la humedad. latiliza a temperatura de aproximadamente 300 C).
Solubilidad Soluble en agua y en glicerol, fcilmente so-
Cloruro de calcio, anhidro
luble en etanol.
CAS [10043-52-4]
Conservacin En recipientes bien cerrados.
Frmula y masa molecular CaCl2 -110,99
Almacenamiento Proteger de la luz.
Especificacin Contiene, como mnimo, 98,0%(p/p), cal-
culado sobre la sustancia desecada. Seguridad Irritante. Custico. Txico. Contaminante.
Solubilidad Muy soluble en agua, fcilmente soluble en Conservacin En recipientes bien cerrados.
etanol, en cido actico glacial, y en cido clorhdrico di-
Almacenamiento Proteger de la luz.
luido y concentrado.
Conservacin En recipientes bien cerrados. Clorhidrato de benzoilo
Almacenamiento Proteger del aire y del calor. CAS [98-88-4]
Frmula y masa molecular C7H5ClO 140,57
Cloruro de estao SR
Descripcin Lquido incoloro. Se descompone en agua
Especificacin Contiene 10 g de cloruro de estao en ci- y etanol.
do clorhdrico a 100 ml.
Caractersticas fsicas Densidad (20 C): cerca de 1,21.
Caracterstica fsica Temperatura de fusin: en torno de gotas de azul de timol SI) y diluir en 100 ml con agua des-
245 C, con descomposicin. tilada.
Solubilidad Soluble en agua y en etanol.
Cloro SR
Conservacin En recipientes bien cerrados.
Especificacin Solucin saturada de cloro en agua.
Almacenamiento Protegido de la luz.
Conservacin En frascos completamente llenos y bien
cerrados.
Clorhidrato de fenilhidracina SR
Almacenamiento En local fro, protegido de la luz y del
Preparacin Disolver 0,9 g de Clorhidrato de fenilhidra-
aire.
cina en 50 ml de agua. Decolorar con carbn activado y
filtrar. Recolectar el filtrado en baln volumtrico de 250
ml, aadir 30 ml de cido clorhdrico y completar para vo-
lumen con agua.
Observaciones La solucin tiende a deteriorarse a pesar
de estar protegida de la luz y del aire. 14
Estabilidad Utilizar solucin recin preparada.
Clorhidrato de hidrastina
p-Cloroacetanilida
CAS [5936-28-7]
CAS [539-03-7]
Frmula y masa molecular C21H22ClNO6 419,86
Frmula y masa molecular C8H8ClNO 169,61
Descripcin Polvo blanco, o casi blanco. Higroscpico.
Descripcin Polvo cristalino.
Caractersticas fsicas Poder rotatorio (17 C): cerca de
Caracterstica fsica Temperatura de fusin: cerca de 178
+127. Temperatura de fusin: cerca a 116 C.
C.
Solubilidad Muy soluble en agua y en etanol.
Solubilidad Prcticamente insoluble en agua y soluble
en etanol.
Clorhidrato de hidroxilamina
CAS [5470-11-1] Clorobenceno
Frmula y masa molecular NH4ClO 69,49 CAS [108-90-7]
Especificacin Contiene, como mnimo, 96,0% (p/p). Frmula y masa molecular C6H5Cl 112,56
Descripcin Cristales incoloros o polvo cristalino blanco. Descripcin Lquido incoloro, refringente, de olor carac-
terstico.
Caracterstica fsica Temperatura de fusin: aproxima-
damente 151 C Caractersticas fsicas Temperatura de ebullicin: apro-
ximadamente 132 C. Densidad: aproximadamente 1,11.
Solubilidad Muy soluble en agua y soluble en etanol.
ndice de refraccin (20 C): 1,5251.
Conservacin En recipientes bien cerrados.
Conservacin En recipientes bien cerrados.
Almacenamiento Proteger de la humedad.
Seguridad Txico. Inflamable.
Clorhidrato de hidroxilamina SR
1-Cloro-2,4-dinitrobenceno
Preparacin Disolver 5 g en 5 ml de agua caliente. Com-
CAS [97-00-7]
pletar a 100 ml con etanol.
Frmula y masa molecular C6H3ClN2O4 202,55
Conservacin En recipientes bien cerrados.
Descripcin Cristales amarillos plidos o polvo crista-
Seguridad Inflamable. lino.
Clorhidrato de hidroxilamina SR1 Caracterstica fsica Temperatura de fusin: en torno de
51 C.
Preparacin Disolver 20 g de Clorhidrato de hidroxila-
mina en agua destilada para obtener, aproximadamente, 65 Cloroformo
ml. Transferir para embudo de separacin. Aadir cinco
gotas de azul de timol SI y aadir hidrxido de amonio Sinonimia Triclorometano Frmula y masa molecular
hasta que la solucin adquiera color amarilla. Aadir 10 ml CHCl3 119,40.
de solucin acuosa de dietilditiocarbamato de sodio a 4% Especificacin Contiene, como mnimo, 99,9 % (p/p).
(p/v), agitar, y dejar en reposo por 5 minutos. Extraer esa
solucin con sucesivas porciones de 10 a 15 ml de cloro- Descripcin Lquido mvil, incoloro, olor dulce.
formo hasta que una porcin de 5 ml del extracto de cloro- Caractersticas fsicas Densidad: aproximadamente
formo no adquiera coloracin amarilla cuando agitada con 1,48. Temperatura de ebullicin: aproximadamente 62 C.
sulfato cprico a 12,5% (p/v). Aadir cido clorhdrico 3
M hasta obtener coloracin rosa (se necesario, aadir una Conservacin En recipientes bien cerrados.
o dos Seguridad Txico.
14 CAS [58-94-6]
Frmula y masa molecular C7H6ClN3O4S2 295,73
Conservacin En recipientes hermticos.
Almacenamiento Proteger de la luz, humedad y oxgeno.
Descripcin Polvo cristalino blanco o casi blanco, ino-
doro. Seguridad Irritante. Custico. Txico.
14
Caracterstica fsica Banda de fusin: 63 C a 67 C.
Diclorhidrato de N-(1-naftil) etilendiamina SR
Diaveridina
Sinonimia Reactivo de Bratton-Marshall Preparacin
CAS [5355-76-S] Disolver 0,1 g de diclorhidrato de N-(1- naftil) etilendiami-
Nombre qumico 5-[(3,4-Dimetoxifenil)metil]-2,4- piri- na en 100 ml de agua.
midinodiamina Frmula y masa molecular C13H16N4O2 Conservacin En recipientes bien cerrados.
260,30
Caracterstica fsica Temperatura de fusin: en torno de 2,6-Dicloroquinona-4-clorimida
233 C. CAS [101-38-2]
Sinonimia Reactivo de Gibbs, 2,6-dicloro-4- (cloroimi-
2,6-Dibromoquinona-4-clorimida
no)-2,5-cicloexadien-1-ona.
CAS [537-45-1]
Frmula y masa molecular C6H2Cl3NO 210,45
Frmula y masa molecular C6H2Br2ClNO 299,35
Descripcin Polvo cristalino amarillo o anaranjado.
Descripcin Polvo cristalino amarillo.
Caracterstica fsica Temperatura de fusin: en torno de
Caracterstica fsica Banda de fusin: entre 82 C y 66 C.
84C.
Solubilidad Prcticamente insoluble en agua, soluble en
Solubilidad Insoluble en agua y soluble en etanol y en etanol y en soluciones alcalinas diluidas.
soluciones hidrxido-alcalinas diluidas.
Conservacin En recipientes cerrados. 1-(2,6-Diclorofenil)-1,3-dihidro-2fl-indol-2-ona
(Impureza A del diclofenaco)
Dibutilamina CAS [15362-40-0]
CAS [111-92-2] Sinonimia 1-(2,6-diclorofenil) indolin-2-ona Frmula y
Frmula y masa molecular C8H19N 129,24 masa molecular C14H9Cl2NO 278,14
Descripcin Lquido incoloro. Descripcin Polvo cristalino blanco.
Caractersticas fsicas Temperatura de ebullicin: cerca Conservacin En recipientes bien cerrados.
de 159 C. ndice de refraccin (20 C): cerca de 1,417. Almacenamiento Proteger de la exposicin a la luz.
Miscibilidad Soluble en agua y etanol.
2,6-Dicloroindofenol sdico
Conservacin En recipientes bien cerrados.
CAS [620-45-1]
Dicloruro de etileno Sinonimia 2,6-Diclorofenolindofenol sdico.
CAS [107-06-2] Frmula y masa molecular C12H6Cl2NNaO2 290,08.
Sinonimia 1,2-Dicloroetano Descripcin Polvo verde oscuro.
Frmula y masa molecular C2H4Cl2 98,96 Solubilidad Fcilmente soluble en agua y en etanol anhi-
Descripcin Lquido incoloro y lmpido, de olor similar dro. La solucin acuosa presenta coloracin azul oscura y
al del cloroformo. cuando acidificada se torna rosa.
Caractersticas fsicas Temperatura de ebullicin: en tor- Conservacin En recipientes bien cerrados.
no de 83 C. Densidad (20 C): en torno de 1,25. ndice de
refraccin (20 C): 1,444. Dicromato de potasio
14
Conservacin En recipientes bien cerrados.
Seguridad Custico. Oxidante. Contaminante. Agua (5.2.20.1) Determinar en 0,5 g. como mximo
1,0%.
Dietilamina
Dietilftalato
CAS [109-89-7]
CAS [84-66-2]
Frmula y masa molecular C4H11N 73,14
Frmula y masa molecular C12H14O4 222,24
Descripcin Lquido lmpido, incoloro, voltil, de olor
amoniacal. Reaccin fuertemente alcalina. Descripcin Lquido oleoso incoloro y prcticamente
inodoro.
Caractersticas fsicas Banda de ebullicin: 55 C a 58
C. ndice de refraccin (20 C): 1,386. Densidad: aproxi- Especificacin Contiene, como mnimo, 99,0% (p/p).
madamente 0,707. Caractersticas fsicas densidad 1,118. Temperatura de
Miscibilidad Miscible en agua y en etanol. ebullicin: 295 C.
Conservacin En recipientes bien cerrados. Miscibilidad Miscible en agua, etanol, ter etlico y otros
solventes orgnicos.
Seguridad Irritante. Inflamable.
Conservacin En recipientes bien cerrados.
Dietilaminoetildextrano Seguridad Irritante!
CAS [9015-73-0]
Difenilamina
Frmula y masa molecular C12H28N2O 216,36
CAS [122-39-4]
Descripcin Polvo.
Frmula y masa molecular C12H11N 169,22
Solubilidad Soluble en agua.
Descripcin Cristales blancos o casi blancos.
Dietilditiocarbamato de plata Caractersticas fsicas Temperatura de fusin: cerca de
CAS [1470-61-7] 55 C. Temperatura de ebullicin: 302 C. Pierde el color
Frmula y masa molecular C5H10AgNS2 256,13 en presencia de la luz.
Descripcin Polvo amarillo claro a amarillo grisceo. Solubilidad Poco soluble en agua y soluble en etanol.
Forma sal en solucin con cidos fuertes.
Solubilidad Prcticamente insoluble en agua y soluble
en piridina. Conservacin En recipientes bien cerrados.
Especificacin Contiene 0,25 g en piridina para 50 ml. Preparacin Disolver 1 g de difenilamina en 100 ml de
Estabilidad Preparar para uso inmediato. cido sulfrico.
Solubilidad Prcticamente insoluble en agua, poco solu- Conservacin Acondicionar la solucin en recipiente de
ble en acetona y en etanol. vidrio mbar a la temperatura de 4 C a 8 C.
Conservacin En recipientes cerrados.
Difenilcarbazona mercrica SR
Almacenamiento Proteger de la exposicin a la luz.
Solucin A Disolver 0,1 g de difenilcarbazona en etanol
y completar el volumen para 50 ml con el mismo solvente.
Difenilborato de aminoetanol
Solucin B Disolver 1 g de cloruro de mercurio (II) en
CAS [524-95-8]
etanol y completar el volumen para 50 ml con el mismo
Frmula y masa molecular C14H16BNO 225,09 solvente. Preparacin Mezclar volmenes iguales de las
Descripcin Polvo cristalino blanco o amarillento. Soluciones A y B en el momento del uso.
Caracterstica fsica Temperatura de fusin: cerca de 193
C.
N,N-Diisopropiletilenodiamina 14
CAS [4013-94-9]
Solubilidad Prcticamente insoluble en agua y soluble
Frmula y masa molecular C8H20N2 144,26
en etanol.
Descripcin Lquido incoloro o amarillento. Corrosivo,
Difenilborato de aminoetanol SR inflamable e higroscpico.
Preparacin Disolver 1 g de difenilborato de aminoeta- Caractersticas fsicas Densidad (20 C): cerca de 0,798.
nol en metanol y completar el volumen para 100 ml con el ndice de refraccin (20 C): cerca de 1,429. Temperatura
mismo solvente. de ebullicin: cerca de 170 C.
Difenilcarbazida Dimetilacetamida
CAS [140-22-7] CAS [127-19-5]
Frmula y masa molecular C13H14N4O 242,28 Frmula y masa molecular C4H9NO 87,12
Descripcin Polvo cristalino blanco; se torna rosa por la Descripcin Lquido incoloro y lmpido.
exposicin al aire.
Caractersticas fsicas Temperatura de ebullicin: cerca
Caracterstica fsica Banda de fusin: 168 C a 171 C. de 165 C. ndice de refraccin (20 C): cerca de 1,437.
Densidad (20 C): cerca de 0,94.
Solubilidad Muy poco soluble en agua, soluble en aceto-
na, en etanol y cido actico glacial. Miscibilidad Miscible en agua y en la mayora de los
solventes orgnicos.
Conservacin En recipientes hermticos.
Conservacin En recipientes cerrados.
Almacenamiento Proteger de la luz y del aire.
p-Dimetilaminobenzaldehdo
Difenilcarbazida SR
CAS [100-10-7]
Especificacin Contiene 1 g de difenilcarbazida en etanol
para 100 ml. Sinonimia 4-Dimetilaminobenzaldehdo y Reactivo de
Ehrlich.
Conservacin En recipientes bien cerrados.
Frmula y masa molecular C9H11NO 149,19
Almacenamiento Proteger de la luz.
Descripcin Polvo cristalino, blanco a levemente ama-
Seguridad Inflamable. rillento.
Difenilcarbazona Caracterstica fsica Temperatura de fusin: aproxima-
damente 74 C.
CAS [538-62-5]
Frmula y masa molecular C13H12N4O 240,26 Solubilidad Soluble en etanol y en soluciones cidas di-
luidas.
Descripcin Cristales de color anaranjado-rojizo.
Conservacin En recipientes bien cerrados.
Caracterstica fsica Temperatura de fusin: aproxima-
damente 157 C, con descomposicin. Almacenamiento Proteger de la luz.
drico. Agitar la solucin con carbn activado y filtrar. La Descripcin Cristales blancos o casi blancos.
coloracin de la solucin es menos intensa que una solu-
Caracterstica fsica Temperatura de fusin: en torno de
cin de yodo a 0,0001 M recientemente preparada. Utilizar
74,5 C.
inmediatamente despus de preparado.
Dimetilformamida
p-Dimetilaminobenzaldehdo SR2
CAS [68-12-2]
Sinonimia Reactivo de Wasicky.
Frmula y masa molecular C3H7NO 73,09
Preparacin Disolver 0,5 g de p-Dimetilaminobenzalde-
hdo en 8,5 ml de cido sulfrico y aadir, cuidadosamen- Descripcin Lquido lmpido, incoloro, con olor seme-
te, 8,5 ml de agua. jante al de aminas.
14 4-Dimetilaminocinamaldedo
Caractersticas fsicas Temperatura de ebullicin: apro-
ximadamente 153 C. Densidad: aproximadamente 0,95.
ndice de refraccin (20 C): 1,428.
CAS [6203-18-5]
Frmula y masa molecular C11H13NO 175,22 Miscibilidad Miscible en agua y en etanol.
Descripcin Cristales anaranjados o marrn-anaranjados Conservacin En recipientes bien cerrados.
o polvo.
Seguridad Irritante. Txico.
Caracterstica fsica Temperatura de fusin: en torno de
138 C. Dimetilsulfxido
Solubilidad Soluble en etanol, acetona y benceno. CAS [67-68-5]
Sinonimia DMSO.
2,6-Dimetilanilina
Frmula y masa molecular C2H6 OS 78,13
CAS [87-62-7]
Descripcin Lquido incoloro e inodoro. Higroscpico.
Sinonimia 2,6-Xilidina.
Caractersticas fsicas Temperatura de ebullicin: apro-
Frmula y masa molecular C8H11N 121,18
ximadamente 189 C. Densidad: aproximadamente 1,10.
Descripcin Lquido incoloro. ndice de refraccin (20 C): 1,479.
Caracterstica fsica Densidad (20 C): cerca de 0,98 Miscibilidad Miscible en agua y en etanol.
Conservacin En recipientes bien cerrados.
N,N-Dimetilanilina
Almacenamiento Proteger de la humedad y de la exposi-
CAS [121-69-7]
cin a la luz.
Sinonimia N,N-Dimetilbencenamina.
Seguridad Irritante.
Frmula y masa molecular C8H11N 121,18
Descripcin Lquido oleoso, lmpido, prcticamente in- 1,3-Dinitrobenceno
coloro, oscurece durante el almacenamiento. CAS [99-65-0]
Caracterstica fsica -Banda de destilacin: 192 C a 194 Frmula y masa molecular C6H4N2O4 168,11
C.
Descripcin Cristales amarillentos.
Miscibilidad Prcticamente insoluble en agua, fcilmen-
Caracterstica fsica Temperatura de fusin: en torno de
te soluble en etanol y ter etlico.
89 C.
1,1-Dimetiletilamina Solubilidad Prcticamente insoluble en agua y poco so-
luble en etanol.
CAS [75-64-9]
Sinonimia terc-Butilamina. Conservacin En recipientes bien cerrados.
Frmula y masa molecular C8H10O 122,16 Descripcin Lquido lmpido, incoloro, con olor seme-
jante al de ter etlico.
Descripcin Polvo amorfo, fino, casi blanco, o rojizo, o Frmula y masa molecular C2H6O 46,07
amarillento.
Especificacin Contiene, como mnimo, 96,0% (v/v). Caractersticas fsicas Temperatura de ebullicin: apro-
ximadamente 35 C. Densidad: aproximadamente 0,715.
Descripcin Lquido lmpido, incoloro, voltil, de olor
ndice de refraccin (20 C): 1,355.
caracterstico.
Miscibilidad Miscible en agua y en etanol.
Caractersticas fsicas Temperatura de ebullicin: apro-
ximadamente 78 C. Densidad: 0,803 a 0,808. Conservacin En recipientes bien cerrados.
Miscibilidad Miscible en agua y en cloruro de metileno. Almacenamiento Proteger de la luz y del calor (no exce-
der 15 C).
Conservacin En recipientes bien cerrados.
Categora Anestsico.
Almacenamiento Proteger del calor.
14
Seguridad Inflamable. Riesgo de explosin!
Seguridad Txico. Inflamable.
ter isoproplico
Etanol absoluto
CAS [108-20-3]
CAS [64-17-5]
Sinonimia ter diisoproplico.
Sinonimia Alcohol anhidro.
Frmula y masa molecular C6H14O 102,17
Frmula y masa molecular C2H6O 46,07
Descripcin Lquido incoloro y lmpido.
Especificacin Contiene, como mnimo, 99,5% (v/v).
Caractersticas fsicas Banda de ebullicin: 67 C a 69
Descripcin Lquido lmpido, incoloro, voltil, de olor
C. Densidad (20 C): 0,723 a 0,728.
caracterstico. Higroscpico.
Miscibilidad Muy poco miscible en agua y miscible en
Caractersticas fsicas Temperatura de ebullicin: 78-79
etanol.
C. Densidad: 0,790 a 0,794. ndice de refraccin: (20 C):
1,361. Conservacin En recipientes cerrados.
Conservacin En recipientes hermticos. Almacenamiento Proteger de la luz.
Almacenamiento Proteger del calor y de la humedad. Seguridad Inflamable
Seguridad Txico. Inflamable.
Etilenglicol
Etanol glicerinado CAS [107-21-1]
Preparacin Mezclar 20 ml de glicerina y 80 ml de eta- Nombre qumico 1,2-Etanodiol
nol a 70% (v/v). Frmula y masa molecular C2H6O2 62,07
Descripcin Lquido oleoso, incoloro o levemente amari- Caracterstica fsica Sublima en el vaco.
llento. Oscurece, y se torna ms viscoso, con la exposicin
a la luz y con el contacto con el aire. Fenol
Caractersticas fsicas Densidad (20 C): cerca de 1,07. CAS [108-95-2]
Temperatura de ebullicin: cerca de 250 C. Frmula y masa molecular C6H6O 94,11
Miscibilidad Prcticamente insoluble en agua miscible Especificacin Contiene, como mnimo, 98,0% (p/p).
en etanol, en aceites grasos y aceites esenciales.
Descripcin Masa cristalina o cristales incoloros o leve-
Verde rpido (CI 42053) mente rosados o amarillentos, de olor caracterstico. Deli-
cuescente.
14
CAS [2353-45-9]
Caractersticas fsicas Temperatura de fusin: aproxima-
Frmula y masa molecular C37H34N2Na2O10S3 808,86
damente 43 C. Temperatura de ebullicin: aproximada-
Descripcin Polvo o grnulo verde oscuro, con brillo mente 180 C.
metlico.
Solubilidad Soluble en agua, muy soluble en etanol, en
Solubilidad Soluble en agua y ligeramente soluble en glicerol y en cloruro de metileno.
etanol.
Conservacin En recipientes hermticos.
Conservacin En recipientes cerrados.
Almacenamiento Proteger de la luz y del calor.
Factor Xa de la coagulacin sangunea bovina Etiquetado Debe indicar el nombre y la cantidad del es-
tabilizante.
Especificacin Enzima que posibilita la conversin de la
protrombina en trombina. La sustancia semi-purificada es Seguridad Custico. Txico.
obtenida a partir de plasma bovino lquido y es preparada
Categora Desinfectante.
por activacin del zimgeno del Factor X por medio de un
agente apropiado, tal como el veneno de vbora de Russel.
Fenolftalena
Almacenamiento La preparacin liofilizada debe ser al-
CAS [77-09-8]
macenada a una temperatura de -20 C. La preparacin
congelada debe ser almacenada a una temperatura inferior Frmula y masa molecular C20H14O4 318,33
a -20 C. Especificacin Contiene, como mnimo, 97,0% (p/p),
calculado sobre la sustancia desecada.
Factor Xa bovino, solucin
Descripcin Polvo cristalino o amorfo, blanco o leve-
Preparacin Reconstituir, segn las instrucciones de fa- mente amarillento. Inodoro.
bricante, y diluir con la solucin tampn de trometamina
cloruro de sodio de pH 7,4. Caracterstica fsica Temperatura de fusin: aproxima-
damente 258 C.
Absorbancia (5.2.14) Cualquier modificacin de la ab-
sorbancia de la solucin en 405 nm, usando el tampn de Solubilidad Prcticamente insoluble en agua y soluble
trometamina-cloruro de sodio de pH 7,4, como blanco, no en etanol.
es superior a 0,15-0,20 por minuto. Conservacin En recipientes bien cerrados.
14 Conservacin En recipientes bien cerrados. Descripcin Grnulos o cristales blancos o casi blancos.
Higroscpico.
Formaldehdo, solucin
Caracterstica fsica Presenta pH de cerca de 8,0 en solu-
Sinonimia Formol, formalina. cin acuosa a 20% (p/v).
Frmula y masa molecular CH2O 30,03 Solubilidad Muy soluble en agua y prcticamente inso-
Especificacin Contiene, como mnimo, 34,0% (p/v) y, luble en etanol.
como mximo, 37,0% (p/v). Conservacin En recipientes bien cerrados.
Descripcin Lquido incoloro, lmpido; vapores irritan-
tes. Fosfato de amonio monobsico
14
Fosfato de potasio dibsico Fosfato de sodio dibsico heptahidratado SR
CAS [7758-11-4] Especificacin Contiene 12 g de fosfato de sodio dibsi-
Sinonimia Fosfato de potasio monocido. co heptahidratado en 100 ml de agua.
Frmula y masa molecular K2HPO4 174,18 Conservacin En recipientes bien cerrados.
Descripcin Cristales incoloros o polvo blanco o casi
Fosfato de sodio monobsico
blanco. Muy higroscpico.
CAS [7558-80-7]
Solubilidad Muy soluble en agua, muy poco soluble en
etanol. Sinonimia Di-hidrogeno-ortofosfato de sodio.
14
Solucin A Disolver 38 g de fosfato de sodio monobsico
y 2 g de fosfato de sodio dibsico anhidro en agua y diluir Ftalaldehido
para 1000 ml con el mismo solvente. Ajustar el pH, si ne- CAS [643-79-8]
cesario, en 5,3 0,1 utilizando hidrxido de sodio 5 M o
Frmula y masa molecular C8H6O2 134,14
cido fosfrico.
Descripcin Polvo cristalino amarillo.
Solucin B Disolver 400 mg de prpura de bromocresol
en 30 ml de agua, aadir 6,3 ml de hidrxido de sodio 0,1 Caracterstica fsica Temperatura de fusin: cerca de 55
M y diluir con agua para 500 ml. C.
Preparacin En el da de la utilizacin, mezclar las So- Conservacin En recipientes cerrados.
luciones A y B y cloroformo (1:1:1) en embudo de sepa-
Almacenamiento Proteger de la exposicin a la luz y del
racin. Agitar y descartar la fase orgnica. Repetir la ex-
contacto con el aire.
traccin con porciones iguales de cloroformo hasta que
la camada orgnica se presente incolora. Utilizar la fase Ftalato de dibutilo
acuosa.
CAS [84-74-2]
Fsforo rojo Frmula y masa molecular C16H22O4 278,3
CAS [7723-14-0] Sinonimia ster dibutlico del cido ftlico, ftalato de di-
Descripcin Polvo rojo oscuro. n-butilo y dibutil ftalato.
Solubilidad Insoluble en agua y en cidos diluidos. Descripcin Lquido oleoso, lmpido, incoloro o ligera-
mente colorido.
Seguridad Inflamable!
Caractersticas fsicas Temperatura de ebullicin: 340
Fructosa C. Densidad: 1,043 a 1,048.
CAS [57-48-7] Miscibilidad Muy poco soluble en agua, muy soluble en
Sinonimia b-D-Fructosa, levulosa. acetona, benceno, etanol y ter etlico.
Guayacol n-Heptano
CAS [95-05-1] CAS [142-82-5]
Sinonimia 2-metoxifenol, metilcatecol. Frmula y masa molecular C7H16 100,20
Frmula y masa molecular C7H8O2 124,14 Especificacin Principal componente de heptano.
Descripcin Cristales blancos o levemente amarillentos, Descripcin Lquido lmpido e inflamable.
o lquido incoloro o levemente amarillento. Higroscpico.
Caractersticas fsicas Temperatura de ebullicin: 98,4
Caractersticas fsicas Temperatura de fusin: cerca de C. Densidad: 0,684. ndice de refraccin (20 C): 1,3855.
28 C. Temperatura de ebullicin: cerca de 205 C. Poco
Miscibilidad Prcticamente insoluble en agua y miscible
soluble en agua, muy soluble en cloruro de metileno y f-
14
en etanol anhidro.
cilmente soluble en etanol.
Conservacin En recipientes bien cerrados. Heptanosulfonato de sodio
Almacenamiento Proteger de la luz. CAS [22767-50-6]
Frmula y masa molecular C7H15NaO3S 202,25
Guanina
Descripcin Masa cristalina blanca o casi blanca.
CAS [73-40-5]
Solubilidad Fcilmente soluble en agua y soluble en me-
Frmula y masa molecular C5H5N5O 151,13
tanol.
Descripcin Polvo blanco o casi blanco, amorfo.
Conservacin En recipientes hermticos.
Solubilidad Prcticamente insoluble en agua, poco solu-
ble en etanol. Se disuelve en soluciones hidrxido-alcali- Hexano
nas diluidas.
Especificacin Contiene usualmente mezcla de ismeros
de C6H14, predominantemente n-hexano y metilciclopenta-
Heparina sdica
no (C6H12).
CAS [9041-08-1]
Descripcin Lquido lmpido, incoloro, voltil, altamen-
Descripcin Consiste en mezcla de principios activos, te inflamable, de olor caracterstico.
que poseen la propiedad de prolongar el tiempo de coa-
gulacin de la sangre. Obtenida, normalmente, de mucosa Caractersticas fsicas Banda de ebullicin: 67 a 70 C .
intestinal, pulmones u otro tejido adecuado de mamferos Densidad: 0,66.
domsticos usados para alimento del hombre. Conservacin En recipientes hermticos.
Solubilidad Fcilmente soluble en agua. Almacenamiento Proteger del calor. Mantener distante de
Conservacin En recipientes hermticos. Etiquetado El llama/chispa.
etiquetado debe indicar el rgano y la especie de origen. La Seguridad Irritante del trato respiratorio. Inflamable.
potencia debe ser indicada en UI.
Categora Anticoagulante. n-Hexano
CAS [110-54-3]
Heptano
Frmula y masa molecular C6H14 86,18
Especificacin Contiene usualmente mezcla de hidrocar-
Especificacin Principal componente de ter de petrleo
buros fraccin de petrleo con predominio de n -hep-
y de hexano.
tano.
Descripcin Lquido lmpido, voltil, de olor semejante
Descripcin Lquido lmpido, incoloro, voltil, altamen-
al del petrleo.
te inflamable, de olor caracterstico.
Caractersticas fsicas Temperatura de ebullicin: 69 C.
Caractersticas fsicas Banda de ebullicin: 95 a 99 C.
Densidad: 0,66. ndice de refraccin (20 C): 1,375.
Densidad: aproximadamente 0,69.
Miscibilidad Prcticamente insoluble en agua y miscible
Miscibilidad Prcticamente insoluble en agua y soluble en etanol anhidro.
en etanol absoluto. Miscible en ter etlico, en cloroformo,
Conservacin En recipientes hermticos.
en benceno y en la mayora de los aceites voltiles y no
voltiles. Almacenamiento Proteger del calor. Mantener distante de
llama/chispa.
Conservacin En recipientes hermticos.
Seguridad Inflamable.
Almacenamiento Proteger del calor. Mantener distante de
llama/chispa. 1-Hexanosulfonato de sodio
Seguridad Irritante del trato respiratorio. Inflamable. CAS [2832-45-3]
Frmula y masa molecular C6H13NaO3S 188,22
Descripcin Polvo blanco o casi blanco. Especificacin Contiene, como mnimo, 93,0% (p/p).
Descripcin Polvo o grnulos blancos blandos, inodoros.
Hexilamina
Solubilidad Prcticamente insoluble en agua.
CAS [111-26-2]
Sinonimia Hexanamina. Conservacin En recipientes bien cerrados.
Frmula y masa molar C6H15N 101,19 Almacenamiento Proteger del dixido de carbono.
Especificacin Contiene 8% (p/v) de NaOH en agua. Caracterstica fsica Temperatura de fusin: en torno de
75 C.
Conservacin Ver hidrxido de sodio M.
Solubilidad Poco soluble en agua, fcilmente soluble en
Hidrxido de sodio M acetona, en etanol y en soluciones diluidas de cidos mi-
nerales.
Especificacin Contiene 40 g en agua exenta de dixido
de carbono a 1000 ml. Hidroxitolueno butilado
Conservacin En recipientes de vidrio lcali resistentes CAS [128-37-0]
o de polietileno.
Sinonimia BHT.
Almacenamiento Proteger de la humedad y del dixido
Frmula y masa molecular C15H24O 220,34
de carbono.
Especificacin Contiene, como mnimo, 99,0% (p/p).
Hidrxido de sodio, solucin concentrada SR
Descripcin Polvo cristalino blanco o blanco amarillen-
(aproximadamente 10 M)
to.
Especificacin Contiene 20 g de hidrxido de sodio en
Caractersticas fsicas Temperatura de congelamiento:
agua a 50 ml.
no menos del que 69,2 C. Temperatura de ebullicin: 265
Conservacin En recipientes bien cerrados. C. Densidad: 1,048.
Almacenamiento Proteger del dixido de carbono. Solubilidad Prcticamente insoluble en agua, muy solu-
ble en acetona, fcilmente soluble en etanol y en aceites
Seguridad Custico.
vegetales.
Hidrxido de tetrabutilamonio Seguridad Puede causar dermatitis por contacto.
CAS [2052-49-5]
Hipersido
Frmula y masa molecular (C4H9)4NOH 259,47
CAS [482-36-0]
Descripcin Cristales blancos o casi blancos.
Frmula y masa molecular C21H20O12 464,38
Solubilidad Soluble en agua.
Descripcin Agujas amarillas plidas.
Hidrxido de tetrametilamonio Caracterstica fsica Temperatura de fusin: cerca de 240
C, con descomposicin.
CAS [75-59-2]
Yoduro de potasio mercrico alcalino SR Descripcin Cristales o polvo cristalino blanco o poco
colorido.
Sinonimia Reactivo de Nessler, solucin alcalina de te-
trayodomercurato (II) de potasio, yoduro de potasio- clo- Solubilidad Poco soluble en agua y soluble en etanol.
ruro de mercurio SR.
Carmn de ndigo botar no alfabeto
Preparacin Disolver 5 g de yoduro de potasio en 5 ml
de agua, aadir poco a poco solucin de cloruro de mercu- CAS [860-22-0]
rio (II) a 25% (p/v), controlndose la adicin, para que el Frmula y masa molecular C16H8N2NaO8S2 466,36
precipitado formado en el inicio no quede completamente
disuelto. Dejar enfriar. En seguida, aadir solucin de hi- Descripcin Grnulos azules con brillo de cobre, o polvo
drxido de potasio a 50% (p/v), diluir con agua hasta com- azul o azul-violeta.
14
Almacenamiento Proteger de la luz.
Yodo sulfuroso SR
Seguridad Inflamable.
Preparacin Utilizar baln redondo de 3000 ml a 4000
Yodobismutato de potasio ml, con tres tubuladuras, provisto de un agitador, un ter-
Usar yodobismutato de potasio acuo actico. mmetro y un tubo de secado. El baln deber estar seco y
cerrado durante la preparacin. Mezclar 700 ml de piridina
Yodobismutato de potasio acuo-actico anhidra con 700 ml de metoxietanol; juntar, con agitacin,
220 g de yodo, finamente pulverizado y seco anteriormen-
Preparacin Mezclar 58 ml de agua, 1,21 g de subnitrato te, bajo pentxido de fsforo. La agitacin debe ser mante-
de bismuto, 14 ml de cido actico glacial y 28 ml de solu- nida hasta completa disolucin (por cerca de 30 minutos.).
cin de yoduro de potasio a 40% (p/v). Enfriar a -10 C y, en agitacin, introducir rpidamente
190 g de dixido de azufre lquido. La temperatura no debe
Yodobismutato de potasio diluido SR pasar los 30 C. Enfriar. Dosificacin Determinar el ttulo
Preparacin Disolver 100 g de cido tartrico en 500 ml en el momento de la utilizacin, trabajando siempre al abri-
de agua. Separadamente, disolver 100 g de cido tartrico go de la humedad. Introducir en un matraz cerca de 20 ml
en 400 ml de agua y aadir 8,5 g de subnitrato de bismuto. de metanol anhidro y proceder a Determinacin del agua
Agitar por una hora, aadir 200 ml de solucin de yoduro por el mtodo semi-micro (5.2.20.3), con la muestra, hasta
de potasio a 40% (p/v) y agitar bien. Dejar en reposo por al punto final de la titulacin. Introducir en el matraz una
24 horas y filtrar. Mezclar la primera solucin con 50 ml cantidad de agua exactamente medida y efectuar una nueva
de la segunda. titulacin. Calcular el equivalente en agua de la muestra,
en miligramos por mililitro. Cada mililitro de yodo sulfu-
Yoduro de potasio y subnitrato de bismuto SR roso SR corresponde, como mnimo, a 3,5 mg de H2O.
Sinonimia Reactivo de Dragendorff Conservacin En recipiente seco.
Preparacin Mezclar volmenes iguales de solucin de Irganox 1010
yoduro de potasio a 40% (p/v) en agua y de solucin prepa-
rada disolviendo 0,85 g de subnitrato de bismuto en mezcla CAS [6683-19-8]
de 10 ml de cido actico glacial y 40 ml de agua. Diluir 1 Frmula y masa molecular C73H108O12 1177,81
volumen de esa mezcla con 2 volmenes de cido actico
Descripcin Polvo blanco a ligeramente amarillento.
glacial y 10 volmenes de agua inmediatamente antes del
Inodoro, inspido.
uso.
Caractersticas fsicas Banda de fusin: 110 C a 125 C.
Almacenamiento Proteger de la luz.
Cristaliza en dos formas: forma alfa, banda de fusin 120
C a 125 C; y forma beta, banda de fusin 110 C a 115
Yodobismutato de potasio SR
C La banda de fusin vara de acuerdo con la proporcin
Preparacin Disolver 16,6 g de cido tartrico en 67 ml de las formas cristalinas en la mezcla; esta proporcin no
de agua y juntar 1,41 g de subnitrato de bismuto. Agitar influye en la eficiencia del producto.
durante una hora, aadir 33 ml de solucin de yoduro de
Informacin adicional Estabilizador para sustancias or-
potasio a 40% (p/v). Agitar durante una hora ms. Dejar en
gnicas, tales como polietileno y polipropileno, protegin-
reposo por 24 horas. Filtrar.
dolas contra degradacin trmino-oxidante.
Conservacin En recipientes bien cerrados.
Irganox 1076
Almacenamiento Proteger de la luz.
CAS [2082-79-3]
Yodobismutato de potasio SR1 Frmula y masa molecular C35H62O3- 530,97
Preparacin Disolver 10 g de cido tartrico en 40 ml Descripcin Polvo blanco a ligeramente amarillento.
de agua y aadir 0,85 g de subnitrato de bismuto. Agitar Inodoro, estable a la luz.
durante una hora. Aadir 20 ml de solucin de yoduro de
potasio a 40% (p/v) y homogeneizar. Dejar en reposo du- Caracterstica fsica Banda de fusin: 49 C a 54 C In-
rante 24 horas y filtrar. formacin adicional Antioxidante para sustratos orgni-
cos, tales como polietileno y polipropileno, protegindolos Descripcin Lquido incoloro o amarillento.
de degradacin trmino-oxidante.
Caractersticas fsicas Densidad: aproximadamente
0,870. ndice de refraccin (20 C): aproximadamente
Irganox PS 800
1,431. Temperatura de fusin: aproximadamente 5 C
CAS [123-28-4]
Conservacin En recipientes bien cerrados.
Frmula y masa molecular C30H58O4S 514,94
Descripcin Cristales blancos. Laurilsulfato de sodio
Isooctano
dio.
Frmula y masa molecular C12H25NaO4S 288,38
Especificacin Mezcla de, como mnimo, 85,0% (p/p),
CAS [540-84-1]
de alquilsulfatos de sodio, que consiste principalmente de
Sinonimia 2,2,4-Trimetilpentano. Frmula y masa mole- laurilsulfato de sodio [CH3(CH2)10,H2SO4,Na]. El conteni-
cular C8H18 114,23 do combinado de NaCl y Na2SO4 es, como mximo, de
Descripcin Lquido incoloro e inflamable. 8,0% (p/p).
Caractersticas fsicas Densidad (20 C): 0,691 a 0,696. Descripcin Polvo, escamas o cristales blancos o amari-
ndice de refraccin (20 C): 1,391 a 1,393. llo claro; olor suave y caracterstico.
Miscibilidad Prcticamente insoluble en agua y soluble Solubilidad Fcilmente soluble en agua, y parcialmente
en etanol. soluble en etanol.
Conservacin En recipientes cerrados. Conservacin En recipientes bien cerrados.
14
5 ml de cido clorhdrico. Completar con agua a 100 ml.
Categora Indicador para magnesio y molibdeno.
Conservacin En recipientes bien cerrados, inertes (tipo
polietileno). Melamina
CAS [108-78-1]
Macrogol 300
Frmula y masa molecular C3H6N6 126,12
CAS [25322-68-3]
Descripcin Polvo amorfo, blanco o casi blanco.
Sinonimia PEG 300, polietilenglicol 300. Frmula y
masa molecular H(OCH2CH2)nOH Masa molecular no Solubilidad Muy poco soluble en agua y en etanol.
inferior a 95% del valor nominal rotulado. Presenta el n-
mero medio de grupos oxietileno: n = 6 o 7. 2-Mercaptoetanol
Especificacin Mezcla de productos de policondensacin CAS [60-24-2]
de xido de etileno y agua. Frmula y masa molecular C2H6OS 78,14
Descripcin Lquido viscoso, lmpido, incoloro o casi, de Descripcin Lquido lmpido e incoloro.
olor suave y caracterstico, higroscpico.
Caractersticas fsicas Densidad (20 C): cerca de 1,116.
Caractersticas fsicas Densidad: aproximadamente Temperatura de ebullicin: cerca de 157 C.
1,125. ndice de refraccin (20 C): aproximadamente
1,465. Viscosidad: aproximadamente 80 cP. Miscibilidad Miscible en agua.
Solubilidad Fcilmente soluble en agua y poco soluble Descripcin Cristales o folhetos blancos, o blanco- azu-
en etanol. lados.
Conservacin En recipientes bien cerrados, bien llenos. Caracterstica fsica Banda de fusin: 90 C a 91 C.
Almacenamiento Proteger del calor excesivo, del aire y Solubilidad Prcticamente insoluble en agua, poco solu-
de la humedad. ble en etanol y soluble en cidos minerales.
Estabilidad Oxida lentamente a sulfato, por exposicin Conservacin En recipientes cerrados.
al aire y, a la humedad, con desintegracin de los cristales.
Metilenbisacrilamida
Metanol
CAS [110-26-9]
14 CAS [67-56-1]
Sinonimia Alcohol metlico.
Sinonimia N,N-metilenbisacrilamida, metilenobispro-
penamida.
Frmula y masa molecular CH4O 32,04 Frmula y masa molecular C7H10N2O2 154,19
Especificacin Contiene, como mnimo, 99,5% (p/v). Descripcin Polvo fino blanco o casi blanco.
Descripcin Lquido lmpido, incoloro, inflamable, de Caracterstica fsica Temperatura de fusin: arriba de
olor caracterstico. 300 C, con descomposicin.
Caractersticas fsicas Temperatura de ebullicin: 64 C
Metil Etil Cetona
a 65 C. Densidad: 0,790 a 0,793. ndice de refraccin (20
C): 1,328 a 1,330. CAS [78-93-3]
Conservacin En recipientes hermticos. Sinonimia Etil metil cetona; 2-butanona.
Descripcin Grnulo o polvo blanco, o blanco amarillen- Descripcin Cristales blancos, poco solubles en agua,
to, o blanco grisceo. Higroscpico. fcilmente solubles en acetona, en etanol y en ter etlico.
Solubilidad Prcticamente insoluble en agua caliente, en Solubilidad Muy poco soluble en agua y fcilmente solu-
acetona, etanol absoluto y tolueno. ble en etanol y en metanol.
Categora Conservante.
4,4-Metilenobis-N,N-dimetilanilina
CAS [101-61-1] 4-Metilpentan-2-ol
Sinonimia Tetrametildiaminodifenilmetano. CAS [108-11-2]
Frmula y masa molecular C17H22N2 254,37 Frmula y masa molecular C6H14O 102,17
Descripcin Lquido incoloro, lmpido y voltil.
Caractersticas fsicas Densidad (20 C): cerca de 0,802. Conservacin En recipientes bien cerrados.
ndice de refraccin (20 C): cerca de 1,411. Temperatura
Seguridad Venenoso! Usar en ambientes con ventilacin
de ebullicin: cerca de 132 C.
adecuada.
3-Metil-2-pentanona
Miristato de metilo
CAS [565-61-7]
CAS [124-10-7]
Frmula y masa molecular C6H12O 100,16
Frmula y masa molecular C15H30O2 242,40
Descripcin Lquido incoloro e inflamable.
Especificacin Contiene, como mnimo, 98,0% (p/v).
Caractersticas fsicas Temperatura de ebullicin: cerca
Descripcin Lquido incoloro o levemente amarillento.
de 118 C. Densidad (20 C): cerca de 0,815. ndice de
Refraccin (20 C): cerca de 1,400.
Conservacin En recipientes cerrados.
Caractersticas fsicas Densidad: aproximadamente
0,868. ndice de refraccin (20 C): aproximadamente
14
1,437. Temperatura de fusin: aproximadamente 20 C.
Metoxiazobenceno Miscibilidad Miscible en etanol y ter de petrleo.
CAS [2396-60-3] Conservacin En recipientes bien cerrados.
Frmula y masa molecular C13H12N2O 212,3
Mezcla de negro de eriocromo T
Descripcin Lminas anaranjadas.
Preparacin Mezclar 0,2 partes de negro de eriocromo T
Solubilidad Prcticamente insoluble en agua, soluble en con 100 partes de cloruro de sodio.
etanol, en ter de petrleo y otros solventes orgnicos. Cro-
matografa en camada delgada Aplicar, en placa de gel Conservacin En recipientes bien cerrados.
de slice G, solucin de 5 mg de metoxiazobenceno en ben- Categora Indicador para calcio y magnesio.
ceno y desarrollar cromatograma con el mismo solvente.
Aparece una nica mancha con Rf en torno de 0,6. Mezcla reductora
14
solucin, un precipitado amarillo abundante no se forma Caractersticas fsicas Temperatura de fusin: cerca de
inmediatamente o despus de leve calentamiento. Si hu- 80 C. Banda de ebullicin: entre 217 C y 219 C.
biese formacin de precipitado durante el almacenamiento, Solubilidad Prcticamente insoluble en agua, soluble en
emplear solamente la solucin sobrenadante lmpida. etanol y fcilmente soluble en benceno y cloroformo.
Almacenamiento Proteger de la luz. Conservacin Recipiente bien cerrados.
Molibdato de amonio, solucin cida 1,3-Naftalendiol
Preparacin Diluir 25 ml de molibdato de amonio a 7% CAS [132-86-5]
(p/v) para 200 ml con agua. Aadir, lentamente, 25 ml de
Frmula y masa molecular C10H8O2 160,17
cido sulfrico 3,75 M y homogeneizar.
Descripcin Polvo cristalino, generalmente, violeta-
Molibdato de amonio a 1% (p/v) en cido sulfrico M amarronado.
Preparacin Pesar 1 g de molibdato de amonio R y di- Caracterstica fsica Temperatura de fusin: cerca de 125
solver con 50 ml de solucin de cido sulfrico M. Diluir a C.
100 ml con el mismo solvente.
Solubilidad Fcilmente soluble en agua y en etanol.
Molibdato de sodio
2,7-Naftalendiol
CAS [10102-40-6]
CAS [582-17-2]
Frmula y masa molecular Na2MoO4.2H2O 241,95
Frmula y masa molecular C10H8O2 160,17
Descripcin Cristales incoloros o polvo cristalino blanco
Descripcin Polvo o slido cristalino amarillo a casi
o casi blanco.
blanco.
Solubilidad Fcilmente soluble en agua.
Caractersticas fsicas Banda de fusin: 187 C y 191 C.
Molibdovanadato SR Solubilidad Soluble en agua y en etanol.
Sinonimia Reactivo molibdatovanadato, reactivo molib-
Naftalendiol, reactivo
dovanadato.
Preparacin Disolver 20 mg de 1,3-Naftalendiol en 10
Preparacin Usando sustancias finamente pulverizadas,
ml de etanol conteniendo 0,2 ml de cido sulfrico.
preparar suspensin de 4 g de molibdato de amonio y 0,1 g
de vanadato de amonio en 70 ml de agua. Juntar 20 ml de
1-Naftilamina
cido ntrico. Completar el volumen de 100 ml con agua.
CAS [134-32-7]
Conservacin En recipientes bien cerrados.
Sinonimia -Naftilamina.
Almacenamiento Proteger de la luz.
Frmula y masa molecular C10H9N 143,12
Morfolina Descripcin Cristales incoloros o polvo cristalino blan-
CAS [110-91-8] co. Por la exposicin al aire y a la luz, se torna rojizo. Olor
desagradable.
Sinonimia Tetraidro-2H-1,4-oxazina; dietileno oximida
Frmula y masa molecular C4H9NO 87,12 Caracterstica fsica Banda de fusin: 49 C a 51 C.
Descripcin Lquido incoloro. Higroscpico. Solubilidad Poco soluble en agua y fcilmente soluble
en etanol.
Caracterstica fsica Temperatura de ebullicin: en torno
de 128 C. Conservacin En recipientes bien cerrados.
Miscibilidad Miscible en agua y en etanol. Almacenamiento Proteger de la luz y del aire.
Conservacin En recipientes hermticos. Seguridad Vapor y polvo nocivos.
1-Naftol Naringina
CAS [90-15-3] CAS [10236-47-2]
Sinonimia Alfanaftol, -naftol. Frmula y masa molecular C27H32O14 580,54
Frmula y masa molecular C10H8O 144,17 Descripcin Polvo cristalino blanco o casi blanco.
Descripcin Cristales incoloros, o blancos o casi blan- Caracterstica fsica Temperatura de fusin: cerca de 171
cos; o polvo cristalino blanco o casi blanco. Oscurece con C.
la exposicin a la luz.
Solubilidad Poco soluble en agua, soluble en metanol y
Caracterstica fsica Temperatura de fusin: cerca de 95 en dimetilformamida.
C.
Solubilidad Poco soluble en agua y fcilmente soluble
en etanol.
Negro de almidn 10B
CAS [1064-48-8]
14
Conservacin En recipientes cerrados. Frmula y masa molecular C22H14N6Na2O9S2 616,50
2-Naftol Ninhidrina
Frmula y masa molecular C10H8O 144,17 Frmula y masa molecular C9H4O3.H2O 178,14
Descripcin Polvo cristalino blanco a levemente rosa, de Especificacin Contiene, como mnimo, 96,0% (p/p).
olor fenlico suave. Descripcin Polvo cristalino blanco a amarillo levemen-
Caracterstica fsica Temperatura de fusin: aproxima- te plido.
damente 122 C Solubilidad Soluble en agua y en etanol.
Solubilidad Muy poco soluble en agua y muy soluble en Conservacin En recipientes bien cerrados.
etanol.
Almacenamiento Proteger de la luz.
Conservacin En recipientes bien cerrados.
Almacenamiento Proteger de la luz. Ninhidrina etanlica actica SR
Preparacin Disolver 1 g de ninhidrina en 50 ml de eta-
2-Naftol SR nol y aadir 10 ml de cido actico glacial.
Sinonimia Betanaftol SR, -naftol SR.
Ninhidrina SR
Especificacin Contiene 1 g en 100 ml de hidrxido de
sodio a 1% (p/v). Sinonimia Ninhidrina SR.
Conservacin En recipientes bien cerrados. Estabilidad Especificacin Contiene 0,2% (p/v) en mezcla de 1-buta-
Preparar para uso inmediato. nol y cido actico 2 M (95:5).
Solubilidad Muy soluble en agua y etanol, muy poco so- Solubilidad Fcilmente soluble en agua.
luble en acetona. Conservacin En recipientes bien cerrados.
Conservacin En recipientes hermticamente cerrados Seguridad Veneno!
Nitrato de amonio
14
Nitrato de cobalto (II)
CAS [6484-52-2] CAS [10026-22-9]
Frmula y masa molecular NH4NO3- 80,04 Sinonimia Nitrato cobaltoso.
Descripcin Cristales incoloros, delicuescentes, o polvo Frmula y masa molecular CoN2O6.6H2O 291,03
blanco, de sabor salado.
Especificacin Contiene, como mnimo, 99,0% (p/p).
Caractersticas fsicas Temperatura de fusin:
Descripcin Cristales pequeos, rojos, higroscpicos.
aproximadamente 155 C, se descompone alrededor de
210 C en agua y xidos de nitrgeno. Caracterstica fsica Temperatura de fusin: aproxima-
damente 55C.
Solubilidad Muy soluble en agua, fcilmente soluble en
metanol y soluble en etanol. Solubilidad Soluble en agua.
Solubilidad Prcticamente insoluble en agua, y poco so- CAS [98-95-3] Sinonimia Nitrobenzol.
luble en etanol. Frmula y masa molecular C6H5NO2 123,11
Conservacin En recipientes cerrados. Descripcin Lquido incoloro a amarillo plido, de olor
semejante al de aceite de almendra.
Almacenamiento Proteger de la exposicin a la luz.
Caractersticas fsicas Temperatura de ebullicin: apro-
Nitrito de sodio ximadamente 211C. Densidad: aproximadamente 1,20.
CAS [7632-00-0] Miscibilidad Prcticamente insoluble en agua y miscible
Frmula y masa molecular NaNO2 69,00 en etanol.
Especificacin Contiene, como mnimo, 97,0% (p/p). Conservacin En recipientes bien cerrados.
Descripcin Cristales incoloros, o polvo granulado blan- Seguridad Veneno!
co, o levemente amarillento. Higroscpico.
Nitrometano
Caractersticas fsicas Temperatura de fusin: 271C. Se
descompone arriba de 320 C. CAS [75-52-5]
Frmula y masa molecular CH3NO2 61,04
Solubilidad Fcilmente soluble en agua.
Descripcin Lquido oleoso incoloro, de olor caracters-
Conservacin En recipientes bien cerrados. Estabilidad
tico.
Se oxida al aire muy lentamente a nitrato.
Caracterstica fsica Temperatura de ebullicin: en torno
Nitrito de Sodio SR de 102 C.
Especificacin Contiene 10 g de nitrito de sodio en agua Miscibilidad Poco miscible en agua y miscible en etanol.
para 100 ml.
Nitroprusiato de sodio
Conservacin Preparar para consumo inmediato.
CAS [13755-38-9\
p-Nitroanilina Sinonimia Pentacianonitrosilferrato (III) disdico dihi-
CAS [100-01-6] dratado, nitroprusiato de sodio, nitroferrocianuro de sodio.
Frmula y masa molecular C6H6N2O2- 138,12
14
0,25 g de piperazina en 5 ml de agua.
CAS [6487-48-5]
Conservacin En recipientes bien cerrados.
Frmula y masa molecular K2C2O4.H2O 184,23, se an-
1-Octanosulfonato de sodio hidro 166,22
Especificacin Contiene, como mnimo, 99,5% (p/p). Seguridad Altamente irritante a la piel, ojos y mucosas.
Descripcin Polvo fino amarillo a amarillo anaranjado.
Peryodato frrico de potasio SR
Caracterstica fsica Temperatura de fusin: 690 C.
Preparacin Disolver 1 g de peryodato de potasio en 5
Solubilidad Poco soluble en agua y soluble en cidos mi- ml de solucin de hidrxido de potasio 12% (p/v), reciente-
nerales fuertes y soluciones hidrxido-alcalinas con forma- mente preparada. Aadir 20 ml de agua y 1,5 ml de cloruro
cin de sales. frrico SR. Diluir a 50 ml con solucin de hidrxido de
potasio 12% (p/v) recientemente preparada.
Conservacin En recipientes bien cerrados.
Peryodato de sodio
Pepsina purificada
Especificacin Derivada de la mucosa estomacal del
puerco, con actividad de 800 a 2500 unidades/mg de pro-
CAS [7790-28-5]
Sinonimia Metaperyodato de sodio. 14
tena. Frmula y masa molecular NaIO4 213,89
Descripcin Polvo cristalino o amorfo, blanco o poco Especificacin Contiene, como mnimo, 99,0% de per-
amarillo. Higroscopio. yodato de sodio.
Solubilidad Soluble en agua, prcticamente insoluble en Descripcin Cristales blancos tetragonales.
etanol. La solucin en agua puede quedar un poco opales-
cente con una pequea cantidad de cido. Caracterstica fsica Temperatura de fusin:
Almacenamiento Protegido de la luz y en temperatura de Solubilidad Soluble en agua, cido actico, cido
2 C a 8C. ntrico y cido sulfrico.
Etiquetado Debe expresar la actividad de la pepsina. Conservacin En recipientes bien cerrados.
14
Perxido de hidrgeno concentrado
CAS [7722-84-1] Persulfato de amonio
Sinonimia perhidrol.
CAS [7727-54-0]
Frmula y masa molecular H2O2 34,01 Sinonimia -Peroxidisulfato de amonio. Frmula y masa
Especificacin Contiene, como mnimo, 29,0% (p/p) de molecular H8N2O8S2 228,10
H2O2. Corresponde a aproximadamente 100 partes en vo- Especificacin Contiene, como mnimo, 95,0% (p/p).
lumen. Puede contener estabilizante.
Descripcin Cristales o polvo granulado blanco. Inodo-
Descripcin Lquido incoloro, irritante, de suave olor. ro. Estable durante meses cuando puro y seco; se descom-
Caracterstica fsica Densidad: 1,11. pone en presencia de humedad.
Preparacin En el da del uso, diluir 2 ml de perxido de Preparacin Mezclar 20 ml de cido pcrico a 1% (p/v)
hidrgeno concentrado para 100 ml con metanol y almace- con 10 ml de hidrxido de sodio a 5% (p/v) y diluir para
nar en refrigerador. Inmediatamente antes del uso, diluir 2 100 ml con agua.
ml de esta solucin para 100 ml con metanol. Estabilidad Utilizar dentro de, como mximo, dos das.
Piperazina Poliacrilamida
CAS [110-85-0] CAS [9003-05-8]
Frmula y masa molecular C3H10N2 86,14 Sinonimia Polmero de acrilamida.
Descripcin Grumos o copos blancos o casi blancos. Frmula y masa molecular (C3H5NO)n; monmero
Olor amoniacal. 71,08.
Solubilidad Soluble en agua y en etanol, insoluble en ter Especificacin Polmero de varias formas, solubles e in-
etlico. solubles en agua, obtenidos por el calentamiento con va-
rios catalizadores de polimerizacin.
Piridina
Conservacin En recipientes bien cerrados.
CAS [110-86-1]
Frmula y masa molecular C5H5N 79,10
Seguridad Altamente txico e irritante. Causa parlisis
del sistema nervioso central. Puede ser absorbido por la
14
Descripcin Lquido incoloro, de olor caracterstico y piel ntegra.
desagradable.
Polisorbato 20
Caractersticas fsicas Banda de ebullicin: 115 C a 116
Ver monografa Polisorbato 20.
C Densidad (25 C): aproximadamente 0,980. ndice de
refraccin (20 C): 1,5092. Polisorbato 80
Miscibilidad Miscible en agua y en etanol. Especificacin Mezcla de oleatos del sorbitol y sus an-
Conservacin En recipientes bien cerrados. hdridos copolimerizados con aproximadamente 20 M de
xido de etileno para cada mol de sorbitol anhidro y an-
Almacenamiento Proteger de la humedad. hdrido.
Seguridad Inflamable. Txico. Descripcin Lquido claro, amarillento o amarillo oscu-
ro. Oleoso. Suave olor caracterstico.
Piridina anhidra
Caractersticas fsicas Densidad: en torno de 1,08. Vis-
Especificacin Contiene, como mximo, 0,01% (p/p) de cosidad: aproximadamente 400 cP.
agua.
Conservacin En recipientes bien cerrados.
Preparacin Secar la piridina con carbonato de sodio an-
hidro. Filtrar y destilar. Categora Tensoactivo.
Conservacin En recipientes bien cerrados. Potasio SRA 600 g/ml
Almacenamiento Proteger de la humedad. Especificacin Contiene 1,144 g de cloruro de potasio en
Seguridad Inflamable. Txico. agua a 1000 ml.
Conservacin En recipientes bien cerrados, inertes (tipo
Pirofosfato de sodio polietileno).
CAS [13472-36-1]
Prednisolona
Frmula y masa molecular Na4P2O7.10H2O 265,90
Descripcin Cristales incoloros poco eflorescentes. CAS [50-24-8]
Frmula y masa molecular C21H28O5 360,45
Caracterstica fsica Temperatura de fusin: 79,5 C.
Especificacin Contiene, como mnimo, 97,0% (p/p),
Solubilidad Fcilmente soluble en agua. calculado sobre la sustancia desecada.
Conservacin En recipientes bien cerrados. Descripcin Polvo cristalino blanco o casi blanco. Hi-
groscpico. Presentado en la forma anhidra o conteniendo
Pirogalol una o media molcula de agua de hidratacin.
CAS [87-66-1] Caracterstica fsica Temperatura de fusin: 240-241 C,
Frmula y masa molecular C6H6O3 126,11 con descomposicin.
Descripcin Cristales blancos o casi blancos. Tornndose Solubilidad Muy poco soluble en agua, soluble en etanol
marrn en exposicin al aire y a la luz. y en metanol, ligeramente soluble en acetona y poco solu-
Caracterstica fsica Temperatura de fusin: cerca de 131 ble en cloruro de metileno.
C. Conservacin En recipientes bien cerrados.
Solubilidad Muy soluble en agua y en etanol. Soluciones Categora Corticoide.
acuosas se tornan marrones en exposicin al aire.
Conservacin En recipientes cerrados. Prednisona
Frmula y masa molecular C21H26O5 358,43. Solubilidad Prcticamente insoluble en agua y soluble
en etanol. En la forma de sal sdica es soluble en agua y
Especificacin Contiene, como mnimo, 97,0% (p/p),
prcticamente insoluble en etanol.
C21H26O5, calculado sobre la sustancia desecada.
Ensayo de sensibilidad Disolver 10 mg en 1 ml de so-
Descripcin Polvo cristalino blanco o casi blanco.
lucin concentrada de amonaco y diluir para 100 ml con
Caracterstica fsica Temperatura de fusin: aproxima- agua. A 5 ml de la solucin, aadir 95 ml de agua, 4 ml
damente 233C, con descomposicin. de solucin concentrada de amonaco, 50 ml de etanol y
0,1 ml de cloruro de bario 0,1 M SV. La solucin presenta
Solubilidad Prcticamente insoluble en agua y poco solu-
coloracin azul violeta. Aadir 0,15 ml de edetato disdico
ble en etanol y en cloruro de metileno.
0,1 M SV. La solucin quedar incolora.
14
Conservacin En recipientes bien cerrados.
Quinalizarina (CI 58500)
Categora Corticoide.
CAS [81-61-8]
Negro brillante BN ordenar por alfabeto Sinonimia Mordiente violeta 26
CAS [2519-30-4] Frmula y masa molecular C14H8O6 272,20.
Frmula y masa molecular C28H17N5Na4O14 S4 867,69
Descripcin Polvo rojo oscuro.
Descripcin Cristales finos, polvo azul violceo o negro
Conservacin En recipientes bien cerrados.
grisceo. Indicador de xido-reduccin. Forma oxidada:
azul violcea. Forma reducida: amarillo-marrn.
Quinidina
Caracterstica fsica A (1%, 1 cm) es mayor que 0,390
CAS [56-54-2]
en 570 nm.
Frmula y masa molecular C20H24N2O2 324,42
Conservacin En recipientes bien cerrados.
Descripcin Cristales blancos, o casi blancos.
Propilenglicol Caractersticas fsicas Poder rotatorio especfico (20 C):
CAS [57-55-6] cerca de +260, determinado y una solucin a 1% (p/v) en
etanol. Temperatura de fusin: cerca de 172 C.
Sinonimia 1,2-Propanodiol.
Solubilidad Muy poco soluble en agua, ligeramente solu-
Frmula y masa molecular C3H8O2- 76,09
ble en etanol y poco soluble en metanol.
Descripcin Lquido incoloro, viscoso, higroscpico.
Conservacin En recipientes cerrados.
Caractersticas fsicas Densidad (25 C): 1,035 a 1,037.
Almacenamiento Proteger de la exposicin a la luz
Banda de ebullicin: 187 C a 189 C.
Quinhidrona
Miscibilidad Miscible en agua y en etanol.
CAS [106-34-3]
Conservacin En recipientes bien cerrados.
Frmula y masa molecular C12H10O4 218,21
Almacenamiento Proteger de la humedad.
Descripcin Cristales lustrosos o polvo cristalino verde
Propilparabeno oscuro.
CAS [94-13-3] Caracterstica fsica Temperatura de fusin: 170 C, pue-
Nombre qumico ster proplico del cido 4-hidroxiben- de sublimar y descomponerse parcialmente.
zoico Solubilidad Poco soluble en agua fra, soluble en
Frmula y masa molecular C10H12O3 180,20 agua caliente, amonaco y ter etlico.
Descripcin Cristales blancos. Conservacin En recipientes cerrados.
Solubilidad Muy poco solubles en agua, fcilmente solu-
Quinina
ble en etanol y en ter etlico.
CAS [130-95-0]
Categora Conservante.
Frmula y masa molecular C20H24N2O2 324,42
Prpura de ftalena Descripcin Polvo microcristalino blanco, o casi blanco.
CAS [2411-89-4] Caractersticas fsicas Poder rotatorio especfico (20 C):
Sinonimia Metalftalena. cerca de -167, determinado y una solucin a 1% (p/v) en
Frmula y masa molecular C32H32N2O12 636,61 etanol. Temperatura de fusin: cerca de 175 C.
Descripcin Polvo amarillo claro a marrn. Puede ser Solubilidad Muy poco soluble en agua, poco soluble en
encontrado en la forma de sal sdica: polvo amarillo claro agua hirviendo y muy soluble en etanol.
a rosa. Conservacin En recipientes bien cerrados.
14
Caracterstica fsica Banda de fusin: 109 C a 111 C.
Sacarosa 0,1% (p/v) en piridina
Solubilidad Soluble en agua y etanol.
Especificacin Contiene 0,1 g de sacarosa en piridina a
Conservacin En recipientes bien cerrados. 100 ml.
Almacenamiento Proteger de la luz y del aire. Conservacin En recipientes bien cerrados.
Ristocetina Seguridad Txico.
CAS [1404-55-3] Safranina O
Sinonimia Ristocetina A.
CAS [477-73-6]
Frmula y masa molecular C94H108N8O44 2053,89 Descripcin Polvo rojo oscuro. Consiste de mezcla de
Descripcin Slido blanco. Encontrado, tambin, como cloruro de 3,7-diamino-2,8-dimetil-5-fenilfenaznio (C20H-
ristocetina sulfatada. 19
ClN4 350,85) y cloruro de 3,7-diamino-2,8- dime-
til-5,o-tolilfenaznio (C21H21ClN4 364,88). Indicador de
Rodamina B xido-reduccin. Forma oxidada: pH cido, violeta azula-
do; pH alcalino, parda Forma reducida: incoloro tanto en la
CAS [81-88-9] acidez cuanto en la alcalinidad.
Sinonimia Tetraetilrodamina, Violeta bsico 10. Frmula
y masa molecular C28H31ClN2O3 479,01 Caracterstica fsica Absorcin mxima: 530-533 nm.
Solubilidad Soluble en agua, y bajo agitacin, forma es- Gel de slice HF254
puma.
Sinonimia Gel de slice HF254.
Conservacin En recipientes cerrados.
Especificacin Contiene aproximadamente 1,5% (p/v) de
indicador de fluorescencia de intensidad mxima a 254 nm.
Slice, seca
Descripcin Polvo fino blanco de granulometra variable
CAS [7631-86-9]
entre 10 y 40 m, homogneo.
Frmula y masa molecular SiO2 60,08
Caracterstica fsica Ver gel de slice G.
Especificacin cido silcico coloidal, polimerizado,
previamente deshidratado; contiene cloruro de cobalto Conservacin En recipientes bien cerrados.
como indicador.
Descripcin Grnulos vtreos, amorfos, de granulometra
variable, con grnulos impregnados con indicador de capa-
Categora Soporte para cromatografa.
Slice kieselguhr
14
cidad de adsorcin por el color azul a rosa. Descripcin Polvo blanco o amarillo claro.
Conservacin En recipientes hermticos. Solubilidad Prcticamente insoluble en agua, soluciones
Almacenamiento Proteger de la humedad. cidas diluidas y solventes orgnicos.
2 M y completar el volumen para 1000 ml con el mismo agite durante 2 horas. Filtre a presin reducida y suspenda
solvente. el residuo obtenido en 5 ml a 10 ml de solucin de cloruro
de sodio a 0,9% (p/v). Determinacin de la actividad del
Solucin estndar de sodio (200 ppm En la) Factor IX Prepare una diluicin en solucin de cloruro de
sodio a 0,9% (p/v), tal que la diferencia entre los tiempos
Preparacin Disolver 0,509 g de cloruro de sodio en 100
de coagulacin de las diluiciones sucesivas de la prepara-
ml de agua. En el momento del uso, diluir 1:10.
cin de referencia sea cerca de 10 segundos.
Solucin estndar de sulfato (10 ppm SO4) Conservacin Las suspensiones diluidas pueden ser usa-
Preparacin Disolver 0,182 g de sulfato de potasio en das durante las 6 semanas que siguen a la preparacin, si
100 ml de agua. Diluir 1 ml de esta solucin en 100 ml de conservadas a -30 C.
agua en el momento del uso.
Preparacin Hacer una solucin compuesta por 30 ml de Preparacin Utilizar equipo hidrfobo fabricado en ma-
Solucin base de cloruro frrico (5.2.12), 30 ml de Solu- terial plstico apropiado o vidrio siliconado para recolec-
cin base de cloruro cobaltoso (5.2.12), 24 ml de Solucin cin y manipulacin de la sangre. De un nmero adecuado
base de sulfato cprico (5.2.12) y 16 ml de cido clorhdri- (cinco por lo menos) de corderos, vivos o en el momento
co a 1% (p/v). del sacrificio, recolecte un volumen de sangre apropiado
de cada uno (es considerado como apropiado un volumen
Solucin reductora de 285 ml de sangre recolectada sobre 15 ml de solucin
anticoagulante). La recoleccin est hecha por medio de
Preparacin Disolver 5 g de tetrahidroborato de sodio en una aguja adaptada a una cnula con un largo suficiente
500 ml de hidrxido de sodio a 1% (p/v). para alcanzar el fondo del recipiente colector. Descarte los
primeros mililitros y recolecte, nicamente, la sangre que
Subnitrato de bismuto drena libremente. Mezcle la sangre con una cantidad su-
CAS [1304-85-4] ficiente de solucin anticoagulante conteniendo 8,7 g de
Sinonimia Oxinitrato de bismuto. citrato de sodio y 4 mg de aprotinina en 100 ml de agua
para obtener una proporcin final de 19 volmenes de san-
Frmula y masa molecular Bi5O(OH)9(NO3)4 1461,99. gre para 1 volumen de solucin anticoagulante. Durante
Especificacin Es sal bsico que contiene, en el mni- e inmediatamente despus de la recoleccin dele al reci-
mo, el equivalente a 79,0% de trixido de bismuto (Bi2O3) piente un movimiento rotatorio a fin de que la mezcla se
(p/p). haga sin formacin de espuma. Luego que termine la reco-
leccin cierre el baln y deje enfriar a 10-15 C. Despus
Descripcin Polvo blanco, denso, higroscpico, inodoro del enfriamiento rena el contenido de todos los frascos, a
y sin gusto. Presenta reaccin alcalina frente al papel de excepcin de aquellos que presenten seales de evidente
tornasol. hemlisis o coagulacin, y mantenga la sangre recolecta-
Solubilidad Prcticamente insoluble en agua. da a 10-15 C. Lo ms temprano posible y dentro de las
4 horas siguientes a la recoleccin, centrifugue la sangre
Conservacin En recipientes bien cerrados. recolectada a 1000-2000 g a 10-15 C, durante 30 minutos.
Almacenamiento Proteger de la luz. Separe el lquido sobrenadante y centrifguelo a 5000 g,
durante 30 minutos. Si necesario, haga una centrifugacin
Categora Anticido. ms rpida, por ejemplo, a 20 000 g, durante 30 minutos,
para clarificar el plasma (no utilice procesos de filtracin).
Sustituto de plaquetas Separe los lquidos sobrenadantes e, inmediatamente, mez-
Preparacin A una cantidad entre 0,5 g y 1 g de fosfol- cle, cuidadosamente, y distribuya el sustrato de plasma por
pidos, aadir 20 ml de acetona, y agite la mezcla, frecuen- pequeos recipientes, que son cerrados al fin de la ope-
temente, durante 2 horas. Centrifugue durante 2 minutos y racin, en cantidades suficientes que permitan una titula-
elimine el lquido sobrenadante. Seque el residuo con auxi- cin completa de la heparina (por ejemplo, 10 ml a 30 ml).
lio de una trompa de agua, adicione 20 ml de cloroformo y Inmediatamente congele, rpidamente, a una temperatura
Preparacin Disolver 0,5 g de Sudn III en 100 ml de Conservacin Proteger de la luz, calor y humedad.
etanol a 80% (v/v), calentado a 60 C, enfriar y filtrar. Seguridad Txico y oxidante.
Caractersticas fsicas Banda de fusin: 181 C a 188 C. Descripcin Cristales amarillo anaranjados.
Se descompone completamente a 260 C. Caracterstica fsica Temperatura de fusin: en torno de
Solubilidad Prcticamente insoluble en agua. Poco so- 130 C.
luble en acetona, etanol y benceno. Soluble en parafina y Solubilidad Soluble en agua.
fenol
Conservacin En recipientes bien cerrados.
Conservacin En recipientes bien cerrados.
Categora Estndar para volumetra de oxireduccin.
14
Caracterstica fsica Calentado a 250 C hasta peso cons-
orgnicos, muy poco soluble en cidos y en soluciones hi-
tante, pierde entre 33,0 a 36,5% de su peso.
drxido-alcalinas.
Solubilidad Muy soluble en agua y poco soluble en eta-
Conservacin En recipientes bien cerrados.
nol.
Categora Contraste radiolgico para el trato gastroin-
Conservacin En recipientes bien cerrados.
testinal.
Almacenamiento Proteger del aire.
Sulfato de cadmio
Seguridad Irritante.
CAS [7790-84-3]
Sulfato cprico SR Frmula y masa molecular 3CdSO4.8H2O 769,49
Especificacin Contiene 12,5 g sulfato cprico pentahi- Especificacin Contiene, como mnimo, 99,0% (p/p).
dratado en agua a 100 ml.
Descripcin Polvo cristalino, incoloro e inodoro.
Conservacin En recipientes bien cerrados.
Conservacin En recipientes bien cerrados.
Sulfato cprico amoniacal SR
Sulfato de calcio, hemihidratado
Sinonimia Sulfato de cobre amoniacal SR y reactivo de
Schweitzer. CAS [10034-76-1]
Frmula y masa molecular CaSO4.1/2H2O 145,14
Preparacin Disolver 10 g de sulfato cprico en 100 ml
de agua, aadir cantidad suficiente de solucin de hidrxi- Especificacin Contiene, como mnimo, 98,0 % (p/p),
do de sodio (1:5) para precipitar el hidrxido de cobre. Fil- calculado sobre base seca.
trar y recolectar el precipitado. Lavar con agua fra. Disol-
Descripcin Polvo blanco, fino; contiene aproximada-
ver el precipitado, que debe ser mantenido hmedo durante
mente 7,0% de agua.
el proceso, en la menor cantidad de amonaco SR necesaria
para completar la solucin. Solubilidad Muy poco soluble en agua, prcticamente in-
soluble en etanol. Cuando mezclado con mitad de su masa
Sulfato de aluminio y potasio, dodecahidratado en agua, es rpidamente solidificado en una masa porosa
y dura.
CAS [7784-24-9]
Sinonimia Alumen de potasio Conservacin En recipientes bien cerrados.
14
Miscibilidad Miscible en agua (con hidrlisis) y en ter Conservacin En recipientes bien cerrados.
etlico y acetona.
Almacenamiento Proteger de la luz.
Conservacin En recipientes cerrados.
Sulfato de 4-metilaminofenol SR
Seguridad Corrosivo! Venenoso!
Preparacin Disolver 0,35 g de sulfato de 4-metilamin-
Sulfato de hidracina ofenol en 50 ml de agua. Aadir 20 g de bisulfito de sodio
y mezclar. Diluir para 100 ml con agua.
CAS [10034-93-2]
Frmula y masa molecular H6N2O4S 130,12 Sulfato de potasio
Descripcin Cristales incoloros. CAS [7778-80-5]
Solubilidad Ligeramente soluble en agua fra, soluble en Frmula y masa molecular K2SO4 174,25
agua caliente (50 C) y fcilmente soluble en agua hirvien-
Especificacin Contiene, como mnimo, 99,0% (p/p),
do. Prcticamente insoluble en etanol.
calculado sobre la sustancia desecada.
Sulfato de litio Descripcin Cristales incoloros o polvo cristalino blan-
co, de sabor amargo.
CAS [10102-25-7]
Frmula y masa molecular LiSO4.H2O 127,95 Caractersticas fsicas Solucin acuosa con carcter neu-
tro. Temperatura de fusin: 1067 C.
Descripcin Cristales incoloros.
Conservacin En recipientes cerrados.
Solubilidad Fcilmente soluble en agua y prcticamente
insoluble en etanol. Sulfato de protamina
Especificacin Obtenido de cascaras de diversas plantas, Frmula y masa molecular C4H4O6Na2.2H2O 230,08
consistiendo, especialmente, de mezcla de sustancias poli-
Especificacin Contiene 84,34% de C4H4O6Na2 y 15,66%
fenlicas.
de H2O. Calentado a 150 C, pierde, como mnimo, 15,6%
Descripcin Polvo amarillo a marrn. Olor levemente y, como mximo, 15,7% de su peso.
caracterstico y sabor astringente.
Descripcin Cristales blancos o casi blancos.
Solubilidad Muy soluble en agua, fcilmente soluble en
Solubilidad Muy soluble en agua y prcticamente soluble
etanol y soluble en acetona.
en etanol.
Conservacin En recipientes bien cerrados.
Conservacin En recipientes bien cerrados.
Almacenamiento Proteger de la luz.
Tartrato de sodio y potasio
Etiquetado La etiqueta debe indicar la fuente botnica.
CAS [6381-59-5]
Tartrato cido de epinefrina Sinonimia Sal de Rochelle o de Seignette, tartrato doble
CAS [51-42-3] de potasio y sodio, trtaro emtico.
Sinonimia Bitartrato de epinefrina. Frmula y masa molecular C4H4KNaO6.4H2O 282,22;
Frmula y masa molecular C13H19NO9 333,29
Especificacin Contiene, como mnimo, 97,0% (p/p),
anhidro 210,16
Especificacin Contienen, como mnimo, 99,0% (p/p), A
calculado en base seca de C4H4KNaO6.
calculado sobre la sustancia desecada.
Descripcin Cristales incoloros o polvo cristalino blan-
Descripcin Cristales, o polvo cristalino blanco, o gris
co, inodoro, de sabor salado. Eflorescente al aire caliente.
claro. Inodoro.
Solubilidad Muy soluble en agua y prcticamente inso-
Caracterstica fsica Temperatura de fusin: aproxima-
luble en etanol.
damente 150 C, con descomposicin.
Conservacin En recipientes hermticos.
Solubilidad Fcilmente soluble en agua y poco soluble
en etanol. Almacenamiento Proteger del calor.
Conservacin En recipientes hermticos.
Tartrato de sodio y potasio SR
Almacenamiento Proteger del aire y de la luz. Estabilidad
Especificacin Contiene 20% (p/v).
Oscurece lentamente por la exposicin al aire y a la luz.
Conservacin En recipientes bien cerrados.
Categora Adrenrgico.
Tartrato ferroso SR
Tartrato cprico alcalino SR
Preparacin Disolver 1 g de sulfato ferroso heptahidra-
Sinonimia Solucin de Fehling
tado, 2 g de tartrato de sodio y potasio y 0,1 g de bisulfito
Solucin A Disolver 34,6 g de sulfato cprico pentahidra- de sodio en agua. Completar el volumen para 100 ml con
tado en 500 ml de agua. agua. Preparar en el momento del uso.
Solucin B Disolver 173 g de tartrato de sodio y potasio
Tetraborato sdico
y 50 g de hidrxido de sodio en 400 ml de agua y calentar
hasta ebullicin. Enfriar y completar el volumen para 500 CAS [1303-96-4]
ml con agua exenta de dixido de carbono. Preparacin Sinonimia Borato sdico, borato de sodio, brax. Frmu-
Mezclar volmenes iguales de las Soluciones A y B inme- la y masa molecular Na2B4O7.10H2O 381,37
diatamente antes del uso.
Especificacin Contiene, como mnimo, 99,0% (p/p).
Tartrato de antimonio y potasio Descripcin Cristales incoloros o polvo cristalino blan-
CAS [28300-74-5] co, inodoro, de sabor custico. Eflorescente.
Sinonimia Sal de antimonio y potasio. Solubilidad Soluble en agua, muy soluble en agua hir-
viendo y fcilmente soluble en glicerol.
Frmula y masa molecular C8H4K2O12Sb2.3H2O 667,85.
Conservacin En recipientes bien cerrados; efloresce al
Descripcin Cristales incoloros o polvo blanco.
aire seco.
Caracterstica fsica Banda de fusin: 332 C a 335 C.
Almacenamiento Proteger del aire.
Conservacin Recipientes bien cerrados.
Tetracloruro de carbono
Seguridad Txico.
CAS [56-23-5]
Tartrato de sodio Frmula y masa molecular CCl4 153,82
CAS [6106-24-7] Especificacin Contiene, como mnimo, 99,0% (p/p).
A CAS [629-59-4]
Frmula y masa molecular C14H30 198,39
Descripcin Lquido incoloro. Olor intenso y semejante
al del ter etlico.
Especificacin Contiene, como mnimo, 99,5% (p/p). Caractersticas fsicas Temperatura de ebullicin: 65 C
a 66 C. Densidad: aproximadamente 0,889. ndice de re-
Descripcin Lquido lmpido e incoloro.
fraccin (20 C): 1,4070.
Caractersticas fsicas Densidad (20 C): cerca de 0,76.
Miscibilidad Miscible en agua y en etanol.
ndice de refraccin (20 C): cerca de 1,429. Temperatura
de fusin: cerca de -5 C. Temperatura de ebullicin: cerca Conservacin En recipientes bien cerrados: pequeos y
de 252 C. repletos.
Conservacin En recipientes cerrados. Almacenamiento Proteger del contacto con la luz.
Seguridad Irritante a la piel, ojos y mucosas.
Tetrafenilborato de sodio
CAS [143-66-8] 1,1,3,3-Tetrametilbutilamina
Frmula y masa molecular NaB(C6H5)4 342,22 CAS [107-45-9]
Descripcin Polvo o cristales blancos o casi blancos. Frmula y masa molecular C8H19N 129,24
Solubilidad Fcilmente soluble en agua y en acetona. Descripcin Lquido incoloro y lmpido.
Conservacin En recipientes bien cerrados. Caractersticas fsicas Densidad (20 C): cerca de 0,805.
ndice de refraccin (20 C): cerca de 1,424. Temperatura
Tetrahidroborato de sodio de ebullicin: cerca de 140 C.
CAS [16940-66-2]
Tetrametiletilendiamina
Frmula y masa molecular NaBH4 37,83
CAS [110-18-9]
Descripcin Cristales incoloros y higroscpicos.
Sinonimia N,N,N,N-Tetrametiletilendiamina, TEMED.
Solubilidad Fcilmente soluble en agua, soluble en eta-
Frmula y masa molecular C6H16N2. -116,21
nol absoluto.
Especificacin Calidad apropiada para electroforesis.
Almacenamiento En recipientes bien cerrados.
Descripcin Lquido incoloro.
3,3-Tetrahidrocloruro de diaminobenzidina
Caractersticas fsicas Densidad (20 C): aproximada-
CAS [7411-49-6] mente 1,418. Temperatura de ebullicin: aproximadamente
Frmula y masa molecular C12H18Cl4N4 360,12 121 C.
Descripcin Cristales blancos o amarillentos, ocasional- Miscibilidad Miscible con agua, con etanol y con ter
mente prpura. etlico.
Caracterstica fsica Temperatura de fusin: cerca de 280 Tetraoxalato de potasio
C, con descomposicin.
CAS [6100-20-5]
Solubilidad Soluble en agua.
Frmula y masa molecular C4H3KO8.2H2O 254,20
Conservacin En recipientes bien cerrados, bajo
Descripcin Polvo cristalino blanco o cristales incoloros
refrigeracin. o blancos.
Solubilidad Ligeramente soluble en agua y soluble en Caracterstica fsica Temperatura de fusin: en torno de
agua hirviendo, poco soluble en etanol. 50 C.
Conservacin En recipientes bien cerrados. Solubilidad Muy poco soluble en agua, muy soluble en
etanol, fcilmente soluble en aceites esenciales y en aceites
Tetrxido de osmio grasos, ligeramente soluble en glicerol. Disuelve en solu-
ciones hidrxido-alcalinas.
CAS [20816-12-0]
Frmula y masa molecular OsO4 254,20 Tioacetamida
Descripcin Masa cristalina amarilla, o agujas amarillas CAS [62-55-5]
claras, higroscpicas, sensibles a la luz.
Frmula y masa molecular C2H5NS -75,13.
Solubilidad Soluble en agua, etanol y ter etlico.
Descripcin Cristales o polvo cristalino blanco, o casi
Conservacin En recipientes hermticos. blanco. Suave olor de mercaptana.
Seguridad Vapores venenosos. Caracterstica fsica Temperatura de fusin: 113 C a
114 C.
Tetrxido de osmio SR
Solubilidad Fcilmente soluble en agua y en etanol.
Especificacin Contiene 0,25 g de tetrxido de osmio en
cido sulfrico 0,05 M para hacer 100 ml.
Conservacin En recipientes bien cerrados. A
Conservacin En recipientes bien cerrados. Tioacetamida SR
Preparacin Mezclar 0,2 ml de la solucin de tioaceta-
Timerosal
mida a 4% (p/v) y 1 ml de la siguiente mezcla: 1,5 ml de
CAS [54-64-8] hidrxido de sodio M, 0,5 ml de agua y 2 ml de glicerol a
Frmula y masa molecular C9H9HgNaO2S 404,81 85% (p/v). Calentar en bao mara durante 20 segundos
Estabilidad Preparar en el momento de uso.
Descripcin Polvo cristalino amarillo claro.
Solubilidad Muy soluble en agua y fcilmente soluble Tiocianato de amonio
en etanol. CAS [1762-95-4]
Timidina Sinonimia Sulfocianuro de amonio.
Descripcin Cristales incoloros, o polvo cristalino blan- Frmula y masa molecular C7H8 92,14
co, fcilmente eflorescentes, de sabor levemente amargo. Descripcin Lquido incoloro de olor caracterstico.
Caractersticas fsicas Temperatura de fusin: Caractersticas fsicas Temperatura de ebullicin:110 C
a 111 C. Densidad de aproximadamente 0,87. ndice de Caractersticas fsicas Densidad (20C): cerca de 1,46.
refraccin (20 C): 1,4967. ndice de refraccin (20 C): cerca de 1,477. Temperatura
de ebullicin: aproximadamente 87 C.
Miscibilidad Muy poco soluble en agua, miscible en eta-
nol. Miscibilidad Prcticamente insoluble en agua, soluble en
acetona y en metanol.
Seguridad Txico! Inflamable!
Conservacin En recipientes bien cerrados.
p-Toluidina
Seguridad Txico.
CAS [106-49-0]
Sinonimia 4-Metilanilina. Trietanolamina
A
ner bajo refrigeracin.
Trixido de cromo
Categora Preparacin con actividad enzimtica. He-
CAS [1333-82-0] mosttico local.
Sinonimia Anhdrido crmico.
Frmula y masa molecular CrO3 99,99 Tromboplastina, reactivo
Descripcin Cristales o polvo granulado o escamas ma- Preparacin Agitar 1,5 g de polvo de cerebro de buey,
rrones rojizas, delicuescentes. seco con acetona, con 60 ml de agua a 50 C, durante 10 a
15 minutos. Centrifugar a 1500 rpm, durante 2 minutos y
Caracterstica fsica Temperatura de fusin: aproxima- decantar el lquido sobrenadante.
damente 197 C.
Conservacin El extracto, almacenado en temperaturas
Solubilidad Muy soluble en agua. menores que 0 C, conserva la actividad durante varios
Conservacin En recipientes de vidrio hermticos. das. Puede ser adicionado cresol, en la cantidad de 3 g/L,
como antimicrobiano.
Almacenamiento Evitar proximidad con inflamables.
Seguridad Oxidante enrgico. Irritante. Trometamina
CAS [77-86-1]
Trombina bovina
Frmula y masa molecular C4H11NO3 121,14
CAS [9002-04-4]
Sinonimia -Trometamol, tris(hidroximetil)aminometano.
Especificacin Preparado biolgico obtenido de plasma
bovino, conteniendo enzima que convierte fibringeno en Especificacin Contiene, como mnimo, 99,0%, calcula-
fibrina. do sobre la sustancia desecada.
Tromboplastina Urea
CAS [9035-58-9] CAS [57-13-6]
A verde azulada.
Conservacin En recipientes bien cerrados.
cido perclrico 0,1 M SV
Especificacin Contiene 10 g de cido perclrico en ci-
do actico a 1000 ml.
Almacenamiento Proteger de la humedad.
Estandarizacin Disolver, bajo agitacin, 8,5 ml de cido
Seguridad Txico! perclrico en 200 a 300 ml de cido actico glacial. Aadir
20 ml de anhdrido actico, diluir la mezcla a 1000,0 ml
Zinc SRA 5 mg/ml con cido actico glacial y dejar en reposo por 24 horas.
Especificacin Contiene 2,5 g de zinc granulado en 20 Determinar el tenor de agua, que debe situarse entre 0,02%
ml de cido clorhdrico 5 M. Completar con agua a 500 ml. y 0,05%. Pesar exactamente cerca de 700 mg de biftalato
de potasio previamente pulverizado y desecado a 120 C
Conservacin En recipientes bien cerrados, inertes (tipo por 2 horas y disolverlo en 50 ml de cido actico glacial
polietileno). en frasco de matraz de 250 ml de capacidad. Aadir 2 gotas
de cloruro de metilrosanilina y titular con la solucin de
14.3 SOLUCIONES cido. perclrico hasta que coloracin violeta cambie para
verde esmeralda. Cada 20,422 mg de biftalato de potasio
VOLUMTRICAS equivale a 1 ml de cido perclrico 0,1 M.
Las soluciones volumtricas (SV) estn acompaadas de
mtodo de estandarizacin, a pesar de que puedan existir cido sulfrico M SV
otros que conduzcan al mismo grado de exactitud. Especificacin Contiene 98,07 g de cido sulfrico en
Los valores obtenidos en la estandarizacin son vlidos agua a 1000 ml.
para todos los usos farmacopeicos. Estandarizacin Aadir lentamente, bajo agitacin, 60
Los reactivos empleados deben poseer grado qumicamen- ml de cido sulfrico sobre 1020 ml de agua. Enfriar a tem-
te puro y, cuando necesario, ser sometidos a la desecacin. peratura ambiente. Determinar la molaridad por titulacin
Las soluciones volumtricas son estandarizadas y usadas con carbonato de sodio, conforme descrito para cido clor-
a temperaturas alrededor de 25 C. Frente a variaciones hdrico M, sin embargo pesando exactamente cerca de 3 g
significativas de temperatura, la solucin volumtrica debe de carbonato de sodio anhidro. Cada 105,98 mg de carbo-
tener ttulo confirmado en la misma temperatura o ser me- nato de sodio anhidro equivale a 1 ml de cido sulfrico M.
dida mediante factor de correccin.
Bromato de potasio 0,1 M SV
cido clorhdrico M SV
Especificacin Contiene 16,704 g de bromato de potasio
Especificacin Contiene 85 ml de cido clorhdrico en en agua a 1000 ml.
agua a 1000 ml.
Estandarizacin Medir exactamente volumen en torno
Estandarizacin Pesar exactamente cerca de 1,5 g de car- de 40 ml de la solucin de bromato de potasio a 1,67%
bonato de sodio anhidro. Juntar 100 ml de agua y dos gotas (p/v). Juntar 3 g de yoduro de potasio y 3 ml de cido clor-
de rojo de metilo SI. Aadir el cido lentamente, a partir hdrico SR. Aguardar 5 minutos y titular el yodo liberado
de bureta, hasta coloracin rosa suave. Calentar la solucin con tiosulfato de sodio 0,1 M SV, usando 3 ml de almidn
hasta ebullicin; enfriar y continuar la titulacin. Repetir SI como indicador. Preparar un blanco. Corregir y calcular
esta secuencia de operaciones hasta que el calentamiento la molaridad. Cada ml de bromato de potasio corresponde
no afecte la coloracin rosa. Calcular la molaridad. Cada a 6 ml de tiosulfato de sodio 0,1 M SV.
52,99 mg de carbonato de sodio anhidro equivale a 1 ml de
cido clorhdrico M. Conservacin Recipientes bien cerrados.
Conservacin En recipientes bien cerrados, inertes (tipo dixido de carbono y de la humedad. Consumir en 60 das.
polietileno). Determinar la molaridad en el da de uso, disolviendo cerca
de 400 mg de cido benzoico exactamente pesados, en 80
Seguridad Custico.
ml de dimetilformamida. Aadir a esta solucin tres gotas
de solucin de azul de timol a 1% (p/v) en dimetilformami-
Hidrxido de sodio M SV
da y titular con solucin de hidrxido de tetrabutilamonio
Preparacin Preparar solucin de hidrxido de sodio a hasta coloracin azul. Proteger la solucin del contacto con
50% (p/v) con agua exenta de dixido de carbono. Enfriar el aire durante la titulacin. Utilizar bureta provista de tubo
a temperatura ambiente y dejar sedimentar. Retirar 82 ml de absorcin de dixido de carbono. Efectuar ensayo en
del sobrenadante y diluir con agua a 1000 ml. Estandari- blanco. Cada ml de hidrxido de tetrabutilamonio equivale
zacin Pesar exactamente cerca de 5 g de biftalato de a 12,212 mg de cido benzoico.
potasio desecado y disolver en 75 ml de agua exenta
Carmn de ndigo SV
de dixido de carbono. Juntar dos gotas de fenolftalena SI
y titular con la solucin de hidrxido de sodio hasta forma- Preparacin Triturar 4 g de carmn de ndigo con su-
cin permanente de color rosa. Cada ml de hidrxido de cesivas porciones de agua hasta disolucin, sin pasar 900
sodio M SV equivale a 204,220 mg de biftalato de potasio. ml. Transferir para baln volumtrico de 1000 ml, aadir
2 ml de cido sulfrico y completar el volumen con agua.
A
Conservacin Recipientes bien cerrados, inertes (tipo po-
Estandarizacin A 10 ml de solucin estndar de nitrato
lietileno). Tapones provistos de tubo conteniendo la mez-
(100 ppm NO3) aadir 10 ml de agua, 0,05 ml de carmn
cla hidrxido de sodio y xido de calcio.
de ndigo SV y, cuidadosamente, 30 ml de cido sulfri-
Almacenamiento Proteger del dixido de carbono. co. Titular inmediatamente con carmn de ndigo SV hasta
Seguridad Custico. cambiar para una coloracin azul estable. El volumen total,
en ml, de carmn de ndigo SV requerido es equivalente a
Informacin adicional Verificar el ttulo con frecuencia. 1 mg de NO3.
A
tiltioninio 0,02% (p/v) y titular lentamente con solucin
Metxido de litio 0,1 M SV de nitrato de bario hasta cambio de color de amarillo para
rosa.
Preparacin Disolver, cuidadosamente, en baln volu-
mtrico de 1000 ml, 0,694 g de litio en 150 ml de metanol
Nitrato de plomo 0,1 M SV
anhidro y completar el volumen con tolueno. Estandari-
zacin Estandarizar siempre antes del uso. A 10 ml de Preparacin Transferir, exactamente, cerca de 8,28 g de
dimetilformamida aadir 0,05 ml de azul de timol a 0,3% nitrato de plomo para baln volumtrico de 250 ml, diluir
(p/v) en metanol y titular con metxido de litio 0,1 M SV en agua y completar el volumen con el mismo solvente.
hasta coloracin azul. Inmediatamente, aadir 0,2 g de ci- Homogeneizar.
do benzoico, agitar y titular con metxido de litio 0,1 M
Estandarizacin Transferir, exactamente, 5 ml de nitrato
SV hasta coloracin azul. Evitar la absorcin de dixido
de plomo 0,1 M, para matraz de 125 ml, aadir 50 ml de
de carbono atmosfrico. El volumen de titulante gastado
agua y, bajo agitacin magntica, aadir 5 gotas de anaran-
en la segunda titulacin representa la cantidad de metxido
jado de xilenol a 0,1% (p/v) en agua y 5 g de metenamina,
de litio requerido. Cada ml de metxido de litio 0,1 M SV
hasta coloracin violeta. Titular con edetato disdico 0,05
equivale a 12,212 mg de C7H6O2.
M SV hasta coloracin amarilla. Cada ml de edetato dis-
dico 0,05 M SV equivale a 16,560 mg de Pb (NO3)2.
Metxido de sodio 0,1 M SV
Especificacin Contiene 5,402 g en solucin tolueno me- Nitrato de mercurio (II) 0,1 M SV
tanol a 1000 ml.
Sinonimia Nitrato mercrico 0,1 M SV.
Preparacin Enfriar en bao de hielo 150 ml de metanol,
Preparacin Disolver cerca de 35 g de nitrato de mercu-
contenido en baln volumtrico de 1000 ml. Aadir, en pe-
rio (II) en 5 ml de cido ntrico y 500 ml de agua. Comple-
queas porciones, cerca de 2,5 g de sodio metlico recin
tar con agua a 1000 ml.
fragmentado. Despus de la disolucin del metal, aadir
tolueno hasta completar 1000 ml y mezclar. Mantener esta Estandarizacin A 20 ml de esta solucin, aadir 2 ml de
solucin en recipiente al abrigo del dixido de carbono. cido ntrico SR y 2 ml de sulfato frrico amoniacal SR.
Estandarizacin Pesar exactamente cerca de 400 mg de Enfriar a temperatura inferior a 20 C y titular con tiocia-
cido benzoico, disolver en 80 ml de dimetilformamida, nato de amonio 0,1 M hasta aparecimiento permanente de
aadir tres gotas de solucin de azul de timol a 1% (p/v) la coloracin marrn. Calcular la molaridad.
en dimetilformamida y titular por la solucin de metxido Conservacin En recipientes bien cerrados.
de sodio hasta el aparecimiento de coloracin azul. Cada
12,212 mg de cido benzoico equivale a 1 ml de metxido Nitrato de plata 0,1 M SV
de sodio 0,1 M.
Preparacin Disolver cerca de 17,5 g de nitrato de plata
Nitrato crico amoniacal 0,01 M SV en agua a 1000 ml.
Preparacin A 100 ml de nitrato crico amoniacal 0,1 Estandarizacin Pesar exactamente cerca de 100 mg de
M SV aadir, cuidadosamente, con enfriamiento, 30 ml de cloruro de sodio, desecado; transferir para vaso de precipi-
cido sulfrico y diluir para 1000 ml con agua. tados de 150 ml y disolver en 5 ml de agua. Juntar 5 ml de
cido actico SR, 50 ml de metanol y tres gotas de eosina Y
Nitrato crico amoniacal 0,1 M SV SI. Agitar, de preferencia con agitador magntico, y titular
con la solucin de nitrato de plata. Calcular la molaridad.
Preparacin Agitar solucin conteniendo 56 ml de cido
Cada ml de nitrato de plata 0,1 M SV corresponde a 5,844
sulfrico y 54,82 g de nitrato crico amoniacal por 2 minu-
mg de cloruro de sodio.
tos y, cuidadosamente, aadir cinco porciones sucesivas de
100 ml de agua, agitando despus de cada adicin. Diluir Conservacin Recipientes bien cerrados.
A
Nitrito de sodio 0,1 M SV
4,496 mg de trixido de arsnico.
Especificacin Contiene 6,9 g de nitrito de sodio en agua
a 1000 ml. Sulfato de zinc 0,1 M SV
Estandarizacin Disolver 7,5 g de nitrito de sodio en Especificacin Contiene 16,144 g de sulfato de zinc hep-
agua y completar el volumen a 1000 ml. Pesar exactamen- tahidratado en agua a 1000 ml. Preparacin Disolver
te cerca de 500 mg de sulfanilamida previamente desecada 28,8 g de sulfato de zinc en agua y completar el volumen a
por 3 horas a 105 C. Transferir para vaso de precipitados. 1000 ml. Pipetear 20 ml de la solucin de edetato disdico
Aadir 20 ml de cido clorhdrico y 50 ml de agua. Agitar 0,05 M para un matraz de 250 ml y aadir, en este orden,
hasta disolucin y enfriar a 15 C. Manteniendo la tempe- 20 ml de solucin tampn cido actico-acetato de amo-
ratura en torno de 15 C, titular lentamente con solucin nio, 100 ml de etanol y 2 ml de ditizona SR. Titular por la
de nitrito de sodio usando como indicador externo almidn solucin de sulfato de zinc hasta la coloracin rosa clara.
yodado SI, hasta cambio: Cada 17,220 mg de sulfanilami- Calcular la molaridad.
da equivalen a 1 ml de nitrito de sodio 0,1 M.
Tetrafenilborato de sodio 0,02 M SV
Permanganato de potasio 0,02 M SV
Preparacin Disolver 6,845 g de tetrafenilborato de so-
Especificacin Contiene 3,161 g de permanganato de po- dio en agua a 1000 ml.
tasio en agua a 1000 ml.
Estandarizacin Pipetear dos porciones de 75 ml en dos
Preparacin Disolver cerca de 3,2 g de permanganato vasos de precipitados. A cada uno de ellos, aadir 1 ml de
de potasio en 1000 ml de agua, calentar a ebullicin por cido actico SR, 25 ml de agua y, lentamente, bajo agi-
15 minutos. Dejar en reposo en frasco mbar con tapa de tacin, 25 ml de biftalato de potasio a 5% (p/v). Dejar en
vidrio, al abrigo de la luz, por dos das, y filtrar a travs de reposo por dos horas. Filtrar una de las mezclas en crisol
embudo de vidrio sinterizado. filtrante, de vidrio sinterizado (porosidad 100-160 micr-
metros) y lavar el precipitado con agua fra. Transferir el
Estandarizacin Disolver, exactamente, cerca de 0,2 g
precipitado con 50 ml de agua y agitar intermitentemente
de oxalato de sodio, previamente desecado a 110 C hasta
por 30 minutos. Filtrar y usar el filtrado como solucin sa-
peso constante, en 250 ml de agua. Aadir 7 ml de cido
turada de tetrafenilborato de potasio en el siguiente proce-
sulfrico, calentar a cerca de 70 C, y titular lentamente
dimiento de estandarizacin. Filtrar la segunda mezcla en
con la solucin de permanganato de potasio, con agitacin
crisol filtrante, de vidrio sinterizado, tarado, y lavar con
constante, hasta coloracin rosa plida, que persista por 15
tres porciones de 5 ml de la solucin saturada de tetrafe-
segundos. La temperatura al final de la titulacin no debe
nilborato de potasio. Secar el precipitado a 105 C durante
ser inferior a 60 C. Cada ml de permanganato de potasio
una hora. Cada g de tetrafenilborato de potasio equivale a
0,02 M SV equivale a 6,700 mg de oxalato de sodio.
955,1 mg de tetrafenilborato de sodio. A partir del peso del
Conservacin Recipientes de vidrio mbar bien cerrados, tetrafenilborato de sodio obtenido, calcular la molaridad de
con tapa de vidrio. la solucin.
Almacenamiento Proteger de la luz. Conservacin Recipientes bien cerrados. Estabilidad
Informacin adicional Verificar el ttulo con frecuencia. Usar soluciones recientes.
Especificacin Contiene 33,22 g de sulfato crico en Preparacin Disolver cerca de 8 g de tiocianato de amo-
1000 ml de agua. nio en agua a 1000 ml.
y 2 ml de sulfato frrico amoniacal SR. Titular con la solu- el pH para 3,5 con cido clorhdrico SR o hidrxido de
cin de tiocianato de amonio hasta aparecimiento del color amonio 6 M y completar el volumen para 100 ml con agua.
castao rojiza. Cada ml de nitrato de plata 0,1 M equiva-
lente a 7,612 mg de tiocianato de amonio. Tampn acetato pH 4,0
Conservacin Recipientes bien cerrados. Preparacin Transferir 900 ml de agua para baln volu-
mtrico de 1000 ml, aadir 2,86 ml de cido actico glacial
Tiosulfato de sodio 0,1 M SV y 1 ml de hidrxido de sodio a 50% (p/v), completar el
volumen con agua y homogeneizar. Si es necesario, ajustar
Preparacin Disolver cerca de 25 g de tiosulfato de sodio
el pH en 4,0 con cido actico glacial o hidrxido de sodio
pentahidratado y 200 mg de carbonato de sodio en agua,
a 50% (p/v).
recientemente hervida y enfriada, a 1000 ml. Estandariza-
cin Pesar exactamente cerca de 210 mg de dicromato de
Tampn acetato pH 4,4
potasio, pulverizado y desecado, y disolver en 100 ml de
agua. Transferir para baln de 500 ml y aadir 3 g de yodu- Preparacin Disolver 136 g de acetato de sodio y 77 g de
ro de potasio, 2 g de bicarbonato de sodio y 5 ml de cido acetato de amonio en agua y diluir a 1000 ml. Aadir 250
clorhdrico SR. Agitar y dejar en reposo por 10 minutos en ml de cido actico glacial y homogeneizar.
oscuro. Titular el yodo liberado con la solucin de tiosul-
A
fato de sodio hasta color verde amarillento. Aadir 3 ml de Tampn biftalato pH 4,4
almidn SI y continuar la titulacin hasta desaparicin de Preparacin Disolver 2,042 g de biftalato de potasio en
la color azul. Calcular la molaridad. Cada ml de tiosulfato 50 ml de agua, aadir 7,5 ml de hidrxido de hidrgeno 0,2
de sodio 0,1 M SV corresponde a 4,903 mg de dicromato M y diluir para 200 ml en agua. Ajustar el pH si necesario.
de potasio.
Conservacin Recipientes bien cerrados. Informacin Tampn acetato 0,05 M pH 4,5
adicional Verificar el titulo con frecuencia. Preparacin Transferir 2,99 g de acetato de sodio tri-
hidratado y 1,66 ml de cido actico glacial para baln
14.4 TAMPONES volumtrico de 1000 ml. Disolver en agua y completar el
volumen con el mismo solvente. Ajustar el pH si necesario.
Ciertos ensayos farmacopeicos exigen el ajuste o el man-
tenimiento de pH. Para ello, se emplean soluciones deno- Tampn acetato de sodio pH 4,5
minadas tampones, capaces de soportar variaciones en la
actividad de iones hidrgeno. Los componentes requeridos Preparacin Diluir 2,8 ml de cido actico glacial con
estn descritos en el tem Reactivos. Los de naturaleza cris- agua para 1000 ml. Ajustar el pH en 4,5 0,05 con hidrxi-
talina deben ser previamente desecados a 110 120 C por do de sodio a 50% (p/v).
una hora; utilizar agua exenta de dixido de carbono. El
almacenamiento debe ser hecho en recipientes hermticos Tampn acetato de sodio 0,1 M pH 5,0
y apropiados. Considerar la estabilidad en el preparado de Preparacin Transferir 13,61 g de acetato de sodio tri-
las cantidades para consumo. A continuacin, se relacionan hidratado para baln volumtrico de 1000 ml, disolver en
las soluciones en orden creciente de valores de pH. Otros cantidad suficiente de agua y completar el volumen con el
tampones con caractersticas particulares son descritos en mismo solvente. Homogeneizar. Ajustar el pH en 5,0 con
los textos de los respectivos ensayos. cido actico 0,1 M.
Preparacin Disolver 12 g de acetato de sodio en agua, Solucin A Disolver 13,61 g de fosfato de potasio mo-
aadir 6 ml de cido actico glacial y diluir con agua para nobsico en agua y completar para 1000 ml con el mismo
completar 100 ml. Ajustar el pH si necesario. solvente.
Solucin B Disolver 35,81 g de fosfato de sodio dibsico
Tampn acetato pH 3,5 dodecahidratado en agua y completar para 1000 ml con el
Preparacin Disolver 25 g de acetato de amonio en 35 mismo solvente.
ml de agua, aadir 38 ml de cido clorhdrico 7 M, ajustar
Preparacin Mezclar 96,4 ml de la Solucin A y 3,6 ml actico 0,5 M. Completar con agua a 100 ml. Ajustar el pH
de la Solucin B. Ajustar el pH si necesario. si necesario.
Conservacin En recipientes bien cerrados.
Tampn fosfato pH 5,8
Preparacin En baln volumtrico de 200 ml, aadir 3,6 Tampn citrofosfato pH 7,0
ml de hidrxido de sodio 0,2 M a 50 ml de fosfato de po-
Nombre alternativo Tampn fosfato de sodio pH 7,0 Pre-
tasio monobsico 0,2 M y completar el volumen con agua.
paracin Mezclar 82,4 ml de fosfato de sodio dibsico
Ajustar el pH si necesario.
dodecahidratado a 7,15% (p/v) con 17,6 ml de cido ctrico
a 2,1% (p/v). Ajustar el pH si necesario.
Tampn fosfato pH 6,0
Preparacin Mezclar 50 ml de fosfato de potasio mo- Tampn fosfato pH 7,0
nobsico 0,2 M y 5,7 ml de hidrxido de sodio 0,2 M.
Solucin A Hidrxido de sodio M
Completar el volumen a 200 ml con agua. Ajustar el pH
si necesario. Solucin B Disolver 13,6 g de fosfato de potasio mono-
bsico en agua y completar el volumen para 100 ml con el
Tampn acetato pH 6,0 mismo solvente.
Preparacin Disolver 2,73 g de acetato de sodio en apro- Preparacin Mezclar 50 ml de una solucin conteniendo
ximadamente 70 ml de agua. Ajustar el pH a 7,0 con cido 1,94% (p/v) de acetato de sodio y 2,95% (p/v) de barbital
sdico en agua con 50,5 ml de cido clorhdrico 0,1 M. Tampn acetato de amonio pH 8,5
Juntar 20 ml de solucin a 8,5% (p/v) de cloruro de sodio y
Preparacin Disolver 50 g de acetato de amonio en 1000
completar a 250 ml con agua.
ml de etanol a 20% (v/v). Ajustar el pH en 8,5 con hidrxi-
do de amonio 6 M.
Tampn fosfato de potasio pH 7,4 con polisorbato 80 a
2% (v/v)
Tampn fosfato pH 8,5
Preparacin Disolver 27,22 g de fosfato de potasio mo-
Preparacin Disolver 3,5 g de fosfato de potasio dibsi-
nobsico en 1000 ml de agua. Transferir 250 ml de la so-
co anhidro y 4,5 g de cloruro de sodio en 500 ml de agua.
lucin anterior para baln volumtrico de 1000 ml, aadir
Ajustar el pH en 8,5 con una mezcla de agua y cido fos-
195,5 ml de hidrxido de sodio 0,2 M y 450 ml de agua.
frico (1:1).
Ajustar el pH para 7,4 con cido fosfrico o hidrxido de
sodio y completar el volumen con agua. El polisorbato 80 Tampn barbital pH 8,6
debe ser adicionado despus, debido a la difcil
Preparacin Mezclar 129 ml de cido clorhdrico 0,1 M
Solubilidad del mismo. aadir volumen suficiente de barbital sdico 0,1 M para
completar 1000 ml. Ajustar el pH si necesario.
Tampn imidazol pH 7,4
Preparacin Disolver 3,4 g de imidazol y 5,84 g de clo-
ruro de sodio en agua. Aadir 18,6 ml de cido clorhdrico
M y completar con agua a 1000 ml. si necesario, ajustar el
Tampn fosfato pH 8,6
Preparacin Mezclar 2,3 volmenes de hidrxido de so-
A
dio 0,2 M, con 2,5 volmenes de fosfato de potasio mono-
pH para 7,4 0,1. bsico 0,2 M y 2 volmenes de metanol. Enfriar y mezclar
con agua para obtener 10 volmenes de solucin. Ajustar,
Tampn de trometamina-cloruro de sodio de pH 7,4.
si necesario, el pH para 8,60 0,05 con hidrxido de sodio.
Preparacin Disolver 6,08 g de trometamina y 8,77 g de
cloruro de sodio en 500 ml de agua destilada. Junte 10 g Tampn de tris-clorhidrato 1,5 M pH 8,8
de albmina bovina. Ajustar el pH con cido clorhdrico y Preparacin Disolver 90,8 g de trometamina en 400 ml
complete 1000 ml con agua destilada. de agua. Ajustar el pH para 8,8 con cido clorhdrico y di-
luir para 500 ml con agua.
Tampn tris-cloruro de sodio pH 7,5
Preparacin Disolver 7,27 g de trometamina y 5,27 g de Tampn borato pH 9,0
cloruro de sodio en 950 ml de agua. Ajustar el pH en 7,5 Preparacin Disolver 12,37 g de cido brico y 14,91
con cido clorhdrico 2 M y completar con agua a 1000 ml. g de cloruro de potasio en agua y completar el volumen
para 1000 ml con el mismo solvente. Transferir 50 ml de la
Tampn borato pH 8,0
solucin obtenida para baln volumtrico de 200 ml, aa-
Preparacin Mezclar 0,619 g de cido brico y 0,746 dir 20 ml de hidrxido de sodio 0,2 M y 120 ml de agua.
g cloruro de potasio en 50 ml de agua. Aadir 3,97 ml de Ajustar el pH en 9,0 con hidrxido de sodio SR o cido
hidrxido de sodio 0,2 M y diluir para 200 ml de agua. clorhdrico SR y completar el volumen con agua.
Ajustar el pH si necesario.
Tampn tris 0,05 M pH 9,0
Tampn de barbital de pH 8,4
Preparacin Transferir 6,05 g de trometamina para baln
Preparacin Disolver 8,25 g de barbital sdico en agua volumtrico de 1000 ml. Disolver en agua y completar el
y completar a 1000 ml con el mismo solvente. Ajustar el volumen con el mismo solvente. Ajustar el pH en 9,0
pH si necesario. 0,05 utilizando cido fosfrico. Disolver 10 g de laurilsul-
fato de sodio en cerca de 600 ml del tampn. Mezclar la
Tampn de trometamina-EDTA de pH 8,4. solucin obtenida con lo restante del tampn.
Preparacin Disolver 5,12 g de cloruro de sodio, 3,03
Tampn borato pH 9,6
g de trometamina y 1,40 g de yoduro de sodio en 250 ml
agua destilada. Ajuste el pH con cido clorhdrico y com- Preparacin Transferir 3,093 g de cido brico y 3,728 g
plete 500 ml con agua destilada. de cloruro de potasio para baln volumtrico de 1000 ml,
aadir 250 ml de agua y agitar hasta disolucin. Aadir 182
Tampn de tris-EDTA ASB de pH 8,4 ml de hidrxido de sodio 0,2 M y completar el volumen
con agua. Ajustar el pH si necesario.
Preparacin Disolver 6,1 g de trometamina, 2,8 g de yo-
duro de sodio, 10,2 g de cloruro de sodio y 10 g de albmi-
Tampn carbonato-bicarbonato de sodio pH 9,6
na bovina en agua, ajustar el pH con cido clorhdrico M y
completar para 1000 ml con agua. Preparacin Disolver 0,75 g de carbonato de sodio y 1,5
g de bicarbonato de sodio en 500 ml de agua. Distribuir en
recipientes con 50 ml cada uno. Autoclavar a 121 C, pre-
sin de 1 atm, por 20 minutos. Almacenar a 4 C.
A
Tabla Peridica de los Elementos Qumicos
3 4 5 6 7 8 9 10
Li Be B C N O F Ne
6,941 9,0122 10,811 12,011 14,007 15,999 18,998 20,180
11 12 13 14 15 16 17 18
Na Mg Al Si P S Cl Ar
22,990 24,305 26,982 28,086 30,974 32,065 35,453 39,948
3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36
K Ca Sc Ti V Cr Mn Fe Co Ni Cu Zn Ga Ge As Se Br Kr
39,098 40,078 44,956 47,867 50,942 51,996 54,938 55,845 58,933 58,693 63,546 65,38 69,723 72,64 74,922 78,96 79,904 83,798
37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54
Rb Sr Y Zr Nb Mo Tc Ru Rh Pd Ag Cd In Sn Sb Te I Xe
85,468 87,62 88,906 91,224 92,906 95,96 - 101,07 102,91 106,42 107,87 112,41 114,82 118,71 121,76 127,60 126,90 131,29
55 56 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86
Cs Ba 57-71 Hf Ta W Re Os Ir Pt Au Hg Tl Pb Bi Po At Rn
132,91 137,33 178,49 180,95 183,84 186,21 190,23 192,22 195,08 196,97 200,59 204,38 207,2 208,98 - - -
57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71
La Ce Pr Nd Pm Sm Eu Gd Tb Dy Ho Er Tm Yb Lu
138,91 140,12 140,91 144,24 - 150,36 151,96 157,25 158,93 162,50 164,93 167,26 168,93 173,05 174,97
8 Oxgeno 0 15,9994 g/mol 1,33 g/l -218.4 C -182,9 C 1774 Priestley y Scheele
9 Flor F 18,9984032 g/mol 1,58 g/l -219.6 C -188,1 C 1886 Moissan
10 Nen Ne 20,1797 g/mol 0,84 g/l -248.7 C -246,1 C 1898 Ramsay y Travers
11 Sodio En la 22,989768 g/mol 0,97 g/cm3 97,8 C 892 C 1807 Davy
12 Magnesio Mg 24,305 g/mol 1,74 g/cm3 648,8 C 1107C 1755 Black
13 Aluminio Al 26,981539 g/mol 2,70 g/cm3 660,5 C 2467 C 1825 Oersted
14 Silicio Si 28,0855 g/mol 2,33 g/cm3 1410C 2355 C 1824 Berzelius
15 Fsforo P 30,973762 g/mol 1.82 g/cm3 44 (P4) C 280 (P4) C 1669 Brandt
16 Azufre S 32,066 g/mol 2.06 g/cm3 113 C 444,7 C Pre-historia Desconocido
17 Cloro Cl 35,4527 g/mol 2,95 g/l -34.6 C -101 C 1774 Scheele
18 Argn Aire 39,948 g/mol 1,66 g/l -189.4 C -185,9 C 1894 Ramsay y Rayleigh
19 Potasio K 39,0983 g/mol 0,86 g/cm3 63,7 C 774 C 1807 Davy
20 Calcio Ca 40,078 g/mol 1,54 g/cm3 839 C 1487 C 1808 Davy
21 Escandio Sc 44,95591 g/mol 2,99 g/cm3 1539C 2832 C 1879 Nilson
22 Titanio Ti 47,88 g/mol 4,51 g/cm3 1660 C 3260 C 1791 Gregor y Klaproth
A
A
Nmero Densidad a Punto de Punto de Ao de la
514
76 Osino Los 190,2 g/mol 22.61 g/cm3 3045 C 5027 C 1803 Tenant
77 Iridio Ir 192,22 g/mol 22.65 g/cm3 2410 C 4130 C 1803 Tenant y andere
78 Platino Pt 195,08 g/mol 21,45 g/cm3 1772 C 3827 C 1557 Scaliger
79 Oro Au 196,96654 g/mol 19,32 g/cm3 1064.4 C 2940 C Pre-historia Desconocido
80 Mercurio Hg 200,59 g/mol 13,55 g/cm3 -38,9 C 356,6 C Pre-historia Desconocido
81 Talio Tl 204,3833 g/mol 11,85 g/cm3 303,6 C 1457 C 1861 Crookes
82 Plomo Pb 207,2 g/mol 11.34 g/cm3 327,5 C 1740 C Pre-historia Desconocido
83 Bismuto Bi 208,98037 g/mol 9.80 g/cm3 271.4 C 1560 C 1540 Agrcola
84 Polonio Po 208,9824 g/mol 9,20 g/cm3 254 C 962 C 1898 Marie y Pierre Curie
85 Astato At 209,9871 g/mol 302 C 337 C 1940 Corson y MacKenzie
86 Radn Rn 222,0176 g/mol 9,23 g/l -71 C -61,8 C 1900 Dom
87 Francio Fr 223,0197 g/mol 27 C 677 C 1939 Perey
88 Radio Ra 226,0254 g/mol 5,50 g/cm3 700 C 1140 C 1898 Marie y Pierre Curie
89 Actinio Ac 227,0278 g/mol 10,07 g/cm3 1047 C 3197 C 1899 Debierne
90 Torio Th 232,0381 g/mol 11,72 g/cm3 1750 C 4787 C 1829 Berzelius
91 Protactinio Pa 231,0359 g/mol 15.37 g/cm3 1554C 4030 C 1917 Soddy, Cranston y Halin
A
Farmacopea Brasilea, 5 edicin
El sistema internacional posee siete unidades de base, utilizadas como referencia en todas las mediciones y relacionadas
en la Tabla B.1
Todas las otras magnitudes son descritas como magnitudes derivadas y medidas como unidades derivadas. En la Tabla
B.2 estn listadas algunas magnitudes derivadas.
B Note que el ndice de refraccin y la permeabilidad relativa son ejemplos de magnitudes adimensionales, para las cuales
la unidad del SI es el nmero uno (1), a pesar de que esta unidad no sea escrita.
Algunas unidades derivadas reciben nombre especial, siendo ese simplemente una forma compacta de expresin de
combinaciones de unidades de base que son usadas frecuentemente. Entonces, por ejemplo, el joule, smbolo J, es por
definicin, igual a m2 kg s-2. Existen actualmente 22 nombres especiales para unidades aprobados para uso en el SI, que
estn listados en la Tabla B.3.
Expresin en trminos
Nombre de la Smbolo de
Magnitud derivada de otras
unidad derivada la unidad
unidades
ngulo plano Radin rad m/m = 1
ngulo slido estereorradin sr m2/m2 = 1
Frecuencia Hertz Hz s-1
Fuerza newton N m kg s-2
presin, tensin pascal Pa N/m2 = m-1 kg s-2
energa, trabajo, cantidad de calor Joule J N m = m2 kg s-2
potencia, flujo de energa Watt W J/s = m2 kg s-3
carga elctrica, cantidad de electricidad coulomb C sA
diferencia de potencial elctrico Volt V W/A = m2 kg s-3 A-1
Capacitancia Farad F C/V = m-2 kg-1 s4 A2
resistencia elctrica Ohm V/A = m2 kg s-3 A-2
conductancia elctrica siemens S A/V = m-2 kg-1 s3 A2
flujo de induccin magntica weber Wb V s = m2 kg s-2 A-1
induccin magntica Tesla T Wb/m2 = kg s-2 A-1
Inductancia Henry H Wb/A = m2 kg s-2 A-2
temperatura Celsius grado Celsius C K
flujo luminoso lumen lm cd sr = cd
Iluminancia Lux lx lm/m2 = m-2 cd
actividad de un radionclido becquerel Bq s-1
dosis absorbida, energa especfica (comunicada), Gray Gy J/kg = m2 s-2
kerma
equivalente de dosis, equivalente de dosis ambiente sievert Sv J/kg = m2 s-2
actividad cataltica Katal kat s-1 mol
A pesar de que el Hertz y el becquerel sean iguales al inver- para especificar la magnitud. Esto se aplica tanto a los tex-
so del segundo, el Hertz es usado solamente para fenme- tos cientficos como a los instrumentos de medicin (esto
nos cclicos, y el becquerel, para procesos estocsticos en es, la lectura de salida de un instrumento debe indicar la
el decaimiento radioactivo. magnitud medida y la unidad).
La unidad de temperatura Celsius es el grado Celsius, oC, Las magnitudes adimensionales, tambin llamadas de
que es igual en magnitud al kelvin, K, la unidad de tempe- magnitudes de dimensin uno, son usualmente definidas
ratura termodinmica. La magnitud temperatura Celsius t como la razn entre dos magnitudes de la misma natura-
est relacionada con la temperatura termodinmica T por la leza (por ejemplo, el ndice de refraccin es la razn entre
ecuacin t/oC = T/K 273,15. dos velocidades, y la permeabilidad relativa es la razn
entre la permeabilidad de un medio dielctrico y la del
El sievert, tambin, es usado para las magnitudes: equiva- vaco). Entonces la unidad de una magnitud adimensional
lentes de dosis direccional y equivalente de dosis individual. es la razn entre dos unidades idnticas del SI, por tanto
es siempre igual a uno (1). Sin embargo, al expresarse los
Los cuatro ltimos nombres especiales de las unidades de valores de magnitudes adimensionales, la unidad uno (1)
la Tabla B.3 fueron adoptados especficamente para res- no es escrita.
guardar mediciones relacionadas a la salud humana.
MLTIPLOS Y SUBMLTIPLOS DE LAS UNIDADES
Para cada magnitud, existe solamente una unidad SI (a pe- DEL SI
sar de que pueda estar expresada frecuentemente de dife-
rentes modos, por el uso de nombres especiales). Sin em- Un conjunto de prefijos fue adoptado para uso con las uni-
bargo, la misma unidad SI puede ser usada para expresar dades del SI, a fin de expresar los valores de magnitudes
los valores de diversas magnitudes diferentes (por ejemplo, que son mucho mayores o mucho menores que la unidad SI
la unidad SI para la relacin J/K puede ser usada para ex-
presar tanto el valor de la capacidad calorfica como de la
entropa). Por tanto, es importante no usar la unidad sola
usada sin un prefijo. Los prefijos SI estn listados en la Ta-
bla B.4. Ellos pueden ser usados con cualquier unidad de
base y con las unidades derivadas con nombres especiales.
B
Tabla B.4 Mltiplos y submltiplos del SI Prefijos y smbolos.
Cuando los prefijos son usados, el nombre del prefijo y el El kilogramo, kg, es una excepcin, porque a pesar de que
de la unidad son combinados para formar una palabra ni- l sea una unidad de base el nombre ya incluye un prefijo,
ca y, similarmente, el smbolo del prefijo y el smbolo de por razones histricas. Los mltiplos y los submltiplos
la unidad son escritos sin espacios, para formar un smbo- del kilogramo son escritos combinndose los prefijos con
lo nico que puede ser elevado a cualquier potencia. Por el gramo: luego, se escribe miligramo, mg, y no microki-
ejemplo, se puede escribir: quilmetro, km; microvolt, V; logramo, kg.
femtosegundo, fs; 50 V/cm = 50 V(10-2 m)-1 = 5000 V/m.
UNIDADES FUERA DEL SI
Cuando las unidades de base y las unidades derivadas son
usadas sin cualquier prefijo, el conjunto de unidades re- El SI es el nico sistema de unidades que es reconocido
sultante es considerado coherente. El uso de un conjunto universalmente, de modo que l tiene una ventaja distinta
de unidades coherentes tiene ventajas tcnicas. Sin embar- cuando se establece un dilogo internacional. Otras unida-
go, el uso de los prefijos es conveniente porque l evita la des, es decir, unidades no SI, son generalmente definidas
necesidad de emplear factores de 10n, para expresar los en trminos de unidades SI. El uso del SI, tambin, sim-
valores de magnitudes muy grandes o muy pequeas. Por plifica la enseanza de la ciencia. Por todas esas razones
ejemplo, el largo de una conexin qumica es ms conve- el empleo de las unidades SI es recomendado en todos los
nientemente expresado en nanmetros, nm, que en metros, campos de la ciencia y de la tecnologa.
m, y la distancia entre Londres y Paris es ms convenien-
temente expresada en quilmetros, km, que en metros, m.
A pesar de que algunas unidades no SI sean todava am- Los cientficos deben tener la libertad para utilizar unida-
pliamente usadas, otras, a ejemplo del minuto, de la hora des no SI si ellos las consideran ms adecuadas a su prop-
y del da, como unidades de tiempo, sern siempre usadas sito. Sin embargo, cuando unidades no SI son utilizadas, el
porque ellas estn arraigadas profundamente en la nuestra factor de conversin para el SI debe ser siempre incluido.
cultura. Otras son usadas, por razones histricas, para aten- Algunas unidades no SI estn listadas en la Tabla B.5, con
der a las necesidades de grupos con intereses especiales, o su factor de conversin para el SI.
porque no existe alternativa SI conveniente.
B Fuerza
milla nutica
Dina
M
dyn
1 M = 1852 m
1 dyn = 10-5 N
Energa Erg erg 1 erg = 10-7 J
__________________________
1El Diccionario Houaiss de la Lengua Portuguesa admite esa palabra escrita sin el smbolo sobre la a.
Los smbolos de las unidades comienzan con letra mays- embargo no hay un acuerdo general sobre ningn smbolo
cula cuando se trata de nombre propio (por ejemplo, ampe- para la milla nutica.
re, A; kelvin, K; hertz, Hz; coulomb, C). En los otros casos
ellos siempre comienzan con letra minscula (por ejem- En la Tabla B.6 estn listados otros ejemplos de unidades
plo, metro, m; segundo, s; mol, mol). El smbolo del litro fuera del SI y de uso, adems corriente, pero, que deben ser
es una excepcin: la letra mayscula es usada para evitar evitadas. Cuando mencionadas en un documento conviene
confusin entre a letra minscula l y el nmero uno (1). El indicar su equivalencia con la unidad SI.
smbolo de la milla nutica es presentado aqu como M; sin
Los smbolos de las unidades son impresos en tipo romano En la formacin de productos o cocientes de unidades, se
(vertical), independientemente del tipo usado en lo restante aplican las reglas normales del lgebra. En la formacin
del texto. Ellos son entidades matemticas y no abreviatu- de productos de unidades, se debe dejar un espacio entre
ras. Ellos nunca son seguidos por un punto (excepto en el las unidades (alternativamente se puede colocar un punto
final de una oracin) ni por una s para formar el plural. Es en el medio de la altura de la lnea, como smbolo de mul-
obligatorio el uso de la forma correcta para los smbolos tiplicacin).
de las unidades, conforme ilustrado por los ejemplos pre-
sentados en la publicacin completa del SI. Algunas veces En la formacin de nmeros el marcador decimal puede ser
los smbolos de las unidades pueden tener ms de una le- o un punto o una coma, de acuerdo con las circunstancias
tra. Ellos son escritos en letras minsculas, excepto que apropiadas. Para documentos en la lengua inglesa es usual
la primera letra es mayscula cuando el nombre es de una el punto, pero en Brasil y para muchas lenguas de Europa
persona. Sin embargo, cuando el nombre de una unidad continental y en otros pases, la coma es de uso ms comn.
es escrito por extenso, debe comenzar con letra minscu-
la (excepto en el inicio de una oracin), para distinguir el Cuando un nmero tiene muchos dgitos es usual agrupar
nombre de la unidad del nombre de la persona. las cifras en bloques de tres, antes y despus de la coma,
para facilitar la lectura. Eso no es esencial, pero se hace
Al escribirse el valor de una magnitud, como el producto frecuentemente, y generalmente es muy til. Cuando esto
de un valor numrico y una unidad, ambos, el nmero y se hace, los grupos de tres dgitos deben ser separados por
la unidad deben ser tratados por las reglas ordinarias del apenas un espacio pequeo; no se debe usar ni un punto y
lgebra. Por ejemplo, la ecuacin T = 293 K puede ser es- ni una coma entre ellos. La inseguridad del valor numrico
crita igualmente T/K = 293. Ese procedimiento es descri- de una magnitud puede ser convenientemente expresada,
to como el uso del clculo de magnitudes, o el lgebra de explicitndose la inseguridad de los ltimos dgitos signi-
magnitudes. A veces esa notacin es til para identificar el ficativos, entre parntesis, despus del nmero. Ejemplo:
encabezamiento de columnas de tablas, o la denominacin
de los ejes de grficos, de modo que las entradas en la tabla
o la identificacin de los puntos sobre los ejes son simples
123 456,789 0
C
Esta traduccin no sustituye la versin en portugus.
Farmacopea Brasilea, 5 edicin 525
ANEXO D ALCOHOLIMETRA
D
2,3 1,82 994,80 0,996591
2,4 1,90 994,66 0,996450
2,5 1,98 994,51 0,996300
2,6 2,06 994,37 0,996160
2,7 2,14 994,23 0,996020
2,8 2,22 994,09 0,995879
2,9 2,30 993,95 0,995739
D 6,9
7,0
5,51
5,59
988,56
988,43
0,990339
0,990209
7,1 5,67 988,30 0,990079
7,2 5,75 988,18 0,989959
7,3 5,83 988,05 0,989828
7,4 5,91 987,92 0,989698
7,5 5,99 987,79 0,989568
7,6 6,07 987,67 0,989448
7,7 6,15 987,54 0,989318
7,8 6,23 987,42 0,989197
7,9 6,32 987,29 0,989067
12,0
9,56
9,64
982,47
982,35
0,984238
0,984118
D
12,1 9,72 982,24 0,984008
12,2 9,80 982,12 0,983888
12,3 9,89 982,01 0,983778
12,4 9,97 981,89 0,983657
12,5 10,05 981,78 0,983547
12,6 10,13 981,67 0,983437
12,7 10,21 981,55 0,983317
12,8 10,29 981,44 0,983207
12,9 10,37 981,32 0,983086
D 16,9
17,0
13,65
13,74
976,89
976,79
0,978648
0,978548
17,1 13,82 976,68 0,978438
17,2 13,90 976,57 0,978328
17,3 13,98 976,46 0,978218
17,4 14,07 976,35 0,978107
17,5 14,15 976,25 0,978007
17,6 14,23 976,14 0,977897
17,7 14,31 976,03 0,977787
17,8 14,40 975,92 0,977677
17,9 14,48 975,81 0,977566
22,0
17,79
17,87
971,51
971,40
0,973259
0,973149
D
22,1 17,96 971,29 0,973038
22,2 18,04 971,18 0,972928
22,3 18,12 971,08 0,972828
22,4 18,21 970,97 0,972718
22,5 18,29 970,86 0,972608
22,6 18,37 970,75 0,972497
22,7 18,46 970,64 0,972387
22,8 18,54 970,53 0,972277
22,9 18,62 970,42 0,972167
D 26,9
27,0
21,98
22,06
965,93
965,81
0,967669
0,967548
27,1 22,15 965,70 0,967438
27,2 22,23 965,58 0,967318
27,3 22,32 965,46 0,967198
27,4 22,40 965,35 0,967088
27,5 22,49 965,23 0,966967
27,6 22,57 965,11 0,966847
27,7 22,65 964,99 0,966727
27,8 22,74 964,88 0,966617
27,9 22,82 964,76 0,966497
32,0
26,23
26,32
959,79
959,66
0,961518
0,961387
D
32,1 26,40 959,53 0,961257
32,2 26,49 959,40 0,961127
32,3 26,57 959,27 0,960997
32,4 26,66 959,14 0,960866
32,5 26,75 959,01 0,960736
32,6 26,83 958,87 0,960596
32,7 26,92 958,74 0,960466
32,8 27,00 958,61 0,960335
32,9 27,09 958,47 0,960195
D 36,9
37,0
30,56
30,65
952,83
952,69
0,954545
0,954405
37,1 30,74 952,54 0,954255
37,2 30,83 952,39 0,954104
37,3 30,92 952,24 0,953954
37,4 31,00 952,09 0,953804
37,5 31,09 951,94 0,953653
37,6 31,18 951,79 0,953503
37,7 31,27 951,63 0,953343
37,8 31,35 951,48 0,953193
37,9 31,44 951,33 0,953042
42,0
35,00
35,09
944,93
944,76
0,946631
0,946461
D
42,1 35,18 944,59 0,946290
42,2 35,27 944,42 0,946120
42,3 35,36 944,25 0,945950
42,4 35,45 944,08 0,945779
42,5 35,54 943,91 0,945609
42,6 35,63 943,74 0,945439
42,7 35,72 943,57 0,945268
42,8 35,81 943,40 0,945098
42,9 35,90 943,23 0,944928
D 46,9
47,0
39,54
39,64
936,07
935,88
0,937755
0,937565
47,1 39,73 935,70 0,937384
47,2 39,82 935,51 0,937194
47,3 39,91 935,32 0,937004
47,4 40,00 935,14 0,936823
47,5 40,10 934,95 0,936633
47,6 40,19 934,76 0,936443
47,7 40,28 934,57 0,936252
47,8 40,37 934,38 0,936062
47,9 40,47 934,19 0,935872
52,0
44,22
44,31
926,36
926,16
0,928027
0,927827
D
52,1 44,41 925,95 0,927617
52,2 44,50 925,75 0,927416
52,3 44,60 925,55 0,927216
52,4 44,69 925,35 0,927016
52,5 44,79 925,14 0,926805
52,6 44,88 924,94 0,926605
52,7 44,98 924,73 0,926395
52,8 45,07 924,53 0,926194
52,9 45,17 924,32 0,925984
D 56,9
57,0
49,03
49,13
915,91
915,70
0,917559
0,917348
57,1 49,23 915,48 0,917128
57,2 49,32 915,27 0,916917
57,3 49,42 915,05 0,916697
57,4 49,52 914,83 0,916477
57,5 49,62 914,62 0,916266
57,6 49,72 914,40 0,916046
57,7 49,81 914,18 0,915826
57,8 49,91 913,97 0,915615
57,9 50,01 913,75 0,915395
62,0
53,99
54,09
904,83
904,60
0,906459
0,906228
D
62,1 54,19 904,37 0,905998
62,2 54,30 904,15 0,905777
62,3 54,40 903,92 0,905547
62,4 54,50 903,69 0,905317
62,5 54,60 903,46 0,905086
62,6 54,70 903,23 0,904856
62,7 54,80 903,00 0,904625
62,8 54,90 902,77 0,904395
62,9 55,00 902,54 0,904165
D 66,9
67,0
59,12
59,22
893,13
892,89
0,894738
0,894497
67,1 59,33 892,65 0,894257
67,2 59,43 892,41 0,894016
67,3 59,54 892,17 0,893776
67,4 59,64 891,93 0,893535
67,5 59,74 891,69 0,893295
67,6 59,85 891,45 0,893055
67,7 59,95 891,20 0,892804
67,8 60,06 890,96 0,892564
67,9 60,16 890,72 0,892323
72,0
64,43
64,53
880,79
880,54
0,882375
0,882125
D
72,1 64,64 880,29 0,881875
72,2 64,75 880,03 0,881614
72,3 64,86 879,78 0,881364
72,4 64,97 879,52 0,881103
72,5 65,08 879,27 0,880853
72,6 65,19 879,01 0,880592
72,7 65,29 878,75 0,880332
72,8 65,40 878,50 0,880081
72,9 65,51 878,24 0,879821
D 76,9
77,0
69,94
70,06
867,75
867,48
0,869312
0,869041
77,1 70,17 867,21 0,868771
77,2 70,28 866,94 0,868500
77,3 70,39 866,67 0,868230
77,4 70,51 866,40 0,867960
77,5 70,62 866,13 0,867689
77,6 70,73 865,86 0,867419
77,7 70,85 865,59 0,867148
77,8 70,96 865,32 0,866878
77,9 71,07 865,05 0,866607
82,0
75,70
75,82
853,91
853,62
0,855447
0,855157
D
82,1 75,93 853,34 0,854876
82,2 76,05 853,05 0,854585
82,3 76,17 852,76 0,854295
82,4 76,29 852,48 0,854014
82,5 76,41 852,19 0,853724
82,6 76,52 851,90 0,853433
82,7 76,64 851,61 0,853143
82,8 76,76 851,32 0,852852
82,9 76,88 851,03 0,852562
D 86,9
87,0
81,74
81,86
839,08
838,77
0,840590
0,840280
87,1 81,99 838,46 0,839969
87,2 82,11 838,15 0,839659
87,3 82,24 837,84 0,839348
87,4 82,36 837,52 0,839028
87,5 82,49 837,21 0,838717
87,6 82,61 836,90 0,838406
87,7 82,74 836,59 0,838096
87,8 82,86 836,27 0,837775
87,9 82,99 835,96 0,837465
92,0
88,16
88,29
822,74
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D
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