CONTENIDO

1. RECONOCIMIENTO DE RGANOS LINFOIDES

2. RECONOCIMIENTO DE LEUCOCITOS

3. TCNICAS DE INOCULACIN Y SANGRIA

4. REACCIONES ANTGENO:ANTICUERPO AGLUTINACIONES

5. TITULO DE ISOAGLUTININAS Anti-A y Anti-B

6. FIJACIN DE COMPLEMENTO

7. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE LINFOCITOS CD2+

8. DETERMINACIN DE GCH POR DAS-ELISA

9. INMUNODIFUSIN

10. FAGOCITOSIS

11. SEPARACIN DE INMUNOGLOBULINAS DEL SUERO

12. INMUNOELECTROFORESIS

1
 PRESENTACIN

L
a inmunologa se inici como una rama de la Microbiologa
Mdica , relacionada con el estudio de la resistencia a las
enfermedades infecciosas. En la actualidad se le reconoce por
mritos propios como un campo de la investigacin biomdica.
Pasando a travs de las fases de la serologa, inmunologa
celular, inmunologa molecular e inmunogentica. Al mismo
tiempo la inmunologa ha crecido hasta abarcar muchos
campos tales como la alergia, inmunologa clnica,
inmunoqumica, inmunopatologa, inmunofarmacologa,
inmunologa de tumores y trasplantes.
La inmunologa siempre estimul la aplicacin de tecnologa y
dependiendo de ella tal como el uso del microscopio, electroforesis,
radiomarcaje, inmunofluorescencia, ADN recombinante y ratones
transgnicos.

En la actualidad esta publicacin desarrolla prcticas de la

INMUNOLOGA BSICA EXPERIMENTAL, pero con la esperanza de
equipar an ms el bioterio y el mismo laboratorio de inmunologa para
estar al nivel de nuestra expectativa.

Finalmente, su apreciacin, crtica y sugerencia permitir seguramente

obtener un material ms logrado, gracias anticipadamente por su
gentileza.

El autor

2
 RECOMENDACIONES DE TRABAJO

1. Lea cuidadosamente el texto de cada prctica antes de realizar la

experiencia.
2. Dejar los efectos personales en el lugar indicado, nunca sobre las
mesas de trabajo.
3. Mientras est en el laboratorio, usar mandil de color blanco,
planchado, limpio, preferiblemente de algodn, sin marcas, salvo el
logotipo de la universidad.
4. Utilizar vestimenta apropiada: pantaln largo, medias y zapatos
cerrados a fin de evitar el contacto de la piel con las muestras.
Evitar sandalias.
5. Evitar el uso de lentes de contacto.
6. Llevar el pelo recogido. No acicalarse en el laboratorio.
7. No se deben llevar pulseras, colgantes, piercings o prendas
sueltas.
8. Las heridas se deben llevar cubiertas, aunque utilicen guantes
para trabajar
9. Mantener una actitud responsable en el laboratorio. No comer, ni
beber.
10. Debe revisar el material o equipo antes de empezar la prctica. S
detecta en el alguna anormalidad avise inmediatamente al docente.
11. Mantener su sitio de trabajo limpio y ordenado, evitando la
presencia de material y equipo que no tengan relacin con el
trabajo.
12. Nunca pipetear lquidos con la boca, sino usando propipeta.
13. Llevar a cabo todos los procedimientos tcnicos en forma tal que
sea mnimo el riesgo de producir aerosoles, gotitas, salpicaduras o
derrames de productos txicos o sustancias potencialmente
infectantes.
14. Lavar las manos antes de abandonar el laboratorio.

3
 P R A C T I C A No 01

RECONOCIMIENTO
DE RGANOS
LINFOIDES
-----------------------

INTRODUCCIN
-----------------------

Si un agente logra vencer las primeras lneas de mecnicas (piel y

mucosas), nuestro organismo cuenta a nivel de las diversas puertas de
entrada (digestiva, urogenital, respiratoria, etc.) con tejido linfoide
especializado dispuesto estratgicamente para cumplir con las funciones
de vigilancia, defensa y homeostasis. Al respecto son de importancia los
siguientes rganos: Ndulos linfticos, ganglios linfticos, timo, bazo.

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OBJETIVOS
----------------

a. Reconocer los rganos linfoides en mamferos, aves y peces.

b. Determinar a los linfocitos
c. viables en el timo de ratn.
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MATERIALES Y METODOS
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Aparatos y equipos - Algodn
- Lminas y laminillas
- Microscopio - Placas petri
- Equipo de diseccin - Papel filtro o gasa
Reactivos y colorantes
Material biolgico
- ter
- Azul de toluidina al 1% - Ratn
- PBS
- Alcohol
4
PROCEDIMIENTO

a. Proceda a sacrificar al animal utilizando ter.

b. Sobre la plataforma de diseccin colocar al animal y sujetarlo
utilizando alfileres o agujas hipodrmicas. Separar la piel y observar
los diversos ganglios linfticos.
c. Abrir cuidadosamente la caja torcica y abdominal y reconocer cada
uno de los rganos linfoides estudiados. Extirparlos y colocarlos en
una placa Petri con PBS.
d. Lavar cuidadosamente el timo y ayudndose con una pinza hacer un
montaje en fresco coloreando con azul de toluidina. Observar al
microscopio los linfocitos y expresar en porcentaje el nmero de
linfocitos viables y no viables.

CUESTIONARIO
----------------------

1. Dibuje el sistema inmunolgico humano indicando los rganos que lo

componen.
2. Cmo reconoce a los linfocitos viables?
3. Dibuje la anatoma del ganglio linftico y del bazo.
4. Ocpese brevemente del desarrollo filogentico y ontognico del
sistema inmunitario.
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EVALUACION DE CONTROL
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Completar:
rganos Primario

Ubicacin Anatoma Funcin

Timo

Medula sea

Bursa de Fabricio

Bazo
rganos secundarios

Ganglios linfticos

Ndulos linfticos

Amgdalas

Adenoides

Placas de Peyer

Apndice

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 P R A C T I C A No 02

RECONOCIMIENTO
DE LEUCOCITOS

------------------------

INTRODUCCION
------------------------

Durante las infecciones y en toda reaccin en general de agresin, la

frmula leucocitaria muestra variaciones segn la fase en el tiempo, la
virulencia del agente y la resistencia del organismo, SCHILLING, ha
establecido una CURVA LEUCOCITARIA BIOLOGICA tpica y comn al
sndrome general parainflamatorio.

La primera fase, DE LUCHA, consiste en una leucocitosis neutrofilia

con desviacin a la izquierda (formas inmaduras) aneosinofilia y
linfopenia con monopenia.

La segunda fase, DE DEFENSA, aparece una monocitosis.

La tercera fase, DE CURACION, ocurre una linfocitosis con la

reaparicin de los eosinfilos.

Se apartan de este patrn determinadas infecciones como la tifoidea y las

virasis, que cursan generalmente con leucopenia.

Tiene inters pronstico seguir la evolucin de la frmula leucocitaria.

---------------

OBJETIVOS
----------------

6
a. Reconocer las diferentes clases de leucocitos.
b. Desarrollar el recuento diferencial de los leucocitos.

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MATERIALES Y METODOS
-------------------------------

- Microscopio
- Lminas portaobjetos
- Colorante Wright
- Solucin tamponada pH=6,4
- Aceite de inmersin
- Sangre

FROTIS SANGUNEO

- Utilizar dos portaobjetos completamente limpios, colocar una gota de

sangre en el centro de uno de los portaobjetos.
- Con el otro portaobjetos poner en contacto la gota de sangre formando
un ngulo de 30 a 45, de tal manera que la sangre quede dentro del
ngulo formado por ambos.
- Mediante movimiento rpido y firme deslizar el portaobjeto superior,
logrando que la muestra de sangre quede extendida sobre el
portaobjeto inferior formando una capa delgada.
- Finalmente agitar en el aire para que la sangre seque con rapidez.
COLORACION

- El frotis sanguneo cubrir con 15 gotas del colorante WRIGHT y dejar

actuar por 15 minutos.
- Sin desechar el colorante agregar agua tamponada 15 gotas y dejar
actuar por 10 minutos.
- Finalmente lavar con agua tamponada y dejar secar al medio
ambiente.
RECONOCIMIENTO DE LEUCOCITOS

De acuerdo a las caractersticas particulares que tienen las

subpoblaciones leucocitarias, las que se describieron en el aspecto
terico, reconocer a los neutrfilos, eosinfilos, basfilos, linfocitos y
monocitos.

RECUENTO:

Con el objetivo de inmersin, contar 100 leucocitos, siguiendo el

mtodo recomendado por Schilling, que consiste en tomar cuatro puntos
marginales distintos recorriendo el campo en zigzag desde el borde de la
parte central en razn de que los granulocitos generalmente se

7
encuentran en las mrgenes y los linfocitos en el centro. Realizar los
clculos y expresarlos en porcentaje.

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FORMULA LEUCOCITARIA
TIPOS DE LEUCOCITOS PROPORCION VALORES
RELATIVA ABSOLUTOS
Neutrfilos segmentados 55-65 % 3000-5000
Neutrfilos en cayado 3-5 % 150-400
Eosinfilos 0,5-4 % 20-350
Basfilos 0,5 % 10-60
Monocitos 4-8 % 100-500
Linfocitos 25-35 % 1500-4000
CUESTIONARIO

----------------------

1.- Identificar los diferentes tipos celulares y dibujarlos realizando

una descripcin de los detalles morfolgicos (tamao, forma,
presencia y forma del ncleo)

2. Qu tipo de glbulos blancos se ven con ms frecuencia?

3.- Qu patologa podra indicar:

Un nmero excesivamente alto de leucocitos?

Un nmero muy alto de eosinfilos?
Un nmero muy bajo de linfocitos?
Un nmero muy alto de linfocitos?

P R A C T I C A No 03
TECNICAS DE
INOCULACION

8
Y SANGRIA

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INTRODUCCION
----------------------
La inoculacin experimental tiene por objeto el estudio de las propiedades
patognicas de un germen o de sus productos y en general el de ensayar
todo tipo de sustancias en animales susceptibles a su accin. Pudindose
emplearse tambin, para aislar una especie microbiana contenida en un
producto patolgico o para obtencin de suero inmune.

La especie y la condicin del animal vara de acuerdo con el

propsito del experimento. En toda inoculacin debe llevarse una tarjeta
de anotaciones de las que se controlarn los datos de procedencia, peso,
temperatura y fecha de inoculacin. Las vas empleadas para la
inoculacin pueden ser: subcutnea, intravenosa, intraperitoneal,
intracraneana, testicular y otros. Se emplean jeringas estriles; el
dimetro y la longitud de las agujas se ajustan a las vas escogidas y a la
talla del animal. En reas pilosas se acostumbra depilar y desinfectar con
alcohol yodado. Es prctica general eliminar los ectoparsitos
previamente.

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OBJETIVOS
----------------
a. Conocer y practicar las diversas vas de inoculacin.
b. Practicar la obtencin de diferentes volmenes de sangre para luego
obtener sueros inmunes (inmunoglobulinas).

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MARCO TEORICO
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I. INSTRUCCIONES GENERALES PARA INOCULAR A LOS ANIMALES

1.- Se elige una jeringa de tamao conveniente y se comprueba con

agua que no deje escapar lquido. No hay nada ms desagradable
que una jeringa con este defecto, pues no slo ensucia las manos
del operador, sino que produce prdida de una cantidad
desconocida de lquido que se inyecta.

9
 2.-Llenar con el lquido que se va inocular, midiendo la dosis por
medio de sus graduaciones o colocando la dosis exacta con una
pipeta en una cpsula petri y aspirarlo seguidamente.

3.- El animal se mantiene fuertemente sujeto amarrado en posicin no

forzada. Debe tenerse todo preparado de modo que la inyeccin
pueda darse completa y con sumo cuidado.

4.- Al prepararse el inculo tngase especial cuidado de que no

penetren partculas slidas al interior de la jeringa. Adems de
obstruir la aguja. En las inyecciones intravenosas pueden ser
causas de embolias fatales.

5.- Las burbujas de aire deben ser expelidas. Para evitar estos
trastornos una vez llena la jeringa se mantendr en posicin
vertical con la aguja hacia arriba. Hecho esto se envolver la aguja
en algodn mojado en alcohol y se presionar el mbolo suave-
mente para expulsar el aire, lo mismo del cuerpo de la jeringa. Si
en esta maniobra se expulsa una gota de sustancia a inocular, el
algodn se encargar de recogerla debindose quemar
inmediatamente despus o dejarlo en solucin desinfectante.

6.- La inyeccin debe hacerse lentamente.

7.- Cuando se haga necesario escindir la piel, con el objeto de

encontrar la vena, se recurrir a un anestsico. Cuando se trata de
venas superficiales o de inoculaciones subcutneas, la inyeccin se
hace rpida y fcilmente, sin provocar mayor dolor que el que
acompaa a las inyecciones similares en los seres humanos.

8.- Cuando sea necesario que la piel de la regin donde se ha de

inyectar est desprovista de pelos, se esquilar lo ms al rape
posible, afeitndole a continuacin, si fuere conveniente. A los
cobayos se les puede depilar o una vez esquilados aplicarles una
pasta de sulfuro de bario y almidn de maz a partes iguales,
mezclada con agua. Se le aplica esta pasta 3 4 minutos, luego se
les lava con agua caliente y luego se les seca con una toalla. Este
mtodo es recomendable cuando se ha de preparar una zona
cutnea extensa. A causa de la irritacin que puede producir s
conveniente depilar el da anterior a la inyeccin.

9.- Antes de inyectar se limpiar la piel con alcohol al 70% u otro

desinfectante.

II. VIAS DE INOCULACION

INOCULACION SUBCUTANEA

El sitio usual de inoculacin es la pared abdominal o la cara

interna del muslo; en ratas se puede realizar cerca de la base de la
cola.

10
 a. Usando los dedos pulgar e ndice izquierdos, a manera de
pinzas, levantar la piel en forma tal que se forme un pliegue.
b. Con la otra mano introducir la aguja en la base del referido
pliegue e inocular.
c. Sacar la aguja con un movimiento rpido y firme y
desinfectar con alcohol yodado.

INOCULACION INTRADERMICA

Se usa principalmente para la demostracin de reacciones de

hipersensibilidad, tanto en el hombre como en los animales.

a. Con la ayuda de los dedos ndice y pulgar izquierdos hacer

una pinza sobre la piel de la zona elegida y extenderla al
mximo.
b. Con la otra mano introducir la aguja lo ms superficialmente
posible, con el bisel dirigido hacia arriba.
c. Rotar la jeringa, de manera que el bisel de la aguja quede
hacia abajo.
d. Introducir la cantidad adecuada de inculo. La formacin de
ppula indica que la inoculacin se hizo de manera
apropiada.
INOCULACION INTRAPERITONEAL

Se realizar en la lnea media, bajo del ombligo o en la ingle

izquierda.

a. Una persona sujetar firmemente al animal y lo mantendr

con la posicin declive y con la cabeza hacia abajo.
b. Introducir la aguja bajo la piel, luego, levantando ligeramente
la mano, forzar oblicuamente el paso de la punta de la aguja
a travs de la capa muscular y el peritoneo e inocular.
c. Cuando se atraviesan los msculos y el peritoneo, se sienten
la relajacin de la pared abdominal.

INOCULACION ENDOVENOSA

Se realiza en la vena marginal de la oreja (conejos) y en animales

mayores se utiliza la yugular.

a. Inmovilizar al animal.
b. Frotar la oreja con los dedos.
c. Pasar sobre la zona a punzar, un algodn embebido con xilol,
limpiar el exceso.
d. Coger la punta de la oreja y tirar suavemente de ella,
enrollndola sobre el dedo ndice y mantenindola sujeta
entre este dedo y el pulgar.

11
 e. Punzar primero la piel y luego dirigir la aguja hacia la vena.
Aspirar ligeramente; una vez que aparece sangre en la jeringa
inocular lentamente.
f. Retirar la aguja rpidamente y hacer hemostasia
comprensiva, aplicando sobre la zona de puncin, un
algodn humedecido en alcohol yodado.
g. Colocar vaselina a la zona de puncin.

INOCULACION INTRACRANEAL

Para cobayos y ratones se hace uso de agujas resistentes; para

conejos es necesario emplear trepanos.

En el primer caso:

a. Localizar la sutura sea. Buscar de preferencia entre el ojo y

la oreja.
b. Introducir rpidamente la punta de la aguja e inocular.

III. SANGRADO

Para obtener pequea cantidad de sangre.

a. Cobayo
- Desinfectar el borde de la oreja.
- Seccionar superficialmente la zona desinfectada con
tijeras.
- Extraer algunas gotas de sangre, valindose de una pipeta
Pasteur.
b. Conejo
- Punzar la vena marginal de la oreja de acuerdo a la tcnica
descrita.
c. Ratas y ratones
- Desinfectar el extremo distal de la oreja.
- Seccionar el extremo con una tijera.
IV. SANGRIA
Este mtodo est diseado para obtener mayor cantidad de
sangre.Los animales como el conejo y el cobayo se sangra por
puncin cardiaca, venosa o arterial.

a. Puncin cardiaca

Es fcil de realizar y permite recoger mayor cantidad de sangre.

- Fijar al animal sobre el dorso.
- Depilar y desinfectar la regin precordial.
- Utilizando una jeringa de 10 ml. provista de la aguja de bisel
corto, punzar la zona elegida.
En el cobayo

12
 El punto de puncin se localiza a nivel del borde izquierdo del
esternn 8-10 mm por encima del relieve que forma la base del
apndice xifoides con el ltimo cartlago costal articulado al
esternn. Introducir de un golpe brusco la aguja a una profundidad
de 15-17 mm inclinndola ligeramente hacia la lnea media. No
extraer ms de 10 ml de sangre y retirar la aguja de golpe.

En el conejo

El punto de puncin, se ubica en el tercer espacio intercostal

izquierdo, a 3 mm por fuera del borde del esternn. A un conejo
adulto se puede extraer 10-15 ml de sangre. Otra forma de extraer
volmenes similares es realizando un corte en la vena marginal de
la oreja del conejo utilizando un bistur.

En la rata

El punto de puncin se realiza en el plexo venoso retro-orbitario.

Introduciendo una pipeta capilar en el ngulo interno de la cavidad
orbitaria. Introduciendo una pipeta capilar en el ngulo interno de
la cavidad orbitaria se logra extraer de 0,5-1 ml de sangre.

En la gallina
El punto de puncin se ubica al nivel del manubrio esternal.
En el carnero
El punto de puncin se localiza en la vena yugular.
En el caballo
El punto de puncin se ubica en la vena yugular. El caballo soporta
una sangra de 4-5 litros.

CANTIDAD DE INOCULO A INYECTAR (mL)

VIA CONEJO COBAYO RATA RATON

Subcutnea 20 10 05 1,5

Intramuscular 08 05 02 0,5

Endovenosa 10 05 03 0,5 13

Intraperitoneal 10 05 03 2,0
V. CONSERVACION DE INMUNOSUEROS

Las muestras de sangre deben ser obtenidas aspticamente y los

sueros separados, teniendo en cuenta las tcnicas destinadas a
evitar su contaminacin. Es altamente recomendable el uso de
sustancias conservadoras como fenol, timerosal (merthiolate) o
glicerina.

1. Solucin de fenol.- Se emplea una concentracin final de

0,5% (1 parte de fenol al 5% en agua por cada 3 partes de
suero).

2. Solucin de timerosal.- Se utiliza en una concentracin final

de 1/10 000 (aadir 1/100 de solucin de timerosal al 1%
por volumen de sangre).

Estas dos soluciones son los preservantes de eleccin para los

sueros antitxicos, aglutinantes y precipitantes, pero es necesario
mencionar que el fenol es anticomplementario y puede causar
coagulacin en algunos casos.

P R A C T I C A No 04

REACCIONES
ANTIGENO
ANTICUERPO
AGLUTINACIONES

14
------------------------

INTRODUCCIN
-------------------------

La determinacin del grupo sanguneo es una prctica habitual e

imprescindible para la transfusin de componente hemticos. La razn
est en que el sistema inmune de algunos individuos rechaza los
hemates de otros. Esta reaccin inmunolgica est mediada por
anticuerpos y es fcilmente visualizable in vitro mediante reacciones de
aglutinacin. Se conocen ms de 20 grupos de antgenos eritrocitarios
codificados en otros tantos loci gnicos, para los cuales existen
mltiples variantes allicas. El resultado son ms de 200 antgenos
eritrocitarios identificables. Estos antgenos varan en su
inmunogenicidad. Los ms importantes a efectos transfusionales son
los antgenos del sistema H / ABO y los del sistema Rhesus (Rh).

-----------------

OBJETIVOS
------------------

Conocer el concepto y tipos de grupos sanguneos

Entender el concepto de compatibilidad en una transfusin

--------------------------

MARCO TERICO
--------------------------

El tipo de sangre es determinado, en parte, por los antgenos de los

grupos sanguneos A, B, O presentes en los glbulos rojos.

Las dos clasificaciones ms importantes para describir grupos

sanguneos en humanos son los antgenos y el factor RH.

Las personas con sangre del tipo A tienen glbulos rojos que expresan
antgenos de tipo A en su superficie y anticuerpos contra los antgenos
B en el suero de su sangre.

Las personas con sangre del tipo B tienen la combinacin contraria,

glbulos rojos con antgenos de tipo B en su superficie y anticuerpos
contra los antgenos A en el suero de su sangre.

15
Los individuos con sangre del tipo O 0 (cero) no expresan ninguno de
los dos antgenos (A o B) en la superficie de sus glbulos rojos pero
tienen anticuerpos contra ambos tipos, mientras que las personas con
tipo AB expresan ambos antgenos en su superficie y no fabrican
ninguno de los dos anticuerpos.

A causa de estas combinaciones, el tipo 0 puede ser transfundido sin

ningn problema a cualquier persona con cualquier tipo AB0 y el tipo
AB puede recibir de cualquier tipo AB0.

La aglutinacin se produce por la actuacin de los anticuerpos (Acs) del

suero o aglutininas sobre los antgenos (Ags) de los glbulos rojos o
aglutingenos.

El grupo sanguneo es una caracterstica permanente e inmutable; su

herencia se produce como carcter dominante simpIe mendeliano

El factor Rh
En los hemates humanos existe un aglutingeno denominado factor
Rh; su existencia se puso de manifiesto por la aglutinacin producida
en presencia de aglutininas obtenidas al inyectar a conejos o cobayos
con hemates de una variedad de mono Rhesus (Macaca Mulatta).

16
METODO DIRECTO

Materiales:

Alcohol

Antisuero, A, B y D

Lanceta estril

Algodn , hisopos

Lminas excavadas

1. Desinfectar con alcohol yodado la zona donde se va a realizar la

puncin y dejar seca.
2. con una lanceta estril hacer la puncin digital y colocar una
gota de sangre en cada una de las 3 excavaciones de la lmina.
3. Agregar una gota de antisuero, A, B y D a cada una de las gotas
de sangre en forma independiente y mezclar con un agitador.
4. Cogiendo la lmina con ambas manos, efectuar movimientos de
rotacin durante 30 segundos, esperar 3 a 5 minutos y finalizado
este tiempo verificar si hubo aglutinacin.

-----------------------

CUESTIONARIO
-----------------------

Qu es un antgeno? Describa la naturaleza qumica de los

antgenos del sistema ABO y Rh
Qu es un anticuerpo?
En qu consiste una reaccin antgeno anticuerpo?
Cul es la importancia de la determinacin de los grupos
sanguneos y su factor Rh, en una transfusin?
Cul es su factor Rh?
En qu consiste la eritroblastosis fetal?Cmo podra evitarse?
 P R A C T I C A No 05

TTULO DE
ISOAGLUTINIANAS
Anti-A y Anti-B

-----------------------

INTRODUCCION
-----------------------
Los bufffer y soluciones tamponadas tienen la propiedad de ser pocos
susceptibles a cambios bruscos de pH. Consiste en una mezcla de un
cido o una base dbil, con una de sus sales donde se establece un
equilibrio inico, pudiendo tenerse en pH deseado al variar las
proporciones de las sales. Entre otros usos est el de conservar viables a
las clulas y en este sentido son ms efectivos que simples soluciones
isotnicas.
El saber preparar diluciones garantiza el trabajo de laboratorio,
normalmente se realizan diluciones para determinar el ttulo ya sea de
antgeno, anticuerpo, complemento etc.
Determinar la concentracin de antgeno o anticuerpo que participan en
una reaccin es sumamente til, porque nos permite determinar cunto
de cada una de los reactantes necesitamos porque ellos necesitan estar
en proporcin y en casos de enfermedades de acuerdo al ttulo del
anticuerpo que se va formando podemos determinar el curso de la
enfermedad.
---------------

OBJETIVOS
----------------

a. Titular Anti-A y Anti-B.

b. Entender la importancia de las titulaciones en inmunologa.

------------------------------------

MATERIALES Y METODOS
------------------------------------

N de tubo 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10

Anti-A 0,2

SSF 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

Homogenizar el primer tubo y luego transferir 0,2 mL al siguiente tubo

Agregar 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
GRH A

al 2%
 Centrifugar a 1500 RPM x 5 minutos
Homogeneizar
Realizar la lectura
Dilucin
obtenida en
cada tubo

Dilucin
obtenida en
cada tubo
con respecto
a la muestra

-----------------------

CUESTIONARIO
-----------------------

Cul es el ttulo para los anticuerpos contra antgenos febriles

Cul es el valor permisible de Anti-A y Anti-B
Ponga dos enfermedades donde se titula IgG e IgM

P R A C T I C A No 06

FIJACIN DE
COMPLEMENTO
-----------------------

INTRODUCCION
-----------------------

La definicin de complemento, de la OMS es la siguiente: El sistema

de complemento est formado por factores presentes en el suero
normal que se activan caractersticamente por complejos antgenos
anticuerpos. Como consecuencia de esta actividad ocurren varias
reacciones biolgicas.

El complemento est presente en el suero fresco de mamferos. Se

utiliza generalmente por conveniencia, suero fresco de cobayo como
fuente de complemento. Dado que algunos componentes del
complemento son muy sensibles a la temperatura, por lo que el
suero de cobayo debe mantenerse en refrigeracin. La temperatura
ptima para la activacin del complemento es de 37C. Sueros
calentados a 56C por 30 minutos pierde su actividad.

Cuando se aade complemento a un sistema antgeno (GRC) ms

anticuerpo (hemolisina) e activa al complemento y como consecuencia
de esta activacin se produce lisis de los glbulos rojos.

-----------------

OBJETIVOS
-----------------

a. Demostrar la fijacin de complemento, por la lisis celular.

b. Aplicacin de la fijacin de complemento para fines de
diagnstico.

-------------------------------------

MATERIALES Y METODOS
--------------------------------------

MATERIALES

- Antgeno. GRC al 2% en SSF

- Complemento
- Hemolisina
- SSF
- Tubos de ensayo y gradilla
- Micropipeta
1. Aadir los reactivos, segn el siguiente protocolo:
Tubo N 1 2 3 4 5
 Antgeno 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

Complemento 0,2 -.- 0,2 -.- -.-

Hemolisina 0,2 0,2 -.- -.- -.-

SSF -.- 0,2 0,2 0,4 -.-

Agua destilada -.- -.- -.- -.- 0,4

Lectura

2. Incubar a 37C en bao mara por 30 minutos.

3. Realice la lectura considerando a los tubos 4 y 5 como controles
negativo y positivo respectivamente.

-----------------------

CUESTIONARIO
-----------------------

Cul es la importancia de determinar el complemento.

La deficiencia del complemento puede producir
Cuntas vas de fijacin de complemento conoce

P R A C T I C A No 07

AISLAMIENTO E
IDENTIFICACION
DE LINFOCITOS
CD2+

------------------------
INTRODUCCION
------------------------
La cuenta precisa de los linfocitos T de la sangre perifrica del humano
ha logrado contribuciones importantes para entender:
a) Los padecimientos por inmunodeficiencia.
b) Las enfermedades autoinmunes
c) La inmunidad tumoral
d) La inmunidad de las enfermedades infecciosas.
Se considera roseta T, para aquellos linfocitos que han logrado adherir
glbulos rojos de carnero por lo menos 3 .
Algunos llegan a tener 8 a 10 GRC presentando la forma de una
mrula.
-----------------
OBJETIVOS
------------------
Reconocer a los Linfocitos T mediante la formacin de rosetas.
-------------------------------------
MATERIALES Y METODOS
-------------------------------------
MATERIALES

- Solucin de ficoll
- Solucin de hanks
- GRC frescos al 0,5% en hanks
- Albmina bovina al 12%
- Heparina
- Tubos d ensayo
- Lminas
- Microscopio
- Refrigeradora

PROCEDIMIENTO

1. Tomar 1 ml de sangre desfibrinada y colocarlo en un tubo.

2. Agregar 4 ml de PBS para diluir la sangre 1:5.
3. Mezclar bien y depositar en zona 3 ml de sangre en un tubo que
contenga 1,5 ml de Ficoll-Hypaque.
4. Centrifugar a 4000 rpm por 15minutos
5. Separar suavemente el anillo de linfocitos, con la pipeta de pasteur
y transferirlos a un tubo pequeo. Agregar 4,5 ml de PBS
6. Centrifugar a 800 rpm durante 3 minutos. Descartar el
sobrenadante y agregar 2ml de PBS. Resuspender las clulas,
agitando suavemente. Esto se hace para lavar los linfocitos y retirar
restos de Ficoll-Hypaqu
7. Centrifugar nuevamente a 800 rpm por 3 minutos y descartar el
sobrenadante resuspender las clulas en aproximadamente 0,5 ml
de PBS agregando una gota de suero de ternera fetal

FORMACIN DE ROSETAS T
 1. La suspensin de clulas debe tener 1 a 10 x 10 6 clulas/ml, y
debe contener 90-90% de clulas vivas. Las rosetas T slo se
forman alrededor de las clulas vivas. Para lo cual se depositan en
un tubo de prueba:
- 0,1 ml de los linfocitos en suspensin
- 0,1 ml de GRC
- 0,14 ml de hanks
- 0,12 mls de albmina bovina al 12%

2. Incubar a 37C por 30 minutos.

3. Centrifugar a 1000 rpm por 5 minutos
4. Colocar el tuboo sin resuspender a 4C de 18-24 horas
5. Decantar y agregar al sedimento 3 gotas de azul de toluidina ,
mezclar suavemente y reposar por 30 minutos
6. Efectuar la lectura.

Valores normales : 69 a 85%

P R A C T I C A No 08
DETECCIN DE GCH POR
DAS-ELISA

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INTRODUCCION
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Los enzimoinmunoanlisis (EIA) o ELISA (Enzyme-Linked Immuno
Sorbent Assay), se basan en dos fenmenos:
1) La elevada especificidad de los anticuerpos.
2) La alta actividad de algunas enzimas usadas en este tipo de
ensayo, por lo que permite la amplificacin de la seal generada
por la muestra.

3) La gran ventaja del ELISA sobre los otros mtodos reside en que
no requiere un equipamiento demasiado sofisticado para su
implementacin en el laboratorio. Adems los reactivos
empleados son de una vida media muy alta (en el caso del RIA,
un trazador radiactivo marcado con yodo tiene una vida media de
60 das, mientras que un conjugado enzimtico usado en ELISA,
suele conservarse en buen estado durante aos) y no se corre el
riesgo de contaminacin producidos por el manipuleo de istopos
radiactivos.
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OBJETIVOS
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Conocer el fundamento de la prueba.
Identificar las distintas etapas de la prueba.
Conocer el fundamento de la prueba.
Identificar las distintas etapas de la prueba.

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MARCO TERICO
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El anlisis hCG ELISA est basado en la clsica tcnica ELISA haciendo
el uso del sistema de alta afinidad biotina Estreptavidina. Se recubren
micropocillos ELISA con Streptavidina. En la primera etapa de la
incubacin, se mezclan muestras, calibradores o controles y el
conjungado enzimtico-anticuerpo (anticuerpo monopolyclonales anti-
hCG marcados con peroxidasa o biotinados) para formar el complejo
sndwich que se fija a la superficie de los micropocillos por la
interaccin de la Biotina con la estreptavidina inmovilizada. Al final de
la incubacin, el exceso del conjugado y antgenos no fijados son
eliminados por lavado. Se agrega TMB/Sustrato. Se forma un color
azul que se transforma a amarillo despus de parar la reaccin. La
intensidad del color es directamente proporcional a la concentracin de
hCG en la muestra. La absorvancia de los calibradores y muestras se
determina haciendo uso de un lector de micropocillos ELISA. La
concentracin en la muestra problema
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MATERIALES Y METODOS
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MATERIALES
- Conjugado enzimtico. Anticuerpo monoclonal-peroxidasa
- Reactivo A (peroxido de hidrgeno)
- Reactivo B (sustrato cromgeno)
 - GCH estandar
- Control negativo
- Placas de microtitulacin con anticuerpos policlonales contra
GCH

PROCEDIMIENTO

1. Colocar una gota de la muestra en la placa de microtitulacin.

2. Adicionar 1 gota de la enzima conjugada.
3. Incubar 3 minutos temperatura ambiente.
4. Lavar
5. Agregar una gota de los reactivos A y B.
6. Realizar la lectura.

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CUESTIONARIO
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1. Describa los principales tipos de ELISA.
2. Cul es el principio para utilizar cromgenos? Ponga ejemplos
3. Qu valores normales se tienen para la hormona que se estudi en
prctica y que valores se presentan en otros casos?

P R A C T I C A No 09

INMUNODIFUSIN
Sensibilidad de las diferentes tcnicas para la
deteccin de anticuerpos (mg/mL)

SENSIBILIDAD
MTODO
(mg/mL)

Precipitacin en gel 30

Precipitacin en anillo 18

Aglutinacin bacteriana 0,05

Fijacin de complemento 0,05

Hemaglutinacin pasiva 0,01

Inhibicin de la hemaglutinacin 0,005

Inmunofluorescencia 0,005

ELISA 0,0005

Neutralizacin bacteriana 0,00005

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INTRODUCCION
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La reaccin entre anticuerpo y antgeno soluble se denomina reaccin
de precipitacin, donde el anticuerpo se denomina PRECIPITINA y el
antgeno AGLUTINOGENO. Los antgenos pueden ser: protenas en
general, hormonas, enzimas, polisacridos etc.
Estas reacciones pueden producirse en medios lquidos o en geles
como los de agar o poliacrilamida, formndose en la zona de contacto
una banda de precipitacin.
Simple.
Doble.
Electroinmunodifusin.
Inmunoelectroforesis.
Radial.
Cohete.
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OBJETIVOS
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a) Determinar la reaccin de precipitacin por la precipitina y
aglutingeno.
b) Determinar la presencia de anticuerpos sin cuerpo.
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MATERIALES Y METODOS
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1. Sobre un portaobjeto limpio y seco distribuir 3,5 ml de Agar
fundido, dejar secar y solidificar a temperatura ambiente. Luego
poner las lminas en cmara hmeda por 15 minutos a 4C (en
refrigeracin).
2. Retirar las lminas de la refrigeradora y colocar sobre un diseo
de distribucin de los pocillos de 3 a 5 mm de dimetro con una
distancia de 3 a 5 mm entre ellos y cortar por puncin los agujeros,
haciendo uso de un sacabocado. Sellar el fondo con el mismo agar.
3. El suero se coloca en los pocitos extremos mientras que el
antgeno en el orificio central
4. Una vez llenado los orificios respectivos se llevan las lminas a
 cmara hmeda y dejar difundir a temperatura ambiente por 40 a
48 horas.
Registrar los resultados. Las reacciones pueden ser:

a. Identidad
b. No Identidad
c. Identidad parcial
5. Finalizada la difusin, sumergir las lminas en una solucin
fisiolgica tamponada pH=7,4 y dejarlas 36 horas a temperatura
ambiente. Durante este perodo deber cambiarse cinco veces la
solucin de lavado.
6. Desmineralizar las lminas sumergiendo en agua destilada por 10
minutos. Luego envolver en papel filtro (whatman N 1) previamente
humedecido en agua destilada y secar es estufa a 37C.
7. Retirar cuidadosamente el papel de filtro y sumergir las lminas
en solucin colorante por 15 a 20 minutos.
8. Decolorar escurriendo las lminas del colorante, enjuagar con
agua, escurrir y sumergirlas en solucin decolorante durante 30 a
40 minutos hasta obtener una decoloracin satisfactoria en las
zonas libres de precipitacin.
9. Observar los arcos de precipitacin.
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CUESTIONARIO
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a. Qu diferencia ocurre en la reaccin de aglutinacin directa e
indirecta?
b. Cuales son las diferencias entre aglutinacin y precipitacin?
c. Describa el fenmeno de prozona.
d. Que fuerzas intervienen en una reaccin de aglutinacin?

P R A C T I C A No 10

FAGOCITOSIS
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INTRODUCCION
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Si un agente agresor vence las barreras naturales de la inmunidad, un

segundo mecanismo de defensa entra en actividad: LA FAGOCITOSIS.

La FAGOCITOSIS, es una forma de defensa que puede ser medida

por una variedad de clulas asociadas con el sistema sanguneo, siendo
los ms importantes, los neutrfilos polimorfonucleares y macrfagos,
tanto fijos como circulantes; ambos tipos de clulas son extradas a los
lugares de infeccin o dao tisular por una serie de factores
quimiotcticos solubles, lo que vendra a constituir el primer paso dentro
de todo el proceso fagocitario.

Una vez que las clulas fagocitarias llegan al lugar donde se

encuentra el agente extrao, entra en contacto con l, mediante una
actividad mecnica u opsnica. El paso siguiente es la ingestin del
antgeno y la consecuente formacin de los FAGOSOMAS, que son
vesculas delimitadas por la membrana celular que se van a internar en el
citoplasma. Los granos celulares adquieren gran movilidad y se
aproximarn al fagosoma, depositando en su interior su contenido con la
consecuente y final digestin del antgeno.

El estudio de la fagocitosis es importante, pues permite en casos,

determinar deficiencias en los mecanismos de defensa a travs de:

1. ndice de fagocitosis

Que se realiza, colocando en una suspensin de leucocitos frescos

de partculas inertes.

Despus de un periodo de incubacin, se observan las propiedades

PolimorfoNeutrfilos, que tienen en su interior partculas
fagocitadas.

2. La actividad bactericida

Que se efecta en forma similar a la anterior, pero en lugar de

partculas inertes, se colocan en suspensin bacterias y
posteriormente con tcnicas de cultivo se establece la propiedad de
bacterias destrudas por las lizosimas de los fagosomas de los
leucocitos.

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OBJETIVOS
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Conocer las clulas que intervienen en la fagocitosis.

Entender los mecanismos y los pasos de la fagocitosis

FAGOCITOSIS IN VITRO

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MATERIALES Y METODOS
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- Paquete globular de conejo
- Suero de conejo
- Solucin de Hanks
- Colorante de Wrigth
- Agua tamponada
- Cultivo de Escherichia coli y estafilococos. Lavados dos veces y
resuspendidas en Hanks.
- Capilares de vidrio
- Tubos de WINTROBE, para microhematocrito.
- Pipetas Pasteur
- Tubos de prueba de 13x100 mm
- Lminas portaobjetos y cubreobjetos
- Estufa
- Centrfuga
- Bao mara
- Microscopio
- Aceite de inmersin
PROCEDIMIENTO

1. Extraer 5 ml de sangre de conejo y repartirlo en partes iguales en

dos tubos de 13x100 mm. Uno con anticoagulante.
2. Colocar la sangre con anticoagulante en un tubo de wintrobe y
centrifugar a 500 rpm por 10 minutos.

3. Eliminar el plasma sanguneo.

4. Extraer la capa blanca que recubre los glbulos rojos
sedimentados, resuspendindolos en un tubo que contenga 0,5 ml
de solucin de Hanks.
5. A la suspensin de glbulos blancos agregar: 0,5 ml de bacterias
lavadas ms 5 gotas de suero, ms 0,5 ml de solucin de Hanks.
6. Incubar en bao mara a 37C, agitndolo frecuentemente. A
intervalos de 10, 20 y 30 minutos, tomar 0,3 ml de la mezcla y
colocarlo en un tubo de hemlisis.
7. Centrifugar a 500 rpm por 10 minutos, decantar el sobrenadante y
efectuar un frotis del sedimento.
8. Dejar secar al aire y colorear con Wrigth.
9. Observar con el objetivo de inmersin
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RESULTADOS
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OBSERVACIONES 10' 20' 30'

N de bacterias
fagocitadas
FAGOCITOSIS IN VIVO

PROCEDIMIENTO

1. Inocular un ratn albino, 0,5 ml de un cultivo de Escherichia coli

calentado por 10 a 80C, por va intraperitoneal.
2. Dejar el ratn en reposo por una semana, controlndole
peridicamente.
3. Dos horas antes de la prueba, el ratn que ha sido previamente
inoculado, inyectar por va intraperitoneal 0,5 ml de cultivo en
caldo de Escherichia coli, ajustando al tubo N 3 de escala de Mac
Farland.
4. Hacer una inoculacin igual a otro ratn, al que no ha sido
inoculado previamente. Otro servir de control.
5. A las dos horas del paso anterior, sacrificar los ratones
colocndolos en una cmara de ter.
6. Abrir la cavidad abdominal y con una torunda tomar muestras de
las paredes abdominales y realizar frotices en las lminas
portaobjetos limpios.
7. Colorear por el mtodo Wright:
* Cubrir la lmina con el colorante wright y dejar por 5
* Agregar agua tamponada y dejar por 10.
* Lavar con agua tamponada, dejar secar y observar.
8. Observar a inmersin las bacterias libres y fagocitadas.

RESULTADOS

OBSERVACIONES 1 2 3

N de bacterias
fagocitadas

1 = Ratn previamente inoculado.

2 = Ratn sin inoculacin previa.

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CUESTIONARIO
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Qu es la fagocitosis?
Explique los pasos de la fagocitosis
 P R A C T I C A No 11

SEPARACIN DE
INMUNOGLOBULINAS DEL
SUERO
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INTRODUCCION
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Para separar protenas de una mezcla, se utilizan las propiedades fsico
qumicas que estas tienen. As utilizando diferentes tcnicas se separan las
protenas sricas: ultracentrifugacin o filtracin en gel, separan protenas
de acuerdo a los pesos moleculares, la electroforesis demuestra las
diferencias en carga inica y las sales concentradas, precipitan protenas
de acuerdo a su solubilidad.
El propsito de la prctica es hacer una demostracin de la precipitacin
diferencial de inmunoglobulinas con solucin saturada de sulfato de
amonio (SSSA). Es necesario tener en consideracin el grado de
purificacin obtenido con este mtodo sirve como punto de partida para la
separacin de inmunoglobulinas de suero y luego se completara en
columnas de filtracin en gel o intercambio inico.
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OBJETIVOS
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a. Demostrar la precipitacin diferencial de las inmunoglobulinas.
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MATERIALES Y METODOS
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MATERIALES
- Suero
- SSSA
- Beaker pequeo
- Pipeta de 10 ml
- 2 pipetas de 5 ml
- Bagueta
- Tubos para centrfuga
- Frascos de 20 ml de agua destilada
- SSF (aadir timerosal 1/10000)
- Bolsas de dilisis
- 1 probeta de 1 litro de capacidad
- Solucin saturada de cloruro de bario
- Centrfuga
PROCEDIMIENTO
1. Medir 10 ml de suero y depositarlo en el beacker.
2. Agregar 5 ml de SSSA, lentamente, agitando con la bagueta. Observar
la precipitacin que se forma (Igs y SSSA).

3. Trasvasar la precipitacin a un tubo de centrfuga y centrifugar a 3500

rpm por 10 minutos.
4. Separar el sobrenadante del sedimento.
5. Resuspender el sedimento en 5 ml de agua destilada
6. Colocar el sobrenadante nuevamente en el beacker y aadir 2,5 ml de
SSSA para volver a precipitar
7. Centrifugar nuevamente a 3500 rpm por 10 minutos. Descartar el
sobrenadante y resuspender el sedimento en 2,5 ml de agua destilada.
8. Colocar los sedimentos resuspendidos en una bolsa de dilisis y dializar
contra salina durante 3 das, cambiando peridicamente el lquido de
dilisis para eliminar el sulfato de amonio. Se comprueba la presencia
de sulfato por el enturbiamiento con una solucin saturada de cloruro
de bario.

INMUNOPRECIPITACION

Aadir 20 l de protena G PLUS-agarosa o protena A / G PLUS-agarosa, a 40

l de suero humano

Mantener en un rotador tubo a 4 durante 30 minutos.

Centrifugar a 13000 rpm durante 1 minuto, se descarta el sobrenadante y

aadir 1 ml de tampn HNT G. Mezclar suavemente y centrifugar de nuevo.
Repita este paso 4 veces, utilizar PBS durante el ltimo lavado.

Descartar tanto sobrenadante como sea posible y aadir 15 l de tampn de

carga 2X.

Calentar las muestras durante 5 min a 95, de centrifugacin y realizar SDS-

PAGE.
 P R A C T I C A No 12
INMUNOELECTROFORESIS

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INTRODUCCION
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La inmunoelectroforesis viene a ser una herramienta para la identificacin de
inmunoglobulinas y anticuerpos y hacer diagnstico de enfermedades
importantes relacionados con el suero sanguneo orina u otro lquido biolgico.
El desarrollo de la presente prctica esta sujeto a la obtencin de
inmunosueros de un conejo a partir de un suero sanguneo humano el que se
utiliza como inmungeno.

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OBJETIVO
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1. Obtener anticuerpos especficos en conejos utilizando suero humano como
antgeno
2. Realizar la separacin de las bandas de precipitacin de las diferentes
inmunoglobulinas por el mtodo electrofortico
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MARCO TERICO
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EI principio de la inmunoelectroforesis consiste en combinar la electroforesis y

la inmunodifusi6n radial.
La tcnica es la siguiente.
Se dispone de una placa de vidrio. Se recubre esta con una capa de agar,
sobre la cual se escavan un pocillo central y un canal lateral. En el pocillo se
deposita una gota del suero a estudiar. EI canal lateral se reserva para el
antisuero, es decir para el anticuerpo.
Se conecta una corriente elctrica de manera que el suero depositado en el
pocillo se descomponga por electroforesis.
AI final de la electroforesis, el suero del paciente se encuentra descompuesto
en sus principales fracciones Estas son las que deben analizarse. Entonces, se
vierte en el canal lateral el antisuero, es decir la mezcla de anticuerpos que
reaccionaran con las diferentes fracciones del suero a estudiar.

Se dejan difundir en el agar el suero el antisuero.

En el punta de encuentro antigeno-anticuerpo aparecen reas de precipitacin
especficos. Cada arco corresponde a una fracci6n determinada del suero a
estudiar. Estas precipitinas son especficas. Se Ileva a cabo una tincin de la
preparacin para hacer posible su lectura.
Gracias a la inmunoelectroforesis se han podido poner de manifiesto en el
suero humane numerosos componentes distintos. Las diferentes
inmunoglobulinas que nos interesan especialmente en inmunoalergologia han
si de identificadas por este mtodo.

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MATERIALES Y METODOS
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MATERIALES

Suero humano (Ag)

Suero de conejo (Ac)
Agar noble
Solucin stock de merthiolate
Buffer veronal pH 8,6
Colorante amido black 10B
Solucin tamponada

PROCEDIMIENTO

Para obtener el inmnosuero: Inocular 2,5 ml de suero sanguneo con 2,5

ml de adyuvante. Va intraperitoneal. Despus de 7 das volver a inocular
2,5 ml de suero ms 1,5 ml de adyuvante, despus de 7 das desarrollar la
sangra.
Para preparar las laminas distribuir 3,5 ml de agarosa sobre un
portaobjetos limpio, dejar solidificar al medio ambiente y luego siguiendo
un diagrama establecido realizar los cortes del agar mediante sacabodados,
luego sellarlos. Colocarlos en cmara hmeda.
Colocar el suero humano en el orificio y colocar en la cuba electrofortica
en solucin tamponada, Para establecer continuidad a cada lmina colocar
una tira de papel de filtro embebida de la solucin tamponada.
El tiempo de corrida del antgeno es de 90 minutos, y la diferencia de
potencial entre los extremos de la lmina debe ser de 20 voltios.
Colocar en el canal central el suero de conejo (anticuerpo) y dejar en
cmara hmeda por 24 horas a temperatura ambiente.
Sumergir las lminas en solucin tamponada pH 7,4 y dejar a
temperatura ambiente por 24 horas cambiando dos veces por lo menos la
solucin.
Sumergir las lminas en agua destilada por 10 minutos y colocar en estufa
a 37C recubiertas de papel de filtro.
Sumergir las lminas en solucin colorante durante 15 a 30 minutos.
Escurrir, lavar y sumergir en solucin decolorante por 30 a 40 minutos
hasta obtener una decoloracin satisfactoria.
Realizar la lectura.