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Alcamidas maca (Lepidium meyenii) bioactivos son el

resultado de las prcticas tradicionales de secado


posterior a la cosecha Andino
Eliana Esparza a, Antonella Hadzich a, Waltraud Kofer a, Axel Mithfer b, Eric G.
Cosio a,

Resumen

Maca, Lepidium meyenii Walpers (Brassicaceae), es una planta anual herbcea de las altas mesetas de la
sierra central del Per. Sus hipocotilos de almacenamiento subterrneos han sido un agente medicinal
tradicional y alimento bsico desde tiempos precolombinos. Propiedades reportadas incluyen efectos
energizantes y para mejorar la fertilidad. Los informes publicados se han centrado en los bencilalcamidas
(macamidas) presentes en hipoctilos secos como uno de los principales componentes bioactivos.
Macamidas son amidas secundarias formadas por bencilamina y un resto de cido graso, con diferentes
longitudes de cadena de hidrocarburos y grado de insaturacin. Aunque se ha supuesto que son por lo
general presente en los tejidos no daados frescos, los anlisis demuestran que son esencialmente
ausentes de ellos. Sin embargo, hipoctilos secos por las prcticas de poscosecha andino tradicionales o
secado en horno industrial contienen hasta 800 molg -1 peso seco (2,3 molg -1 peso seco) de macamidas.
En este estudio, la generacin de macamidas y sus precursores putativos fueron estudiados durante los
ensayos tradicionales de secado de nueve semanas en 4200 m de altitud y en hornos bajo condiciones de
laboratorio. Ciclos hielo-deshielo en el campo abierto durante el secado produce resultado de la maceracin
de tejidos y la liberacin de cidos grasos libres de los lpidos de almacenamiento y de membrana hasta
niveles de 1,200 g g -1 en peso seco (4,3 molg -1 en peso seco). el metabolismo endgeno de los
isotiocianatos generados a partir de la hidrlisis de glucosinolatos en resultados de secado en los valores
mximos de bencilamina 4300 g g -1 peso seco (40,2 molg -1 peso seco). Existe coeficientes de
correlacin de los perfiles de acumulacin de bencilamina y cido graso libre al de macamidas mostraron
buenos valores de 0,898 y 0,934, respectivamente, lo que sugiere que ambos proporcionan sustrato
suficiente para la sntesis de amida durante el secado.
Palabras clave: Maca, Lepidium meyenii, Brassicaceae, el procesamiento post-cosecha, alcamidas,
macamidas, glucosinolatos, bencilamina, bencil isotiocianato, amida de cido graso hidrolasa.

1. Introduccin los ltimos diez aos, a ms de 10 millones de dlares


en 2013 (SCIICEX, 2013). Maca presenta tres
Maca (Lepidium meyenii Lepidium peruvianum fenotipos principales, rojo, amarillo y negro (Fig. 1), en
Walpers o Chacn), una planta herbcea anual de la funcin de su hipoctilo y el tallo coloracin. Como en
familia Brassicaceae, es nativa de los Andes la mayora Brassicaceae, glucosinolatos se acumulan
centrales. Es la nica especie del gnero reportados en los tejidos, de los cuales bencillglucosinolato(1)
Lepidium que muestra una hipocotilo fundido y raz (Fig. 2) es el producto principal. Dependiendo del
pivotante que forma un rgano de almacenamiento quimiotipo, cantidades menores de los derivados de
subterrneo que est bien adaptado a la dureza del bencilo, hidroxi o metoxilados 3- o 4- (14-17) (Fig. S1)
clima de la meseta central andina de gran altitud. La y de triptfano compuestos derivados (18-20) pueden
planta, tambin mencionado como un '' cosecha estar presentes (Fig. S1) ( Li et al, 2001;.. Piacente et
perdida de los Incas '' (NRC, 1989), ha sido cultivada al., 2002, Clment et al, 2010;. Ybar et al, 2011).Los
y utilizada con fines alimenticios y medicinales desde informes publicados sugieren que las diferencias en la
tiempos precolombinos.Se ha ganado la atencin en composicin qumica de los fenotipos estn asociadas
las ltimas dos dcadas debido a los informes sobre con los efectos biolgicos reportados o de destino
las propiedades medicinales que lo convierten en un mdico para el que se pueden utilizar estos diferentes
buen candidato para el mercado nutracutico tipos. Por ejemplo, maca negro es til para estimular el
(Canales et al, 2000;. Dini et al., 1994). Como recuento de espermatozoides (Gonzales et al., 2006),
consecuencia de ello, informaron las exportaciones
peruanas de maca seca y procesados aumentaron mientras que maca rojo es ms til para el tratamiento
casi cuatro veces en de la hiperplasia benigna de la prstata (Gonzales et
al., 2005). maca negro tambin se ha informado a presin atmosfrica tpicas del entorno de gran altitud
aumentar la memoria y el aprendizaje en ratones (> 3500 m), donde crece la maca. La variabilidad en
(Rubio et al., 2006, 2007). Otras propiedades las condiciones ambientales durante el secado, y en el
declaradas que no pueden estar relacionados con manejo del producto, lo que implica considerable
fenotipo incluyen el aumento de la fertilidad femenina magulladuras de los tejidos, significa que uno puede
y la libido (Ruiz-Luna et al., 2005) y un efecto esperar variaciones en las cantidades de los productos
estimulante sobre el sistema nervioso central a travs hidrolticos de los principales compuestos de
de la inhibicin de hidrolasas de mamferos de almacenamiento maca presentes en los tubrculos,
amidas de cidos grasos (FAAH) y la potenciacin del que puede a su vez, afectar a sus propiedades
sistema endocannabinoide (Pino-Figueroa et al., nutracuticas. En este trabajo, los efectos del proceso
2011). Wang y colaboradores (2007) han publicado de secado en los niveles de los macamidas segn los
un resumen completo sobre las propiedades informes bioactivos y de sus precursores metablicos
biolgicas y farmacolgicas de la maca reportados. putativos fueron investigados (Fig. 2) durante las
prcticas de procesamiento post-cosecha tradicionales
e industriales. Se demuestra que las amidas son un
producto intrnseca del proceso de secado que implica
la liberacin hidroltica y la transformacin metablica
de los lpidos y los glucosinolatos en sus cidos
grasos y bencilamina precursores libres.

Fig. 1. Maca hipocotilos de tres fenotipos caractersticos,


amarillo, rojo y negro. (Para la interpretacin de las
referencias a color en esta leyenda de la figura, se remite al
lector a la versin web de este artculo).

El secado de tejidos de la planta, ya sea durante la


produccin de semillas o por la accin humana como
en el procesamiento post-cosecha, es un proceso
bioqumico complejo en el que el grado de dao a los
tejidos y las reacciones siguientes durante la
desecacin determinar la composicin y la viabilidad
del producto. Maca se exporta de forma rutinaria en
forma de harina obtenida de campo o hipocotilos
secadas al horno o de material fresco liofilizado. La
diferencia en la composicin entre estos productos
es, como se esperaba, significativa y depende del
grado de actividad que varias enzimas hidrolticas
han tenido, en especial la de los tioglucsidos
endgenos (mirosinasas). Por lo tanto, un criterio
considerado como importante para la calidad del
producto secado es los niveles de glucosinolatos, que
se espera para parecerse lo ms posible a los valores
originales (Xing-Hao et al., 2014) y de sus metabolitos
hidrolticas, tales como isotiocianatos aromticos y Fig. 2. La principal glucosinolatos la maca y metabolitos
sus aldehdos ms estables, nitrilos y alcoholes. analizados en este estudio. BGL (1): benzylglucosinolate,
La mayor parte de harina de maca se obtiene BITC (2): isotiocianato de bencilo, BIOC (3): isocianato de
bencilo, BCN (4): nitrilo bencilo, BOH (5): alcohol benclico,
generalmente de hipoctilos que se han secado al BCHO (6): benzaldehdo, BNH2 (7) : bencilamina, hexanal
aire libre en el sitio al menos por algunas semanas (8), FFA 18: 2 (9): cido linoleico (9), FFA 18: 3 (10): cido
antes de la estufa de secado a 60? C. El secado linolnico, MAC 16 (11): hexadecanamida N-bencilo, MAC
18: 2 (12 ): N-bencil- (9Z, 12Z) octadecadienamide, MAC 18:
tradicional campo abierto por lo general toma ms de 3 (13): N-bencil- (9Z, 12Z, 15Z) octadecatrienamide.
dos meses y consiste en la exposicin a los ciclos
extremos de temperatura y las condiciones de luz
intensa y baja
2. Experimental
la muestra, la columna se lav con de CH2Cl2-hexano
2.1. Procedimientos generales y de instrumentacin (4ml, 2:1). Las impurezas se eliminan con CH2Cl2-
Caracterizacin estructural de amidas sintticos se hexano (8 ml, 3: 1) y la fraccin amida con CH2Cl2
puro seguido de CH2Cl2-EtOAc (8: 1). Los dos eluidos
realiz usando un Bruker 300 UltraShield RMN
(Karlsruhe, Alemania), una serie Perkin Elmer 1600 se combinaron, se evaporan a sequedad y se
(Waltham, MA) espectrmetro de FT-IR y un almacenan a -20 C bajo gas N2. Las amidas
ThermoSpectronic Genesys 6 (Rochester, NY) UV / sintticos se caracterizan por RMN, IR, LC-MS y GC-
Vis espectrofotmetro. Los registradores de datos MS (ver Informacin suplementaria para datos
espectroscpicos de las amidas sintticos).
para las variables ambientales durante los estudios
de secado de campo fueron OM-62 unidades de
Omega Engineering (Stamford, CN) y un sistema de 2.4. Material vegetal
XR5 SE desde Pace Cientfica (Mooresville, Carolina
Cuatro lotes cosechados de forma independiente de la
del Norte), equipado con una temperatura y humedad
maca, desde los campos de cuatro productores
sensor de TRH-100 y un SRS-100 medidor de
asociados a diferentes ECOANDINO S.A.C. (Lima,
radiacin solar. Tratamiento estadstico y anlisis de
Per) se pusieron a secar al aire libre en un campo
regresin no lineal se realizaron utilizando SigmaPlot
situado a 4128 m de altitud, 2 km al norte de la ciudad
11 para Windows (Systat Software).
de Junn (UTM 18 L 391976m E, 8768061m S) en el
centro de Per entre junio y agosto de 2011 y 2012.
2.2. productos qumicos
Todos los lotes se secaron bajo las mismas
condiciones y se expusieron al aire durante el da y se
Becilglucosinalatos (1) se obtuvo de Calbiochem / cubren por la noche con lona de plstico para evitar
Merck Biosciences (San Diego, CA). las heladas. Sobre una base semanal, se tomaron
Bencilisotiocianato (2), becil nitrilo (4), alcohol muestras aleatorias de 10 hipocotilos (20-100 g de
benclico (5), benzaldehdo (6), isocianato de bencilo peso total) entre 0,5 y 4 cm de dimetro de cada uno
(2), cidos grasos (9, 10) y reactivos para la sntesis de los 4 lotes y colocados directamente en cestas
de amida se obtuvieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, metlicas en 10 L CX 100 contenedores Taylor-
MO ). Hexanal era de Accustandard (New Haven, Wharton llenos N2 lquido. Los contenedores fueron
CT). Todos los otros disolventes y reactivos fueron de enviados a nuestro laboratorio y se mantuvieron en N2
grado analtico o HPLC. lquido hasta que se analizaron. Las muestras
contenan un surtido de los fenotipos conocidos de
2.3. Sntesis de normas macamida maca (negro, prpura, amarillo y rojo). Para ensayos
de secado del horno en el laboratorio, frescas
Los bencilamidas de palmtico, linoleico y linolnico hipoctilos de maca amarillo se obtuvieron de un
se sintetizaron para su uso como estndares para la mercado local en Lima, Per, con un tamao uniforme,
cuantificacin en la obra. Para ello, el mtodo general de aproximadamente 3 cm de dimetro. Estos se
de Kataoka y colaboradores (1996) se adapt como lavaron con H2O destilada, pat-seca con papel de filtro
sigue: cido graso (1 mmol), catalizador de 4- y desmenuzada. A continuacin, se colocaron en
pirrolidinil-piridina (0,5 mmol) y bencilamina (1,5 placas de Petri, que se colocaron en un horno a 45 C.
mmol) se mezclaron en CH2Cl2 (10 ml) en una Se tomaron muestras a 0, 1, 2, 5, 10 y 24 h para el
agitacin constante a 0 C, despus de lo cual N, anlisis de HPLC y en 0, 1, 2, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22 y
Ndicyclohexylcarbodiimide (1,0 mmol) disuelto en 24 h para el anlisis de VOC por GC- espacio de
CH2Cl2 (5 ml), se aadi lentamente a la mezcla cabeza SRA.
(Montalbetti y Falque, 2005). progreso de la reaccin
se control por TLC en 10 cm Si 60 placas F254 2.5. La extraccin del material vegetal
(Merck, Darmstadt, Alemania) utilizando CH2Cl2
como fase mvil. La mezcla de reaccin se filtr a hipocotilos maca, congelados en N2 lquido se
travs de filtros Whatman GF-A, con el filtrado se molieron en un molino de anlisis IKA A11 (Staufen,
extrajo con 10% ac. NaOH (x3); a continuacin, este Alemania) con porciones (1 g) colocados directamente
procedimiento se repiti usando HCl 10%. La fase en botellas de centrfuga de polipropileno (50 ml) que
orgnica extrada se sec (Na2SO4 anhidro), se filtr, contena H2O-MeOH (10 ml, 30:70, v / v) previamente
y se diluy con un volumen medio de hexano. La
mezcla se someti a cromatografa de gel de slice 60 calentada a 70 C. Las botellas se lav
de columna (4 g, 10 x 1 cm column) Y se acondiciona abundantemente con gas N2, se cerraron y se
con hexano CH2Cl2- (10 ml, 2: 1). Despus de cargar colocaron en un bao de agua con agitacin a 70 C
se filtr a vaco a travs de filtros Whatman GF / A y durante 1 h. a continuacin, se centrifugaron a 10
se recogi el filtrado en tubos de cultivo de vidrio (50 000x g por 15 min. El sobrenadante
ml) con tapones de tefln alineados. El sedimento se temperatura nebulizador; capilar de alta tensin en -
volvi a extraer por 15 min (x 2) y se agruparon los 4000 V, la salida del capilar en 116,9 V, espumadera
sobrenadantes filtrados. Las muestras se 40,0 V, la trampa de la unidad 41.0 y rango de
almacenaron bajo N2 a -20 C hasta que se exploracin (m / z) 125-700.
analizaron. El mismo procedimiento se utiliza para
maca rallado en experimentos de secado en horno. 3.8. Anlisis de bencilamina y aminocidos libres

3.6. Anlisis de amidas, cidos grasos libres y los Las aminas fueron analizadas por derivatizacin con
isotiocianatos o-ftaldialdehdo (OPA), seguido de HPLC de fase
inversa. Cada extracto MeOH combinado (200 LL) se
Macamidas (11-13), cidos grasos insaturados libres diluy con tampn de borato 0,4 M Na (250 lL, pH 9,5)
(9-10) e isotiocianato de 2 bencil se analizaron como antes de aadir el reactivo OPA (50 IL). El reactivo
una modificacin de los mtodos reportados por contena OPA (27 mg) en EtOH (0,5 ml) diluido con
McCollom y colaboradores (2005) y Ganzera y tampn de borato de sodio (5 ml) y 2-mercaptoetanol
compaeros de trabajo (2002). Las muestras estaban (25 lL). La mezcla se agit en vrtice durante 1 min, se
en H2O-MeOH (50:50, v / v) de columna con 7 ml se deja a temperatura ambiente durante 3 min y se
carg en una Merck LiChrolut RP-18 (500 mg) inyectaron 20 lL para el anlisis HPLC. HPLC
invierten SPE de fase. Las columnas se lavaron con instrumentacin fue el mismo que para los anlisis de
H2O-MeOH (5 ml,, v v 50:50 /) y se diluy con MeOH macamida. La columna utilizada fue una Merck
(2 ml). El anlisis por HPLC del eluato se llev a cabo LiChrospher 100 RP-18, 125 mm? 4,6 mm de dimetro
en un sistema de bomba de HPLC cuaternaria Merck- interno (5 lm). La temperatura del horno se mantuvo a
Hitachi LaChrom D-7000 con horno de columna 30? C y la deteccin se realiz a 340 nm. El sistema
acoplada a un L-7450 un detector de matriz de disolvente consisti en MeOH (disolvente A) y tampn
diodos. A Merck LiChrospher 100 RP-18, de 250 de NaOAc 20 mM, pH 6,0 (disolvente B). El programa
mm? 4,6 mm de dimetro interno (5 lm) la columna se consista de un gradiente de 9 min desde 40% a 100%
utiliz para las separaciones. El programa disolvente de A y 4 min a 100% A (vase la Fig. S5). El mismo
se muestra en la Tabla S1 en la informacin procedimiento se utiliza para el anlisis de
complementaria. El horno de la columna se ajust a aminocidos, excepto que el gradiente de HPLC fue
40 C, el flujo a 1 ml min? 1, y el volumen de cambiado a comenzar en 15% de A, se mantuvo
inyeccin fue de 20 lL. La elucin se monitoriza a 210 durante 5 min, a continuacin, a partir de 15% a 25%
nm. Los resultados presentes macamidas totales de A en 5 min y se mantuvo a 25% de A durante 2
como suma de los compuestos 11-13. cidos grasos min. Despus de eso, tomada a 50% de A en 12 min,
libres (AGL) son la suma de los compuestos 9 y 10. despus a 70% de A en 9 min, y finalmente a 100% de
A en 9 min y se mantiene a 100% de A durante 6 min.
3.7. El anlisis LC-MS de macamidas
3.9. Anlisis de glucosinolatos
LC-MS anlisis se llevaron a cabo en un sistema
binario de HPLC Agilent 1200 bomba acoplada a un Becncilglucosinalatos (1) se analiz como su
detector de diodos Agilent 1260 Infinity conectada en contraparte desulfatado con una ligera modificacin de
serie con una trampa de iones Bruker Esquire 6000 la bibliografa (Brown et al, 2003;.. Mldrup et al, 2011)
ESI-MS. La columna utilizada fue una Merck se diluyeron alcuotas de los extractos de hipoctilo se
LiChrospher 100 RP-18, 250 mm? 4,6 mm de agrupan en H2O-MeOH (50:50, v / v) con 1,5 ml aplica
dimetro interno (5 lm). Se ejecuta se realizaron a 40 sobre columnas Agilent Bond Elut SPE-SAX
C y un flujo de 1ml min x1. El disolvente A consista acondicionado (500 mg). Este ltimo secuencialmente
en MeOH-H2O (95: 5, v / v) y B de CH3CN. Ambos se lavaron con MeOH-H2O (5 ml, 70:30, v / v) y
disolventes contienen 0,005% HCOOH. El gradiente despus se acondicion con tampn de 0,02 M MES
de elucin se modific debido a que es un (1 ml, pH 5,2) despus de lo cual 150 lL de sulfatasa
instrumento de gradiente binario, al contrario que en (H-1, Helix pomatia, se aadi Sigma, St. Louis, MO) y
la seccin anterior. Un 4 min inicial a 65% de B las columnas se incubaron durante la noche a
seguido de un gradiente de 2 min de 65% a 85% de temperatura ambiente. Los siguientes das los
B, 20 min de 85% a 100% de B y un 10 min final en desulfoglucosinalatos se diluyeron con MeOH-H2O
100% parmetros B. ESI-MS fueron las siguientes: 70 (800 lL, 70:30, v / v) y H2O (800 lL). Ambos eluatos se
psi presin nebulizador, 12 L min -1 N2 flujo, 365 C combinaron en viales de 2 ml del muestreador
una Merck LiChrospher 100 RP-18, 250 mm? 4,6 mm automtico y se utilizan directamente para el anlisis
de dimetro interno columna (5 lm), la temperatura por HPLC. El anlisis por HPLC se realiz utilizando
del horno 30? C y una velocidad de flujo 1 ml min? 1. masas NIST y NIST 2011 biblioteca espectral de
Se inyectaron muestras (20 LL) y la elucin se masas.
monitoriza a 229 nm. El programa de gradiente
utilizado CH3CN (disolvente A) y H2O (solvente B) y 2. Resultados y discusin
fue el siguiente: 6 min de 2% de A a 5% A, 2 min 5%
de A a 7% A, 10 min 7% de A a 21% A , 5 min 21% 2.1. Amida, amina y contenido de cidos grasos libres
de a a 29% a, 2 min 29% de a a 100% de a y 2 min a en la maca seca
100% a (Brown et al., 2003). LC-MS anlisis utiliza la
misma columna y gradiente se describe en el prrafo Macamidas son bencilalcamidas secundarios
anterior. parmetros ESI-MS se configuran de la bioactivos reportados en hipocotilos de L.meyenii
siguiente manera: la presin del nebulizador 65,0 psi, (Ganzera et al, 2002;.. McCollom et al, 2005;. Zhao et
12L min -1 flujo de N2, temperatura nebulizador 365 C, al, 2005;. Muhammad et al, 2002). Aunque el material
de alta tensin capilar -4000 V, la salida del capilar utilizado para el anlisis en estas publicaciones
113,5 V, espumadera 40,0 V, el motor trampa de consista en hipoctilos secos o productos disponibles
37,8, rango de exploracin 100- 700( m / z) comercialmente obtenidos a partir de ellos, se ha
(Matthus y Luftmann, 2000). Para el propsito de supuesto que los macamidas estaban presentes
este trabajo slo se BGL (1), como el principal tambin en hipocotilos frescas como es el caso con
glucosinolatos, se identific y cuantific. otras especies reportadas para contener alcamidas
(Martin-Tanguy et al, 1978;. Greger, 1984; Molina-
3.10. El anlisis de COV Torres et al, 1999;.. Clifford et al, 2002). En el estudio
de anlisis de HPLC en el presente documento de
Espacio de cabeza fase micro-extraccin slido (HS- recin o de maca fresca liofilizado mostraron niveles
SPME) de los voltiles se realiz mediante fibras de muy bajos o indetectables de las amidas (Fig. 3a). Por
slice fundida recubierta con una capa 30 lm de DVB / esta razn, un anlisis comparativo se llev a cabo del
Carboxen / PDMS (divinilbenceno / Carboxen / material obtenido por el mtodo de secado tradicional
polidimetilsiloxano) (Supelco, Bellefonte, PA). Las con muestras frescas liofilizados. Esta secuencia
fibras fueron acondicionadas siguiendo las analtica (Fig. S2) fue elegido para proporcionar un
instrucciones del fabricante de la exposicin en el procedimiento simplificado para la determinacin de
puerto de inyeccin de GC a 270 C durante 30 min. un nmero de productos que se espera de la hidrlisis
Para el anlisis, de maca rallado (x10 g) se colocaron (cidos grasos libres, aminas, isotiocianatos y otros
en una cmara de vidrio cilndrico cerrado (13 x 11 compuestos orgnicos voltiles (COV)) junto con el
cm) con una tapa con tres puertos con septos glucosinolatos (1) y amida (11-13) niveles. La Tabla 1
inyeccin. La cmara se coloc en un horno a 45 C. muestra una comparacin de los niveles de estos
fibras SPME se introdujeron a travs de los tabiques metabolitos en ambas preparaciones durante nuestra
para exponerlos a la cmara de aire dentro (vase la evaluacin inicial del Centro Internacional de la Papa
Fig. S7). fibras SPME fueron expuestos al espacio de (CIP, Lima) germoplasma o de muestras comerciales.
cabeza por 30 min. Despus de la exposicin, las El material fresco liofilizado mostr consistentemente
fibras se insertan en el orificio de inyeccin del GC altos niveles de glucosinolatos de bencilo (BGL, 1),
para el anlisis. GC-MS anlisis se realiz utilizando pero baja, o no detectables, niveles de cidos grasos
un Agilent 7890 GC acoplado a un cuadrupolo 5977 libres (9, 10), bencilamina (BNH2, 7) y amidas (11-13)
MSD. El GC estaba equipado con una columna DB-5 (vase Fig. S4 y S5 para los perfiles de LC BGL y
ms (espesor de la pelcula 30 m x 0,25 mm, 0,25 m). BNH2 en material fresco y secado). El material
temperatura del inyector se fij en 250 C; divisin fue tradicionalmente seca mostr consistentemente
5: 1, y la tasa de flujo del gas portador helio era 0,9 niveles de amidas, aminas y cidos grasos libres que
ml min -1. La temperatura del horno se llev a cabo eran al menos un orden de magnitud mayor, y BGL (1)
inicialmente a 45 C durante 4 minutos y despus se niveles que eran menos de un tercio de las muestras
elev a 280? C a 12 C min-1. y finalmente llev a frescas.
cabo durante 3 minutos a 280 C. La ionizacin se
estableci en 70 eV. Identificacin de los compuestos tabla 16
se realiz por el uso de los estndares puros, los
ndices de retencin y por espectro de masas. Masa .
anlisis espectral utilizado AMDIS 32 (versin 2.69, el
NIST), el programa de bsqueda de espectros de

metabolitos secundarios en hipoctilos de maca secos


obtenidos por cualquiera de liofilizacin de material fresco
congelado en nitrgeno lquido o mediante secado al aire
libre tradicional. Los resultados son la media de siete
experimentos independientes (n = 7). Las muestras fueron
analizadas a partir de los mismos lotes cosechados.

Fig. 3. Amida y perfiles de HPLC de cidos grasos de la


maca fresca y seca. extractos de MeOH de liofilizado
fresco (a) y el campo abierto secaron (b) hipocotilos
se analizaron por cromatografa lquida de fase
inversa. El material tradicionalmente seco tiene significativamente mayor tamao relativo pico para el C16: 0 (11), C18:
2 (12) y C18: 3
(13)

macamidas y para linoleico libre (9) y linolnico (10) (en cajas de lnea de puntos ). Bencil isotiocianato (2) se muestra
en un cuadro de lnea continua. La elucin se monitoriza a 210 nm.
Los niveles ms altos de isotiocianato de bencilo campo en nueve semanas en la alta meseta de Junn
(BITC, 2) observada en material fresco eran un (ver Fig. S3 para condiciones ambientales durante el
producto de la alta actividad de la mirosinasa secado de campo abierto). Para ello, las muestras de
esperado en tubrculos que actan sobre los cuatro lotes diferentes de cosecha fueron enviados
glucosinolatos tan pronto como se ha procesado el semanalmente en Lima, congeladas en N2 lquido.
tejido. La reactividad de los isotiocianatos muy Dado que la maca es un cultivo heterogneo con una
probable impide una mayor acumulacin de estos variedad de fenotipos / quimio-tipos actuales, se
productos de degradacin, pero su potencial de incluyeron muestras representativas de los fenotipos
interconversin, enzimticos o de otro modo, presentes en el lote particular. Otro criterio fue
probablemente se alimenta un grupo de intermedios estandarizar el tamao de los tubrculos en cada lote
menos reactivos que pueden funcionar como en el inicio del procedimiento para reducir la variacin
precursores para la BNH2 (7) y para las amidas (11- en las velocidades de secado. Los ensayos se
13). llevaron a cabo para BGL (1), linoleico libre (9) y
00 linolnico (10), BITC (2) y BNH2 (7), teniendo en
2.2. Perfiles de productos durante el secado en cuenta que todos estos eran posibles fuentes
campo abierto tradicional biosintticas directos o indirectos, y los principales
macamidas, 16 : 0 (11), 18: 2 (12) y 18: 3 (13).
Con el fin de evaluar la aparicin de amidas en maca
durante el secado, las muestras de tejido se
analizaron a lo largo de todo el procedimiento de Teniendo en cuenta el grado de transformacin
secado por metablica de glucosinolatos durante el proceso de
Fig. La figura 4 muestra los cambios en los niveles de secado, el aumento observado en BNH2 libre (7) en
los productos seleccionados durante el proceso de los tejidos podra explicarse como el resultado de la
secado. El contenido de agua en los tejidos se redujo hidrlisis de protenas y descarboxilacin de
ms de 9 semanas a un valor mnimo de 13%, que es aminocidos aromticos, o desde BGL (1) hidrlisis y
el contenido medio de maca seca. Durante este el metabolismo. Teniendo en cuenta las cantidades
perodo, BGL (1) Contenido mostr un ligero aumento que intervienen en la formacin de macamida, la
durante las dos primeras semanas de secado y luego ltima va parece ms probable. BNH2 (7) ha sido
disminuy continuamente hasta que la inactivacin de reportado como un producto de BITC (2), BIOC (3) y
la enzima en el contenido de agua del 13%. El BCN (4) hidrlisis (Olsen y Srensen, 1980; Mewis et
aumento inicial de los niveles de glucosinolatos al, 2012)..
durante el secado tambin se ha informado en otras El aumento de la BNH2 (7) se correlaciona bien con la
partes (Ybar et al., 2011) y tiene que ver con la evolucin tanto BGL (1) (-0,835, P = 0,00514) y BITC
sntesis continua durante la primera semana despus (2) ( -0,920, P <0,005) perfiles (Tabla 2). Ybar y
de la cosecha, cuando los hipocotilos no han sufrido colaboradores (2011) tambin describen una actividad
suficiente dao por los ciclos de congelacin y mirosinasa inferior durante un proceso de secado en
descongelacin. Como consecuencia de daos en los el campo despus de 90 das de secado (alrededor de
tejidos, BITC (2) se acumula como producto principal 20-30%), pero an tiene actividad. Por otro lado, un
de la actividad de la mirosinasa. Inicialmente, BITC aumento significativo de la concentracin de cidos
(2) est presente en cantidades cuantificables, pero a grasos libres insaturados (cidos grasos libres, 9 y 10)
medida que pasa el tiempo, otra mirosinasa productos tambin se observ y es probablemente debido a la
de hidrlisis, como bencil nitrilo (BCN, 4) o isocianato hidrlisis de la reserva y de membrana lpidos. La
de bencilo (bioc, 3) parecen ser ms frecuentes en correlacin con el aumento de cidos grasos libres (9,
cantidad (Williams et al., 2009). Adems, hay 10) y BNH2 (7) es un aumento en macamida
mayores niveles de BITC (2) hidrlisis o mayor contenido (MAC, 11, 12 y 13). Hay un retraso en la
acumulacin de productos de oxidacin, como aparicin de macamidas en comparacin con el
benzaldehdo (BCHO, 6) y alcohol benclico (BOH, 5). aumento de los cidos grasos libres insaturados (9,
Esto es consistente con las observaciones en nuestro 10) y BNH2 (7), pero los tres perfiles se correlacionan
laboratorio en el que el principal producto voltil bien (Tabla 2).
detectable de maca fresca es BITC (2) mientras que
la de maca tradicionalmente seco se BCN (4) (datos
no mostrados).
Fig. 4. Perfiles de almacenamiento seleccionado y metabolitos secundarios durante el secado campo abierto tradicional
de hipoctilos de maca enteros. Panel superior izquierda muestra la disminucin del contenido de agua de los tejidos
durante el secado. Otros paneles muestran los niveles de varios metabolitos secundarios durante el proceso de secado:
BGI (1): bencilglucosinalatos, BITC (2): bencilisotiocianato, BNH2 (7): bencilamina, FFA: 18: 2 (9) y 18: 3 (10) cidos
grasos libres y MAC: C16: 0 (11), C18: 2 (12) y C18: 3 (13) macamidas. Los datos que se muestran corresponden a los
anlisis realizados por triplicado a partir de cuatro diferentes lotes de hipocotilos. Las barras de error representan el
error estndar.

Tabla 2
El anlisis de correlacin de perfiles de metabolitos durante el proceso de secado en el campo. Metabolitos analizados
fueron, BGI (1): glucosinolatos bencilo, BITC (2): isotiocianato de bencilo, BNH2 (7): bencilamina, FFA (9, 10): linoleico y
cido linolnico libre y MAC (11-13): suma de C16 : 0, C18: 2 y C18: 3 alcamidas bencilo. Nmero total de la muestra
fue 9 y corresponde a los puntos de tiempo en cada uno de los grficos en la Fig. 4.
Esta correlacin sugiere fuertemente que los con esto se mantiene estable durante los prximos
procesos hidrolticos que acompaan a secado al 19 h. El aumento de la BNH2 (7) es precedida por
aire libre son responsables de la formacin de los un aumento muy rpido en BITC (2) las
precursores de macamidas. Hay que sealar que la concentraciones, que luego caen en un patrn que
sntesis macamida se sigue produciendo hasta que coincide con el aumento de la amina libre (7)
el punto final del proceso de secado a 13% de niveles. Por otro lado, el aumento de cidos grasos
contenido de agua de los tejidos (Fig. 4). libres (9, 10) y MAC (11-13) parece seguir un ritmo
relativamente constante para la primera 10 h y a
2.3. Perfiles de productos durante el secado en continuacin, aparece a disminuir hacia 24h. La
horno lenta disminucin de las tasas de su acumulacin
se correlaciona bien con la disminucin del
Los perfiles de los productos de los ensayos de contenido de humedad de los tejidos, es decir, por
secado a campo abierto mostraron una 10 horas, que han alcanzado el nivel de humedad
acumulacin lenta y constante de los MAC (11, 12, del 5%, con una disminucin concomitante de la
13). As, la cuestin se abord en cuanto a si el mayora de los procesos enzimticos.
proceso de secado tradicional, con su larga El aumento extremadamente rpido y la
exposicin a ciclos de temperatura, alta radiacin disminucin de BITC (2) los niveles y el aumento
solar, humedad ambiental y daos en los tejidos a rpido en BNH2 (7) es compatible con una
travs de la manipulacin repetida eran condiciones reduccin de aproximadamente 50% en BGL (1)
esenciales para la acumulacin de amida. Para contenido en los tejidos. La correlacin en los
evaluar esto, se pusieron a prueba las condiciones perfiles (Tabla 3) de glucosinolatos y la
de secado horno, stos siendo utilizados por los descomposicin de los lpidos y el aumento de los
exportadores de harina de maca, y que implican la niveles de metabolitos y amida es bueno. Los
trituracin de los hipocotilos y secado a coeficientes de correlacin (r) de la BGL (1) y FFA
temperaturas entre 45 y 60 C. Los experimentos (9, 10) perfiles a la de MAC (11-13) mostraron
se llevaron a cabo con maca fresca que fue acumulacin de buenos valores de -0,933 y 0,974,
triturado a 1 mm tiras gruesas de 2 x 0,5 cm respectivamente.
utilizando una trituradora de cocina vegetal
estndar. El tamao resultante era similar a la de
tiras obtenidas de grandes trituradoras comerciales.
Las tiras se colocan a secar en placas de Petri de
vidrio estndar en un horno de laboratorio a 45 C.
Se tomaron muestras a 0, 1, 2, 5, 10 y 24 h y se
analizaron como se describe en la seccin anterior.
Los resultados (Fig. 5) muestran que, despus de
la trituracin, el aumento de la libre BNH2 (7)
asciende es rpido, alcanzando un mximo
despus de 5 h,
Fig. 5. Los perfiles de metabolitos seleccionados durante el secado en horno de hipoctilos de maca triturados a 45 C.
Para las abreviaturas vase la leyenda de la figura. 4. Los experimentos se realizaron por triplicado con una gran
cantidad de hipoctilos de maca. Las barras de error representan el error estndar.

2.4. perfiles de COV en hipocotilos secadas al horno simultnea. Esto se hizo para permitir un muestreo
rpido de los tiempos iniciales y evitar el arrastre de
El secado al horno, a diferencia de secado en el compuestos orgnicos voltiles por la acumulacin en
campo, siempre que la oportunidad de seguir el la cmara. La cmara se ventila completamente entre
curso del tiempo de subproductos orgnicos voltiles las mediciones. Esto no permiti una medicin
(COV) de la hidrlisis del glucosinolato. Para evaluar cuantitativa clara, pero, como muestran los resultados,
esto, tiras de maca recin rallado fueron colocados s ofrece un perfil representativo de la secuencia de
dentro de cmaras de vidrio en un horno a 45 C las emisiones de COV. Los resultados (Fig. 6)
(Fig. S7) y el espacio de cabeza microextraccin en muestran un muy fuerte aumento de (2) niveles y su
fase slida (HS-SPME) el anlisis de los compuestos correspondiente isocianato BITC (BIOC, 3) durante los
voltiles presentes en la cmara se llev a cabo en primeros minutos, justo despus de la trituracin y el
varios momentos durante el proceso de secado. calentamiento de los tejidos. Estos niveles bajan
fibras SPME con tres fases estacionarias (Supelco) rpidamente en los siguientes 5 h. El siguiente grupo
fueron elegidos como estos han demostrado ser de compuestos orgnicos voltiles, sin embargo,
tiles con la gama de polaridades presentes en otras comienza a elevarse despus de BITC (2) juegos
emisiones voltiles de plantas evaluados en descenso en. Benzaldehdo (BCHO, 6) y alcohol
nuestros laboratorios. La exposicin de las fibras se benclico (BOH, 5) pico entre 4 y 8 horas y bencil
realiz durante un perodo de 30 min, que inclua nitrilo (BCN, 4) tiene un pico muy amplio a las 8 h
tambin el tiempo de saturacin de cmara. despus de la trituracin.
Exposicin y cmara de saturacin se llev a cabo
de forma Lo que puede ser concluido de forma fiable es que la
El indicador general desglose de lpidos, hexanal (8), amina (7), el aldehdo (6) y el alcohol (5) todos
se eleva lentamente y alcanza una meseta a las 8h parecen ser generada en la misma secuencia. Por
que entonces se mantiene para todo el periodo de otro lado, el hexanal indicador desglose de lpidos
medicin. Aunque las condiciones de ensayo tambin sigue el patrn general para la liberacin de
diferentes, si los resultados de HPLC (Fig. 5) y GC cidos grasos libres y la emisin de este VOC indica
(Fig. 6) se comparan experimentos con maca que un grado significativo de degradacin de cidos
triturado secado en horno, se puede observar que grasos (muy probable incluyendo la peroxidacin y la
los perfiles para BNH2 (7), BCHO (6) y BOH (5) pico hidroxilacin) est llevando a cabo en todo el perodo
alrededor de tiempos similares y muestran una de tiempo en que todo se observa la acumulacin de
buena correlacin (Tabla 3). La nica diferencia amida.
entre BNH2 (7) niveles, y la otra COV es que la
amina se acumula con el tiempo, pero dada la forma
en que se hicieron las determinaciones del espacio
de cabeza, y la naturaleza de SPME COV captura
en s, es difcil concluir si estos compuestos no
tienen una mayor concentracin en los tejidos
macerados.

Tabla 3
El anlisis de correlacin de perfiles de metabolitos maca postcosecha durante el secado en horno. El anlisis de
correlacin de Pearson de los datos obtenidos a partir de experimentos de secado en estufa. Las primeras cinco
columnas y filas corresponden a los voltiles analizados por espacio de cabeza SPME GC MS. Los siguientes cuatro se
analizaron por HPLC. Tamao de la muestra era de 6 o 7 como se muestra, y corresponde a los datos mostrados en las
Figs. 5 y 6. Los compuestos orgnicos voltiles analizados fueron BCN (4): nitrilo bencilo, BIOC (3): isocianato de
bencilo, BITC (2): isotiocianato de bencilo, BOH (5): alcohol benclico. Para abreviaturas de otros metabolitos ver Tabla
2. FFA se refiere exclusivamente a la suma de linoleico (9) y linolnico (10) cidos, y MAC a MAC 16 (11), MAC 18: 2
(12) y MAC 18: 3 (13 ).
2.5. el metabolismo posterior a la cosecha Por otro lado, el aumento de (7) niveles libres
BNH2 no puede ser explicada por la hidrlisis de
el metabolismo post-cosecha en la maca de protenas, ya que sus niveles de tejido sobre una
someterse a secado tradicional en campo abierto base molar son un orden de magnitud mayor que
se determina por una combinacin de daos los de la fenilalanina libre y que muestran un perfil
mecnicos, ciclos hielo-deshielo y la deshidratacin relativamente plano a lo largo de la proceso de
de los tejidos en un ambiente con alta irradiacin, secado (vase la Fig. S6). Lo ms probable, BNH2
baja humedad y temperaturas extremas (Fig. S4). (7) surge a partir del metabolismo de glucosinolatos
Estas manipulaciones, al igual que con otros dado que BGL (1) es el principal compuesto que se
procedimientos de procesamiento postcosecha que acumula en la maca. Los resultados presentados
implican maceracin, resultan en dao tisular aqu muestran secuencias de coincidencia para la
progresiva con la liberacin de enzimas hidrolticas. apariencia de BGL (1) productos de degradacin
La accin de las lipasas en la reserva y de tanto en campo abierto y en material seco horno y
membrana lpidos representa el aumento de los se pueden ver en los anlisis tanto de
cidos grasos libres (9, 10) que tambin puede cromatografa de lquidos y gas. conversin
someterse a hidroxilacin y de peroxidacin de metablica entre BITC (2), BCHO (6), BOH (5) y
reacciones como se ve desde la liberacin de BNH2 (7) puede ser mediada por enzimas
hexanal en las muestras. Ningn anlisis detallado endgenas o, para el caso del proceso de secado a
de las modificaciones de FFA durante el proceso de largo plazo en el campo, por las enzimas
secado se llev a cabo. El estudio se centr en microbianas presentes durante tejido maceracin.
linoleico (9) y linolnico (10) los niveles de FFA, La conversin de BITC (2) en BNH2 (7) en la pulpa
que puedan controlarse fcilmente mediante HPLC de la papaya se ha informado (Tang et al., 1972)
a 210 nm, con la confirmacin de la estructura por como se lleva a cabo por las bacterias del gnero
ESI-MS. Enterobacter.

Fig. 6. Perfiles de metabolitos voltiles (COV) obtenidos por microextraccin en fase slida del espacio de cabeza (HS-
SPME) y el anlisis GC-MS de hipoctilos de maca triturados durante horno de secado a 45 C. Desde la parte superior
izquierda de los paneles inferiores derechas, BITC (2): isotiocianato de bencilo, BIOC (3): isocianato de bencilo, BCHO
(6): benzaldehdo, BOH
(5): alcohol benclico,
BCN (4): nitrilo bencilo y
hexanal (8 ). Los valores
mostrados son
promedios de rea
de pico obtenidos de iones
total de cromatogramas
GC-MS (TIC) en tres
muestreos
independientes, las
barras de error indican el
error estndar
Adems, hay una serie de informes posteriores de 18: 2 y 18: (Zhao et al., 2005) cidos grasos 3 y
la conversin de BITC (2), BIOC (3) y BCN (4) en tambin aparecen como parte de la estructura
BNH2 (7) en la planta y tejidos de mamferos y por macamida; su procesamiento es aunque muy
bacterias (Goosen et al, 2001;. Cheng et col., 2004, probablemente similar a la de etanolamidas de N-
Huesos y Rossiter, 2006;. Gimsing et al, 2007; alquilo (Naes) en plantas, donde la participacin de
Bednarek et al, 2009;.. Williams et al, 2009). lipoxigenasas ha sido bien documentados para
Nuestro trabajo no ha, sin embargo, se ocup de la Arabidopsis thaliana (Shrestha et al., 2002).
aparicin de macanas que se oxida derivados de
Fig. 7. Un esquema biosinttica para macamidas (12) propuso en L. meyenii tejidos de secado. Se supone que los
principales sustratos son cidos grasos libres (9) y bencilamina (7), que surge de la hidrlisis de triacilgliceroles de
almacenamiento y los lpidos de membrana y de glucosinolatos (1) hidrlisis de isotiocianato de bencilo (BITC, 2) y para
bencilamina (BNH2, 7).

La desecacin y el dao tisular son dos procesos Expresiones de gratitud


que se presentan para activar la sntesis de amida
en los tejidos vegetales (Greger, 1984; Sendker y Los autores desean agradecer el apoyo financiero
Nahrstedt, 2008). Durante el procedimiento de del programa Per-Biodiverso (cuenta 318.1) y el
secado, por lo que es probable que BNH2 (7) y los Ministerio peruano programa FIDECOM-PIPEA
cidos grasos libres (9, 10) entran en contacto con Produccin de (contrato 132- 10). Tambin
un sistema generador de amida enzimtica. La queremos dar las gracias a Ecoandino S.A.C. y
sntesis de macamidas potencialmente podra tener Carlos Arbizu e Ivn Manrique del Centro
lugar mediante la accin de un cido graso amida Internacional de la Papa (CIP) para proporcionar la
hidrolasa (FAAH) que trabajan en sentido inverso planta y reconoce el apoyo de viaje de la Fundacin
(Fig. 7). Alexander von Humboldt para visitar el MPI-Jena.
Esto se ha demostrado para la sntesis de la W. K. reconoce el apoyo del Servicio Alemn de
anandamida, el neurotransmisor endocannabinoide Intercambio Acadmico (DAAD) para un puesto de
en los tejidos de mamferos (Devane y Axelrod, profesor a largo plazo en la PUCP. a.m. quiere
1994; Kruszka y Gross, 1994; Ueda et al, 1995;.. agradecer el DAAD de apoyo de viaje para visitas
Hgesttt et al, 2005) y, posiblemente, pueden cortas a material de referencia PUCP.germplasm.
producirse en plantas como en el caso de la E.G.C.
sntesis de las pequeas cantidades de amidas
durante la maceracin de los granos de cacao.

2.6. conclusiones

Muchos procesos postcosecha de los cultivos


tradicionales implican dao a los tejidos que altera
los perfiles qumicos y genera metabolitos
bioactivos de ausencia del material recin
cosechado. En este trabajo, se encontr que el
secado tradicional de campo abierto de la maca (L.
meyenii.) Hipocotilos en los Andes, o descamacin
industrial y secado en estufa, resultados en el
procesamiento de la hidrlisis de los lpidos y los
glucosinolatos y la liberacin de cantidades
significativas de cidos libres grasos insaturados (9,
10) y bencilamina (7), ambos de los cuales son
precursores de, y cuya acumulacin se correlaciona
bien con, la sntesis de macamidas (11, 12, 13). La
serie de reacciones implicadas (Fig. 7) ya ha sido
demostrado en la literatura en otros sistemas a
tener lugar a travs de la accin de las enzimas
endgenas o microbianos o por medio de procesos
enzimticos. los accin inversa propuesta de un
cido graso amida hidrolasa endgena (FAAH)
para la sntesis de amidas tambin ha sido objeto
de discusin en la literatura. Esto abre la cuestin
de si otras plantas que contienen glucosinolatos-
amidas pueden generar cuando se someten a
secado del tejido perjudicial. Teniendo en cuenta
que macamidas juegan un papel estimulante sobre
el sistema nervioso central a travs de la inhibicin
de la FAAH de mamferos y el sistema receptor
cannabinoide endgeno asociado, una
comprensin de la relevancia an por descubrir del
metabolismo posterior a la cosecha de este cultivo
debe ayudar a desarrollar productos con perfiles
qumicos mejorados y actividad biolgica.