4. UJAEN. PRCTICAS DE FISIOLOGA VEGETAL.

EXTRACCIN DE CLOROPLASTOS Y
MEDIDA DE LA REACCIN DE HILL EN CLOROPLASTOS AISLADOS. Obtenido de:
http://www4.ujaen.es/~amocana/F.V/Reaccion%20de%20Hill.pdf

PRCTICAS DE FISIOLOGA VEGETAL

EXTRACCIN DE CLOROPLASTOS Y MEDIDA DE LA REACCIN DE HILL EN

CLOROPLASTOS AISLADOS

1. INTRODUCCIN

En 1939, Robin Hill y col. encontraron que una suspensin de cloroplastos aislados puede
desprender O2 en presencia de luz, si se suministra un compuesto oxidado capaz de aceptar electrones
procedentes de la fotolisis del agua. De esta forma, el proceso de desprendimiento de O 2 en la fotosntesis
pudo ser separado del de la fijacin de CO2.

En la hoja intacta, los principales aceptores naturales de electrones son la ferredoxina y el NADP,
pero se inactivan durante el proceso de aislamiento de los cloroplastos. in vitro, estos aceptores
naturales pueden sustituirse por el 2,6 diclorofenolindofenol (DCPIP). Este compuesto es azul en forma
oxidada (quinona) pero se decolora lentamente cuando se reduce (fenol). La reaccin que tiene lugar es la
siguiente:

Luz
DCPIP+ (azul) + H2O DCPIP-H (azul plido) +
O2 Cloroplastos
En esta prctica se medir la fotosntesis a travs de la decoloracin del DCPIP mediante un
espectrofotmetro.

2. MATERIAL
Hojas frescas de espinaca
Mortero y mano
Papel de filtro
Centrfuga y tubos
Papel de aluminio
Espectrofotmetro y cubeta
Parafilm
Gradilla con tubos de ensayo pyrex
Probeta de 50 ml
Erlenmeyer
Embudo
Varilla de vidrio
Pipetas de 2 ml (2) y de 1 ml (1)
Vaso de precipitados de 50 ml
Solucin de sacarosa 0.5 M
Propilenglicol al 10%
DCPIP al 0.1%
Tampn fosfato 0.1 M pH 6.5 con ClK 0.08 M
Foco

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3. METODOLOGA

Aislamiento de cloroplastos. Pesar 6 g de hojas de espinaca previamente desnerviadas y lavadas

dos veces con agua destilada fra. Cortar las hojas en pequeos trozos y macerar en un mortero (si es
posible con arena de cuarzo limpia) y 2 ml de sacarosa 0.5 M e ir completando paulatinamente hasta 10
ml con la misma solucin .

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 Filtrar el homogenado obtenido a travs de papel de filtro y recogerlo sobre un tubo de centrfuga

Centrifugar el filtrado durante 10 min a 1000 r.p.m. Eliminar el precipitado y volver a centrifugar
el resto de sobrenadante durante 10 min a 2500 r.p.m. Desechar el sobrenadante y resuspender el
precipitado que contiene los cloroplastos aislados en 6 ml de propilenglicol al 10% agitando con una
varilla o un pincel.

Tomar 2 ml de esta suspensin de cloroplastos en un tubo de ensayo pyrex y llevarla a ebullicin .

Enfriar con agua.

Reaccin de Hill. Preparar 3 tubos de ensayo siguiendo el esquema que a continuacin se expone.

Tubo 1 2 3

Solucin tampn 9 ml 9 ml 9 ml

Suspensin cloroplastos hervidos 0.5 ml - -

Suspensin cloroplastos frescos 0.5 ml 0.5 ml

A continuacin cubrir el tubo 2 con papel de aluminio con objeto de mantenerlo en oscuridad
Seleccionar en el espectrofotmetro la longitud de onda de 590 nm (es la longitud de onda a la que
absorbe el DCPIP)
*Colocar un recipiente con agua a 30 cm del foco luminoso aunque sin encender todava ste.
Aadir rpidamente 0.1 ml de la solucin de DCPIP al tubo 1. Agitar, poner una parte de la
solucin en la cubeta de espectrofotmetro y medir la absorbancia a 590 nm.
Situar el tubo en el recipiente con agua y encender el foco. Mirar la hora, y a partir de este
momento, medir la absorbancia a los 3, 6 y 9 min. Apagar el foco.
Repetir desde * para los tubos 2 y 3. Apagar el foco
Anotar los resultados de absorbancia en el siguiente cuadro:

0 min 3 min 6 min 9 min

Tubo 1
cloroplastos hervidos
tubo destapado
Tubo 2
cloroplastos frescos
tubo tapado

Tubo 3
cloroplastos frescos
tubo destapado

Representa grficamente los resultados