INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLIGICAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA

CURSO PRCTICO DE MTODOS DE

ANALISIS
VERIFICACIN DEL FUNCIONAMIENTO DE UN
ESPECTROFOTMETRO

PROFESOR: HERNANDEZ DERRAMADERO

FERNANDO

CEVADA SANTIAGO KAREN JAZMIN

5QM1 SECC. 4

FECHA DE ENTREGA: 31 DE OCTUBRE DEL 2017

OBJETIVOS

Determinar algunos parmetros que caracterizan al lecho cromatogrfico.

Efectuar la desalacin de la albmina, utilizando la tcnica de cromatografa por

exclusin.

FUNDAMENTO

La cromatografa es una tcnica que permite la separacin de molculas diferentes

presentes en una misma muestra. El mtodo est basado en la circulacin de una fase
mvil (que arrastra a la mezcla de compuestos a separar), a travs de una fase
estacionaria. Dependiendo de la afinidad relativa que por ambas fases tengan los
distintos compuestos presentes en la mezcla resultar su separacin. La cromatografa
de exclusin molecular (a menudo tambin llamada filtracin en gel o de tamiz
molecular) es una de las tcnicas ms sencillas de las empleadas en la separacin de
protenas y cidos nucleicos. Este tipo de cromatografa se realiza en columnas
cilndricas rellenas con algunos de los geles que se fabrican con este fn y que pueden
ser de varios tipos: dextranos con enlaces cruzados (sephadex), agarosa (sepharose,
Bio-gel A), poliacrilamida (Bio-gel B), etc. Todos estos geles (fase estacionaria) se
hallan constituidos por grnulos (partculas) de un material esponjoso hidratado, que
contiene poros con un tamao de dimetro determinado.

Cuando se hace pasar una mezcla de molculas de distinto tamao, a travs de una
columna de filtracin en gel; aquellas molculas con un tamao mayor que el dimetro
de los poros de las partculas, slo podrn moverse en su camino, a travs de la fase
estacionaria, en el espacio que queda entre las partculas; y por lo tanto, no se vern
retrasadas en su descenso. En cambio aquellas molculas capaces de penetrar en las
partculas se vern retrasadas por la fase estacionaria; en mayor medida, cuanto menor
sea su tamao. Por lo tanto, las molculas eluyen en este tipo de cromatografa por
orden decreciente de tamao molecular.

Las mallas del gel permiten la entrada selectiva de las partculas de menor masa
molecular. De ah que las partculas de mayor peso molecular salgan primero.
RESULTADOS

Determinacin del volumen vaco (Vo) de la columna

Tabla 1. Resultados de absorbancia y volumen para la determinacin del volumen

vaco de la columna.

Volumen de elucin (mL) A615

3 0.045
6 0.020
9 0.014
12 0.016
15 0.846
18 0.548
21 0.053
24 0.020
27 0.017
30 0.015
33 0.014

Separacin de la protena del sulfato de amonio

Tabla 2. Resultados de absorbancia y volumen para la separacin de la albmina.

Datos de volumen y masa del sulfato de amonio en la separacin por cromatografa
por exclusin.

Volumen de A280 Masa del tubo Masa del tubo (NH4 )2 SO4
elucin (mL) vaco (g) con (mg)
precipitado
seco (g)
3 0.202
6 0.191
9 0.200
12 0.099
15 0.135
18 0.072
21 0.170
24 0.145 8.5222
27 0.147 8.5415 8.5527 11.2
30 0.193 8.5217 8.5355 13.8
33 0.280 5.1844 5.2255 41.1
36 0.107 7.5212 7.5871 65.9
39 0.296 7.7100 7.77327 22.7
42 0.178 6.3078 6.3145 6.7
45 0.263 6.2129
48 0.194 6.4736
 51 0.137 6.1177
54 0.199 5.1955
57 0.215 7.7278
60 0.162 6.4586
63 0.384 6.4596
66 0.236
69 0.157
72 0.287
75 0.130

perfil de elucin
0.45 70

0.4
60
0.35
50
absorbancia a 280 nm

0.3

masa en mg
0.25 40

0.2 30

0.15
20
0.1
10
0.05

0 0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
volumen en mL

albmina sulfato de amonio

Figura 1. Grfica a dos ejes de los perfiles de elucin de la albmina en color azul a
absorbancia de 280 nm y del sulfato de amonio en color anaranjado con masa en mg.

a) qu sustancia eluy primero y cul despus? Explique porqu

Primero eluy la albmina debido a que una protena de un peso molecular
grande, por lo cual al momento de la separacin en la cromatografa, esta
rodea los geles y sale ms rpidamente, mientras que el sulfato de amonio al
ser de menor tamao molecular pasa por en medio de los poros del gel por lo
tanto se retarda su salida en la cromatografa.
b) Qu es un gel?que caractersticas debe tener el que es cromatogrficamente
til?
Es una matriz porosa polimrica cuyos poros se llenan con el solvente que se
usar en la fase mvil. La separacin por cromatografa en gel est influenciada
 por las propiedades de los poros de la red tridimensional, y la naturaleza del
material que forma el poro. Se distinguen dos tipos de material para el gel:
xerogeles y aerogeles. Los xerogeles son geles simples; consisten en polmeros
entrecruzados que se engrosan en contacto con el solvente para formar un
medio porosos relativamente suave. Los aerogeles son slidos porosos que son
penetrados por el disolvente; algunos ejemplos es el vidrio y silica porosos. El
nombre de los geles ms comnmente utilizados: Sephadex, Strygel, Biogel
c) Mencione por lo menos tres aplicaciones, diferentes a las usadas en la prctica,
que puede tener esta tcnica.
La cromatografa en gel se utiliza para separar protenas, pptidos, cidos
nuclicos, polisacridos, enzimas, hormonas y los qumicos en polmeros, para
determinar distribuciones de pesos moleculares en mezclas de polmeros.
d) Escribe las estructuras qumicas del Sephadex, del Bio-Gel A y del Bio-Gel P ,
indicando donde y de qu forma se da el entrecruzamiento en cada caso y el
tipo de enlace que se presenta.
Los geles de poliacrilamida Bio-Gel P, para la filtracin en gel de alta resolucin,
se preparan por copolimerizacin de acrilamida y N , N ' -metilenbisacrilamida.
Geles Bio-Gel P: Se suministran secos y estn disponibles en varios rangos de
tamao de partculas con lmites de exclusin de peso molecular que van de
100 a 100.000.Son extremadamente hidroflicos y esencialmente no inicos
Proporcione filtracin en gel eficiente y suave de compuestos sensibles.
Los geles son compatibles con cidos orgnicos diluidos, urea 8 M, agentes
caotrpicos, detergentes y disolventes orgnicos miscibles. El alcohol, hasta
20% v / v, puede usarse para mejorar la solubilidad de nucletidos, pptidos y
taninos sin alterar las propiedades de exclusin de los geles. La formamida
tambin se puede usar con toda su potencia ya que los geles Bio-Gel P estn
completamente hinchados en este solvente.

Sephadex es una resina de filtracin en gel bien establecida para la

desalinizacin y el intercambio de tampn en aplicaciones industriales.
Desalma rpidamente, elimina contaminantes y transfiere a un nuevo buffer en
un solo paso. Excelente recuperacin y mnima dilucin de muestra. Disponible
en columnas preevainadas HiPrep Desalin y HiTrap Desalting para una
desalacin rpida y conveniente. Resina BioProcess compatible con
aplicaciones industriales y bien establecidas para la desalacin y el intercambio
de tampn en aplicaciones industriales. Sephadex es una resina de filtracin en
 gel preparada por entrecruzamiento de dextrano con epiclorohidrina. Los
diferentes tipos de Sephadex difieren en su grado de entrecruzamiento y, por
lo tanto, en su grado de hinchamiento y su rango de fraccionamiento
molecular. Sephadex tiene cinco tipos de G que van desde G-10 para molculas
pequeas hasta G-75 para molculas ms grandes.

Bio-Gel Un gel de 1.5m, ideal para la purificacin de anticuerpos y agregados,

consiste en perlas de agarosa en las que el tamao de poro est controlado
por el porcentaje de agarosa en el gel. Este soporte es compatible con todos
los buffers comnmente utilizados y se puede usar con buffers con alto
contenido de sal sin cambiar significativamente el volumen de la cama. Bio-Gel
Se puede usar un gel de 1.5m a pH 4-13 y a 2-30 C. El rango de
fraccionamiento es de 10,000 a 1,500,000.

DISCUSIN

Se realiz la separacin de la albmina del sulfato de amonio (desalacin), donde

primeramente se tuvo un montado de la columna en regulador de pH de 7.25 tratando
de evitar un mal empaquetamiento, se procedi a realizar la determinacin del
volumen vaco debido a que en este tipo de cromatografa la fase estacionaria es un
gel, que se introduce en una columna como soporte cromatogrfico, el gel est
constituido por partculas esfricas que tienen poros de un determinado tamao, las
molculas de pequeo tamao difunden a travs de los poros de las partculas del gel
y por ello son retardadas en su paso por la columna mientras que las molculas
grandes no entran en los poros de las partculas del gel y por ello eluyen rpidamente
en lo que es el volumen vaco de la columna que fue de 15 mL, se dice que son
excluidos del gel, de esta forma, las molculas se separan en funcin de su tamao,
eluyendo en orden decreciente de peso molecular, es debido a esto que para esta
determinacin se utiliz la dextrana debido a que es una molcula de gran tamao y
peso molecular y eluya fcilmente por los intersticios y cuya absorbancia mxima al
espectrofotmetro se correlaciona con el volumen que se presentan entre las
partculas de gel.

Despus se procedi a la aplicacin de la muestra y obtencin de los eluatos, los cuales

fueron ledos a una absorbancia de 280 nm debido a que la albumina es una protena
y posee enlaces peptdicos los cuales presentan una absorbancia caracterstica a esta
longitud de onda, obtenindose las absorbancias correspondientes donde los datos
arrojan (tabla 2) que en todos los eluatos existe protena, y realizando el perfil de
elucin para la albmina mostrado en la figura 1, donde de manera terica la albmina
debi ser la primera en elur por su gran tamao y peso molecular y despus el sulfato
debido a que es una molcula ms pequea y retenida por el gel separador, de manera
prctica solo se puede observar la separacin del sulfato de amonio y comparando
con la teora la albmina debe de estar a volmenes menores inclusive casi debe de
salir con el volumen vaco debido a que la dextrana y la albmina tiene tamao
semejantes, sin embargo esto no se obtuvo y se puede comprobar esto debido a que
se observan constantes fluctuaciones en la lecturas (varios picos y valles), esto puede
ser debido a varios factores como los volmenes de los tubos, debido a que si estos
no eran constantes con el volumen indicado (3 mL) se tenda a concentrar (menor
volumen del indicado) o diluir (mayor volumen de lo indicado) los eluatos,
modificando as las lectura. Otro factor puede ser un cambio en la velocidad de
elucin, ya que si comienza a elur los compuestos de forma ms rpida impide que
los analitos de menor tamao puedan pasar por los poros del gel de manera efectiva
eluyendo demasiado rpido por la columna as como tambin por los espacios
intersticiales, si el la velocidad de elucin disminuyera provocara que el analito de
mayor tamao se retenga por su trayecto por la columna ocasionando que llegara a
salir con el compuesto de menor tamao y no lograr una separacin. Un factor ms
que puede ser el causante, es un error en la calibracin de las lecturas en el
espectrofotmetro, donde de manera errnea se pudo utilizar de blanco el tubo que
no era el indicando provocando as lecturas errneas.

Para el perfil de elucin del sulfato de amonio se utiliza un mtodo gravimtrico para
su determinacin donde se precipita el compuesto con cloruro de bario formando una
sal que precipita y posteriormente se calcula su masa y elabora el segundo perfil de
elucin (figura 1, color anaranjado), en este cromatograma muestra que un volumen
de elucin que es el volumen necesario para elur un compuesto de una columna de
36 mL.
CONCLUSIN

El volumen vaco de la columna es de 15 mL.

El volumen total de la columna es de 33.17 mL.

El volumen del gel Sephadex G-25 es de 1.59 mL.

El volumen interno de la columna es de 16.58 mL.

Se obtuvo una separacin de sulfato de amonio de la protena a un volumen de elucin

de 36 mL.

BIBLIOGRAFA

Rojo Callejas F., Manual de Qumica Analtica Instrumental II, Anexo III, Facultad de
Qumica UNAM, Mxico 2002.

BERMEJO, F. - Qumica Analtica General, Cuantitativa e Instrumental - Vol 1. - Ed.

Paraninfo 7ma edicin, Madrid 1991.

HARRIS, D. - Anlisis Qumico Cuantitativo - Ed. Revert - 2 edicin - Espaa, 2001.