Cuantificacin de clulas mononucleares mucosas en tejidos con un ensayo de

citometra de flujo policromtico basado en perlas fluorescentes.

RESUMEN
Dado que la gran mayora de las infecciones se producen en las superficies de la mucosa,
la caracterizacin precisa de las clulas inmunes de la mucosa es de importancia crtica
para la comprensin de la transmisin y el control de las enfermedades infecciosas. El
anlisis de citometra de flujo estndar de clulas obtenidas de tejidos de la mucosa puede
proporcionar informacin valiosa sobre el fenotipo de los leucocitos de la mucosa y su
abundancia relativa, pero no proporciona el recuento absoluto de clulas de las
poblaciones de clulas mucosas. Desarrollamos un ensayo de citometra de flujo basado
en perlas para determinar los nmeros absolutos de mltiples tipos de clulas
mononucleares en biopsias colorrectales de macacos rhesus. Utilizando paneles de
citometra de flujo de 10 colores y perlas pan-fluorescentes, las clulas se enumeraron en
muestras de biopsia mediante la adicin de una relacin constante de perlas por mg de
tejido y luego calculando los nmeros de clulas / mg de tejido en base a las proporciones
de celda a perla determinadas en Tiempo de adquisicin de la muestra. La prueba en
muestras duplicadas mostr que el ensayo es altamente reproducible (Spearman R =
0,9476, P <0,0001). Usando este ensayo, informamos la enumeracin de los linfocitos
CD45 (+) totales, CD4 (+) y CD8 (+), clulas B, clulas NK, CD14 (+) monocitos y
clulas dendrticas mieloides y plasmocitoides en biopsias colorrectales, con nmeros de
clulas en macacos Rhesus normales que varan desde medianas de 4486 clulas / mg
(clulas T) a 3 clulas / mg (clulas dendrticas plasmocitoides). Este ensayo representa
un avance significativo en la cuantificacin rpida y precisa de las poblaciones de clulas
mononucleares en los tejidos de la mucosa y podra aplicarse para proporcionar recuentos
absolutos de una variedad de diferentes poblaciones de clulas en diversos tejidos.
Palabras clave: cuentas fluorescentes, enumeracin de linfocitos, citometra de flujo,
linfocitos de la mucosa
1.Introduccin
Porque la mayora de las infecciones ocurren en las superficies de la mucosa, la
cuantificacin de las clulas inmunes de la mucosa es crtica, entender la transmisin y el
control de enfermedades infecciosas. Dos de los enfoques ms comunes utilizados para
estudiar las muestras de la mucosa son la citometra de flujo y las tcnicas histolgicas.
Aunque la citometra de flujo es una herramienta poderosa para caracterizar
fenotpicamente las clulas inmunes aisladas de la mucosa, se emplea tpicamente para
determinar la abundancia relativa de tipos celulares especficos, pero no el nmero
absoluto de clulas. Aunque la cuantificacin celular relativa es adecuada en muchas
circunstancias, como abordar la frecuencia de expresin de un marcador de activacin
fenotpica, estos datos pueden ser engaosos, porque las frecuencias de la poblacin
celular de inters pueden verse afectadas por la afluencia o salida de otras poblaciones
celulares.
Las tcnicas histolgicas como la inmunohistoqumica o la microscopa de
inmunofluorescencia son las tcnicas preferidas para determinar la localizacin
anatmica de las poblaciones de clulas en un sitio, pero estos enfoques requieren
relativamente mucho tiempo y generalmente solo aproximan el nmero de clulas en dos
dimensiones, como mm2 o el rea ocupada por un marcador inmunohistoqumico dado
(Li et al., 2005; Estes et al., 2008).
Dadas las limitaciones de los enfoques existentes para la cuantificacin absoluta de las
clulas en los tejidos de la mucosa, es evidente la necesidad de un ensayo rpido
simplificado que pueda enumerar con precisin las clulas de la mucosa usando
cantidades mnimas de tejido. Hemos desarrollado un mtodo basado en cuentas
fluorescentes para cuantificar recuentos absolutos de linfocitos en biopsias colorrectales
de macacos Rhesus que podran tener una aplicabilidad significativa tanto para la
investigacin bsica de la mucosa como para el diagnstico clnico.
2. Material y mtodos

2.1. Coleccin de animales y biopsias

Un total de 12 macacos Rhesus (Macaca mulatta) de origen gentico indio se utilizaron

para el muestreo en este estudio. Todos los animales estaban libres de VIS y fueron
alojados en el Centro de Investigacin de Primates de Nueva Inglaterra y mantenidos de
acuerdo con las directrices del Comit de Animales de la Facultad de Medicina de
Harvard y la Gua para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Los macacos se
anestesiaron con ketamina HCl (10-20 mg / kg, intramuscularmente) y luego se
recogieron diez a doce biopsias de puncin rectal utilizando frceps de biopsia
endoscpica fenestrada de 1,9 mm (Olympus America, Center Valley, PA). Las piezas de
biopsia se pesaron a granel (balanzas Mettler MS104S o PB602, Mettler-Toledo,
Columbus, OH) y tenan una masa media de 22,9 mg (rango 20-50 mg, 30 muestras).
Granel: Se usa para indicar a peso, sin envase ni etiqueta
2.2. Procesamiento de biopsias y aislamiento celular

Las clulas mononucleares se aislaron a partir de muestras de biopsia rectal utilizando

interrupciones enzimticas y mecnicas siguiendo protocolos estndar para nuestro
laboratorio como se describi previamente (Reeves et al., 2010). Brevemente, despus
del pesaje, las biopsias se incubaron primero durante 30 min en EDTA 5 mM, se lavaron
y luego se incubaron en medio con 15 U / ml de colagenasa (tipo II, Sigma) durante 1 h
en un agitador orbital. Las muestras se rompieron mecnicamente con una aguja de
alimentacin de calibre 18. Para evitar la prdida de clulas, no se realiz separacin
basada en la densidad.
2.3. Ensayo de cuantificacin basado en perlas

La cuantificacin absoluta de subconjuntos de clulas en muestras de mucosas se realiz

mediante un ensayo basado en cuentas fluorescentes modificado a partir de un anlisis de
sangre perifrica optimizado en nuestro laboratorio (Reeves et al., 2009a, 2010). Despus
del aislamiento de clulas mononucleares, todas las clulas se resuspendieron en FBS al
2% en PBS y luego cada suspensin celular se enriqueci con 10 m de partculas
fluorescentes SPHERO AccuCount Rainbow (Spherotech, Lake Forest, IL) a una
concentracin de 1000 perlas / mg de peso absoluto del tejido (medido antes del
procesamiento). Luego se realiz una tincin con citometra de flujo policromtica (PFC)
en cada muestra usando anticuerpos monoclonales conjugados con fluorcromo (Tabla 1).
Todas las muestras tambin incluyeron una tincin Aqua Live / Dead (Invitrogen) para
discriminar clulas vivas y todas las adquisiciones se realizaron en un LSR II (BD
Biosciences) y luego se analizaron usando el software FlowJo 9.0 (Tree Star Inc.,
Ashland, OR).

3. Resultados y discusin

Como se describe en los Materiales y mtodos, se usaron paneles de citometra de flujo

de 10 colores optimizados para uso en macacos rhesus en combinacin con perlas
panfluorescentes para calcular el nmero de clulas absolutas de clulas mononucleares
en biopsias colorrectales basadas en relaciones de clulas a cuentas. Como se muestra en
la figura 1A, las perlas fluorescentes se identificaron fcilmente por sus altas propiedades
de SSC, y los leucocitos vivos se identificaron en una puerta de inclusin de CD45 + que
exclua las clulas epiteliales contaminantes y los desechos que son comunes en las
preparaciones mucosales. Si bien todos los ensayos contenan marcadores para distinguir
clulas CD45 + vivas, se utiliz uno de dos paneles diferentes para identificar clulas T
y clulas NK (figura 1B) (panel I), o clulas B, monocitos y clulas dendrticas (figura
1C) (panel II). Las clulas T CD4 + y CD8 + se identificaron entre la poblacin de clulas
CD3 + y las clulas NK se identificaron basndose en la expresin de NKG2A y la falta
de CD3, una estrategia utilizada previamente para la identificacin de estas
subpoblaciones en macacos rhesus (Reeves et al., 2010). Las clulas B y los monocitos
se identificaron como CD20 + HLA-DR + y CD14 + HLA-DR +, respectivamente, y las
clulas plasmticas (pDC) y mieloides dendrticas (mDC) se enumeraron entre las clulas
HLA-DR + CD3-CD14-CD20- y se identificaron positivamente por expresiones
mutuamente excluyentes de CD123 y CD11c, como se describe (Brown et al., 2007;
Reeves et al., 2009b). Se calcul el nmero absoluto de clulas / mg de tejido en funcin
del nmero de clulas cerradas y el nmero de eventos de perlas usando la frmula que
se muestra en la figura 1D. En un subgrupo de experimentos, las preparaciones de biopsia
independientes se procesaron en paralelo y estos datos estaban altamente correlacionados,
lo que demuestra un alto nivel de reproducibilidad (figura 1E).
En biopsias colorrectales encontramos una mediana del nmero total de leucocitos CD45
+ de 8731 clulas / mg de tejido colorrectal (Fig. 2), y no es sorprendente que el nmero
total de leucocitos CD45 + est fuertemente correlacionado con la masa de la muestra (R
= 0.5452, Pb0.0018, Correlacin de Spearman). Aunque ningn ensayo previo ha
enumerado los linfocitos de la mucosa de esta manera, Sopper et al. (2003), los linfocitos
totales de lmina propia estimados estn entre 1500 y 3700 linfocitos por miligramo de
tejido intestinal, y debido a que nuestros anlisis incluyen linfocitos totales de la mucosa,
tanto la lmina propia como la intraepitelial, nuestras estimaciones parecen estar dentro
del rango. Con respecto a subpoblaciones especficas de clulas mononucleares de
mucosa, encontramos que aproximadamente la mitad de las clulas mononucleares del
intestino eran clulas T CD3 + (mediana, 4486 clulas / mg). Adems, las clulas T CD4
+ y CD8 + se encontraron en una proporcin aproximadamente 1/1 (Figura 2), similar a
las proporciones previamente reportadas en la mucosa del intestino macaco rhesus por
anlisis de citometra de flujo (Sopper et al., 2003), pero en contraste Las proporciones
2/1 o 3/1 normalmente se encuentran en la sangre perifrica de macacos y humanos. Las
clulas NKG2A + NK totales tambin se encontraron en biopsias colorrectales a una
mediana de 152 clulas / mg, de acuerdo con nuestras observaciones previas de una
abundancia relativa de ~ 5% del total de clulas mononucleares colorrectales CD45 +
(Reeves et al., 2010).
Fig. 1. Cuantificacin celular basada en perlas en biopsias rectales. Estrategias de
activacin representativas que muestran perfiles de fluorescencia de (A) cuentas y clulas
vivas y posterior activacin para (B) clulas T y clulas NK o (C) monocitos, clulas B y
clulas dendrticas. (D) Frmula para el clculo del nmero de clulas / mg de tejido. (E)
Correlacin de recuentos de clulas absolutas obtenidas de biopsias colorrectales
duplicadas de 12 animales. Cdigo de colores: azul, leucocitos CD45 +; naranja, clulas
T CD8 +; verde, clulas T CD4 +; y rojo, clulas NK. La correlacin entre las pruebas
repetidas se determin utilizando el coeficiente de correlacin de rango de Spearman.

Usando el Panel II (Fig. 1C), enumeramos las clulas HLA-DR + B, monocitos y clulas
dendrticas en biopsias colorrectales (Fig. 2). Las clulas B fueron relativamente
abundantes en la mucosa rectal (mediana, 574 clulas / mg). Los monocitos CD14 +
fueron detectables con un valor mediano de 115 clulas / mg, mientras que los CDm y los
CDP fueron menos frecuentes, con valores medios de 43 clulas / mg y 3 clulas / mg,
respectivamente. Curiosamente, las clulas CD3-CD14-CD20-HLA-DR + CD123-
CD11c- fueron relativamente frecuentes en muestras colorrectales con una mediana de
489 clulas / mg de tejido. Esta poblacin que se ha observado anteriormente en macacos
(Reeves et al., 2009b; Brown et al., 2007), y muy probablemente est dominada por
macrfagos, basndose en la tincin intracelular para CD68 (figura 1C). Sin embargo, es
posible que esta poblacin pueda contener otros subconjuntos de DC o monocitos que no
sean fenotpicamente identificables en nuestro ensayo.
Fig. 2. Enumeracin de subconjuntos de leucocitos en la mucosa rectal. Las lneas
horizontales indican que los medios y los bigotes representan de un mnimo a un mximo
de 6 a 12 animales por grupo. Los macrfagos se definieron como CD68 + CD3-CD11c-
CD14-CD20-CD123-HLA-DR +. Leuk., Leucocitos; y mono, monocitos.

El desarrollo de este ensayo relativamente simple basado en cuentas para la enumeracin

de clulas mononucleares de la mucosa representa un avance significativo en el anlisis
de muestras de mucosas pequeas. Mientras que las perlas se usaron previamente para
calcular recuentos absolutos de poblaciones de leucocitos en sangre completa (Barnett et
al., 1999; Montes et al., 2006) y rastrear el rendimiento celular de biopsias (Anton et al.,
2008). nunca se han usado para enumerar clulas de la mucosa basadas en la masa de
tejido. Es importante tener en cuenta que las frecuencias celulares calculadas con este
enfoque pueden verse afectadas por factores como la prdida de clulas durante el
procesamiento del tejido. No obstante, el clculo de los recuentos absolutos normalizados
de perlas basados en el peso de los tejidos representa un avance significativo sobre la
prctica estndar actual de informar la frecuencia relativa de las clulas en las biopsias de
la mucosa. Esta tcnica es adecuada para la aplicacin al procesamiento de un nmero
relativamente grande de especmenes y debera resultar especialmente til en entornos
tales como la infeccin por VIH o SIV que producen perturbaciones sustanciales de las
poblaciones de linfocitos en los sitios de la mucosa. Finalmente, esta tcnica podra tener
amplias implicaciones no solo en los estudios de inmunologa de la mucosa bsica en
modelos animales, sino tambin en la investigacin clnica o en estudios de diagnstico
humano.
Expresiones de gratitud

Los autores agradecen a Elaine Roberts por el cuidado de los animales dedicado y Yi Yu
por la asistencia tcnica de calidad. Este trabajo fue apoyado a travs de las subvenciones
NIH AI071306, AI090735 y RR00168, y un premio CHAVI / HVTN Early Career
Investigator, nmero de subvencin U19 AI 067854-04, a R.K.R.