ESCUELA ACADMICO PROFESIONAL DE INGENIERA AMBIENTAL

LABORATORIO DE MICROBIOLOGA
PRCTICA N 04

CRECIMIENTO BACTERIANO

I.OBJETIVO
Desarrollar algunas tcnicas comunes para medir el crecimiento bacteriano en
poblaciones, tanto en clulas vivas, como en muertas, comprendiendo su fundamento
y aplicacin.

II. PRINCIPIOS TERICOS

El trmino crecimiento en las bacterias se refiere a cambios cuantitativos en la poblacin total

de las bacterias, es decir un aumento en la masa total de clulas, ms bien que a cambios en
un organismo en forma individual. Con frecuencia el inculo contiene miles de organismos y
el crecimiento slo denota el incremento del nmero o de la masa, por encima del inculo
original. El mtodo caracterstico de reproduccin bacteriana es la fisin binaria transversal;
una clula se divide en dos. En este caso, si se parte de una sola bacteria, el incremento de
la poblacin se hace en progresin geomtrica: una bacteria produce dos, dos dan cuatro,
cuatro dan ocho; ocho dan diecisis, y as hasta 2n (smbolo del ltimo nmero, es decir el
nmero mximo de clulas que eventualmente alcanzara la poblacin). El tiempo de
generacin se refiere al intervalo de tiempo requerido para que la clula se divida, o lo que es
lo mismo, para que la poblacin se duplique). Muchos estudios bacteriolgicos requieren la
determinacin del nmero de bacterias presentes en una unidad de volumen. Los recuentos
se pueden efectuar por diferentes mtodos, ya sea contando slo clulas vivas o tambin
vivas y muertas. La cantidad y tipo de microorganismos en una muestra dependen de la
composicin qumica de la misma y de los tratamientos a que haya sido sometida. El mtodo
de conteo elegido depende del objetivo del conteo. En esta forma se puede determinar la
presencia o ausencia de microorganismos, as como su nmero presente en el material de
estudio. Un conteo total establece el grado de contaminacin microbiana. Conociendo el
nmero se puede estandarizar la concentracin de inculos y seguir la dinmica poblacional
de un cultivo puro y muchos otros estudios.

MTODOS DE CONTEO DIRECTO AL MICROSCOPIO

Permiten efectuar el conteo de las clulas totales vivas y muertas. Su ventaja es que son
rpidos. Conteo microscpico directo por el mtodo de Breed: Un volumen conocido de la
muestra (generalmente 0.01 ml) se extiende sobre un portaobjetos normal en una superficie
conocida. Se examina en un microscopio calibrado, donde se conoce el dimetro del campo
microscpico. Se cuentan las clulas en diversos campos. Se obtiene el valor medio de
clulas por campo y se multiplica por el nmero de campos microscpicos comprendidos en
la preparacin. El resultado corresponde al nmero de clulas en el volumen extendido (0.01
ml). Multiplicando este valor por 100 se obtiene el nmero total de organismos por ml o por
gramo de muestra. Conteo microscpico directo en cmara de Petroff-Hauser

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Es una placa de vidrio con una cuadrcula en depresin donde se deposita la muestra
medida. Es posible relacionar el nmero de clulas observadas en la superficie de un cuadro,
con el volumen de esa rea. Considerando los volmenes en la cuadrcula se puede calcular
la concentracin de microorganismos por ml. Conteo turbidimtrico: En una suspensin
microbiana, la cantidad de clulas est directamente relacionada con la turbiedad o densidad
ptica de la misma e inversamente relacionada con la cantidad de luz que pasa a travs de
ella. Esto permite determinar con bastante exactitud la cantidad de microorganismos en la
suspensin mediante la determinacin de la turbiedad mediante un nefelmetro o un
espectrofotmetro. Los resultados se comparan con una curva estndar construida con una
suspensin testigo de concentraciones conocidas. La turbiedad que resulta en la suspensin
microbiana se aproxima a la producida por un cierto nmero de clulas en suspensin. Esta
tcnica es til solamente para organismos unicelulares de pocos mm, como las bacterias, lo
que les permite mantenerse suspendidos y homogneamente distribuidos. Contadores
electrnicos: Se hace pasar un volumen conocido de la muestra con microorganismos a
travs de un orificio de 5 a 10 mm de dimetro, mediante manipulacin con una micropipeta
de mercurio. La resistencia elctrica a travs del orificio est normalizada y se altera cada vez
que un microorganismo pasa a travs de l. La modificacin de la resistencia se amplifica y
se registra electrnicamente. Mtodos de conteo en medio de cultivo: Mediante cultivo de la
muestra, se detectan nicamente las clulas vivas. En todos los casos se parte de un
volumen o peso de muestra conocido. Conociendo la procedencia de la muestra se puede
esperar la obtencin de cuentas bajas o altas o incluso ausencia de organismos. Si se
esperan pocos microorganismos, las muestras se pueden centrifugar o filtrar. Si se esperan
cuentas altas, se puede diluir la muestra en cantidades conocidas del diluyente, utilizando
solucin salina, agua peptonada u otros. - Mtodo de las diluciones y vaciado en placa -
Tcnica de conteo en placa por extensin superficial - Recuento por filtro de membrana -
Siembra en tubo o recuento del nmero ms probable - Mtodo de la gota o de Miles y Misra.
Otros mtodos Determinacin del peso seco, determinacin del nitrgeno en las clulas
cultivadas, medicin de actividades bioqumicas.

III.MATERIALES DE LABORATORIO
MATERIAL BIOLGICO:
- Medio de cultivo previamente fundido y manteniendo una Temperatura de 50 C.
- Cultivos de E. coli
- Caldo nutritivo

MATERIALES Y EQUIPOS:

- Microscopio
- Portaobjetos
- Cubreobjetos
- 7 tubos de ensayo de 16 x 150 mm
- Gradillas
- 7 Placas Petri
- Pipetas
- Pizeta con agua destilada
- Incubadora
- Cmara cuenta colonias

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- Fotocolormetro
- Galvanmetro
- Mechero Bunsen
REACTIVOS:
- Azul de metileno de Leffler.
- Solucin salina isotnica
- Alcohol

A. DETALLES EXPERIMENTALES

PROCEDIMIENTO - MTODOS:

I. Conteo directo de bacterias al microscopio.- Mtodo de Breed (conteo que incluye

clulas vivas y muertas):
1. En un portaobjetos limpio y desengrasado, marque un rea de 2 cm2 cuadrados. Invierta la
laminilla.
2. Deposite 0.01 ml de un cultivo y extindalos en el rea marcada del portaobjetos y deje
secar a temperatura ambiente.
3. Fije con calor y tia con azul de metileno de Leffler.
4. Lave con agua de la llave. Deje secar a temperatura ambiente.
5. Coloque el objetivo micromtrico en la platina del microscopio y observe a 100 X.
6. Mida el dimetro del campo microscpico.
7. Cada divisin de la escala del objetivo micromtrico mide 10 mm, es decir:

0.01 mm = 0.001 cm.

8. Determine la superficie del campo microscpico con la siguiente frmula:

r2 en cm X 3. 1416 = Superficie de campo microscpico en cm

9. Determine el nmero de campos microscpicos que existen en la preparacin con la

frmula:

Superficie de la preparacin
--------------------------------------------------- = nmero de campos microscpicos
Superficie del campo microscpico

10. Coloque en la platina del microscopio la preparacin teida de las bacterias y cuente las
bacterias en 10 campos. Obtenga el valor medio de organismos por campo microscpico.
11. Calcule el nmero de bacterias que hay en la preparacin (0.01 ml) y en 1 ml del cultivo,
con la frmula: # de bacterias x # de campos = # de bacterias x 100 = # bacterias/ml por
campo microscpicos en la preparacin de cultivo.

II. Conteo de bacterias por el mtodo de las diluciones y vaciado en placa.- Es un

recuento de clulas bacterianas vivas solamente:

1. Prepare 7 tubos de ensayo de 16 x 150 mm con 9 ml de diluyente estril cada uno (agua
peptonada al 0.1 % o una solucin salina isotnica). Mrquelos con las diluciones desde 1 x
10-2 hasta 1 x 10-8.
2. Marque 7 cajas de Petri vacas estriles con los mismos nmeros de las diluciones. Haga
duplicados con otras 7 cajas.

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3. En condiciones estriles tome 10 ml de una suspensin bacteriana (puede ser E. coli), con
una pipeta estril y depostelos en el frasco con diluyente. Descarte la pipeta y colquela en
un frasco con desinfectante.
4. Tape el frasco con la muestra y agite vigorosamente, aproximadamente 25 veces. Esta
ser la dilucin 1:10.
5. Con una nueva pipeta estril tome 1 ml y transfiera al tubo de la dilucin 1:100, mezclando
en igual forma y descartando la pipeta.
6. Con una nueva pipeta distribuya alcuotas de 1 ml al tubo de la dilucin 1:1000 y a las dos
cajas de Petri correspondientes marcadas. Descarte la pipeta.
7. Repita el procedimiento mezclando bien la dilucin 1:1000 y con una nueva pipeta
distribuya alcuotas al tubo de la siguiente dilucin y sus dos cajas correspondientes y as
sucesivamente con las siguientes diluciones.
8. Enseguida adicione a cada caja aproximadamente 20 mL de medio de cultivo previamente
fundido y mantenido a 50 C. Al tapar cada caja, vaya mezclando el contenido muy
cuidadosamente, rotando la caja suavemente sobre la mesa, para que no se derrame el
lquido.
9. Deje solidificar a temperatura ambiente e incube 24 horas a 37 C.
10. Cuente las colonias desarrolladas bajo la cmara cuenta colonias. El nmero vlido del
conteo es entre 20 y 200 / caja. El nmero de colonias por caja (UFC) equivale a 1 mL de la
muestra inoculada. Calcule la cantidad de colonias por mL y por gr de muestra, mediante la
siguiente frmula:

Promedio de colonias contadas x recproco de la dilucin = UFC / ml

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III. Curva de crecimiento por determinacin tubidimtrica

Esta medicin en un fotocolormetro se basa en el hecho de que un cultivo de bacterias acta

como una suspensin coloidal que intercepta la luz que pasa a travs de ella. Dentro de
ciertos lmites, la cantidad de luz que es absorbida es directamente proporcional a la
concentracin de clulas. Un fotocolormetro es un instrumento con una fotocelda que puede
medir la cantidad de luz que pasa a travs del cultivo; esta luz activa un fototubo que registra
el porcentaje de transmitancia en un galvanmetro. Mientras ms alto sea el porcentaje de
transmitancia, ms bajo es el nmero de clulas en suspensin. El aparato debe ser
calibrado antes de cada lectura, con un tubo del medio estril sin cultivo, para establecer el
100 % de transmitancia.

Este mismo experimento permitir medir el crecimiento de una bacteria y obtener su curva de
crecimiento.
1. Siembre 0.1 ml de cultivo de E. coli en 13 tubos con 10 ml de caldo nutritivo.
2. Incube todos los tubos a 37 C.
3. Deje un tubo control del mismo medio, sin inocular y gurdelo en el refrigerador, servir
para ajustar el fotocolormetro a 100 % de transmitancia, antes de las lecturas.
4. Cada hora saque un tubo y determine la transmitancia en el fotocolormetro.
5. Dibuje una curva con los valores obtenidos, durante el crecimiento de la bacteria.
6. Observe algunas de las etapas de crecimiento: fase Lag, fase logartmica. Para determinar
el resto de las fases se requieren de 24 a 48 horas.

IV. Curva de crecimiento por el mtodo de las diluciones y vaciado en placa

Con los mismos cultivos de E. coli puede desarrollar simultneamente la curva de

crecimiento, por la tcnica de las diluciones y vaciado en placa inoculando 1 ml (haciendo
diluciones seriadas.) Se puede planear el experimento para empezar a las 7: 00 a. m. y
terminar a las 7:00 p. m. Dibuje la curva de crecimiento y calcule el tiempo de generacin.

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IV. CUESTIONARIO:

1. En qu consiste el crecimiento bacteriano?

2. Para qu sirve el:
- Fotocolormetro
- Galvanmetro
3. Cul es la importancia del Mtodo de conteo directo al microscopio?
4. Explique en qu consiste el mtodo de la Curva de crecimiento por determinacin
turbidimtrica?

V. BIBLIOGRAFA
1. AQUIAHUATI, M. Manual de Prcticas de Laboratorio de Microbiologa General;
Universidad Autnoma Metropolitana; Mxico; 2004.
2. GARZN, G.G. Fundamentos de Qumica general, 211 ed. Mxico: Mc. Graw-Hill, 1986.
144p.
3. WILLEY Y OTROS., Microbiologa de Prescott, Harley Klein. 7 ed. Madrid: Interamericana
de Espaa S. A.2009. 1086 p. ISBN: 978-84-481-6827-8
4. TORTORA.FUNKE.CASE. Introduccin a la microbiologa. 9 ed. Madrid: Editorial Mdica
Panamericana S.A. 2007. 931p. ISBN:978-950-06-0740-7
5. MADIGAN, M. Martinko, J. y J. PARKER. Biologa de los microorganismos. 10a ed. Espaa:
Editorial Pearson educacin, S. A. 2006. 1008p.ISBN: 0-13-066271-2.
6. KARP, G. Biologa celular y Molecular: Conceptos y experimentos. 4a ed. Mxico: Mc. Graw-
Hill Interamericana Editores. 2011. 765p. ISBN: 978-607-15-0504-0
7. AQUIAHUATI, M. Manual de Prcticas de Laboratorio de Microbiologa General; Universidad
Autnoma Metropolitana; Mxico; 2004.
8.
9. SAWWYER, C. McCARTY, P. PARKIN, G. Qumica para Ingeniera Ambiental. 4 ed.
Editorial McGraw Hill. 2001, 716 p. ISBN: 9584101641
10. SHARPE, A. Qumica Inorgnica. 1 ed. Editorial Reverte S.A. 2008. 584 p. ISBN:
8429175016.

REDACCIN DEL INFORME DE LABORATORIO

Culminada La Prctica de Laboratorio, el estudiante debe realizar un informe de la experiencia

realizada segn la Gua utilizada, dicho informe debe tener el siguiente contenido;
CARATULA; El informe debe indicar en la caratula los siguientes datos:
Nombre de la Universidad, escuela acadmica profesional.
Nombre del Laboratorio del curso.
N y ttulo de PRCTICA REALIZADA,
Integrantes DEL GRUPO O NOMBRE individual.
Ciclo de estudios- TURNO - AULA.
Nombre del profesor que dirige la prctica. (Mg. Segundo Marter Baca)
Ciudad y fecha.
1. OBJETIVOS
Indicar los objetivos logrados al realizar las experiencias en el laboratorio, en funcin a lo
sealado en la gua
2. MARCO TERICO O PRINCIPIOS TERICOS

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Se realizara un resumen de los principios, leyes, teoras, mtodos o fundamentos que se

ilustran o aplican en la experiencia respectiva, no copiar de la gua, e investigue y
fundamente.
3. DETALLES EXPERIMENTALES ( es la parte ms importante del informe)
3.1. Materiales y reactivos: Colocar solo los usados en laboratorio
3.2. Procedimiento Experimental:
Describir CON SUS PROPIAS PALABRAS las experiencias realizadas detalladamente as
como las observaciones, cantidades usadas, los datos, los reactivos qumicos (elementos
y/o compuestos), y los valores numricos con sus respectivas unidades de medida, usar
grficos, dibujos, fotografas, CLCULOS REALIZADOS, % error, etc.

4. TABLA DE REPORTE DE RESULTADOS FINALES.

Cuadro Final RESUMEN de los datos utilizados y resultados obtenidos, clculos finales,
%error. Aqu no se realizaran los clculos.
5. CONCLUSIONES
Sealar las conclusiones Finales respecto a cada una de las experiencias realizadas.
De los resultados obtenidos en la experiencia Prctica, comparndolos con sus principios
Tericos al respecto, si existiera % error analizarlo e indicar el porqu del resultado, Indicando
las causas de las diferencias y el posible origen de los errores.
6. RECOMENDACIONES
Que recomiendan para obtener los resultados esperados en la Prctica

7. DESARROLLO DEL CUESTIONARIO ENUMERADO SEGN LA GUA DE PRCTICA

USADA
Contestar segn la enumeracin de la gua, DEBE ESCRIBIRSE LA PREGUNTA JUNTO CON
UNA RESPUESTA CLARA, coherente, investigada y fundamentada. Se revisara
especialmente el criterio, anlisis y sntesis al contestar.

8. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
Las referencias se deben colocar segn el estilo APA deben ordenarse alfabticamente,
sangra en la segunda lnea para diferenciar del dato principal; Apellido y Nombre del autor,
edicin, ao, titulo, editorial, Pas, etc.,
Electrnica (digital); Direccin del enlace completa.

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