Proses Absorpsi
Eksitasi juga dapat menaruh molekul dalam keadaan elektronik yang lebih tinggi lagi,
seperti ditunjukkan oleh bagian kiri dari gambar itu. Kadang-kadang tingkat vibrasi terendah
dari keadaan elektronik tereksitasi tertinggi dan tingkat vibrasi tertinggi dari keadaan
elektronik tereksitasi-pertama energinya sepadan. Molekul-molekul dalam keadaan elektronik
yang lebih tinggi, setelah pengenduran ke tingkat vibrasi terendah, kemudian dapat pindah ke
tingkat vibrasi berenergi sama dari keadaan elektronik tereksitasi-pertama, suatu proses yang
disebut konversi dalam, yang ditunjukkan oleh anak panah bergelombang bertandakan IC.
Kemudian mereka mengendur ke tingkat vibrasi terendah dari keadaan elektronik tereksitasi
pertama itu sebelum pancaran berpendar. Jadi sekali lagi, meskipun eksitasinya lebih
berenergi, pancaran berpadan dengan transisi yang sama, yakni dari tingkat vibrasi terendah
dari keadaan elektronik tereksitasi pertama ke berbagai tingkat dari keadaan elektronik dasar.
Hasil netto proses-proses ini biasanya berupa pancaran berpendar dengan frekuensi lebih
panjang (atau panjang gelombang lebih panjang) daripada frekuensi (atau panjang
gelombang) radiasi pengeksitasinya.
Idealnya hubungan antara konsentrasi, c, dari molekul berpendar dalam larutan dan
daya sinar dipancarkan, Pem, akan linear:
Pem = kc
tetapan k sebenarnya mewakili suatu campuran yang rumit dari beberapa faktor.
Karena hanya radiasi terserap yang mungkin dapat menginduksi fluoresensi, daya sinar
masuk merupakan faktor penting, dan aka nada nilai- dan panjang garis sinar; akan termsuk
juga di dalamnya suatu faktor yang memberikan berapa besar fraksi molekul tereksitasi oleh
pemancaran foton, bukannya dengan proses tak-radiatif. Dalam instrument yang sebenarnya,
respons yang bergantung pada panjang gelombang (dari) detector terhadap daya sinar,
maupun fraksi pancaran berpendar yang benar-benar mencapai detector tersebut juga kaan
terlibat dalam besaran pembacaa. Dengan larutan-larutan yang cukup encer, hubungan linear
antara sinyal listrik dan konsentrasi benar-benar dijumpai dalam banyak kasus. cukup encer
bervariasi tergantung analit-analitnya, namun biasanya ini berarti sesuatu dengan orde
beberapa bagian tiap juta (g/mL).
Pengaruh Saringan-Dalam
Pada konsentrasi yang lebih tinggi, fluoesensi menjadi kurang berbanding lurus
dengan konsentrasi dan malahan dapat berkurang dengan meningkatnya konsentrasi, seperti
ditunjukkan dalam gambar2. Pada konsentrasi tinggi, distribusi radiasi pengeksitasian
tidaklah seragam di segala tempat larutan itu. Lapisan pertama larutan dapat menyerap cukup
banyak sehingga lapisan-lapisan yang lebih dalam tak dapat dieksitasi secara penuh, artinya
daya sinar pengeksitasian P0 akan berkurang cukup banyak melintasi lebar sel itu. Kadang-
kadang ini disebut efek saringan dalam, biasanya ini tidak serius jika larutan itu tidak
menyerap lebih dari 5 atau 10% dari radiasi masuk.
Pemadaman
Proses-proses lain yang mengurangi keluaran pendaran dapat disatukandi bawah judul
pemadaman (quenching). Ada sejumlah molekul yangmerupakan pemadam yang sangat
efektif yang karenanya mengganggu analisis fluometri. Sala satu proses semacam itu dapat
ditulis sebagai berikut:
Molekul
Molekul
analit
analit + pemadam + pemadam + kalor
berkeadaan
tereksitas
dasar
i
Artinya, pemadam menginduksi deeksitasi tak radiatif dari molekul analit
yang tereksitasi, dan tidak ada foton dipancarkan. Misalnya, oksigen merupakan pemadam
yang serius untuk beberapa hidrokarbon aromatic berpendar, dan kadang-kadang perlu untuk
menghilangkan oksigen larutan-larutan ini. Dalam mengembangkan suatu metode analitik
yang didasarkan pada fluoresensi, orang harus memperkirakan keaktifan pemadaman yang
mungkin dengan komponen-komponen sampel yang menyertai analit.
Kepekaan
Suatu sifat menonjol dari analisis fluoresensi adalah tingginya kepekaan dibandingkan
dengan teknik lazim lainnya seperti spektrofotometri. Sudah menjadi suatu sifat lebih baik
untuk mengukut sedikit cahaya lawan tak ada cahaya ketimbang mengukur pengurangan
kecil dalam suatu berkas yang terang. Daya pancaran berpendar, Pem, dapat diukur tak
tergantung pada daya cahaya masuk, P0. Pancaran dapat ditingkatkan baik dengan
meningkatkan P0 maupung dengan lebih menggandakan isyarat detector. Dalam
spektrofotometri, peningkatan P0 juga meningkatkan P; jadi absorbansi, log (P0/P), tak
berubah. Serupa pula penggandaan isyarat menyatakan P0 dan P tidak akan mengubah rasio
P0/P maupun logaritmanya. Ini cukup berbeda dari instrument fluoresens, dimana berkas
masuk tidak melewati detektor.
A 10-4
c= = = 10-9
b 1x 105
jarang kita mencapai ini dengan baik; agaknya 10-6 M akan merupakan batas deteksi yang
jauh lebih mewakili. Di pihak lain batas deteksi fluoresens, seringkali berorde 10-9 M, dan
dengan teknik deteksi yang istimewa, telah dihampiri 10-12 M. Sebagai pedoman kasar,
tidaklah menyesatkan untuk mengatakan bahwa fluoresens lazimnya seribu kali lebih peka
daripada spektrofotometri, meskipun nilai-nilai yag sebenarnya bergantung pada senyawaan-
senyawaan apa yang dilibatkan dan instrument mana yang tersedia.