Programa Global de Maz, Centro Internacional de Mejoramiento de Maz y Trigo (CIMMYT). km 45 va Mxico-Veracruz. 56130, Texcoco, Estado de Mxico,
Mxico. Tel. +52 (595) 9521900 Ext.1112
de los maces ACP. Debido a que estos aminocidos USA) se adquirieron el 2-cloro-3, 5-dinitripiridina (Cat.
guardan una proporcin aproximadamente constante de 22,404-9) y la mezcla de aminocidos: cistina, metionina,
4:1, normalmente se da seguimiento slo al contenido de prolina, histidina, alanina, isoleucina, treonina, tirosina,
triptfano como parmetro para la evaluacin de la calidad glicina, fenilalanina, valina, arginina, serina, cido asprtico,
nutricional de la protena de maz (Vivek et al., 2008). Por leucina y acido glutmico (Cat. LAA21-1KT). La papana
su parte, el anlisis de lisina usado para apoyar programas purificada 0.32 MCU (Milk Cloth Units) Proteoferm
de mejoramiento de maces ACP (Villegas et al., (1984), fue adquirida con la empresa Mixim (Naucalpan, Estado
presenta caractersticas que limitan su implementacin: de Mxico, Mxico). La lisina (L-Lisina monoclorhidrato,
a) La hidrlisis enzimtica se debe realizar en tubos de Cat. 6364) fue adquirida con la empresa Nutritional
ensayo porque se usan 100 mg de muestra previamente Biochemicals Corp. (Cleveland Ohio, USA).
acondicionada y el volumen de la solucin de extraccin
es de 5 mL; b) En la reaccin colorimtrica por cada Las soluciones de papana (4 mg mL-1 y 5 mg mL-1) se
muestra a analizar se requieren 15 mL de acetato de etilo prepararon diariamente a temperatura ambiente con una
como solucin de lavado, volumen que prolonga el tiempo solucin amortiguadora de fosfatos 0.03 M con pH 7.4
del anlisis puesto que se debe pipetear repetidamente (mezcla de fosfato de sodio dibsico y fosfato de potasio
para remover el solvente antes de hacer la lectura en el monobsico). Diariamente se prepar la suspensin de
espectrofotmetro; c) Elaboracin de la curva de calibracin cobre al disolver 2.8 g de cloruro cprico en 100 mL de gua
con numerosas diluciones, que provocan que se prolongue y 13.6 g de fosfato de sodio tribsico en 200 mL de agua.
el tiempo requerido en esta fase y que aumentan el error Se mezclaron ambas soluciones, se centrifugaron a 800 x g
durante su preparacin. durante 5 min (aprox. 37.5 mL en cada tubo) y se descart
el sobrenadante. El precipitado se lav tres veces con 15
La cuantificacin se basa en la reaccin entre el compuesto mL (por tubo) de solucin amortiguadora de boratos 0.05
2-cloro-3, 5-dinitripiridina y el grupo -amino de lisina, M con pH 9, y al final se resuspendi el precipitado con 80
despus de haber bloqueado con cobre los grupo -amino mL de la misma solucin.
de los aminocidos y de los pptidos de bajo peso molecular
presentes en el hidrolizado protenico. El complejo La solucin de 2-cloro-3,5-dinitropiridina a 3 % (p/v)
-dinitropiridil-lisina que se forma es soluble en agua pero en metanol, se prepar minutos antes de ser utilizada. La
insoluble en acetato de etilo, lo que permite remover los solucin de aminocidos se prepar mediante la dilucin
dems compuestos formados durante la reaccin, y adems 100 mg de la mezcla de aminocidos en 10 mL de una
eliminar el exceso del reactivo 2-cloro-3, 5-dinitripiridina solucin amortiguadora de carbonatos 0.05 M con pH 9. La
(Tsai et al., 1972). solucin concentrada de lisina se utiliz como estndar y se
prepar utilizando la solucin reguladora de carbonatos a
El objetivo del presente trabajo fue modificar la una concentracin de 1000 g mL-1.
metodologa para que la cuantificacin de lisina sea un
anlisis til para apoyar los programas de mejoramiento. Muestras de maz
Con base en el mtodo de Villegas et al. (1984), se optimiz
el desarrollo de las curvas de calibracin, se redujeron los Se utilizaron maces (no-ACP y ACP) del programa
volmenes para la reaccin y se implement el uso de de mejoramiento del CIMMYT (Centro Internacional
microplacas, todo lo cual reduce tiempo de trabajo ya que del Mejoramiento del Maz y Trigo). La metodologa fue
permite analizar hasta 36 muestras por duplicado, en una validada en 70 muestras de maz ACP y 70 muestras maz
sola lectura. no-ACP.
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GALICIA, ISLAS, ROSALES Y PALACIOS Rev. Fitotec. Mex. Vol. 34 (4), 2011
extraccin. La solucin de papana sin muestra fue utilizada Cuadro 1. Curva de calibracin para la cuantificacin de lisina.
como blanco. Las muestras se incubaron a 64 C por 16 h, mL de solucin mL de solucin mL de solucin Concentracin
con agitacin por lo menos dos veces durante la primera hora Tubo concentrada de lisina amortiguadora de de papana final de lisina
de incubacin. Se asegur que los microtubos estuvieran (1 000 g mL-1) carbonatos (5 mg mL-1) (g mL-1)
perfectamente cerrados para evitar la evaporacin de la 1 0 2.0 8 0
solucin. Una vez completada la incubacin, los extractos 2 0.5 1.5 8 50
se enfriaron a temperatura ambiente y se centrifugaron a 3 1.0 1.0 8 100
20160 x g por 5 min, para as agregar un sobrenadante libre 4 1.5 0.5 8 150
de partculas de harina. 5 2.0 0 8 200
Reaccin colorimtrica
de cada dilucin y 0.5 mL de la solucin de carbonatos
Se transfirieron 500 L del hidrolizado (sobrenadante) que contiene la mezcla de aminocidos y 0.5 mL de la
a un nuevo microtubo de 1.5 mL y se adicionaron 250 suspensin de cobre. La adicin de solucin de papana con
L de la solucin amortiguadora de carbonatos y 250 concentracin de 5 mg mL-1 y la mezcla de aminocidos,
L de suspensin de cobre. Se agitaron manualmente tiene por objeto garantizar la accin bloqueadora del
durante 5 min y se centrifugaron a 1333 x g por 5 min. Se cobre y evitar sobreestimaciones. El resto de la reaccin
transfirieron 125 L de sobrenadante a un microtubo nuevo colorimtrica se hizo como se describi previamente.
de 2 mL y se adicionaron 12.5 L de reactivo 2-cloro-3,
5-dinitropiridina. Despus de una fuerte agitacin en Validacin del mtodo modificado para la
vrtex, las muestras se protegieron de la luz y se incubaron cuantificacin de lisina
a temperatura ambiente durante 2 h con agitacin cada
30 min; despus de la incubacin se les agreg 625 L de Para verificar la precisin y exactitud de la modificacin
cido clorhdrico 1.2 N y se agitaron nuevamente hasta propuesta, 140 muestras se analizaron tambin por el
homogenizar. Posteriormente, se adicionaron 650 L de mtodo colorimtrico descrito por Villegas et al. (1984) y
acetato de etilo y la solucin se mezcl por inversin de los por NIR (espectrofotometra en el infrarrojo cercano).
tubos por 10 veces; luego se dejaron en reposo para permitir
la formacin de dos fases, y se elimin el sobrenadante Clculos y anlisis estadstico
resultante. El lavado con acetato de etilo se repiti dos veces
ms, pero en la ltima repeticin, despus de mezclar la El porcentaje de lisina se obtuvo al multiplicar la DO
solucin, los tubos se centrifugaron a 1333 x g por 5 min corregida (DO390nm muestra DO390nm promedio de los blancos de papana)
para asegurar la separacin de las dos fases formadas y la a 390 nm por el cociente volumen del hidrolizado/(pendiente
remocin del acetato de etilo. Los tubos con la tapa abierta de la curva estndar x peso de la muestra). Se utiliz un
se colocaron por 5 min en la campana de extraccin para diseo completamente al azar con dos repeticiones. Se
asegurar la eliminacin de cualquier remanente de acetato efectu un anlisis de varianza y comparacin de medias
de etilo, y finalmente se transfiri una alcuota de 200 L a con el mtodo de Tukey ( = 0.05) con el programa SAS 9.2
microplacas de 96 pocillos. La lectura se llev a cabo en un (SAS Institute, 2008).
lector de microplacas (Quant (MQX200), BioTek) para
determinar la densidad ptica (DO) a 390 nm. RESULTADOS Y DISCUSIN
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CUANTIFICACIN EFICIENTE DE LISINA EN GRANO DE MAZ Rev. Fitotec. Mex. Vol. 34 (4), 2011
Entre las modificaciones realizadas al mtodo de Comparacin de dos mtodos para la cuantificacin de
referencia se incluye la reduccin de reactivos de elevado lisina
costo, como el acetato de etilo, y reduccin de los riesgos al
personal que se encarga de desarrollar este anlisis debido La correlacin para las 140 muestras analizadas con
a la disminucin en la emisin de residuos contaminantes. ambos mtodos fue de 0.96 (Figura 1), aunque se observ
La cantidad de acetato que se requiere para el mtodo una menor correlacin entre los materiales con contenido
aqu propuesto representa solamente 13 % del volumen de lisina menor a 0.3 % (maz normal). Segn Nurit et al.
original. Otra ventaja importante es la reduccin de pasos (2009), este tipo de diferencias son atribuibles a las bajas
para desarrollar la curva de calibracin, lo cual aumenta la concentraciones de lisina y a los mayores errores estndar,
capacidad de anlisis por da. lo que disminuye la precisin de los valores obtenidos. El
valor mnimo detectado con el mtodo modificado es de
El Cuadro 2 muestra el intervalo de valores de la DO para 0.19 % de lisina en grano completo.
cada una de las concentraciones conocidas evaluadas en las
curvas de calibracin desarrolladas y ledas en microplaca.
Los rangos presentados corresponden a 11 curvas de
calibracin efectuadas en diferentes das, con un R2 superior
Concentracin
Rango de DO a Promedio de Desviacin
de lisina
390 nm DO a 390 nm estndar
(g mL-1)
0 0.119 - 0.148 0.134 0.0084
Lisina (%) por Esp
50 0.158 - 0.185 0.175 0.0091
100 0.209 - 0.250 0.229 0.0154 Figura 1. Correlacin entre el porcentaje de lisina cuantificado
mediante el mtodo en espectrofotmetro (Esp) y la cuantificacin en
150 0.280 - 0.289 0.285 0.0026 microplaca (LPM) (n = 140 muestras).
200 0.297 - 0.324 0.313 0.0080
Con base en la comparacin de medias (P 0.05),
los dos mtodos evaluados no presentaron diferencia
Existen otros mtodos para la cuantificaron de lisina significativa, con medias de porcentaje de lisina de 0.359
que se basan en la reaccin del cido 1-sulfnico-2,4,6- y 0.355 para LMP y Esp, respectivamente. Al comparar los
trinitrobenceno (TNBS) o en la reaccin colorimtrica de datos obtenidos con el mtodo qumico modificado y los
la nihidrina (Beckwith et al., 1975; Obi, 1982). Sin embargo, datos obtenidos por NIR (Modelo Lysun1), la correlacin
stos presentan algunas desventajas, como requerir un obtenida es de 0.83 (Figura 2), valor similar al que se ha
tratamiento previo de la muestra para la remocin de obtenido previamente con dicho modelo y con datos
aminocidos libres o varias filtraciones de soluciones provenientes del mtodo en espectrofotmetro.
durante el desarrollo del anlisis, lo cual demanda ms
manipulacin y tiempo. Se han propuesto tambin
metodologas bacteriolgicas para la cuantificacin de
lisina, pero dado que son mtodos semi-cuantitativos
Lisina (%) por NIR
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