TEKNIK UJI AGLUTINASI CEPAT DAN ENZYME

LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA) UNTUK

MENDETEKSI ANTIBODI MYCOPLASMA
GALLISEPTICUM

Zulqoyah Layla dan M.B . Poerwadikarta

Balai Penelitian Veteriner, Bogor

PENDAHULUAN

Penyakit pernafasan menahun (PPM) pada ayam sampai sekarang

dilaporkan masih tersebar diseluruh dunia (FAO-OIE-WHO, 1992) . Penyebab
utama penyakit ini adalah kuman Mycoplasma gallisepticum (Mg), sedang
kuman lain yang sering menyertai adalah kuman Eschericia coli (Jordan,
1979; Yoder, 1991) .
Penyebaran penyakit PPM dapat terjadi secara vertikal dari induk ke
anaknya melalui indung telur atau secara horizontal dengan kontak langsung
dari ayam yang terinfeksi ke ayam yang peka . Penyebaran penyakit dapat
juga terjadi secara tidak langsung melalui debu percikan ludah dari penderita
ataupun melalui pakan, air minum dan burung liar yang memasuki kandang
(Yoder, 1991) . Faktor lain seperti kelembaban, kebersihan kandang, ventilasi
kandang dan kondisi air minum juga dapat memudahkan terjadinya penyakit
ini .
PPM dapat diamati keberadaannya dengan melakukan uji serologi
secara teratur . Teknik aglutinasi cepat (AC) (Ronohardjo, 1974 ; Sri Purnomo
dan Setyo Raharjeng, 1974 ; Sri Purnomo dkk ., 1986) dan teknik Enzym Linked
Immunosorbent Assay (ELISA) merupakan teknik uji serologi yang dapat
digunakan untuk mendeteksi adanya infeksi kuman mycoplasma pada tubuh
ayam (Soeripto dkk ., 1993) .
Tulisan ini bertujuan untuk mengemukakan teknik AC dan ELISA
sebagai alat untuk mendeteksi antibodi Mg dan membandingkan sensitifitas
dan spesifisitas dari kedua teknik tersebut .

PENYIAPAN MEDIA PERTUMBUHAN

Media yang digunakan untuk pertumbuhan kuman Mg adalah media

cair khusus untuk mycoplasma yang dibuat berdasarkan metode Frey dkk .
(1968) . Media khusus tersebut mengandung bahan-bahan, antara lain

156
 Lokakarya Fungsional Non Penelib'

mycoplasma broth base (oxoid), D-glucose (BDH Chemicals), L .cystein HCI

(BDH Chemicals), Thallous acetate (BDH Chemicals) Yeast ekstrak (Difco),
Phenol red (Chroma strains) dan aquabidest . Media tersebut memiliki pH 7,8
dan disterilkan pada suhu 121 C selama 15 menit . Selain itu kedalam media
cair tersebut ditambahkan secara aseptik bahan penyubur yang terdiri dari
larutan DNA dan serum babi yang sudah diinaktifkan, untuk menghambat
pertumbuhan bakteri lain dan pads media tersebut ditambahkan Thalous
acetate dan Amoxicilin .
Media untuk pembuatan antigen ELISA, sebagai bahan penyuburnya
digunakan foetal Calf serum sebagai pengganti serum babi .

PENYIAPAN ANTIGEN MG

Antigen yang digunakan untuk keperluan uji serologik Mycoplasma

gallisepticum dibuat dari isolat Mg galur S6 yang diperoleh dari Institute of
Medical and Veterinary Science, Adelaide, Australia .
Untuk Uji aglutinasi cepat, Antigen Mg tersebut disiapkan dari sel
biakan kuman yang ditumbuhkan pada media cair khusus mycoplasma .
Setelah itu, sel biakan kuman tersebut diendapkan dengan cara pemusingan
pada putaran 10 .000 rpm selama 15 menit dan dicuci 3 kali menggunakan
larutan penyangga fosfat . Selanjutnya endapan sel biakan Mg tersebut
dihitung jumlah selnya berdasarkan kekeruhan standard 2 x Mc Farlan no .10
dan diukur menggunakan spektrophotometer pada panjang gelombang 546
nm dan diberi larutan zat warna gentiana violet 0 .03% , yang dapat digunakan
sebagai indikator dalam reaksi aglutinasi, dan larutan merthiolate 0 .01
sebagai bahan pengawet .
Untuk uji ELISA, antigen dibuat dari protein membran sel Mg galur S6
yang ditumbuhkan pada medium cair khusus mycoplasma dengan penam-
bahan foetal Calf serum . Protein membran tersebut diperoleh dengan cara
sonifikasi sel Mg dan dihitung menggunakan spektrophotometer pada panjang
gelombang 650 nm dengan standar bovine serum albumin (BSA) .

BAHAN PEMERIKSAAN

Serum darah ayam yang diuji aglutinasi diperoleh dari 75 ekor ayam
yang diinfeksi dengan kuman Mg dan 80 ekor ayam normal yang tidak
diinfeksi dengan kuman Mg . Serum kontrol positif Mg yang digunakan adalah
serum ayam yang secara serologis diketahui positif Mg, balk dengan uji AC
maupun dengan uji ELISA antibodi Mg . Untuk serum kontrol negatif digunakan
serum normal dari ayam bebas mycoplasma spesific pathogen free (SPF) .

1 57


lokakarya Fungsional Non Peneli6

TEKNIK UJI AGLUTINASI CEPAT

Teknik uji aglutinasi cepat dilakukan dengan mencampur serum yang

akan diuji dengan antigen Mg berwama . Sebanyak 25 I serum darah ayam
dan 25 l antigen Mg berwarna pada cawan aglutinasi (WHO plate) .
Selanjutnya cawan tersebut digoyang dengan menggunakan alat penggoyang
(rotary agglutinator-Analite), sehingga serum dan antigen Mg tercampur
secara merata . Pembacaan reaksi aglutinasi dibaca setelah 2 menit
kemudian . Kriteria pembacaan reaksi adalah sebagai berikut
1 .Negatif (-) = tidak terjadi reaksi aglutinasi (penggumpalan),
2 .Positif ringan (+) = terjadi reaksi penggumpalan halus,
3 .Positif (++) = reaksi penggumpalan terlihat agak kasar,
4 .Positif kuat (+++) = reaksi penggumpalan terlihat kasar dan jelas .
Adanya penggumpalan antara antigen dengan serum menunjukan
bahwa serum tersebut mengandung antibodi terhadap Mg . Dengan kata lain,
bahwa serum ayam tersebut diperoleh dad ayam yang terinfeksi atau pernah
terinfeksi kuman Mycoplasma gallisepticum.

TEKNIK UJI ELISA

Teknik ELISA pertama kali diperkenalkan pada tahun 1972 oleh Engval
dan Perlman . Teknik ini dapat digunakan untuk mendeteksi zat antibodi atau
antigen . Prinsip dari uji ELISA adalah reaksi kompleks antigen-antibodi
dengan melibatkan peran enzim kojugasi anti spesien imunoglobulin dan
substrat sebagai indikator dalam reaksi .
Teknik ini merupakan uji serologik kwantitatif dan dilakukan dengan
menggunakan pelat mikrotiter . Untuk mendeteksi kadar antibodi terhadap Mg
pada serum darah ayam, pengerjaan uji Elisa dilakukan sebagai berikut :
Melapisi (coating) sumuran pelat mikrotiter dasar U (Titirtex, 96
sumuran) dengan antigen membran protein Mg galur S6 yang telah
diencerkan 1 :400 dalam larutan penyangga karbonat/bikarbonat 0 .1 M .
Antigen tersebut ditambahkan pada tiap sumuran dari pelat mikrotiter
sebanyak 100 uI dan di simpan pada temperatur 4 C selama satu malam .
Pada kondisi seperti itu, antigen akan melekat secara pasif pada pelat ELISA .
Selanjutnya, pelat yang dilapisi antigen tersebut dicuci dengan larutan
pencuci, yang terbuat dari larutan penyangga phosphat (PBS) yang
mengandung 0 .5% Tween-20 . Pada pencucian tersebut antigen yang tidak
melekat akan terbuang . Kemudian sebanyak 100 l serum ayam yang
diperiksa, dengan enceran 1 :200 dalam larutan PBS yang mengandung 0 .5%
Tween-20, ditambahkan kedalam sumuran pelat tersebut secara ganda
(duplikat) dan diinkubasikan pada temperatur kamar selama 1 jam . Setelah
itu, dengan larutan pencuci pelat yang berisi serum tersebut dicuci dan pada

158
 Lokakarya Fungsional Non Penelifi

setiap sumuran pelat ditambahkan 100 ul larutan konjugat rabbit anti chicken
IgG-HRPx, yang diencerkan 1 :2500 dalam PBS-Tween 0 .5% dengan
penambahan kasein 0 .2% . Pelat yang diisi konjugat tersebut diinkubasikan
lagi pada temperatur kamar selama 1 jam . Kemudian pada setiap sumuran
ditambahkan 100 ul larutan substrat yang terbuat dari ABTS dan H202 dalam
0 .1 M larutan penyangga sitrat (pH 4,2) . Pembacaan reaksi Elisa dilakukan
setelah pelat diinkubasikan pada temperatur kamar selama 1 jam dengan
menggunakan alat Titertek Multiscan MCC (Flow Lab Australia) pada panjang
gelombang 414 nm . Perlu ditambahkan, bahwa setiap pencucian pelat
mikrotiter dilakukan 3 kali dan pada setiap pengujian serum selalu disertakan
serum kontrol positif dan negatif .
Untuk mementukan spesifisitas dan sensitifitas dari kedua reaksi
serologi tersebut, maka dilakukan pengujian dengan membandingkan hasil uji
negatif dan positif berdasarkan metode Bladock (1995) . Pengujian tersebut
dapat dilihat pada tabel 1 . dibawah ini .

Tabel 1 . Perbandingan reaksi serologis AC dan ELISA pada serum

darah ayam

Uji Seroligis Uji Elisa

Negatif Positif Jumlah

AC Negatif a b (a+b)
Positif d (c+d)

Jumlah (a+c) (b+d) (a+b+c+d)

Batasan yang digunakan untuk menganalisa spesifisitas dan sensitifitas

kedua uji serologis tersebut adalah sebagai berikut
- Spesifisitas uji serologis merupakan proporsi dari jumlah reaksi
negatif dalam jumlah populasi negatif secara serologis . Untuk uji AC
dan uji ELISA adalah a/(a+b) .
- Sensitifitas uji serologis merupakan proporsi dari jumlah reaksi
positif dalam jumlah populasi positif . Untuk uji AC dan uji ELISA
sensitifitasnya adalah d/(c+d) .
Sebagai contoh, bahwa hasil dari kedua reaksi serologis yang
digunakan, AC dan ELISA, dapat dibandingkan spesifisitas dan sensitifitasnya
berdasarkan batasan pengujian tersebut diatas .

159


Lokakarya Fungsional Non Penelid

Tabel 2 . Perbandingan reaksi AC dan ELISA antibodi pada pengujian

serum darah ayam terhadap Mycoplasma gallisepticum

AC ELISA
Status Serum Jumlah
+ _ +

Negatif 80 0 80 4 76
Positif 75 41 34 46 29

Jumlah 155 41 114 50 105

Spesifisitas (%) 100% (80/80) 95%(76/80)

Sensitifitas (%) 55%(41/75) 61%(46/75)

Berdasarkan hasil analisis menunjukkan bahwa spesifisitas reaksi

serologis uji AC (100%) menunjukkan lebih tinggi dari uji ELISA (95%) .
Sedangkan sensitifitasnya uji ELISA (61%) menunjukkan nilai lebih tinggi dari
uji AC (55%) . Perbedaan tersebut dapat dikarenakan deteksi antibodi oleh
kedua teknik serologis tersebut relatif berlainan, seperti halnya AC lebih
cenderung mendeteksi lmunoglobulin(Ig) M, sedangkan ELISA mendeteksi
IgG . Secara serologis, keberadaan respons IgM biasanya dapat dideteksi pada
awal infeksi sedangkan untuk respons immunoglobulin selanjutnya yang
terdeteksi adalah IgG (Soeripto dkk ., 1993) .
Hasil-hasil yang dikemukakan diatas merupakan hasil pengujian tahap
awal, dan masih belum dapat ditarik kesimpulan dengan balk . Namun
demikian, teknik yang dilakukan sudah memberikan harapan balk untuk
dikembangkan . Selain itu, satu hal yang perlu dipertimbangkan untuk menguji
tingkat akurasi teknik ELISA masih diperlukan sampel lebih banyak .

KESIMPULAN

Dari tulisan ini dapat disimpulkan sebagai berlikut

1 . Uji serologis AC dan ELISA dapat digunakan sebagai alat untuk
mendeteksi adanya infeksi Mg pada ayam .
2 . Spesifisitas reaksi serologis pada uji AC lebih tinggi dibanding dengan uji
ELISA .
3 . Sensitifitas reaksi serologis pada uji ELISA lebih tinggi dibanding dengan
uji AC .

160
 Lokakarya Fungsional Non Penem

DAFTAR BACAAN

Bladock F .C . 1995 . Evaluasi Epidemiologi terhadap Uji Imunologi . Dalam :

Teknik ELISA dalam Diagnosis dan Penelitian . edisi 1, Dr . Wayan T .
Artama (Penterjemaah) . Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Gajah
Mada, Gajah Mada University Press . 1995 . hal .167-176
FAO-OIE-WHO . 1992 . Animal Health Year Book 1992 . FAO-OIE-WHO,
Geneva, Rome, Paris .
Frey,R .P .Hanson and D .P .Anderson .1968 . A medium for the isolation of Avian
mycoplasma .Am.J. Vet,Res .29 : 2164-2171
Jordan, F .T .W ., 1979 . Avian Mycoplasmas, In : The Mycoplasmas volume II .
Human and Animal Mycoplasmas . J .G .TULLY and R .F .WHITCOMB .
Academic Press, New York, San Francisco . London .p 1-40 .
Ronohardjo,P .1974 .lnfefeksi Mycoplasma gallisepticum pada ayam petelur
dan ayam kampung yang sudah dewasa .Bulletin LPPH 5 : 42-46 .
Sri Purnomo dan Setyo Rahajeng .1974 . Mycoplasmosis pada ayam di
Indonesia . Aglutinasi cepat serum-serum ayam pembibit terhadap
antigen berwarna Mycoplasma gallisepticum . Bulletin LPPH 11 ; 23-28
Sri Purnomo, Supar, R . Napitupulu, N . Kurniasih dan S . Hardjoutomo . 1986 .
Mycoplasmosis pada unggas di Indonesia . Uji lapangan pemakaian
antigen berwarna Mycoplasma gallisepticum pada ayam ras petelur .
Penyakit Hewan . 31 ;40-44
Soeripto, M .B . Poerwadikarta and Z . Layla . 1993 . The use of Elisa for the
detection of chronic respiratory disease in chickens . Penyakit Hewan .
;11-14
;(46A)
25

161