09 marzo, 2008

peroxidasa y polifenol oxidasa

INTRODUCCIN

La peroxidasa es una homoprotena altamente especfica para el aceptor de hidrogeno, que es el

peroxido de hidrogeno, pero es muy inespecfica en cuanto al sustrato donador que utiliza, que
puede ser una de muchas sustancias, por ejemplo: fenoles, aminofenoles diaminas, indofenoles,
leucocolorantes, ascorbato e incluso ciertos aminocidos como tirosina.
La reaccin se puede seguir de la siguiente manera:
Donador reducido + H2O2 peroxidasa donador oxidado + 2H2O
Esta enzima se encuentra en la mayora de las plantas y en ciertos microorganismos, pero es
escasa en los tejidos animales. Se observa la actividad de la peroxidasa en la leche
(lactoperoxidasa), en los leucocitos (leucoperoxidasa) o mieloperoxidasa), en la placenta una de
las formas ms activas en la peroxidasa del rbano.
El mecanismo de accin es sumamente parecido al que se propone para la catalasa, a travs de la
formacin de un complejo. Ms aun, en este caso son diversos los complejos los complejos que se
forman entre la enzima y el peroxido de hidrogeno de que sea capaz de reaccionar con el
donador reducido.
La polifenol oxidasa recibe muchos nombres debido a la gran diversidad de sustratos que emplea.
Tcnicamente es una o-difenol: oxigeno reductasa. Su reaccin se puede describir de la siguiente
manara:
2 o- difenol + O2 polifenol oxidasa 2O-quinona + 2 H2O
Esta enzima puede llevar a cabo la oxidacin directa aerobia de compuestos mono y difenoles
(tirosina, fenol, p-cresol, 3, a-dimetil fenol, 4-terbutilfenol). Tambin puede atacar a o-difenoles
y a la adrenalina. Es una enzima de peso molecular 120.00, con un centro de cobre.
La polifenol oxidasa de la papa ataca a los siguientes compuestos en orden de mayor a menor
actividad: acido clorhdrico, catecol, quercitina, piragalol, acido cafeico, 3,4-
dihidroxifenilalanina, p-creso, tirosina entre otros. Las quinonas resultantes de la reaccin de la
polifenol oxidasa pueden continuar oxidndose y polimerizndose, para dar compuestos finales
que son muy complejos y coloridos.
Es difcil distinguir las actividades de las dos enzimas a partir de la misma fuente, ya que pueden
atacar a los mismos substratos. De Sin embargo utilizando papa como fuente de las enzimas, la
reaccin de la peroxidasa es mucho mas rpida, cosa que puede permitir la observacin de las
dos acciones 1

OBJETIVO
Demostrar las dos actividades enzimticas, peroxidasa y Polifenol oxidasa, a partir de un extracto
de papa.

MATERIALES Y REACTIVOS

Material necesario.
1 Gradilla 1 Mortero
15 tubos de ensaye de 13 x 100 1 vaso de precipitado de 500 mL
2 vasos de precipitados de 250 ml 1 Agitador
Pipeta de 5 ml y 3 de 1 ml. 1 Mechero, tripie y tela de asbestos
1 Pinzas para tubo de ensaye 1 gasa
1 Pelador
Hielo
Reactivos
25 mL de Catecol al 1%
25 mL Pirogalol al 1%
4 mL Tirosina al 1%
35 mL Peroxido de hidrogeno al 3%
8 gotas Cianuro de sodio
10 mL de agua destilada.
10 mL Exacto de papa precalentado y frio 40 mL

PROCEDIMIENTO

Lo indicado en este punto debe hacerse lo ms rpido posible

Una papa limpia se rallo, moli en un mortero. Al mortero le pusimos hielo y 100 ml agua
destilada. Se dejo reposar por 10 min. Se filtro a un vaso de precipitados que estaba sumergido
en el hielo, la pulpa que quedo en la gasa y se desecho. Dejamos reposar el filtrado por 5 minutos
para que el almidn se asiente en el fondo, despus volvimos a decantar y el nuevo filtrado lo
colocamos en hielo. Este liquido filtrado le llamamos Extracto de papa. Obtuvimos ms de 50
ml. Despus en una gradilla colocamos 13 tubos y los enumeramos del 1 al 13. Se coloco 0.5 ml
de catecol al 1 % a los 1, 2, 3, 4, 11.

Despus colocamos 0.5 ml pirogalol al 1 % 5, 6, 7, 8, 12. Luego colocamos 2 ml de tirosina al 1 % a

los tubos 9 y 10. Despus le pusimos 0.5 ml de perxido de hidrgeno al 3 % a los tubos 2, 4, 6, 8,
10, 11, 12. Se agrego 4 gotas de cianuro de sodio al 5% a los tubos 7 y 8. Tomamos 5 ml del
extracto de papa y los colocamos en dos tubos de ensaye sin nmero y los calentamos por 5 min.
En bao de agua hirviendo. Despus pipeteamos 5 ml de agua destilada a los tubos 11 y 12.
Pipeteamos 5 ml del extracto de papa a los tubos 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y 13. Mezclamos bien
dejamos reposar la temperatura ambiente y observamos los cambios de color a los 2, 5, 10 y 15
minutos.

Resultados

Tubo 1 0.5 mL Catecol al 1% 5.0 mL Extracto de papa

Polifenol oxidasa actu libremente sobre el catecol
Tubo N2 0.5 mL Catecol al 1% 0.5 mL H2O2 al 3% 5.0 mL Extracto de papa
La peroxidasa actu libremente sobre el catecol
Tubo N 3 0.5 mL Catecol al 1% 5.0 mL Extracto de papa precalentado
La Polifenol oxidasa se inactivo por el efecto de la temperatura
Tubo N4 0.5 mL Catecol al 1% 0.5 mL H2O2 al 3% 5.0 mL Extracto de papa precalentado
La peroxidasa se inactivo por el efecto de la temperatura
Tubo N 5 0.5 mL Pirogalol al 1% 5.0 mL Extracto de papa
Polifenol oxidasa actu libremente sobre el catecol
Tubo N 6 0.5 mL Pirogalol al 1% 0.5 mL H2O2 al 3% 5.0 mL Extracto de papa
La peroxidasa actu libremente sobre el pirogalol
Tubo N 7 0.5 mL Pirogalol al 1% 4 gotas Cianuro de sodio 5.0 mL Extracto de papa
Polifenol oxidasa se inhibi por la presencia del cianuro
Tubo N 8 0.5 mL Pirogalol al 1% 0.5 mL H2O2 al 3% 4 gotas Cianuro de sodio 5.0 mL Extracto de
papa
La peroxidasa se inhibi por la presencia del cianuro
Tubo N 9 2.0 mL Tirosina al 1% 5.0 mL Extracto de papa
Polifenol oxidasa actu libremente sobre la tirosina
Tubo N 10 2.0 mL Tirosina al 1% 0.5 mL H2O2 al 3% 5.0 mL Extracto de papa
La peroxidasa actu libremente sobre la tirosina
Tubo N11 0.5 mL Catecol al 1%0.5 mL H2O2 al 3%5.0mL Agua destilada
No hay enzima, los compuestos se oxidan por el oxigeno atmosfrico
Tubo N 12 0.5 mL Pirogalol al 1%0.5 mL H2O2 al 3%5.0 mL Agua destilada
No hay enzima, los compuestos se oxidan por el oxigeno atmosfrico
Tubo N 13 5.0mL de agua destilada

No hay enzima, sirve como patrn de observacin

Substratos de las enzimas peroxidasa y polifenol oxidasa

Catecol
Pirogalol

Tirosina

2-Estructuras

La peroxidasa acta con mayor velocidad que el polifenol oxidasa.

Orden de preferencia del la peroxidasa por los substratos: catecol, pirogalol y tiamina, en base
a la velocidad de reaccin. Liberacin de burbujas O2 e intensidad de color.

Orden de preferencia del polifenol oxidasa por los substratos catecol, pirogalol y tiamina, en
base a la velocidad de reaccin e intensidad de color que se fue atenuando del catecol a la
tiamina.

El efecto de los inhibidores se observo claramente, puesto que fueron eficientes. No se observo
que uno actuara mejor que otro aparentemente.

Las enzimas pueden tener substratos en comn.

CONCLUSIN

Se demostr las dos actividades enzimticas de la peroxidasa y polifenol oxidasa partir de de la

misma fuente, el extracto de la papa, y la accin inhibidora de la temperatura y el CN- . En base
a los resultados la peroxidasa es mucho ms rpida en actuar que el Polifenol oxidasa.

CUESTIONARIO

1.- Cules son los productos de la reaccin de la peroxidasa dado que el substrato fuera
polifenol?
Polifenol? Donador reducido + H2O2 peroxidasa polifenol? donador oxidado + 2H2O
Al igual que el Pirogalol que es un polifenol

2.- Qu diferencia hay entre las enzimas peroxidasa y polifenol oxidasa?

Que una acta en presencia de peroxido de hidrgeno (aceptor de hidrgenos altamente
especifico), la peroxidasa y la polifenol oxidasa en presencia de O2, adems de tener un centro
de cobre.

3.- Supuesto que las dos pueden venir en la misma fuente, cmo podemos distinguirlas?
La accin de la peroxidasa es mucho ms rpida, cosa que puede permitir la observacin de las
dos acciones.
4.- Cul es la razn de la diferencia de color con los diferentes substratos?
El anillo fenolico esta ms sustituido del catecol a la tiamina, lo que dificulta la oxidacin.

5.- Para qu se aade peroxido de hidrogeno al vaso de reaccin?

Segn la reaccin de la peroxidasa
Donador reducido + H2O2 peroxidasa donador oxidado + 2H2O
Para la reaccin de redox

6.- Qu efecto tiene en el hgado la accin conjunta de peroxidasa y catalasa, y que diferencia
hay entre las dos enzimas?
La peroxidasa es escasa en tejidos animales, mientras que la catalasa esta concentrada en los
glbulos rojos y puede actuar sobre el pirogalol. La catalasa seria ms eficaz.

7.- Por qu las manipulaciones para la preparacin del extracto de enzima se llevan a cabo a
bajas temperaturas?
Para evitar el contacto con el oxigeno atmosfrico haga que las enzimas comiencen a actuar
sobre los sustratos normales.

8.- Por qu al estar trabajando con una enzima hay que evitar la formacin de espuma, y como
puede evitarse?
La espuma es la liberacin de oxigeno, en este caso quitando el peroxido de hidrogeno, pero la
peroxidasa es altamente especfica para el mismo aceptor de hidrgenos. Manteniendo la
temperatura por de bajo de la de accin.
BIBLIOGRAFA
1.- Manual de laboratorio de bioqumica metablica Gracilazo
Lecturas:
http://es.wikipedia.org/wiki/Peroxidasa
http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/lb/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/schmidth02/p
arte08/02.html

Estructuras:
2. http://www.artbiochem.com/recursos/akpcespanol.pdf