TEKNIK KULTUR SEL HEWAN

Kultur jaringan secara umum digunakan untuk memindahkan sel, jaringan atau organ yang
berasal dari hewan menuju ke tempat dengan kondisi lingkungan yang konduktif untuk mendukung
pertumbuhan sel tersebut. Untuk menjaga agar jaringan tetap hidup dan mengalami pertumbuhan
diperlukan suatu teknik khusus dan medium kultur yang sesuai dan tepat, serta mengandung
campuran nutrisi baik dalam bentuk padat ataupun cair (Nema et al., 2012). Kultur sel sendiri
sebenarnya merupakan sebuah kultur turunan dari sel dispersed yang telah diambil dari jaringan
asli, dari sebuah kultur primer atau dari sebuah sel line oleh enzimatik, mekanik, atau beberapa
reaksi kimia (Freshney,2005). Kultur sel maupun jaringan umumnya dilakukan dalam laboratorium
dan terutama penggunaan kultur sel menjadi semakin meningkat setelah ditemukannya medium
kultur yang tepat. Selain hal tersebut masih banyak manfaat yang diperoleh jika menggunakan
kultur sel diantaranya kontrol terhadap lingkungan lebih mudah, karakteristik dan homogenitas dari
sampel, modeling in vitro yang digunakan dapat disesuaikan dengan kondisi in vivonya,ekonomis
baik dalam skala dan mekanisasi dari kultur, menghindari eksperimen hewan (Roche,2012).
Jika membahas mengenai kultur sel sangat erat kaitannya juga dengan kontaminan yang
dapat ditimbulkan dari organisme lain baik pada saat melakukan kultur ataupun pada saat
penyimpanan kultur. Organisme yang dapat menyebabkan kontaminasi kultur sel seperti bakteri,
mycoplasma, yeast, fungi, dst. Oleh karena itu perlu diterapkannya teknik aseptis seperti berikut:
1. Sebelum bekerja selalu menyemprot tangan dengan alkohol, menggunakan masker dan penutup
kepala.
2. Selalu menjaga kebersihan meja kerja baik sebelum maupun sesudah melakukan kultur dan
pindahkan barang atau alat yang tidak dibutuhkan saat prosedur kultur dilakukan. Ada 5 langkah
yang harus dilakukan diantaranya: gunakan 80% alkohol untuk membersihkan permukaan meja
kerja sebelum digunakan, meja kerja hanya berisi peralatan yang dibutuhkan saja selama
prosedur kultur berlangsung, buat ruang kosong di bagian tengah meja kerja sebagai tempat kerja
saat mengkultur nantinya, hindari membuat kotor meja kerja seperti tumpahan bahan,
membersihakan meja kerja setelah selesai menggunakannya.
3. Selalu gunakan laminar air flow hood saat melakukan kultur sel.
4. Selalu gunakan tempat penyimpanan yang agak luas dan terjaga sirkulasi udaranya seperti kulkas
ataupun freezer.
5. Secara kontinuitas untuk selalu membersihkan kulkas, inkubator, dan water bath agar terhindar
dari pertumbuhan mold dan fungi.
6. Selalu perhatikan tanggal kadaluarsa dari stok reagen-reagen yang akan digunakan.
7. Selalu mengkontrol pertumbuhan dari kultur sel yang telah dibuat, jika ada kontaminan akan
terjadi pertumbuhan sel yang abnormal (Roche,2012).
Selain teknis aseptis sebelum melakukan kultur sel peralatan yang harus disediakan diantaranya
seperti:
1. Laminar Air flow
Ada 2 macam yaitu horizontal hood (tidak dapat digunakan saat bekerja dengan organisme yang
berbahaya atau toksit, karena aliran udaranya langsung menuju ke tubuh kita), dan vertical hood
(dapat dikatakan sebagai biology safety cabinet sebab aliran udaranya dari atas menuju ke
bawah). Dimana pada LAF ini terdapat HEPA(high efficiency particle) yang berfungsi sebagaii
filter penyaring udara, selain itu terdapat juga short wave sinar uv yang bisanya selalu
dinyalakan beberapa menit apabila sebelum bekerja.
2. Inkubator CO2
 Dibutuhkan ini sebab sel dapat tumbuh dengan kandungan CO2 5%.
3. Mikroskop
Inverted phase contrast microscope digunakan untuk visualisasi atau mengamati dari
pertumbuhan sel kultur.
4. Flask atau Cawan Petri
Digunakan untuk tempat biakan dari sel yang sudah dikultur tadi.
5. Freezer
Digunakan sebagai tempat penyimpanan dalam jangka waktu yang lama atau dapat digunakan
untuk merubah fase cair menjadi padat baik pada saat pembuatan medium (Nema et al., 2012).
6. Cryotube
Digunakan untuk menyimpan sel yang akan dibiakkan, dapat digunakan sebagai tempat
penyimpanan pada suhu rendah.
7. Tangki Nitrogen cair
Sebagai tempat penyimpanan sel kultur dalam jangka waktu yang lama (cryopreservation).
8. Haemacytometer
Digunakan untuk menghitung jumlah sel melalui ruang w.
9. Aspirator
Digunakan untuk mengambil medium sisa yang telah digunakan untuk kulur didalam flask.
10.Filter
Digunakan untuk sterilisasi medium (Freshney,2005)
Selain peralatan sebelum kultur sel juga diperlukan sebuah media yang terdiri dari sumber
energi yang tepat untuk sel, dimana sel dapat dengan mudah memanfaatkan senyawa yang
terkandung dalam media untuk regulasi dan pertumbuhan serta siklus sel. Banyak resep dalam
pembuatan media untuk kultur sel tergantung pada persyaratan yang digunakan suatu sel untuk
dapat hidup dan survive dilingkungannya, akan tetapi media kultur harus mengandung banyak
nutrisi, buffer, isotonik, dan media harus selalu steril. Selain itu parameter yang dapat digunakan
dalam pembuatan media kultur sel ini yaitu osmolaritas, pH, formulasi nutrisi (Nema et al., 2012).
Banyak dari media kultur sel hewan mengandung komponen utama seperti glukosa, fruktosa, asam
amino, sumber nitrogen. Ada 2 jenis media yang digunakan dalam kultur sel yaitu:
1. Media alami terbuat hanya dari bahan-bahan alami seperti gumpalan darah, cairan biologis dan
ekstrak jaringan.
2. Media buatan,media ini dibuat untuk mencapai tujuan tertentu yang ingin didapatkan dari kultur
sel seperti immediate survival (larutan garam seimbang dengan ph tertentu dan tekanan osmosis
yang memadai), prolonged survival (larutan garam seimbang dengan suplemen tambahan berupa
serum atau dengan formulasi senyawa organik lainnya), pertumbuhan yang tak menentu dan
spesialisasi fungsi. Contohnya seperti: media dengan serum, media serum free, media yang
mengandung bahan kimia tertentu dan media protein free(Nema et al., 2012).
Lingkungan yang baik dapat mendukung pertumbuhan dan proliferasi dari sel. Kondisi
lingkungan untuk pembiakan kultur sel seperti berikut:
1.pH sel normal mamalia dapat tumbuh pada pH 7,4. Beberapa sel line dapat tumbuh antara pH
7-7,4 dan beberapa sel normal fibroblast tumbuh antara pH 7,4-7,7)
2.CO2 5 %
3.Temperatur sel mamalia 360C-370C, sel line aves 38,50C, derivat sel line dari hewan berdarah
dingin 150C dan 260C (Nema et al., 2012)..
Ada 3 macam tipe sel kultur diantaranya:
1. Sel Epitel sel yang menempel pada substrat, flat atau datar dan bentuknya poligonal.
2. Sel limphoblast sel yang tidak dapat menempel pada substrat, suspension cell, bentuknya
sperikal.
3. Sel fibroblast sel yang menempel pada substrat, memanjang, dan bipolar(Freshney,2005).
Prosedur umum dalam kultur sel terdiri dari :
1. Kultur sel primer
Proses kultur pertama pada sel dalam kondisi sintesis, jadi proses kultur yang terjadi dimana sel
diperoleh langsung melalui pemotongan jaringan yang kemudian dapat dilakukan perlakuan
yang berbeda untuk jangka waktu yang lama. Terdiri dari tahapan sebagai berikut isolasi
jaringan (disagregasi pada sel dengan disagregrasi kimia) dan mekanikal disagregasi(diinkubasi
selama pertumbuhannya).
2. Sub kultur
Kultur sel hewan yang baru dibuat dengan mentransfer beberapa atau semua sel dari medium
kultur sebelumnya ke medium yang baru dibuat. Hal ini dilakukan jika pada medium lama telah
terjadi proliferasi sel yang sudah menumpuk sehingga sel tidak dapat teramati lagi.
3. Kultur monolayer
Pada waktu dibawah dari flask kultur di lingkupi oleh lapisan sel continuous, sering satu sel
tebal, bagian tersebut yang disebur kultur monolayer.
4. Kultur suspensi
Ini digunakan bagi tipe sel yang non adhesive seperti sel leukimia.
5. Sel line
Sebuah sel line yang muncul dari kultur primer pada waktu subkultur pertama berhasil. Hal ini
mengasumsikan bahwa kultur berasar dari original sel lineage yang ada pada kultur primer. Ada
2 macam sel line yakni finite sel line (sel line yang memiliki jangka waktu tertentu (20-80
populasi doubling)), Continuous sel line (sel yang akan terus dapat membelah dan memiliki laju
perumbuhan yang cepat dengan waktu 12-24 jam)
Cryopreservation:
N2 cair digunakan untuk mengawetkan sel kultur jaringan, baik dalam fase cair (-196C) atau dalam
fase uap (-156C). Untuk meminimalkan efek pembekuan, Beberapa tindakan pencegahan yang
dilakukan seperti pertama ditambahkan agen cryoprotective yang menurunkan titik beku, seperti
gliserol atau DMSO. Biasanya sebuah media untuk pembekuan khas mengandung 90% serum, 10%
DMSO. Selain itu, yang terbaik adalah menggunakan sel-sel sehat yang tumbuh dalam fase log dan
mengganti media 24 jam sebelum membeku. Juga, sel-sel secara perlahan didinginkan dari suhu
kamar ke -80 C untuk memungkinkan air bergerak keluar dari sel sebelum membeku(Nema et al.,
2012).