TEMA #3

PROCEDIMIENTOS DE
DIAGNSTICO EN
LAS MICOSIS
Jos Ramn Alvarez Robles
Micologa Clnica
 Estudios Epidemiolgicos
La epidemiologa de las micosis ha mostrado cambios en las ltimas
dcadas como consecuencia de las modificaciones en las condiciones
ambientales, la distribucin de los agentes etiolgicos, el envejecimiento de
la poblacin, el aumento de las terapias inmunosupresoras y de
enfermedades como el VIH, adems del incremento de la resistencia
secundaria al uso indiscriminado de agentes anti fngicos; lo cual se refleja
en cambios en los patrones clnicos.
 Las dermatofitosis son micosis
superficiales muy frecuentes en Mxico.

Actualmente constituyen del 70 al 80% de

todas las micosis y tienen una frecuencia
del 5% en la consulta dermatolgica.

De acuerdo con las publicaciones de Lpez

Martnez en 1972 y 1985 y Bonifaz en 1988,
Trichophyton rubrum contina en un incremento
global del 61% y al mismo tiempo hay decremento
de tinea capitis del 31% al 3%.
Estudios Clnicos
 En Mxico los patrones de distribucin geogrfica de los agentes causales han ido
cambiando, Gonzlez Ochoa y Orozco encontraron entre 1940 y 1970 un aumento del
25-40% en la prevalencia de T. rubrum, este aumento fue paralelo con un decremento
en Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton tonsurans y Microsporum canis [6].

Trichophyton Rubrum Trichophyton Mentagrophytes

Trichophyton Tonsurans

En un estudio realizado en 1972
en un total de 1957 pacientes
con micosis
Microsprum Canis
56% correspondieron a dermatofitos:
*T. rubrum 60%,
*T. mentagrophytes 17%,
*Epidermophyton floccosum 9%,
*Trichophyton tonsurans 8%,
*M. canis 4%,
*Microsporum gypseum 0,2%,
*Microsporum fulvum y
*Trichophyton violaceum 0,1%.
Las onicomicosis fueron por
T. rubrum en 25%
T. tonsurans en 13%
T. mentagrophytes en 21%.
T. rubrum, T. mentagrophytes y E.
floccosum se observaron
exclusivamente en adultos y M. canis y
T. tonsurans preferentemente en nios.
 Se afectaron uas de pies en 42%,
Dos estudios de los pies en 30% y las ingles en 13%.
dermatofitosis realizados en
la dcada de 1980 mostraron
predominio del sexo
masculino (64%). Se aisl T. rubrum en 66-79%, T.
mentagrophytes en 9-14%, M. canis
en 5% y E. floccosum en 4%.

Estudio de 1102 pacientes del
Departamento de
Dermatologa, Hospital
General Dr. Manuel Gea
Gonzlez, Mxico D.F.
http://reviberoammicol.com/2002-19/063067.pdf
Estuvieron en primer lugar las dermatofitosis en 36%: T. Rubrum
61%, M. canis 24%, T. tonsurans 7%, E. floccosum 5%,
T. mentagrophytes 3% y M. gypseum 0,8%.
Correspondieron a tia de la cabeza 13%, encontrandose M. canis
en 82%, T tonsurans en 14% y M. gypseum en 2% y asociaciones
en 2%.
La tia del cuerpo se present en 22% y fue ocasionada por T.
rubrum en 54%, M. canis en 25%, T. tonsurans en 10%, T.
mentagrophytes en 5%, E. floccosum en 3% y M. gypseum en 2%.
La tia de la ingle se present en 11%, afect varones en 84%, y
fue ocasionada por T. rubrum en 76% y E. floccosum en 12%.
La tia de las manos se present en 5%, afect varones en 68% y
debida a T. rubrum en 92%. La tia de las uas se present en 76%
y fue ocasionada por T. rubrum en 84%.
La tia de los pies tuvo una frecuencia de 18%, afect varones en
62%, y nios en 23%; se debi a T. rubrum en 86%, T.
mentagrophytes en 5%, T. tonsurans en 5% y E. floccosum en 2%.

La tia de los pies fue la ms
En Guadalajara en un frecuente con un 36%, y el
estudio retrospectivo en agente etiolgico fue T.
5578 pacientes, las rubrum con 57%, siguieron
M. canis en 20%, T.
dermatofitosis ocuparon mentagropytes 10%, T.
el 79% y representaron el tonsurans 9%, E. floccosum
4% de la consulta
2%, y con menos del 1% T.
dermatolgica.
violaceum, M gypseum y M
audouinii
En este mismo centro
dermatolgico en un estudio Los agentes causales fueron
retrospectivo de 2227 nios, M. canis en 42%,
las dermatofitosis se T. tonsurans en 13%,
presentaron en un 75%, la tia
T. rubrum en 11%,
de la cabeza en primer lugar
con 71%, la tia de los pies y la T. mentagrophytes en 6%,
E. floccosum en 5%,
tia del cuerpo en 12%, la tia
M. gypseum en 1% y
de las uas en 3%, la tia
M. audouinii en 0,04%
inguinal y la tia de las manos
en 1%.
Estudios de Laboratorio

Recoleccin de muestras
Material requerido
La recoleccin de muestras es sencilla, y el
material que se emplea es econmico y est al
alcance de todos; el instrumental metlico por
lo general se esteriliza a la flama; se usan:
Pinzas de depilar y tijeras finas y fuertes.
Cucharilla de Broce u hojas de bistur.
Aguja de diseccin.
Cajas de Petri o dos portaobjetos con envoltura estril
(sirven para obtener y conservar las muestras); para el
transporte es mejor usar paquetes de papel.
Portaobjetos y cubreobjetos.
Asa de aluminio o platino, de preferencia recta; se utiliza
para sembrar y recolectar productos.
Matraces Erlenmeyer.
Tubos de ensayo.
Hisopos estriles, esptulas, torundas.
Cepillos.
Jeringas de insulina.
Frascos.
Solucin salina, formol y alcohol de 70 grados.
Medios de cultivo: agar glucosado de Sabourau con
antibiticos y sin ellos, medio de tioglicolato y, si es
posible, medios colorimtricos para levaduras
Rechazo de 1. Ante micosis pulmonares, se recolecta
esputo, mas no saliva.
muestras 2. Las muestras de piel, uas o pelos
deben tomarse de las zonas enfermas o
del lmite entre la lesin y la parte sana;
no deben tomarse al azar.
3. Muestras insuficientes.
4. De ser posible no se usan muestras con
mucho tiempo de almacenamiento,
puestas en hielo seco, congeladas o en
medios de transporte por ms de 24 h.
Frotis: Anlisis directo

Es til en pus, exudados y otros lquidos, como
expectoracin; se fijan los especmenes en un
portaobjetos mediante calentamiento ligero o poniendo
dos gotas de alcohol.
Se puede utilizar tincin de Gram, azul de metileno,
Giemsa, PAS o Papanicolaou (vanse figuras 7-8 y 23-3).
El examen directo con microscopia ptica permite la confirmacin
inmediata de los elementos fngicos. Es sencillo, rpido y econmico;
permite observar al hongo sin modificaciones y cuantificar la cantidad de
elementos.
Los exudados se observan de manera directa o se pone una gota de agua
destilada o solucin fisiolgica, pero es ms conveniente usar solucin de
Lugol (solucin yodo yodurada) pues da cierta coloracin a los elementos
parasitarios demasiado plidos

Soluciones:

Solucion de Lugol
Solucion de Sosa y Potasa al 30%
Solucion de DMSO
Lactofenol de Amann
Azul de Lactofenol
Azul de Metileno
Sulfito de Sodio 10%
Sulfito de Sodio 5%
ESCAMAS
Fijacin de escamas
Permite conservar por tiempo indefinido para
un anlisis directo; se usa sobre todo en la
enseanza.
Se coloca una capa delgada de albmina de
Meyer sobre un portaobjetos.
Con la ayuda de una aguja de diseccin se
colocan encima algunos fragmentos de
escamas, pelos o raspado de uas; se dejan
secar a temperatura ambiente toda la noche o
1 a 2 h a 37 C y quedan listos para teirse.
Escamas.
En lesiones cutneas secas, se recolectan escamas
abundantes del borde de la lesin o de varios sitios.
Se raspa con una cucharilla, una hoja de bistur o
simplemente con un portaobjetos.
La cinta adhesiva transparente (Scotch tape) se emplea en pitiriasis
versicolor y dermatitis seborreica; se aplica la cinta sobre la piel enferma
y luego sobre un portaobjetos (al cual previamente se le coloca una gota
de algn colorante como por ejemplo, tinta Parker o negro de clorazol)
para observacin directa al microscopio.

Las escamas se colocan dentro de una caja de Petri o entre

dos portaobjetos estriles o flameados, y se cubren con una
hoja de papel donde pueden anotarse los datos.

En lesiones hmedas es mejor utilizar cucharilla, pinzas o

tijeras. Un anlisis con resultados negativos debe repetirse si
la lesin es muy sugestiva. Tambin es muy eficaz el uso de
hisopos previamente humedecidos en agua estril, con los
cuales se raspa la lesin y luego se pasan sobre la superficie
del medio de cultivo.

En lesiones secas, una variante es la biopsia de superficie con

cianoacrilato (Kola Loka).
Se utiliza una gota sobre un portaobjetos, que se coloca en
contacto con la piel durante 40 s, se retira, se tie con cido
perydico de Schiff (PAS) y se observa al microscopio.
Pelos.
Es necesario examinar los pelos afectados; en el caso de tias microspricas, la fluorescencia con
lmpara de Wood orienta hacia tia de la cabeza. Se utilizan pinzas para depilar con las cuales se
arrancan los pelos con facilidad y sin dolor.

Tambin es posible usar el escalpelo y raspar la superficie afectada.

Es necesario obtener la muestra en el lmite entre la regin sana y la enferma, sobre todo de la regin
subungueal o de la ua en s. Deben obtenerse partculas finas mediante raspado con hoja de bistur o
cucharilla. Cuando hay perionixis, es necesario recolectar escamas de la regin periungueal y, si hay pus,
puede sembrarse empleando una pipeta o un hisopo que puede conservarse hmedo al colocarlo en
suero salino fisiolgico.
Pus y lquidos patolgicos (lquido
cefalorraqudeo, lquido pleural, orina).

Se deben obtener las muestras con tcnica estril y

sembrar una cantidad suficiente (0.5 ml); en abscesos, si
es posible, se punciona y aspira con una jeringa; se
levantan las costras y se deposita la muestra en tubos
estriles. En lquido cefalorraqudeo (LCR) y orina,
conviene centrifugar la muestra a 2 000 revoluciones por
minuto (rpm) por 20 min; luego, con una pipeta de
Pasteur estril, se separa con sumo cuidado el
sobrenadante y se pasa a un tubo estril; el sedimento
se utiliza para las pruebas diagnsticas. En el pus se
buscan levaduras, filamentos y granos. En LCR, se usa
tinta china para detectar Cryptococcus .
La tincin de Ziehl-Neelsen (ZN) o el mtodo ZN
modificado de Kinyoun es til en actinomicetos; los
granos o los cultivos de Nocardia muestran
resistencia parcial al cido, y Actinomyces no es
resistente.

La tincin de Gram o de Ziehl-Gram se usa

para teir filamentos actinomicticos. Es posible
combinar impregnacin argntica con mucicarmn
para Cryptococcus (figura 21-8). Casi nunca se usa
tincin de Giemsa.
 CULTIVO
Es la siembra de productos anatomopatolgicos en los
medios idneos; casi siempre se lleva a cabo en laboratorios
especializados, en medios que contienen nitrgeno orgnico,
agua, glucosa y peptona. Las muestras pueden recolectarse
con un hisopo estril o con el asa de platino previamente
calentada al rojo y enfriada en el medio de cultivo, lo cual
facilita la adherencia en el caso de pelos y escamas. En
general, se colocan los especmenes sobre la superficie del
medio de cultivo y se conservan a temperatura ambiente
(25 a 26 C); en caso de micosis profundas, es mejor a 30 a
37 C. Las levaduras se siembran con tcnica de zig-zag.
El material necesario consta de portaobjetos, cajas de Petri, caballetes de vidrio en U (o
en V) dentro de estas ltimas y agua, todo estril.
Se toma una caja de Petri con un caballete (si no estn estriles se pasan por la flama). Se
depositan 5 ml de agua en la caja de Petri, que evitan la desecacin
posterior. Se coloca un portaobjetos sobre el caballete y con una pipeta estril se pone
MICROCULTIVO
una capa de gelosa en la superficie de la laminilla y se reaspira para minimizar el espesor (Cultivo en lmina)
de la capa. Se siembra en el centro un fragmento del cultivo y se incuba a la temperatura
seleccionada.

Luego del desarrollo suficiente del cultivo, se retira el exceso de gelosa, se pone una gota
de azul de lactofenol, se cubre con una laminilla, se sella y se examina.
Hay dos variedades de esta tcnica:

1. Lmina desecada. Tras retirar el exceso de gelosa, se seca el cultivo a 37 C, se fi ja

con una gota de alcohol absoluto, se colorea con azul de algodn, se deshidrata con
alcohol, se enjuaga con tolueno y se monta con resina.

2. Cuadrado de gelosa. El cultivo se realiza en el punto medio de los cuatro lados de un

pequeo cuadrado de gelosa de Sabouraud (1.5 cm de lado y 2 mm de espesor) que
se coloca en el portaobjetos y se pone encima un cubreobjetos (fi gura 5-7).
Luego del crecimiento del hongo se retiran el cubreobjetos y la gelosa. De este
modo, los filamentos y los rganos de reproduccin quedan unidos al cubreobjetos y
al portaobjetos. Ambas partes se montan con azul de algodn, se sellan y examinan
al microscopio
Pruebas Bioqumicas
Sntesis de ureasa
Se realiza por alcalinizacin debido a la formacin de carbonato de
amonio y se manifiesta por viraje del indicador de pH (fi gura 5-9).
Se utiliza medio urea-indol (que se usa para diferenciar
enterobacterias). A 37 C el rojo fenol, de color amarillo, vira a rojo
violeta en 3 a 6 h (Cryptococcus y T. mentagrophytes).

Para dermatofitos se emplea como medio base:

Peptona 1 g
NaCl 5 g
KH
2PO4 2 g
Glucosa 5 g
Gelosa 20 g
Agua destilada 1 L

Se funde la gelosa y se agrega rojo fenol (0.2% en etanol al 50%), 6

ml/L. Se esteriliza en autoclave de 15 a 20 min a 115 C. Se deja enfriar
a 50 C; con tcnica estril, se agregan 100 ml de una solucin acuosa
de urea a 20%, previamente esterilizada por fi ltracin. En los tubos
solidificados en posicin inclinada se siembra un pequeo inculo de
la colonia y se incuba a 25 C
Inoculacin experimental
Se emplea en investigacin, pero puede tener
utilidad diagnstica. Se usan conejos, ratas,
ratones, conejillos de Indias (cobayos o cuyos) y
hmsteres (cricetos) dorados. Los hongos pueden
inocularse por va subcutnea, intravenosa,
intraperitoneal, intratesticular e intracraneal.
La presencia de lesiones es indispensable para
asegurar la patogenicidad del hongo. Si despus
de un tiempo el animal no muere, se sacrifica. En
la necropsia se intenta obtener el cultivo del
hongo inoculado (retrocultivo) y otra parte de los
rganos se fija para estudio histopatolgico.

Para la inoculacin, se prepara una suspensin del

hongo problema; se colocan alrededor de 100 mg
de ste por cada mililitro de solucin salina, y se
aplica mediante jeringa de insulina.
 Reacciones inmunolgicas

Dependen de algunos hongos patgenos y pueden ayudar al diagnstico. Se dividen en

pruebas de sensibilidad cutnea y reacciones serolgicas.

Pruebas de Sensibilidad Serodiagnstico y

Cutanea deteccin de antgenos

Intradermorreacciones Presencia de
en cara interior del Anticuerpos
brazo Reaccin positiva 5mm
Reaccin positiva 5mm
Serodiagnstico y
deteccin de antgenos

Presencia de
Anticuerpos
Reaccin AG-AC
Estudios de Gabinete
Estudio Luz de Wood
Cuando se dispone del equipo
necesario, suele practicarse antes
del estudio micolgico, pero no lo
sustituye; es til en algunas
micosis superficiales.
Se realiza en un cuarto oscuro y se
utiliza una lmpara de luz
ultravioleta que emite radiaciones
de 320 a 400 nm (366 nm en
promedio) de longitud de onda, y
da fluorescencia reconocible con
facilidad.
Gracias