Revista CENIC.

Ciencias Biolgicas
ISSN: 0253-5688
editorial.cenic@cnic.edu.cu
Centro Nacional de Investigaciones Cientficas
Cuba

Ros Hernndez, Miriam; Cepero Caas, Janet

Citotoxicidad in vitro: sistema para la evaluacin de biomateriales y equipos mdicos implantables en
Cuba
Revista CENIC. Ciencias Biolgicas, vol. 37, nm. 3, 2006, pp. 173-176
Centro Nacional de Investigaciones Cientficas
Ciudad de La Habana, Cuba

Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=181220529011

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 Revista CENIC Ciencias Biolgicas, Vol. 37, No. 2, 2006.

Citotoxicidad in vitro: sistema para la evaluacin

de biomateriales y equipos mdicos implantables
en Cuba

Miriam Ros Hernndez y Janet Cepero Caas.*

Ensayos Preclnicos, Centro de Control Estatal de Equipos Mdicos , Calle 4 No. 455 entre 19 y 21, El Vedado, Plaza de la
Revolucin, Cdigo Postal 10400. (mrios@infomed.sld.cu). *Laboratorio de Inmunofarmacologa, Instituto de Oncologa y
Radiobiologa.

Recibido: 14 de mayo de 2003. Aceptado: 9 de febrero de 2004.

Palabras clave: citotoxicidad in vitro, biocompatibilidad, biomateriales, equipos mdicos, iso 10993-5, materiales de referencia.
Key words: in vitro cytotoxicity, biocompatibility, biomaterials, medical devices, ISO 10993-5, reference materials.

RESUMEN. Los ensayos de citotoxicidad in vitro se incluyen en los estudios de INTRODUCCION

la primera fase de evaluacin de los biomateriales y equipos mdicos El desarrollo de los biomateriales,
implantables. La evaluacin citotxica constituye una va simple, rpida y eco-
considerando el sensible ambiente
nmica para obtener una valiosa informacin acerca de la biocompatibilidad de
biolgico al que estn destinados,
los biomateriales. Con el objetivo de establecer el sistema de evaluacin de la
requiere conocimientos de todos los
citotoxicidad in vitro para estos materiales en Cuba y selecionar el ensayo ms
conveniente, se evaluaron tres mtodos recomendados en la Norma ISO 10993- campos de las ciencias naturales y
5, 1999: Elucin de extractos, difusin en agar y contacto directo. Se evaluaron de los mtodos de manufactura. La
tres materiales de referencia japoneses (A y B, positivos y C negativo) donados evaluacin citotxica es uno de los
por el Instituto de Hatano de Japn y se compararon los resultados con los del estudios in vitro usados ms comn-
estudio de validacin interlaboratorio para estos materiales coordinado por el mente para determinar la biocompa-
grupo ISO TC 194/WG5, en el perodo 1997-1998 y con los del mtodo de contac- tibilidad de un material y presenta
to directo referido por HR Stanley en el reporte tcnico de 1984. No hubo dife- una correspondencia de un 97 % con
rencias entre los resultados de citotoxicidad obtenidos a travs de los ensayos los ensayos de implantacin. Es un
propuestos por la ISO 10993-5 y los obtenidos en nuestro laboratorio, estando estudio simple, rpido y econmico
dentro de la media de los parmetros del estudio de validacin de los materiales que proporciona una valiosa infor-
de referencia japoneses. Los mtodos de citotoxicidad por contacto directo tie- macin de los materiales que deben
nen mltiples ventajas. ser descartados o aquellos que deben
ser sometidos a ms estudios. Se han
ABSTRACT. In vitro cytotoxicity assays are included in the first phase evalua- empleado muchos mtodos para de-
tion studies of biomaterials and implant medical devices. Cytotoxicity evalua-
terminar la citotoxicidad de los
tion is a simple, fast and economical way to obtain a valuable information about
biomateriales y equipos mdicos
the biocompatibility of biomaterials. The establishment of the in vitro cytotox-
implantables, estos consisten en ob-
icity evaluation system of these kinds of materials in Cuba and selection of
more suitable assay were the main objectives of this work. In order to carry out servar la inhibicin del crecimiento
these objectives three methods recommended by ISO 10993-5: 1999 were evalu- celular o registrar el dao o muerte
ated: Extracts elution, agar diffusion and direct contact. Three reference mate- celular. Las pruebas de citotoxicidad
rials donated by Hatano Institute of Japan were evaluated (A, B positives and C empleadas con ms frecuencia inclu-
negative) and these results were compared with the interlaboratory validation yen: citotoxicidad por contacto
Study of these materials, coordinated by ISO TC 194/ WG5 group in the 1997- irecto (tincin con colorantes vitales
1998 period and with the direct contact assay refered by Stanley HR in the tech- y liberacin de cromo radiactivo) e
nical report of 1984. The cytotoxicity results obtained by the ISO assays did not indirecto (extendido en agar, elucin
have any difference with our results and these were between the media param- de extractos, mtodo de filtro mi-
eters of validation study of these reference materials. Direct contact cytotoxic- liporo, entre otros).1-3
ity assays have considerable advantages. Con el objetivo de establecer el
sistema de evaluacin de la citotoxi-
cidad in vitro para los biomateriales
y equipos mdicos implantables en
Cuba, se evaluaron tres mtodos de
ensayo recomendados en la Norma
Revista CENIC Ciencias Biolgicas, Vol. 37, No. 2, 2006.
citotoxicidad. Mtodos in vitro.2 Los
mtodos seleccionados fueron: m-
todo de elucin de extractos, contac-
to indirecto por difusin en agar y
contacto directo con tincin con co-
lorantes y liberacin de 51Cr. Para el
anlisis de estos ensayos se evalua-
ron tres materiales de referencia ja-
poneses (A y B positivos y C negati-
vo) donados por el Instituto de
Hatano, Japn y se compararon los
resultados con los del Estudio de
Validacin Interlaboratorio para es-
tos materiales coordinado por el gru-
po ISO TC 194/WG5, en el perodo de
junio 1997 a mayo 1998 y el mtodo
propuesto por H.R. Stanley para la
evaluacin de materiales dentales en
el Technical Report.4--6
MATERIALES Y METODOS
Patrones positivos
Material de referencia A. Lmi-
na de poliuretano con 0,1 % de
dietilditiocarbamato de zinc (ZDEC).
Material de Referencia B. Lmi-
na de poliuretano con 0,25 % de
dietilditiocarbamato de zinc (ZDBC)
Patrn negativo
Material de referencia C. Lmi-
na de poliuretano de elevada densi-
dad.
Ensayo de cittoxicidad por elucin
de extractos
Los materiales de referencia se
cortaron en pequeas piezas (10 mm
x 50 mm) y se esterilizaron durante
15 min a 121 oC y 1,5 atm. La extrac-
cin (6 cm 2 /mL) se realiz en m
edio RPMI con 10 % de SFB a 37 oC
durante 24 h . El extracto original se
defini como el 100 %, al mismo
tiempo, se hizo el control (blanco),
se prepararon diferentes diluciones:
1, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32.
La lnea celular L-929 (fibroblasto
de ratn) fue sembrada en placas de
24 pozos a una concentracin de 5,2
104 celulas/ 0,5 mL/pozo que se in-
cubaron a 37 oC y 5 % CO2. Posterior-
mente, se decant el medio de culti-
vo y se remplaz con 0,5 mL de las
diferentes concentraciones del ex-
tracto o del blanco, respectivamen-
te, incubndose despus por pero-
dos de 24 y 72 h . Al concluir cada
tiempo las clulas se trataron con
tripsina-EDTA, se tieron con tripn
azul y se contaron en cmara de
Neubauer para la evaluacin de la ci-
totoxicidad. Este ensayo permite
evaluar la citotoxicidad de forma
cuantitativa y cualitativa, registran-
do la muerte celular y evaluando el
tracin de los extractos y controles.
Se grafic la supervivencia relativa
respecto al control contra la concen-
tracin del extracto y se hall el
indice de citotoxicidad medio (IC50).
Mtodo de difusin en agar
Este ensayo permite una evalua-
cin cualitativa de la citotoxicidad,
no es apropiado para productos
migrables que no difundan a travs
de la capa de agar, o que puedan re-
accionar con l. Las clulas L-929
fueron sembradas en placas Petri de
35 mm a una concentracin de 2,6
106 clulas en un volumen de 2 mL/
placa y se incubaron durante 24 h a
(37 2) oC y 5 % de CO2. Posterior-
mente, se decant el medio de culti-
vo, reemplazndose por 2 mL de
medio fresco, se esteriliz el agar
noble (3 %) en autoclave a 121 oC du-
rante 15 min, enfrindose luego y se
calent el medio RPMI a 45 oC que
se mezcl con el agar y se enfri a
39 oC . Se aspir el medio de los cul-
tivos y se repuso con 2 mL de medio
con agar.
Se colocaron las placas Petri en
una superficie plana para que
solidificaran a temperatura ambien-
te y luego, se colocaron muestras de
los patrones (1 cm2) en contacto con
la superficie del agar en cada placa
por triplicado. Se incubaron todos
los cultivos durante 24 h, posterior-
mente, se aadi 2 mL de una diso-
lucin de rojo neutro a cada placa,
se incub durante 1 h y se examina-
ron los cultivos, abajo y alrededor de
las muestras. Se evalu la citotoxi-
cidad de las clulas antes y despus
de retirar cuidadosamente los artcu-
los de ensayo del agar. Se determin
el ndice de zona o de decoloracin
que mide la zona clara donde las c-
lulas no estn teidas con el rojo
neutro y el ndice de lisis que mide
el nmero de clulas afectadas den-
tro de la zona de citotoxicidad (reac-
tividad). El cultivo celular presenta
efectos citotxicos si el examen mi-
croscpico revela malformacin, de-
generacin, desprendimiento o lisis
de las clulas dentro de la zona, o una
moderada a severa reduccin en la
densidad de la capa celular. Se de-
termin el grado de reactividad para
cada material de referencia de acuer-
do a la clasificacin propuesta en la
ASTM, 1990.7
Ensayo de citotoxicidad por contac-
to directo con tincin con Tripn
azul3,4
Las clulas L-929 fueron sembra-
ron las muestras de los materiales de
referencia (1 cm2) en el centro de
cada placa por triplicado y todos los
cultivos fueron incubados durante
24 y 72 h a 37 oC y 5 % de CO2. Se
retiraron las muestras cuidadosa-
mente despus de transcurrido el
tiempo de incubacin y se observa-
ron las placas al microscopio para
analizar la morfologa. Se extrajo el
medio de cultivo y se despegaron las
clulas con tripsina- EDTA y a con-
tinuacin, se realiz el conteo en c-
mara de Neubauer por tincin con
tripn azul. Se calcul la media de
clulas viables para cada material de
referencia y se hall el ndice de ci-
totoxicidad (IC).
Mtodo de citotoxicidad por con-
tacto directo referido por HR
Stanley5,6
Las clulas L-929 en fase de cre-
cimiento logartmico se ajustaron a
una concentracin de 106 clulas/
mL, se marcaron con 1,5 mCi de
dicromato de sodio (51Cr) y se incu-
baron durante 24 h a temperatura de
37 C y 5 % de CO2. Las clulas se
lavaron tres veces con medio RPMI
sin suero, posteriormente se colec-
taron del frasco con Tripsina- EDTA
al 0,25 %, resuspendindose en Me-
dio RPMI completo al final de los la-
vados. Se determin la viabilidad ce-
lular y el nmero de clulas por
conteo con tripn azul en cmara de
Neubauer. La suspensin de clulas
marcadas con 51Cr se prepar a una
concentracin de 5 104 clulas via-
bles/mL .
Se adicion 1 mL de la suspen-
sin celular marcada con 51Cr a las
placas de cultivo donde haban sido
polimerizados o depositados previa-
mente los artculos de ensayo por
triplicado. Se emplearon cuatro pla-
cas para cada tiempo de polimeriza-
cin a evaluar (30 min y 24 h). En
cada caso se evaluaron dos tiempos
de contacto del material con las c-
lulas y se incubaron durante 4 y 24 h
a 37 oC y 5 % CO2 en atmsfera hme-
da. Al final del perodo de incubacin,
se colect 1 mL de sobrenadante de
cada pozo. Los tubos se centrifu-
garon a 2 500 r/min durante 10 min a
temperatura ambiente, se transfirie-
ron 0,5 mL de sobrenadante de cada
uno a tubos LP3 para el conteo de la
radioactividad en contador Gamma
LKB, durante 10 min/tubo.
Se utilizaron como control nega-
tivo 5 104 clulas en 2 mL de medio
(cinco rplicas) y como control posi-
 Revista CENIC Ciencias Biolgicas, Vol. 37, No. 2, 2006.

que se les aadieron 0,2 mL de fenol Tabla 1. Indice de citotoxicidad medio (IC50) obtenidos en el ensayo de citotoxi-
al 6,4 % (cinco rplicas). Se aadie- cidad por elucin de extractos.
ron 1,5 mL de medio con 0,5 Ci de
51
Cr a cinco pozos de cultivo con la Material Tratamiento IC 5 0 IC50 media
muestra polimerizada para tener un de referencia (h) (Media) (TC194/WG5)
control de unin de 51Cr al material 24 24,6 19,4
A (Positivo)
de ensayo y se cont antes y despus 72 20,3 20,7
de la incubacin. Para el conteo de
24 44,4 39,0
la liberacin espontnea de 51Cr se B (Positivo)
midi la radioactividad de cuatro 72 43,5 38,7
rplicas de 0,5 mL de la suspensin 24 97,7 >100
celular marcada en tubos LP3. C (Negativo)
72 98,3 >100
Se determin el ndice de cito-
toxicidad (IC) segn la expresin:

M C Tabla 2. Grados de reactividad obtenidos en el ensayo de citotoxicidad por difu-

IC = g 100
T C
donde:
M promedio del material de prueba
(cpm).
C promedio del control negativo
(cpm).
T promedio de la liberacin total
(cpm).
RESULTADOS Y DISCUSION
No se encontraron diferencias en
los resultados de citotoxicidad de los
materiales de referencia japoneses
evaluada a travs de los ensayos pro-
puestos por la ISO 10993-5 y los ob-
tenidos en el laboratorio (Tablas 1, 2
y 3), estando los valores obtenidos
dentro de la media del estudio de
validacin para este tipo de materia-
les.
A travs del mtodo de contacto
directo descrito por HR Stanley se
clasific el material SRM-A como
moderadamente citotxico, ya que la
liberacin de 51Cr en el ensayo de 24 h
con el material endurecido no exce-
di el doble de la media de los contro-
les negativos; el SRM-B se clasific
como ligeramente citotxico, ya que
la liberacin de 51Cr no difiri signi-
ficativamente (1 %) de los con-
troles negativos en el ensayo de 4 h
y no excedi el doble de la media de
los controles negativos en el ensayo
de 24 h, ambos con el material fres-
co y el SRM-C fue considerado como
no citotxico, lo que concuerda con
los resultados del estudio de valida-
cin interlaboratorios y con los re-
sultados obtenidos en el estudio con
los otros mtodos de ensayo.4-6 En el
ensayo de difusin en agar se obtu-
vo un grado de reactividad 2 que se
corresponde con una zona de deco-
loracin extendida menos de 0,5 cm
alrededor de la muestra y de un 20
al 39 % de zona de citotoxicidad
(reactividad).7
A partir de este estudio compa-
sin en agar.
Material Grado Laboratorio Laboratorio 2
de referencia de reactividad 1(TC194/WG5) (TC194/WG5)
A (Positivo) 2 2 2
B (Positivo) 2 2 1
C (Negativo) 0 0 0
Tabla 3. ndice de citotoxicidad (IC) obtenidos en el ensayo de citotoxicidad por
contacto directo.
Material Tratamiento IC media IC media Clasificacin
de referencia (h) (TC194/WG5) (Mtodo de Stanley)
24 41,4 41,8 Moderadamente
A (Positivo)
72 36,1 33,4 citotxico
24 64,4 72,8 Ligeramente
B (Positivo)
72 72,7 61,1 citotxico
C (Negativo) NT NT NT
NT No probado. La lmina del material flotaba en el medio de cultivo y no se
pona en contacto con las clulas.
el descrito por Stanley se puede las clulas, adems, el tiempo de ex-
plantear que en el mtodo de elucin posicin es limitado y al igual que el
de extractos se evala el extracto ensayo de elucin de extractos, no
(migrable) por separado, se puede se puede saber lo que le sucede des-
observar el efecto de dosis/respues- de el punto de vista morfolgico a las
ta, se extiende el tiempo de exposi- clulas cuando entran en contacto
cin a las clulas y se pueden utilizar con el material.
diferentes disolventes, pero tiene Comparativamente con los mto-
como desventaja el tiempo adicional dos anteriores, los de contacto direc-
que emplea y algunos pasos de la to tienen como ventajas que elimi-
evaluacin, adems, no se puede de- nan la preparacin de extractos, se
terminar el efecto global del mate- puede evaluar el efecto directo del
rial sobre las clulas. material en contacto con las clulas
En el mtodo de difusin en agar sembradas, por tanto mimetiza las
se elimina la preparacin de los ex- condiciones fisiolgicas y se puede
tractos y permite observar una zona extender el tiempo de exposicin.
de difusin que es independiente de Como desventajas de estos mtodos
la densidad del material, se puede se pueden sealar la disminucin de
evaluar un lado del material. Este la poblacin celular con materiales
mtodo tiene como desventajas que muy txicos y que se puede ocasio-
requiere una superficie plana para nar trauma celular si el material es
montar las placas, que la sustancia muy denso o se mueve.
a ensayar debe migrar a travs del El mtodo propuesto por Stanley,
agar, el riesgo de un choque trmico que es tambin un ensayo de contac-
Revista CENIC Ciencias Biolgicas, Vol. 37, No. 2, 2006.

mismas ventajas generales seala-
das anteriormente, adems de que
en l se emplea mayor nmero de
rplicas del producto, no se ocasio-
na trauma celular si el material es
muy denso, ya que las clulas se
siembran encima del mismo y como
polimeriza en el fondo del pozo no
se mueve. Como desventaja se tie-
ne que se puede presentar una dis-
minucin de la poblacin celular
con materiales muy txicos, no se
puede observar la morfologa celu-
lar si el material es opaco y el ries-
go a la salud asociado al uso de
istopos radioactivos.
La s aspectos discutidos estn de
acuerdo con lo reportado para estos
mtodos de ensayo.
CONCLUSIONES
En general, los mtodos de cito-
toxicidad por contacto directo tienen
ventajas considerables respecto a los
otros mtodos de citotoxicidad in
vitro y se pueden llegar a reproducir
las condiciones fisiolgicas con mu-
cha aproximacin, por lo que los re-
sultados resultan muy repetitivos.
AGRADECIMIENTOS
A la Dra. Noriho Tanaka, del Ins-
tituto de Investigacin de Hatano,
Japn, quien es jefa del Proyecto de
Validacin de Estndares y Miembro 5. ISO Technical Report 7405:1984. Bio-
del Comit Tcnico 194 de la Inter-
national Standard Organization por
la donacin al laboratorio de los au-
tores de los materiales de referencia
japoneses empleados en el estudio .
BIBLIOGRAFIA
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tics and Elastomers. Stimuli to the re-
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sion cell culture Screening for Cyto-
toxicity, American Society for Testing
and Materials, 1990.

RESULTADOS CIENTIFICOS DESTACADOS

MINISTERIO DE EDUCACION SUPERIOR DE CUBA

UTILIZACION DE FILTRADOS DE CULTIVO PARA LA DIFERENCIACION A

NIVEL FOLIAR DE LA RESISTENCIA A Fusarium oxysporum F. sp.
Cubense RAZA 1 EN EL CULTIVO DEL BANANO
Centro de Bioplantas, Universidad de Ciego de vila
Instituto de Investigaciones en Viandas Tropicales

En Cuba, los bananos y pltanos constituyen uno de los principales cultivos para lograr el equilibrio de
productos en el mercado. Sin embargo, las enfermedades representan uno de los problemas ms serios para la
produccin de estos cultivos. El mal de Panam o fusariosis del banano causada por Fusarium oxysporum F. sp.
Cubense representa una de las enfermedades ms destructivas y de importancia econmica en el gnero Musa.
El control de esta enfermedad con el uso de agroqumicos resulta costoso y causa serios daos al medio ambien-
te. Por esta razn, se ha considerado el mejoramiento gentico de la resistencia como la solucin ms adecuada.
Es por ello, que desde la aparicin del mal de Panam en Cuba y en los diferentes pases productores se desarro-
lla un amplio programa de mejoramiento gentico para la resistencia a este patgeno, mediante tcnicas con-
vencionales y biotecnolgicas. Sin embargo, los sistemas de seleccin de la resistencia del banano a Fusarium
oxysporum F. sp. cubense raza 1 en el campo consumen mucho tiempo, son costosos y dependen de variaciones
en la abundancia del inculo y de factores climticos relacionados con la diseminacin, infeccin y el desarrollo
de la enfermedad.
A partir de las consideraciones anteriores por vez primera a nivel internacional, se desarroll un mtodo para
la diferenciacin a nivel foliar de la resistencia del banano a Fusarium oxysporum F. s.p. Cubense raza 1 mediante
la aplicacin de filtrados del cultivo del hongo, el cual constituye una herramienta til para incrementar la
eficiencia de la seleccin en condiciones ex vitro, sin tener en cuenta las condiciones ambientales y la poca del
ao favorable para el desarrollo de la enfermedad. Tambin permite evaluar un nmero importante de muestras
en condiciones de laboratorio y acelerar los programas de mejoramiento gentico a esta enfermedad.
El resultado recibi Premio de la delegacin provincial del Ministerio de Ciencia, Tecnologa y Medio Ambien-