Mata Kuliah : Praktikum Mikrobiologi

Pewarnaan Gram Bakteri

OLEH :
Nama : Reni Anggraini
NIM : 4143220030
Kelas : Biologi NK A 2014

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS NEGERI MEDAN

2017
 I. Judul : Pewarnaan Gram Bakteri
II. Tujuan :
Untuk mengetahui apa itu bakteri gram negatif
Untuk mengetahui apa itu bakteri gram positif
Untuk mengetahui ciri-ciri bakteri gram negatif
Untuk mengetahui ciri-ciri bakteri gram positif
Untuk mengetahui cara pewarnaan bakteri gram positif dan negatif
III. Tinjauan Pustaka
Pewarnaan pada bakteri dibagi menjadi tiga, yaitu :
1. Pewarnaan sederhana
Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan.
Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai
organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan
sederhana karena sitoplasamanya bersifat basofilik (suka dengan basa). Zat-zat warna yang
digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan
sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa
digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah metilen biru, kristal violet, dan karbol fuehsin
yang mana pewarnaan sederhana ini dibagi lagi menjadi dua jenis pewarnaan.
pewarnaan asam
Merupakan pewarnaan yang menggunakan satu macam zat warna dengan tujuan
hanya untuk melihat bentuk sel. Adapun zat warna yang dipakai dalam pewarnaan positif
adalah metilen biru dan air furksin.
Pewarnaan Basa
Pewarnaan basa atau negatif merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai bakteri
tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme
kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan
ukuran sel. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina.
2. Pewarnaan Diferensial (Gram)
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan
spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram negatif,
berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan
penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (18531938) yang mengembangkan
teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella
pneumoniae. Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna
metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat
warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak.
Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil
ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda.
Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan
struktur dinding sel mereka.
Bakteri Gram Negatif
Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil
ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu
gelap setelah dicuci dengan alcohol, sementara bakteri gram negative tidak.
Bakteri Gram Positif
Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu
sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah
mikroskop, sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah muda. Perbedaan
klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding
sel bakteri (Aditya,2010)
Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu
lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan
safranin akan berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa
peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel
menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna biru
(Fitria, 2009).
Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu
lama. Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu
pendek (Fitria, 2009).
 Perbedaan Bakteri Gram Negatif dan Bakteri Gram Positif

(Manurung, 2010).
Pewarnaan tahan asam yang umum digunakan adalah pewarnaan Zieh Neelson
dengan pewarna utama karbol fuksin dengan pemanasan dan pewarna tandingan metilen blue
Loeffler. Perlakuan panas tersebut diganti dengan penggunaan pembasah yaitu suatu deterjen
untuk mengurangi tegangan permukaan lemak, untuk menjamin penetrasi. Pewarna yang
mengandung pembasah ini disebut pewarna Kinyoun (Purwoko, 2010).
Sekali sitoplasma terwarnai, maka sel-sel organisme seperti mikobakteri menahan zat
warna tersebut dengan erat, artinya tidak terpucatkan sekalipun oleh zat yang bersifat keras
seperti asam alkohol (yaitu 3% HCL dalam etanol 95%). Alkohol asam ini merupakan
pemucat yang sangat intensif dan jangan dikelirukan dengan alkohol-aseton yang banyak
digunakan dalam prosedur pewarnaan Gram. Kondisi pewarnaan ini, organisme yang dapat
menahan zat warna itu dikatakan tahan asam dan tampak merah. Bakteri biasa yang
dindingnya tidak bersifat terlampau lipoidal, pewarna karbol fuksin yang mewarnai sel dapat
dengan mudah dipucatkan oleh alkohol-asam dan karenanya dikatakan tak tahan asam.
Tercucinya karbol fuksin dapat diperagakan oleh terserapnya pewarna tandingan biru metilen
oleh sel, sehingga bakteri tersebut tampak biru (Hadioetomo, 1993).
Pewarnaan Ziehl Neelsen. Larutan carbol fuchsin 0,3% dituang pada seluruh
permukaan sediaan, kemudian dipanaskan diatas nyala api sampai keluar asap tetapi tidak
sampai mendidih atau kering selama 5 menit. Sediaan kemudian dibiarkan dingin selama 5-7
menit lalu kelebihan zat warna dibuang dan dicuci dengan air yang mengalir perlahan.
Setelah itu larutan asam alkohol 3% (hydrochloric acid-ethanol) dituang pada sediaan dan
dibiarkan 2-4 menit kemudian dicuci dengan air mengalir selama 1-3 menit, kelebihan larutan
dibuang. Larutan methylene blue 0,1% dituang sampai menutup seluruh permukaan,
dibiarkan 1 menit lalu larutan dibuang dan dicuci dengan air mengalir (Karuniawati, 2005).
IV. Alat dan Bahan
Alat
No. Nama Alat Jumlah
1. Mikroskop 1 buah
2. Kaca Benda 6 buah
3. Lampu Spiritus 1 buah
4. Jarum Inokulasi 2 buah
5. Botol Semprot 1 buah
6. Kertas Isap 5 buah
7. Cawan Petri 2 buah

Bahan
No. Nama Bahan Jumlah
1. Biakan Murni Bakteri Secukupnya
2. Metilen Blue 2 tetes
3. Safranin 2 tetes
4. Minyak Imersi 1 tetes
5. Kristal Violet 2 tetes
6. Alkohol 96% Secukuonya
7. Larutan Iodium 2 tetes

V. Prosedur Kerja
Pewarnaan Gram
a. Mengambil kaca benda yang telah dibersihkan
b. Dengan cara aseptik letakkan inokulum yang akan diperiksa diatas kaca benda
pada bagin tengah
c. Tetesi sedian tersebut dengan larutan kristal violet, biarkan selama satu menit.
d. Bilaslah dengan air mengalir dengan menggunakan botol semprot
e. Tuangilah sediaan dengan larutan iodium, biarkan selama 1 menit
f. Bilaslah dengan air mengalir dengan botol semprot
g. Tuangilah lkohol 96% setetes demi setetes hingga kristal violet hilang
 h. Bilaslah dengan air mengalir dengan menggunakan botol semprot.
i. Tuangilah sediaan dengan safranin, biarkan 45 detik.
j. Amati dibawah mikroskop, beri minyak imersi
Hasil pewarnaan : ungu = gram positif
merah = Negatif

VI. Hasil dan Pembahasan

Hasil

Dari hasil pengamatan didapatkan bahwa biakan yang diinokulasi adalah bakteri
garam positif. Dimana dari gambar tersebut dapat dilihat bahwa warna dari gambar tersebut
bewarna ungu sehingga bakteri tersebut dapat dikatakan bakteri garam positif.

Pembahasan
Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling
banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting
dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan
peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri.
Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram
negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis.
Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis
membran sel (Manurung, 2010).
Penambahan violet pada bakteri. Kristal violet merupakan reagen yang berwarna
ungu. Kristal violet ini merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberi warna pada
mikroorganisme target. Kristal violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel
mikroorganisme yang bersifat asam. Dengan perlakuan seperti itu, sel mikroorganisme yang
transparan akan terlihat berwarna (ungu). Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif
akan meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan
gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri
gram positif mengandung protein dan gram negatif mengandung lemak dalam persentasi lebih
tinggi dan dinding selnya tipis. Kristal violet yang diteteskan didiamkan selama 1 menit
bertujuan agar cat atau pewarna ini dapat melekat sempurna pada dinding sel bakteri.
Penambahan lugol pada bakteri. Lugol merupakan pewarna Mordan, yaitu pewarna
yang berfungsi memfiksasi pewarna primer yang diserap mikroorganisme target atau
mengintensifkan warna utama. Pemberian lugol pada pengecatan Gram dimaksudkan untuk
memperkuat pengikatan warna oleh bakteri. Kompleks zat lugol terperangkap antara dinding
sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan, penyingkiran zat lipida dari
dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel.
Lugol yang diteteskan didiamkan selama 1 menit bertujuan agar pengikatan warna oleh
bakteri menjadi semakin lebih kuat.
Selanjutnya, 1 tetes alkohol 96% diteteskan di atas objek glass tersebut kemudian
didiamkan selama 45 detik. Setelah itu, kaca objek dibilas dengan air hingga warnanya
hilang. Etanol 95% merupakan solven organik yang berfungsi untuk membilas (mencuci) atau
melunturkan kelebihan zat warna pada sel bakteri (mikroorganisme). Tercuci tidaknya warna
dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat
warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat
menelan warna dasar, maka warna akan tercuci. Pemberian alkohol pada pengecatan ini dapat
mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan yaitu mikroorganisme (bakteri) akan tetap
berwarna ungu atau bakteri menjadi tidak berwarna. Pemberian alkohol 96% juga
menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel.
Selanjutnya diteteskan 1 tetes safranin di atas kaca objek tersebut kemudian
didiamkan selama 1 menit. Setelah itu, kaca objek dibilas dengan air hingga warnanya hilang.
Safranin merupakan pewarna tandingan atau pewarna sekunder. Zat ini berfungsi untuk
mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan
alkohol. Dengan kata lain, safranin memberikan warna pada mikroorganisme non target serta
menghabiskan sisa-sisa cat atau pewarna. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan
menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri
gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori pori mengkerut,
daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk
sehingga sel berwarna ungu.
Pemberian reagen atau pewarna yang berganti dari satu pewarna ke pewarna lain
dengan waktu yang telah ditentukan disebabkan karena zat-zat warna tersebut dapat berikatan
dengan komponen dinding sel bakteri dalam waktu singkat. Karena itulah rentang waktu
pemberian zat warna yang satu ke yang lainnya tidak lama sehingga proses identifikasi
bakteri berlangsung cepat.
Setiap akhir pemberian reagen atau pewarna, selalu dilakukan pembilasan terhadap
kaca objekdengan menggunakan air. pembilasan ini bertujuan untuk mengurangi kelebihan
setiap zat warna yang sedang diberikan. Setiap akhir pembilasan pada masing-masing reagen,
perlu dilakukan penyerapan air bilasan dari air dengan menggunakan kertas tissu agar
aquades tidak tercampur dengan reagen atau pewarna baru yang akan diberikan.
Setelah pembilasan terakhir, gelas benda dikeringkan dan diamati di bawah
mikroskop. Jika terbentuk warna ungu maka termasuk golongan bakteri gram positif , dan
jika terbentuk warna merah atau merah muda maka termasuk golongan bakteri gram negatif.
VII. Kesimpulan
1. Dari praktikum yang dilakukan dapat disimpulkan bahwa bakteri yang diinokulasi
merupkan bakteri gram positif. Karena warna yang terbentuk merupakan ciri-ciri
bakteri garam positif.
2. Perbedaan bakteri garam positif dan gram negatif
 VIII. Daftar Pustaka
Aditya,Mushoffa.2010.Teknik Pewarnaan Bakteri.
http://mushoffaditya.blogspot.com/2010/01/teknik-pewarnaan-bakteri.html. 11 November
2010[http://mushoffaditya.blogspot.com/2010/01/teknik-pewarnaanbakteri.
html.%2011%20November%202010]
Fitria, Bayu. 2009. Pewarnaan Gram (Gram positif dan Gram
Negatif).http://biobakteri.wordpress.com/2009/06/07/7-pewarnaan-gram-gram-
positifdan- gram-negatif. 11 November 2010
[http://biobakteri.wordpress.com/2009/06/07/7- pewarnaan-gram-gram-positif-dan-
gram-negatif.%2011%20November%202010] .
Hadioetomo, R. S. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta : Gramedia.
Karuniawati, Risdiyani, S. Nilawati, Prawoto, Y. Rosana, B. Alisyahbana, I. Parwati, Wia
Melia, dan T.M. Sudiro. 2005. Perbandingan Tan Thiam Hok, Ziehl Neelsen dan
Fluorokrom sebagai Metode Pewarna Basil Tahan Asam untuk Pemeriksaan
Mikroskopik Sputum. Makara Kesehatan Vol. 9 No. 1.
Manurung, Pebrin. 2010. Pengamatan Bentuk Bakteri.
http://pebrinmanurung.blogspot.com/2010/10/pengamatan-bentuk-bakteri.html. 11
November 2010 [http://pebrinmanurung.blogspot.com/2010/10/pengamatan-
bentukbakteri. html.%2011%20November%202010] .
Purwoko, Tjahjadi. dkk. 2010. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi. Laboratorium Mikrobiologi
UNS.