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PRODUCCIN DE BIOPOLMEROS POR PSEUDOMONAS AERUGINOSA AISLADA DE FUENTES MARINAS

1. RESMEN
Dos cepas de bacterias Pseudomonas aeruginosa CMG607w y CMG1421 son productores de biopolmeros
importantes.
- La CMG607w aislada de los sedimentos de la desembocadura Lyari al mar Arbico, sintetiza los mcl-
polihidroxialcanoatos (PHA) de varias fuentes de carbn, la produccin de estos es proporcional al periodo
de incubacin.
- La CMG1421 aislada de suelo seco, produce polisacrido cido extracelular absorbente de agua altamente
viscoso cuando crece aerbicamente en un medio que contiene glucosa, fructosa o sacarosa como nica
fuente de carbono.
De forma general, el biopolmero tiene la capacidad de absorber agua hasta 400 veces su peso seco; esta
propiedad es mayor que los absorbentes de agua sintticos no degradables usados actualmente. Acta como
filtro de sal y tiene actividad reolgica y estabilizadora.
2. INTRODUCCIN Comentado [LVG1]: Actualmente el estilo de vida ha
evolucionado hacia el uso de diferentes tipos de productos
Los biopolmeros como los polihidroxialcanoatos (PHA) y los exopolisacaridos (EPS) son diversas clases de sanitarios (Paales desechables).
materiales que tienen aplicaciones en prcticamente todos los sectores de la economa. En respuesta a la
preocupacin por el efecto daino al ambiente de los materiales plsticos derivados de la petroqumica, se han Comentado [LVG2]: En el estudio se aslan cepas
bacterianas capaces de sintetizar comercialmente
buscado fuentes alternas como materiales plsticos biodegradables. Estos materiales deben tener las importantes biopolmeros para optimizar su produccin y
propiedades deseadas de los plsticos sintticos convencionales y deben ser capaces de degradarse en su estudiar la naturaleza qumica de estos polmeros.

eliminacin.
Los PHA son polisteres de varios hidroxialcanoatos que son sintetizados por microorganismos. Son considerados
como el candidato ms fuerte de polmeros biodegradables porque posee todas las propiedades de los plsticos
sintticos y cuando se descartan son completamente degradables a H2O y CO2 por microorganismos. Comentado [LVG3]: Lee 1996

Las Preudomonas fluorescentes pertenecientes al rRNA (Grupo I) son reportadas para sintetizar y acumular gran
cantidad de polihidroxialcanoatos de cadena media (mcl-PHA) que consiste en varios cidos grasos 3-hidroxi
saturados con 6-14 tomos de carbono y actan como un compuesto de almacenamiento de energa.
Los PHA que comprenden cadenas medianas de monmeros (6 o ms carbonos) son ms elastomricos y pueden
contener enlaces insaturados de carbono; son ms propicios para revestimientos y materiales de pelcula,
ofreciendo buenas posibilidades para modificarlo qumicamente. Comentado [LVG4]: Anderson y Dwes 1990

La mayor parte de los materiales absorbentes son hechos de componentes orgnicos sintticos y sus derivados
como el poliacrilato, poliacrilamida, cido acrlico y la acrilamida, son no degradables, dainos y cancergenos Comentado [LVG5]: ndice de Merck.
para los humanos. Entonces, cuando estos son eliminados permanecen en el ambiente por mucho tiempo Comentado [LVG6]: Ryuichiro y Nohata 1994
contribuyendo a la contaminacin ambiental. Sin embargo, los componentes absorbentes naturales como el Comentado [LVG7]: Ryuichiro y Nohata 1994
exopolisacrido bacteriano son amigables con el ambiente, no son txicos para los humanos, animales o
microorganismos y son degradables por los ltimos.
3. MATERIALES Y MTODOS
3.1.Aislamiento, purificacin y condiciones de cultivo
Un ejemplo del sedimento de la playa oeste cerca de la desembocadura Lyari se recolect en la costa Karachi
(47.21N 67.10E), la cepa bacteriana se aisl, purific y se nombr CMG607w mientras que la cepa CMG1421 se
aisl de un suelo seco (Universidad de Karachi) y tambin se purific, ambas se preservaron en 20% de glicerol a Comentado [LVG8]: Las cepas se identificaron de acuerdo
-70C. a la herramienta API y se encontr que eran P.aeruginosa.

- La cepa CMG607w se mantuvo a 30C en agua de mar artificial (ASW) en 1 litro de agua destilada Comentado [LVG9]: Kuniho and Kurane, 1999
suplementado con 0.5 gramos de triptona y 10 gramos de fuente de carbn. Para la sntesis de PHA se usaron Comentado [LVG10]: Glucosa, Sacarosa, Acetato de sodio
las mismas condiciones de cultivo y el tiempo de incubacin se increment de 24 a 120 horas a 30C y 200 y Gluconato de sodio.

RPM.
- Para la sntesis del hidroabsorbente polisacrido, la cepa CMG1421 creci en un medio mnimo suplementado Comentado [LVG11]: Descrito por Ryuichiro and Nohata.
con 20g/L de fuente de carbn, despus de su crecimiento se inocul 1 mL de un cultivo de semillas (18 horas Comentado [LVG12]: Ryuichiro and Nohata (1994)
de edad) en 1 litro del medio mnimo y se incub a 30C por 15 das. Comentado [LVG13]: Introducir el organismo por medios
artificiales.
3.2.Extraccin y purificacin de los biopolmeros
- El material celular liofilizado se us para extraer PHA con cloroformo a 65C por 4 horas en botellas de tapa Comentado [LVG14]: Deshidratar una sustancia para
su conservacin sometindola a una rpida
de rosca, la extraccin se hace tres veces para el mismo material, los restos celulares se remueven pasando congelacin y eliminando el hielo posteriormente
el material por un filtro de celulosa y por una solucin concentrada de cloroformo. mediante un ligero calentamiento al vaco que lo
transforma en vapor.
El polmero se precipit vertiendo una solucin de cloroformo (1 volumen) en etanol (5 volmenes), ste se Comentado [LVG15]: Se concentr con un evaporador
separ del lquido por filtracin y se sec por exposicin al aire caliente, se repite la precipitacin para rotatorio (Rotavapor BUCHI R-114).
purificarlo ms y para ser usado en anlisis qumicos.
- El cultivo viscoso de CMG1421 se diluy con medio volumen de agua destilada esterilizada y se coloc en una Comentado [LVG16]: Kuniho and Kurane, 1999
incubadora de agitacin (30C) por una hora. Las clulas bacterianas se sedimentaron por centrifugacin
refrigerada a 10000 RMP por 30 minutos a 4C, se aadi cido tricloro actico (TCA) del 5-10% al medio Comentado [LVG17]: Se us la centrfuga refrigerada
sobrenadante libre de clulas para precipitar las fracciones de protena extracelular, posteriormente se KOKUSAN H-200nR.

centrifuga a 9000 RPM por 30 minutos a 4C para recoger las fracciones de protena en una varilla de vidrio.
El medio sobrenadante limpio se aade a un volumen igual de etanol absoluto. La disolucin y el proceso de Comentado [LVG18]: Hiroyasu et al, 1992
precitcin lleva a cabo 4 a 5 veces antes de que se obtengan los precipitados blancos uniformes. Los
ejemplares de secan en desecadores de vaco de sello y el crudo hidroabsorbente se dializ contra el agua Comentado [LVG19]: Separacin o eliminacin de una
sustancia mediante dilisis (Separacin de las
destilada y liofilizada. sustancias que estn juntas o mezcladas en una misma
disolucin, a travs de una membrana que las filtra).
3.3.Cuantificacin y elucidacin de la estructura del PHA
Comentado [LVG20]: Dilucidar o aclarar una cosa.
La cuantificacin del PHA producido por el CMG607w se determina por el Slepecky y la ley mtodo, para la Comentado [LVG21]: 1961
elucidacin de la estructura, el PHA purificado se disuelve en el cloroformo y capas en la ventana de KRS-5,
despus de que se evapora el cloroformo, la pelcula del polmero PHA es sometida al anlisis FTIR. Comentado [LVG22]: Transmisin de Fourier Infrarojo.
El espectro infrarojo se corri en el espectrmetro JASCO
El PHA purificado es analizado usando un espectrmetro de resonancia magntica nuclear de protn (H-NMR) a 320-A con un condensador de haz y el rango del espectro
usado fue 5000-300 cm-1.
300 MHz, un espectro de 0.5% en peso/volumen de polmero en d-cloroformo (CDCl3) se realiz a 298 K y los
picos del H-NMR se determinaron por integracin espectromtrica.
3.4.Composicin qumica de EPS
La composicin qumica de las muestras dializadas de CMG141 se determin en trminos del contenido total de:
- Carbohidratos por el ensayo de antrona-cido sulfrico y el ensayo de fenol-cido sulfrico. Comentado [LVG23]: Spiro 1966
Comentado [LVG24]: Kochert 1978
- Amino azcares por el ensayo de Elson-Morgan.
Comentado [LVG25]: Dey y Harborne 1990
- Protenas por el mtodo de Bradford. Comentado [LVG26]: 1978

- Fosfato por el mtodo de George. Comentado [LVG27]: 1974

- Azcares cidos (cido urnico) por el ensayo de Carbazol. Comentado [LVG28]: Bradford 1978

3.5.Capacidad de absorcin del agua (g)


La capacidad de absorcin de agua del bioabsorbente purificado se determina por el mtodo de la bolsa de t, Comentado [LVG29]: Ryuichiro and Nohata (1994)
la bolsa seca y en capas de se te llena con 20 mg de la muestra y cada una de ellas se introduce en 200 mL de
agua destilada con una solucin de NaCl contenidos en un vaso de precipitado y se dejan por 2. 4 y 6 horas.
Adems del biopolmero, otras 10 muestras de control se examinaron para determinar su capacidad de Comentado [LVG30]: 1.Goma Xantan.
absorcin. La mxima capacidad de absorcin de agua por gramo de muestra seca se calcula en trminos del 2.Alginato de Sodio.
3.Agar.
promedio. 4.Celulosa.
5.Resina de intercambio inico.
3.6.Capacidad de absorcin de humedad 6.Polmero aninico de alta absorcin (Diafloc IncP-MP).
7.Slica Gel.
La capacidad de absorcin de humedad tambin se determina por el mtodo de Ryuichiro y Nohata (1994), se 8.Polmero sinttico de alto grado de absorcin. (SUmika Co
Gel S-50.
usaron desecadores de secado al vaco de Wheaton que contienen una solucin saturada de cloruro de magnesio 9.Suelo.
con humedades relativas del 61.8% mientras son almacenadas a 37C en una incubadora por 2. 6. 24 y 72 horas. 10.Bolsas vacas de t.

3.7.Capacidad de retencin de agua


Se mide por el mtodo de la columna de vidrio, el hidroabsorbente seco sintetizado (100 mg) en presencia de Comentado [LVG31]: Ryuichiro y Nohata (1994)
sacarosa, alignato sdico, xantan, polmero acrilamida sinttica se mexclan con 100 gramos de arena seca y se
empaca en la columna, la cantidad (g) de agua retenida por cada muestra se estima para 10 minutos, 1, 10 y 24
horas a 60C con una humedad relativa del 50-60%.
3.8.Capacidad de retencin de humedad
100 gramos de la muestra de hidroabsorbente secado al vaco y al calor (110C) en presencia de sacarosa y se
pesa el CaCl2, slica gel, glicerina, urea y polmero aninico. Se aaden 30 L de agua destilada a cada muestra y
se dej a 60C, se pesaron despus de 1, 2, 5, 10 y 15 das y la capacidad de retencin de humedad se midi como
el promedio de tres valores adyacentes. Comentado [LVG32]: Ryuichiro and Nohata, 1994

4. RESULTADOS
4.1.Acumulacin de PHA y anlisis qumicos
- La P. aeroginosa CMG607w es capaz de usar glucosa, sacarosa, acetato de sodio y gluconato de sodio como
fuente de carbn en condiciones aerbicas, la cepa CMG607w creci satisfactoriamente en un medio
qumicamente definido soportado con gluconato de sodio y muestra una fase exponencial de 25 horas con
alta densidad celular mientras que en presencia de glucosa/sodio acetato/sacarosa la fase exponencial fue de
20 horas con baja densidad celular.
- El PHA extrado de CMG607w estaba en forma de precipitados blancos en presencia de todas las fuentes de
carbn probadas, pero en presencia de gluconato de sodio, la cantidad de PHA producida fue mayor
comparada con el resto de fuentes.
- En presencia de gluconato de sodio al 1%, sintetiza 56 mg/L de PHA despus de 24 horas mientras que la
mxima produccin de PHA fue 376 mg/L despus de 72 horas; con el incremento en el tiempo de incubacin,
el contenido de PHA en las clulas tiende a aumentar y alcanzar el 42.3% en peso de la masa celular seca.
- El PHA purificado muestra la banda ms fuerte en 1735 cm-1 para el grupo carbonil en el espectro FT-IR.
- Se observa la vibracin del metileno cerca a los 2925 cm-1.
- El PHA purificado aislado de las clulas, crece un medio con gluconato de sodio muestra que el mcl-PHA tiene
la mayor composicin (Espectrmetro de 300-MHz H-NMR).
- Los valores integrados coinciden con la estructura del polmero propuesta (NMR). Comentado [LVG33]: Ohyoung et al, 1995

- El espectro de H.NMR muestra los protones de metil, metileno y metina caractersticos del PHA.
- El mayor triplete de metil aparece en 0.87 (H-e) y el octeto aparece en 2.42-2.62 (H-a) debido al metileno. Un
singlete ancho de 18 H integrados aparece en 1.25 (H-d) y un singlete ancho de dos protones integrados en
1.58 (H-c). Comentado [LVG34]: Campo ascendiente.

- El nico metano est en 5.23 (Campo descendiente).


- Todos los cambios qumicos se confirmaron con datos reportados. Comentado [LVG35]: Ohyoung et al, 1995

4.2.Produccin de EPS y anlisis qumico


- La precipitacin etanlica mostr que los precipitados insolubles se floculaban en componentes de mayor
peso molecular.
- En ausencia de urea, la viscosidad del cultivo se reduce significativamente por lo que la urea mejora la sntesis
del pomero.
- El anlisis qumico del biopolmero usando glucosa, fructosa o sacarosa mostr que el total de los
carbohidratos es 95.73, 96.86 y 97.06%, de cido urnico 2.15, 2.91 y 2.78% y una cantidad mnima de PO 4.
4.3.Propiedades hidroabsorbentes del EPS
- El resultado de las propiedades absorbentes de agua del biopolmero mostr que absorbe agua 400 veces
su peso que es mucho mayor comparado con los componentes absorbentes comerciales (Polmero
sinttico con alto grado de absorcin -244- y el polmero absorbente aninico -348-).
- La capacidad de absorcin de agua es de 3-5 veces mayor que las gomas polisacridas comerciales
(Xantan, alignato y celulosa).
- Cuando las condiciones salinas se desarrollan, la capacidad de absorcin de agua disminuye al aumentar
la concentracin de NaCl, aunque sigue siendo mayor que la de las muestras de control.
- En presencia de un 61.8% de humedad, los hidroabsorbentes bactrianos (bpS, bpF, bpG) son capaces de
absorber de un 26-31% de la humedad que es mayor al que maneja los polisacridos comerciales (Xantan,
Alignato y celulosa).
- CaCl2 y la glicerina muestran mayor absorcin de la humedad que el hidroabsorbente pero el cloruro se
vuelve lquido despus de saturarse 72 horas.
- Cuando el polmero hidroabsorbente y los absorbentes de agua sintticos/poliacrilamidas con el suelo van
al laboratorio del desierto (50-60% de humedad relativa y 60C), el primero retiene un 38% del agua
suministrada por 24 horas mientras que el segundo slo un 8%.

5. DISCUSIN
- La produccin de PHA por CMG607w muestra que el PHA se acumula en grandes cantidades en las clulas
despus de su crecimiento y de las condiciones de desequilibrio de nutrientes. La acumulacin de PHA Comentado [LVG36]: Lee, 1996
despus de 24 horas es el 23% del peso de la masa celular seca y a las 72 horas alcanza un 42.3%.
- PHA purificada muestra una banda ms fuerte en 1735 cm-1 en comparacin del que se produce con
A.zotobacteria vinelandii y pseudomonada mendocina que tienen sus bandas en 1732 cm-1. Comentado [LVG37]: Hong et al, 1999

- En presencia de gluconato de sodio, el mcl-PHA es identificado por H-NMR por lo que se concluye que
CMG607w acumula un polmero de cadena mediana como su mayor constituyente cuando las clulas crecen
el gluconato de sodio. Comentado [LVG38]: Huijbert et al, 1992

- Las cepas que producen ms de un 40% de mcl-PHA se consideran buenas candidatas para ser
comercializadas. Comentado [LVG39]: Harbak, 1992

- CMG607w puede tener ventaja econmica porque usa un derivado de un carbohidrato econmico
(gluconato) como nica fuente de carbono para la produccin de mcl-PHA.
- CMG1421 produce un polisacrido extracelular en un caldo mnimo (Carbohidratos), el polisacrido vuelve el Comentado [LVG40]:
caldo viscoso. La composicin qumica arroja que el biopolmero bacteriano es cido polisacrido en la Un lquido que contiene ingredientes adecuados para el
cultivo de organismos pequeos:
naturaleza.
- El peso es seco del biopolmero extracelular es de 2-4 gramos por litro de caldo. El biopolmero es insoluble
en agua de grifo, agua caliente (60C), agua destilada y salina, lo que indica que el biopolmero es tolerante a
diferentes condiciones.
- El polisacrito absorbe 3-4 veces ms agua que su propio peso (Mayor que las muestras de control). El
polmero es insoluble en componentes hidroflicos y acta como reserva de agua. En presencia de NaCl
disminuye la capacidad de absorcin, aunque sigue siendo superior, el polmero acta como filtro de sal y Comentado [LVG41]: Moazami, 2001
parte del polmero se satura de sal.
- Un tipo similar de exopolisacarido bacteriano se document en Moazami (2001) como un super absorbente
de agua para tierras salinas y desrticas en las que actuaba como depsito de agua, filtro de sal y
biofertilizante. Tambin muestra la mxima capacidad de retencin de agua sin importar las condiciones secas
y calientes del laboratorio (Polmero acta en contra de la evaporacin del agua). Tambin mostr gran
capacidad absorcin y retencin de humedad a diferentes humedades relativas (Desrticas) que se compara
con desecantes actuales (CaCl2, glicerina y slica gel).
Este tipo de exopolisacrido bacteriano lo document Ryuichiro and Nohata (1994) producido por Alcaligene
latus, las propiedades reolgicas se podran usar para estabilizar el suelo y prevenir la erosin y la gran
evaporacin del mismo.