ACARA I

STERILISASI ALAT, PEMBUATAN LARUTAN STOCK DAN

PEMBUATAN MEDIA

A. Pendahuluan
1. Latar Belakang
Kultur jaringan merupakan suatu metode untuk mengisolasi bagian
dari tanaman seperti protoplasma, sel, sekelompok sel, jaringan maupun
organ , serta menumbuhkannya dalam keadaan aseptik, sehingga bagian-
bagian tersebut dapat memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi
tanaman utuh kembali. Konsep awal dari kultur jarngan adalah
diketahuinya kemempuan totipotensi dari sel tumbuhan. Totipotensi sel
(Total Genetic Potential), artinya setiap sel memiliki potensi genetik
seperti zigot yaitu mampu memperbanyak diri dan berediferensiasi
menjadi tanaman lengkap.
Lingkungan aseptic sebagai salah satu syarat utama suksesnya
kegiatan kultur jaringan perlu diterapkan dengan sungguh-sungguh.
Untuk itu perlu adanya usaha sterilisasi peralatan yang akan digunakan
dalam proses kultur. Sterilisasi adalah bahwa segala kegiatan dalam
kultur jaringan harus dilakukan di tempat yang steril, yaitu di laminar
flow dan menggunakan alat-alat yang juga steril. Sterilisasi juga
dilakukan terhadap peralatan, yaitu menggunakan etanol yang
disemprotkan secara merata pada peralatan yang digunakan. Teknisi
yang melakukan kultur jaringan juga harus steril. Sterilisasi pada teknik
kultur jarngan meliputi: Sterilisasi lingkungan kerja, sterilisasi alat dan
media dan sterilisasi bahan tanam.
Metode kultur in vitro dalam bidang pertanian saat ini telah
berkembang untuk usaha perbanyakan tanaman, perbaikan sifat atau
seleksi, produksi bahan metabolit, pemeliharaan plasma nutfah dan
transfer gen dalam biologi molekuler. Semua kegiatan tersebut
smemerlukan media buatan baik dalam bentuk cair maupun padat dengan

1
 2

memberikan formulasi kebutuhan nutrisi, protein dan hormon tumbuh

dalam perbandingan yang sesuai. Pada praktikum ini akan dilakukan
teknik kultur organ tanaman. Macam-macam organ umumnya
menunjukan kecepatan pembelahan sel yng berbeda pula. Faktor yang
mempengaruhi pertumbuhan dan morfogenesis tanaman dalam kultur in
vitro antara lain mencakup genotip sumber bahan tanaman, media dan
ZPT yang digunakan, kondisi lingkungan inkubasi, fisiologi jaringan dari
eksplan secara optimal sehingga diperoleh tanaman lengkap. Kultur
organ dengan bahan eksplan berupa pucuk tanaman yang sehat dan bebas
virus mempunyai aspek praktis sebagai perbanyakan klon yang cepat dan
bebas penyakit.
2. Tujuan
Praktikum Acara 1 Sterilisasi Pembuatan Larutan Stock Dan
Pembuatan Media ini bertujuan :
a. Mengetahui metode dan macam sterilisasi dalam kultur jaringan
yang meliputi sterilisasi alat, ruang dan eksplan.
b. Mengetahui prosedur sterilisasi alat-alat penanaman (diseksi) dan
alat kaca seperti botol kultur, petridish, erlenmeyer dan lain-
lain.
c. Mengetahui langkah-langkah dalam pembuatan media kultur
jaringan terutama dalam pembuatan stock makro nutrien, mikro
nutrien, larutan buffer (Fe-EDTA), vitamin dan Zat Pengaur
Tumbuh (ZPT).
3. Waktu dan Tempat Praktikum
Praktikum Acara 1 Sterilisasi Alat Pembuatan Larutan Stock dan
Pembuatan Media ini dilaksanakan pada hari Selasa, 8 April 2014 pukul
12.00 WIB dan Pembuatan Media Tanam dilaksanakan pada hari Kamis,
17 April 2014 pukul 12.00 WIB di Laboratorium Kultur Jaringan Gedung
D Fakultas Pertanian Universitas Sebelas Maret Surakarta.
 3

B. Tinjauan Pustaka
Sterilisasi merupakan metode praktis yang dirancang untuk
membersihkan dari mikroorganisme, atau sengaja untuk menghambat
pertumbuhannya yang nyata dari kepentingan dasar di banyak keadaan. Jenis
dari mikroorganisme sangat berbeda dalam kelemahannya. Terdapat berbagai
macam agen antimikroba, dan lebih banyak lagi, afek yang praktis dari agen
ini pada adanya keadaan nyata yang sangat besar dipengaruhi oleh keadaan
sekitar. Banyak yang akan bertahan, contohnya, pada cuaca tertentu
organisme memiliki kulit, pada beberapa tubuh zat cair atau pada udara, Air,
makanan, kotoran, atau ruangan berdebu. Caranya harus dirubah, oleh karena
itu, dengan masalah nyata. Hal ini tidak mungkin, bagaimanapun pada garis
besarnya tentunya prinsip dasar digaris bawahi pada umumnya digunakan
cara untuk memusnahkan dan mengontrol kehidupan mikroba ( Inforedia
2009)
Sebelum melakukan kultur jaringan untuk suatu tanaman, kegiatan yang
pertama harus dilakukan adalah memilih bahan induk yang akan diperbanyak.
Tanaman tersebut harus jelas jenis, spesies, dan varietasnya serta harus sehat
dan bebas dari hama dan penyakit. Tanaman indukan sumber eksplan tersebut
harus dikondisikan dan dipersiapkan secara khusus di rumah kaca atau green
house agar eksplan yang akan dikulturkan sehat dan dapat tumbuh baik serta
bebas dari sumber kontaminan pada waktu dikulturkan secara in vitrto
(Sjahril Rinaldi 2011)
Media merupakan faktor penentu dalam perbanyakan dengan kultur
jaringan. Komposisi media yang digunakan tergantung dengan jenis tanaman
yang akan diperbanyak. Media yang digunakan biasanya terdiri dari garam
mineral, vitamin dan hormon. Diperlukan juga bahan tambahan seperti agar,
gula (sebagai sumber energi), dan lain-lain. Zat pengatur tumbuh (hormon)
yang ditambahkan juga bervariasi, baik jenis maupun jumlahnya, tergantung
dengan tujuan dari kultur jaringan yang dilakukan. Media yang sudah jadi
ditempatkan pada tabung reaksi atau botol-botol kaca. Media yang digunakan
 4

juga harus disterilkan dengan cara memanaskannya menggunakan autoklaf

dengan suhu 121o C kurang lebih selama 15 menit (Yuniastuti 2012)
Bahan pemadat (gelling agents) merupakan salah satu komponen yang
penting di dalam media kultur jaringan tanaman maupun mikroorganisme.
Media yang dipadatkan secara sempurna dapat menjadi media yang baik
untuk pertumbuhan jaringan tanaman maupun mikroorganisme, karena dapat
memelihara proses biokimia dan fisiologisnya (Maliro dan Lameck, 2004).
Bahan pemadat yang digunakan dalam kultur jaringan tanaman adalah jenis
agar standar khusus untuk kultur jaringan tanaman yang umumnya masih
diimpor, misalnya merek Bacto, Oxoid atau Gelrite dan Phytagel
(Priadi et al 2008)
Adanya pertumbuhan mikroorganisme menunjukkan bahwa
pertumbuhan bakteri masih berlangsung dan tidak sempurnanya proses
sterilisasi. Jika sterilisasi berlangsung sempurna, maka spora bakteri yang
merupakan bentuk paling resisten dari kehidupan mikrobia akan diluluhkan
sterilisasi dapat dilakukan dengan berbagai cara yaitu panas, penyaringan,
radiasi, dan penambahan bahan kimia. Sedangkan sterilisasi dengan cara
panas dapat dilakukan dengan panas basah, panas kering, pemanasan bertahap
dan perebusan
(Lay dan Hastowo 2002)
Perbanyakan tanaman secara in vitro atau yang lebih dikenal dengan
kultur jaringan terbukti dapat meningkatkan ketersediaan bibit tanaman dalam
jumlah besar dan seragam dalam waktu relatif singkat. Aplikasi teknologi ini
telah banyak dilakukan terhadap berbagai spesies tanaman, diantaranya
seperti yang dilakukan oleh Hutami (1998) untuk perbanyakan tanaman nilam
khimera, Mariska (1998) dalam upaya penyediaan benih tanaman jahe dan
Kosmiatin (2005) dalam upaya perbanyakan gaharu. Telah dilakukan
penelitian terkait media kultur jaringan untuk family orchidaceae terutama
genus Dendrobium. Widiastoety (1994) melaporkan bahwa penambahan 150
ml air kelapa sangat berpengaruh terhadap pembentukan protocorm like
bodies (plb). Widiastoety (1995) meneliti tentang pengaruh berbagai sumber
 5

dan kadar karbohidrat terhadap pertumbuhan planlet anggrek Dendrobium,

dilaporkan bahwa penggunaan karbohidrat dengan kadar 10 gr/ l terbukti
efektif mempercepat pertumbuhan batang, daun dan akar planlet
Dendrobium. Widiastoety (1997) melaporkan bahwa pemberian air kelapa
sebanyak 150 ml/l pada tingkat ketuaan kelapa muda dan sedang dapat
mendorong pertumbuhan planlet anggrek Dendrobium (Oktafiani 2001)
 6

C. Alat, Bahan, dan Cara Kerja

1. Alat
a. Peralatan untuk penanaman eksplan, meliputi :
1) Laminar Air Flow Cabinet (LAFC), lengkap dengan lampu bunsen
yang berisi spirtus.
2) Petridish dan botol-botol kultur.
3) Peralatan diseksi, yaitu pinset besar/kecil, pisau pemes, gunting
eksplan.
b. Peralatan untuk pembuatan media, meliputi :
1) Timbangan Analitik
2) Botol-botol kultur
3) Magnetik stirer
4) pH meter
5) Gelas piala
6) Pipet
7) Plastik pp 0.3 mm
8) Karet gelang
9) Kertas label
2. Bahan-bahan untuk pembuatan media :
a. Media Murashige and Skoorg (Ms Medium)
b. Aquadest
c. Larutan stok, terdiri atas makro dan mikro, vitamin serta ZPT.
d. Agar-agar
e. Gula
f. NaOH 1 N dan HCl 1 N
3. Cara Kerja
a. Pembuatan Larutan Stok antara lain :
1) Menimbang bahan-bahan kimia yang telah dikalikan menjadi
beberapa kali konsentrasi, misalnya untuk unsure hara makro
dikalikan 20 dan unsur hara mikro dikalikan 100 kali konsentrasi.
 7

2) Melarutkan bahan-bahan kimia tersebut ke dalam aquadest dengan

volume tertentu, misalnya 500 ml.
3) Memasukkan masing-masing larutan ke dalam botol dan
menyimpannya ke dalam refrigerator.
b. Pembuatan Larutan Stok Zat Pengatur Tumbuh antara lain :
1) Menghitung kebutuhan bahan BAP 100 ppm sebanyak 300 ml:
100 ppm = 100 mg/l
= 30 mg/ 0,3 l
= 30 mg/ 300 ml
2) Melarutkan bahan dengan alcohol atau NaOH 1 N kemudian
ditambah dengan aquadest sampai 300 ml untuk BAP
3) Memasukkan masing-masing larutan tersebut ke dalam botol dan
menyimpannya ke dalam refrigerator
c. Pembuatan Media Kultur antara lain :
1) Mengambil masing-masing larutan stok sesuai dengan ukuran yang
telah ditentukan dan memasukkannya ke dalam gelas piala
2) Mengambil larutan stok ZPT sesuai dengan perlakuan yaitu:
Untuk membuat media 1 L dengan konsentrasi BAP 2 ppm, maka
volume larutan stok yang diambil adalah :
V1 M1 = V2 M2
V1 100 ppm = 1000 ml 2 ppm
V1 = 20 ml/l
3) Menambah aquadest sampai 1000 ml
4) Menambah Gula sebanyak 30 gr
5) Mengatur pH dalam kisaran 6,2 6,3 dengan menambahkan
beberapa tetes NaOH untuk menaikkan pH atau HCL untuk
menurunkan pH. Pada saat pengukuran pH, larutan media diaduk
dengan magnetik stirer
6) Menambahkan agar-agar 8 gr kemudian dididihkan
7) Menuangkan larutan media ke dalam botol-botol kultur kurang
lebih 25 ml tiap botol
 8

8) Menutup botol berisi larutan media dengan plastik

9) Memasukan botol-botol berisi media kedalam autoklav untuk
proses sterilisasi pada tekanan 1,5 kg/cm2 selama 45 menit
10) Menyimpan media pada rak penyimpan media yang bertujuan
untuk mengantisipasi ada tidaknya kontaminasi pada media
sehingga dapat dicegah penggunaan media yang telah
terkontaminasi pada saat penanaman.
d. Media Penanaman
Dalam prakikum ini, media yang digunakan adalah media
Murashige dan skoog (MS) yang dimodifikasi dengan menambahkan
ZPT BAP 2 ppm. Media kultur tersebut digunakan untuk penanaman 4
macam eksplan dengan masing-masing eksplan diulang sebanyak 2 kali
untuk setiap mahasiswa/praktikan.
 9

D. Hasil Pengamatan dan Pembahasan

1. Hasil Pengamatan
Tabel 1.1 Hasil Pengamatan Pembuatan Media Kultur
No Teknik Pembuatan Media Gambar
1 Persiapan alat yang telah
disterilisasi dan bahan-bahan
pembuatan media kultur

Gambar 1.1
2 Pencampuran berbagai bahan-bahan
pembuatan media kultur

Gambar 1.2
3 Pengukuran pH berkisar 5,8 6,3

Gambar 1.3
4 Pemasakan media kultur setelah
dituangkan agar powder dan larutan
homogen.

Gambar 1.4
5 Menuangkan larutan media ke
dalam botol kultur

Gambar 1.5
6 Menutup botol kultur dengan
plastik

Gambar 1.6
 10

7 Sterilisasi botol kultur berisi media

ke dalam autoklaf

Gambar 1.7
8. Menyimpan media pada rak
penyimpanan media

Gambar 1.8
Sumber: Dokumentasi
2. Pembahasan
Media yang digunakan dalam pembuatan media pada praktikum kali
ini adalah media Murashige & Skoog (media MS).Media ini merupakan
media digunakan hampir pada semua macam tanaman terutama
herbaceous. Media ini memiliki konsentrasi garam-garam mineral yang
tinggi, terutama kebutuhan garam anorganik yang mendukung
pertumbuhan optimum pada kultur jaringan tembakau dan senyawa N
dalam bentuk NO3- dan NH4+.
Senyawa-senyawa di dalam media MS dapat terjadi pengendapan
persenyawaan, ini terlihat jelas pada media cair. Kebanyakan dari
persenyawaan yang mengendap adalah fosfat dan besi, kemudian dalam
jumlah yang lebih sedikit adalah Ca, K, N, Zn dan Mn. Senyawa paling
sedikit adalah senyawa yang mengandung unsur C, Mg, H, Si, Mo, S, Ca
dan Co. Setelah tujuh hari dibiarkan, maka kira-kira 50% dari Fe dan 13%
dari PO4+, mengendap. Pengendapan unsur-unsur tersebut mungkin tidak
penting, karena unsur-unsur tersebut masih tersedia bagi jaringan tanaman
dan pengaruh pengendapannya belum diketahui. Untuk mengatasi
pengendapan Fe, konsentrasi Fe dikurangi sampai 1/3 dengan EDTA yang
tetap (Sujdojo 2005)
 11

Sebelum pembuatan larutan stock dan media hal yang pertama kali
dilakukan adalah mensterilkan semua peralatan yang akan digunakan
dengan mengeluarkan sisa-sisa media atau tanaman yang masih
tertinggal di dalam botol kultur kemudian mencuci dengan sabun
kemudian membilas dengan air bersih yang mengalir, hal ini bertujuan
agar alat tidak terkontaminasi dengan jamur atau bakteri. Setelah itu
botol kultur ditiriskan diatas koran. Kemudian setelah kering
2
disterilkan dengan autoklaf pada tekanan 1,5 kg/cm selama 45 menit.
Setelah peralatan disterilkan dilanjutkan pembuatan larutan stock.
Dilanjutkan pembuataan media, proses ini dilakukan dengan penuangan
larutan stock ke dalam botol kultur kemudian disimpan dalam ruangan
yang sejuk.
Komposisi media yang digunakan dalam pembuatan media terdiri
dari aquadest sebagai pelarut bahan yang digunakan. ,hara- hara makro dan
mikro sebagai zat pertumbuhan tanaman, sukrosa sebagai sumber energi,
agar agar sebagai bahan pemadat, vitamin sebagai zat pertumbuhan dan
perkembangan sel, ZPT sebagai pengatur tumbuh tumbuhan.
Media kultur jaringan menyediakan semua keperluan tanaman juga
harus steril dari kontaminasi. Hal ini bertujuan agar dapat diperoleh
tanaman yang steril dari berbagai mikroorganisme penggangu. Dalam satu
botol berisi sekitar 20-25 ml larutan media. Keadaan media yang diperoleh
dari kelompok satu yaitu berwarna putih bening dan bentuk padat. Warna
putih diperoleh dari warna agar yang digunakan. Sedangkan kepadatan
media menggambarkan kesesuaian perbandingan dan komposisi media.
Pada dasarnya, semua tanaman dapat diregenerasikan menjadi tanaman
sempurrna bila ditumbuhkan pada media yang sesuai. Salah satu
komponen media yang menentukan keberhasilan kultur jaringan adalah
perbedaan komposisi media yang sangat mempengaruhi arah pertumbuhan
dan regenerasi eksplan.
Pembuatan media dikelompokan berdasarkan jenis bahan kimia yang
digunakan, sehingga jika bahan kimia tersebut dicampur tidak terjadi
 12

interaksi yang menghasilkan senyawa baru. Biasanya pengelompokan

dilakukan berdasarkan stok hara makro, stok hara mikro, vitamin dan stok
hormone, terutama jika larutan stok tidak disimpan terlalu lama.
Pembuatan media langkah awal adalah membuat larutan stok. Larutan
stock bertujuan untuk menghemat pekerjaan menimbang bahan yang
berulang-ulang setiap kali membuat media, meningkatkan efisiensi
penggunaan bahan, beberapa hal hang perlu diperhatikan dalam membuat
larutan stok adalah kepekatan dan jumlah larutan yang akan dibuat
(Andini 2006)
Keasaman (pH) adalah nilai yang menyatakan derajat keasaman atau
kebasaan larutan dalam air. Sel-sel tanaman yang dikembangkan dengan
teknik kultur jaringan mempunyai toleransi pH yang relatif sempit dengan
titik optimal antara pH 5,0 6,0. Faktor pH dalam media juga perlu
mendapat perhatian khusus. pH tesebut harus diatur sedemikian rupa
sehingga tidak mengganggu fungsi membran sel dan pH dari sitoplasma.
Pengaturan pH selain memperhatikan kepentingan beberapa fisiologis
(Daisy 2004)
 13

E.Kesimpulan dan Saran

1. Kesimpulan
Dari hasil Praktikum Sterilisasi dan Pembuatan Media, dapat
disimpulkan :
a. Pada praktikum pembuatan media, media yang digunakan adalah media
Murashige dan Skoog (MS) yang dimodifikasi dengan penambahan ZPT
BAP 1 ppm
b. Media kultur jaringan yang baik, selain dapat menyediakan semua
keperluan tanaman juga harus steril dari kontaminasi.
c. pH yang digunakan antara 6,2 sampai dengan 6,3.
2. Saran
Saran yang dapat diberikan terkait praktikum acara Sterilisasi dan
Pembuatan Media yaitu :
a. Pada saat pembuatan media hendaknya perlu ketelitian dalam
menghitung perbandingan dan komposisi agar menghasilkan media yang
baik dan benar.
b. Waktu sterilisasi harus sesuai agar media benar-benar dalam kondisi
steril.
 14

DAFTAR PUSTAKA

Andini 2006. Pembuatan Larutan Stok. Andi Pradhika :Yogyakarta

Daisy 2004. Laporan Kultur Jaringan. www. Laporan kultur jaringan pembuatan
media. Diakses pada tanggal 16 Juni 2014
Inforedia 2009.www.cara-cara-pembuatan-medium-kultur.html.Diakses pada
tanggal 30 April 2014
Ir. Rinaldi Sjahril, MAgr., PhD 2011. Pembiakan in vitro. UNHAS Press:
Makassar
Lay, B. W, Hastowo 2002. Mikrobiologi. Rajawali Press : Jakarta
Oktafiani Aastri 2001. Pengaruh Beberapa Media Kultur Jaringan Terhadap
Pertumbuhan Planlet Anggrek Phalaenopsis bellina. Jurnal Akta Agrosia.
Vol. 4(6):25-31
Priadi Doy 2008. Pertumbuhan In vitro Tunas Ubi Kayu (Manihot esculenta
Crantz) pada Berbagai Bahan Pemadat Alternatif Pengganti Agar. Jurnal
BIODIVERSITAS. Vol. 9(1):9-12.
Sujdojo 2005. Media. Erlangga : Jakarta
Yuniastuti Endang 2012. Petunjuk Praktikum Kultur Jaringan. Surakarta