Anda di halaman 1dari 37

4

Molekul Deteksi dan


Karakterisasi furunkulosis dan lain Aeromonas
Infeksi ikan

Roxana Beaz Hidalgo dan Mara Jos Figueras


Universitat Rovira i Virgili
Spanyol

1. Perkenalan

Spesies dari genus Aeromonas, yang menghuni lingkungan perairan, dapat menghasilkan septikemia dan ulseratif
dan hemoragik penyakit ikan, termasuk furunkulosis, yang mengakibatkan kematian massal dan kerugian ekonomi
yang penting di sektor perikanan budidaya (Austin & Austin, 2007; Beaz-Hidalgo et al, 2010;. Bernoth et al ., 1997;
Gudmundsdttir & Bjrnsdttir, 2007; Noga, 2010; Wiklund & Dalsgaard, 1998). spesies Aeromonas salmonicida ( dengan
5 subspesies: salmonicida, masoucida, smithia, achromogenes dan pectinolytica) dan Aeromonas hydrophila telah
klasik dianggap paling penting Aeromonas patogen ikan, dan subspesies salmonicida dianggap agen penyebab
furunkulosis, penyakit yang dilaporkan lebih dari satu abad yang lalu untuk mempengaruhi trout, dan kemudian
mempengaruhi salmonids dan jenis ikan lainnya (Bernoth et al, 1997;. Goodwin & Merry, 2009; Han et al ., 2011;
Noga, 2010; Wiklund & Dalsgaard, 1998). Saat ini, furunkulosis memiliki distribusi di seluruh dunia, yang telah
dilaporkan di Skotlandia, Perancis, Norwegia, Islandia, Spanyol, Amerika Serikat, Kanada, Jepang, Chile dan
Australia. Fakta bahwa banyak strain diisolasi dari ikan yang sakit tidak sesuai karakteristik yang dijelaskan
ditetapkan untuk A. salmonicida subsp. salmonicida atau untuk furunculosis telah menyebabkan istilah 'strain atipikal'
dan 'furunculosis atipikal' akan diperkenalkan ketika mereka dikaitkan dengan lainnya A. salmonicida subspesies,
lainnya Aeromonas spesies atau ketika furunculosis terjadi pada ikan selain salmon (Wiklund & Dalsgaard, 1998). Hal
ini menyebabkan kebingungan karena istilah 'atipikal' diterapkan dengan cara yang berbeda oleh penulis. Publikasi
seperti monografi furunculosis tertentu yang diterbitkan pada tahun 1997 oleh Bernoth et al, bab berurusan dengan
infeksi ini dalam buku-buku budidaya tertentu (Austin & Austin, 2007; Hiney & Olivier, 1999; Noga, 2010). Dan ulasan
di furunculosis atipikal dan khas ( Wiklund & Dalsgaard, 1998) dan pengobatan mereka (Gudmundsdttir &
Bjrnsdttir, 2007) antara lain, semua mencerminkan pentingnya sektor budidaya Aeromonas infeksi. Beberapa
metode PCR telah dirancang dan dievaluasi relatif untuk deteksi cepat dan identifikasi khas dan atipikal A. salmonicida dari
terinfeksi jaringan ikan dan pengenalan molekul terpercaya Aeromonas metode identifikasi telah mengaktifkan spesies
baru ( Aeromonas tecta dan Aeromonas piscicola) untuk ditemukan dan / atau spesies dikenal lain yang terkait dengan
penyakit ikan untuk diakui yaitu Aeromonas bestiarum, Aeromonas sobria, Aeromonas encheleia, Aeromonas veronii,
Aeromonas eucrenophila dan Media Aeromonas ( BeazHidalgo et al, 2010.; Kozi ska, 2007; Li & Cai, 2011; Nawaz et
al., 2006; Soriano-Vargas et al.,

www.intechopen.com
98 Kesehatan dan Lingkungan di Budidaya

2010). Spesies ini akan tetap bertopeng sebagai, terutama, A. salmonicida atau A. hydrophila
jika identifikasi biokimia hanya diterapkan dan akan salah mengartikan prevalensi nyata dan / atau keragaman
spesies terlibat dalam infeksi ikan (Beaz-Hidalgo et al, 2010;.. Figueras et al, 2011b). Bab ini pada Aeromonas Infeksi
ikan menyajikan informasi terbaru tentang taksonomi dan identifikasi mikroorganisme ini berasal dari penerapan
teknik molekuler bersama-sama dengan tinjauan rinci metode PCR saat ini tersedia yang telah dirancang untuk
mendeteksi atau karakterisasi yang khas atau atipikal

A. salmonicida atau yang lain Aeromonas spesies dalam, terutama, jaringan ikan dan air selama wabah atau
pemantauan preventif biasa. Strategi pencegahan untuk pengendalian penyakit ikan menular, seperti yang
dihasilkan oleh Aeromonas adalah tantangan konstan, dan perlu secara berkala untuk mengenali perubahan dinamis
terkait dengan penyakit ini, yang mungkin disebabkan baik oleh munculnya spesies patogen baru (yaitu baru
ditemukan A. piscicola dan A. tecta) atau oleh faktor lingkungan. Mengenai perubahan terakhir, iklim dianggap
berperan dalam penampilan dan dampak furunculosis (Tam et al., 2011) dan karena itu aspek lain yang dibahas
dalam bab ini.

2. Genus Aeromonas

genus Aeromonas milik kelas Gammaproteobacteria, memesan Aeromonadales dan keluarga Aeromonadaceae ( Martin-Carnahan
& Joseph, 2005). Aeromonas spesies tersebar luas di lingkungan perairan dan terisolasi dari air, ikan sehat atau sakit,
produk makanan, hewan dan kotoran manusia dan sampel klinis dan lingkungan lainnya (Figueras, 2005; Janda &
Abbot, 2010). Deskripsi pertama dari sebuah Aeromonas tanggal spesies kembali ke 1891, ketika Stainer
menggambarkan bakteri Bacillus hydrophillus fuscus ( sekarang A. hydrophila) diisolasi dari sakit katak
(Martin-Carnahan & Joseph, 2005). Beberapa tahun kemudian pada tahun 1894 Emmerich dan Weibel
menggambarkan spesies Bacillus de Forellenseuche ( kemudian Bacillus salmonicida, sekarang A. salmonicida) diisolasi
dari sakit trout (Martin-Carnahan & Joseph,

2005). Deskripsi formal dari genus dibuat oleh Stainer pada tahun 1943, dan pada 1970-an
Aeromonas spesies diklasifikasikan menjadi 2 kelompok berdasarkan suhu pertumbuhan mereka, motilitas dan
produksi pigmen (Martin-Carnahan & Joseph, 2005). Satu kelompok terdiri strain mesofilik mampu tumbuh pada
37C, motil dan non-pigmented, terutama terkait dengan infeksi klinis manusia dan diwakili oleh A. hydrophila. Kelompok
lain terdiri strain psycrophilic (pertumbuhan optimum pada 22-28C), non-motil dan berpigmen, yang patogen
terutama ikan diwakili oleh A. salmonicida. Pada 1980-an, tes hibridisasi DNA-DNA memungkinkan diferensiasi
berbagai genospecies atau kelompok hibridisasi (MartinCarnahan & Joseph, 2005).

Dalam edisi terakhir dari Bergey`s Manual (Martin-Carnahan & Joseph, 2005) genus, yang sebelumnya milik
keluarga Vibrionaceae ditempatkan di keluarga sendiri independen
Aeromonadaceae, itu terdiri 14 spesies yaitu A. hydrophila ( dengan 2 subspesies: hydrophila dan
ranae), A. bestiarum, A. salmonicida ( dengan 5 subspesies: salmonicida, masoucida, smithia, achromogenes dan pectinolytica),
A. caviae, A. media, A. eucrenophila, A. sobria, A. veronii, A. encheleia, Aeromonas jandaei, Aeromonas schubertii,
Aeromonas trota, Aeromonas allosaccharophila,
dan popoffii Aeromonas. Juga beberapa spesies synonymised dengan spesies sebelumnya diakui seperti A.
ichthiosmia dan A. culicicola dengan A. veronii dan A. enteropelogenes dengan A. trota. Sejak itu, genus telah
berkembang pesat dengan penambahan 11 spesies baru

www.intechopen.com
Molekul Deteksi dan Karakterisasi furunkulosis dan lain Aeromonas Infeksi
ikan 99

( Aeromonas simiae, Aeromonas molluscorum, Aeromonas bivalvium, A. tecta, Aeromonas aquariorum, A. piscicola,
Aeromonas fluvialis, Aeromonas taiwanensis, Aeromonas sanarellii, Aeromonas diversa dan Aeromonas rivuli) dan
hari ini genus terdiri 25 spesies divalidasi (Figueras et al., 2011b).

3. furunkulosis dan lainnya Aeromonas infeksi ikan

Furunculosis adalah salah satu penyakit tertua yang diketahui penting dalam budidaya pertama kali didokumentasikan
oleh Emmerich dan Weibel pada tahun 1894 ketika mereka mengamati furunkel atau lesi ulkus pada kulit ikan trout. Lesi
ulserasi karakteristik adalah mereka yang menimbulkan nama penyakit dikaitkan dengan infeksi yang dihasilkan oleh Bacillus
de Forellenseuche, sekarang dikenal sebagai A. salmonicida ( Austin & Austin, 2007; Bernoth et al., 1997; Martin-Carnahan
& Joseph, 2005). Pada kenyataannya, furunkulosis adalah infeksi ikan pertama dimana 'Koch postulates' yang ditunjukkan
lebih dari satu abad yang lalu (Austin & Austin, 2007;. Bernoth et al, 1997). Ia berpikir awalnya bahwa infeksi yang terkena
hanya salmonids, tetapi segera menjadi jelas bahwa itu didistribusikan di seluruh dunia dan mempengaruhi banyak
spesies laut dan ikan air tawar lainnya, seperti Atlantik cod ( Gadus morhua), sejenis ikan pecak ( Hyppoglossus
hyppoglossus), turbot ( Scopthamus maximus), lamprey ( Petromyzon Marinus), ikan mas ( Cyprinus carpio), ikan mas ( Carassius
auratus) dan belut ( Anguilla anguilla) antara lain (Austin & Austin, 2007; Bernoth et al, 1997;.. Godoy et al, 2010;
Goldschmidt-Clermont et al, 2009;. Noga, 2010; Wiklund & Dalsgaard, 1998).

Lesu, kurang nafsu makan, atau kulit hiperpigmentasi dapat menjadi tanda-tanda pertama dari infeksi dan mungkin
menunjukkan manifestasi klinis lain seperti kehadiran furuncules khas atau borok, exophthalmia (pembengkakan
mata), septikemia, petequias (lesi hemoragik kecil karena rusak kapiler darah), anemia, asites dan perdarahan di otot,
insang, sirip, nares, curhat dan organ internal (Austin & Austin, 2007; Bernoth et al, 1997;. Hiney & Olivier, 1999;
Wiklund & Dalsgaard, 1998). Di sisi lain, ikan yang terkena furunculosis tidak selalu menunjukkan semua gejala klinis
ini dan mungkin bahkan tidak menunjukkan furuncules khas atau borok kulit (Noga, 2010). Banyak A. salmonicida ikan
pembawa yang tidak menunjukkan lesi eksternal atau tanda-tanda klinis dari penyakit ini tapi itu memang mampu
untuk menumpahkan mikroorganisme (10 5- 10 6 CFU per ekor / h) dan untuk mengembangkan penyakit dalam kondisi
stres (yaitu peningkatan suhu air, kualitas air yang buruk, dll), menghasilkan wabah epidemi telah dilaporkan (Bernoth
et al, 1997;. Gustafson et al, 1992. ; Hiney & Olivier, 1999; Noga, 2010; Wiklund & Dalsgaard, 1998). Telah
diperkirakan bahwa sampai 80% dari trout dibudidayakan dapat membawa A. salmonicida, sehingga meningkatkan
kemungkinan penularan ke ikan rentan (Gustafson et al., 1992). Ini ikan diam-diam terinfeksi (atau operator)
memainkan peran penting dalam epidemiologi penyakit, oleh karena itu deteksi dini patogen ini sangat penting.
Beberapa metode deteksi PCR telah dikembangkan untuk mendeteksi A. salmonicida ( lihat Bagian 4.2.2-4.2.5, Tabel
1-5), yang penerapannya sangat penting untuk pengendalian penyakit yang efektif (Altinok et al, 2008;.. Byers et al,
2002a, b; Gustafson et al, 1992;. Onuk et al., 2010). Penyakit yang disebabkan oleh strain atipikal A. salmonicida ( orang-orang
yang tidak termasuk subsp tersebut.

salmonicida) disebut sebagai furunkulosis atipikal, meskipun istilah ini juga diterapkan untuk infeksi diproduksi di
non-salmonids. Selanjutnya, nama-nama yang lebih spesifik telah digunakan untuk merujuk pada infeksi yang
mempengaruhi ikan tertentu, yaitu ikan mas penyakit maag, ikan mas

www.intechopen.com
100 Kesehatan dan Lingkungan di Budidaya

erythrodermatitis, dan penyakit flounder ulkus (Austin & Austin, 2007; Noga, 2010; Wiklund & Dalsgaard, 1998). Meskipun
beberapa penulis telah mencoba untuk menggambarkan tanda-tanda klinis yang spesifik untuk masing-masing patologi
bernama (Austin & Austin, 2007; Noga, 2010), dalam prakteknya mereka tidak bisa dibedakan dari orang-orang yang
berhubungan dengan furunculosis atau penyakit ulseratif lain atau septicemia yang disebabkan oleh motil lainnya Aeromonas
jenis. Yang terakhir juga telah bernama 'motil Aeromonas septicemia' dan dianggap sebagai contoh yang jelas dari
penyakit stres yang disebabkan terutama mempengaruhi ikan air tawar. Meskipun spesies motil juga mendiami air payau,
prevalensi mereka menurun dengan meningkatnya salinitas (Austin & Austin, 2007; Noga, 2010). Infeksi ini terutama
disebabkan A. hydrophila, klasik dianggap spesies yang paling penting setelah A. salmonicida. Namun, pentingnya spesies
A. hydrophila adalah berlebihan karena sistem identifikasi biokimia keliru mengidentifikasi hingga 70-80% dari strain Aeromonas
sebagai milik spesies ini, padahal sebenarnya mereka banyak spesies yang berbeda ketika diidentifikasi oleh metode
molekuler (Beaz-Hidalgo et al, 2010;. Figueras, 2005; 2011b;. Soler et al, 2003a). spesies motil lazim terkait dengan ikan
yang sakit berikut identifikasi molekuler termasuk A. veronii, terkait dengan lele, A. sobria dengan nila dan ikan trout, A.
hydrophila dengan trout, A. bestiarum dengan ikan mas dan baru-baru ini dijelaskan A. piscicola

pulih dari salmonids sakit dan turbots (Beaz-Hidalgo et al, 2010;. Kozi ska, 2007; Li & Cai, 2011; Martino et al,
2011.; Nawaz et al., 2006; Soriano-Vargas et al., 2010). Spesies motil lain, seperti A. encheleia, A. allosaccharophila,
A. jandaei, A. media, A. eucrenophila, A. aquariorum dan A. tecta juga telah pulih dari ikan sehat atau sakit, meskipun
kurang sering (Beaz-Hidalgo et al, 2010;. Kozi ska, 2007). Khas atau atipikal furunculosis dan motil Aeromonas septicaemias
semua menghasilkan tanda-tanda klinis serupa yang juga umum dengan yang diamati pada penyakit sistemik ikan
lain yang disebabkan oleh bakteri dan virus patogen lainnya (Austin & Austin, 2007; Bernoth et al, 1997;. Noga,
2010; Wiklund & Dalsgaard, 1998). Oleh karena itu, diagnosis definitif membutuhkan isolasi, budaya dan identifikasi
bakteri pulih dari lesi atau organ internal ikan yang sakit dan / atau dari ikan mati. metode molekuler PCR tersedia
(Tabel 1-5) yang secara khusus mendeteksi A. salmonicida tanpa perlu untuk kultur. Perawatan diperlukan dalam
kasus ikan secara terselubung terinfeksi karena negatif palsu dapat diperoleh. Beberapa penulis menyarankan
menggunakan langkah pra-pengayaan sebelum deteksi PCR atau untuk menggunakan kedua kultur dan deteksi
PCR secara paralel (Byers et al, 2002a;.. Gustafson et al, 1992).

3.1 Isolasi Aeromonas sp. dari ikan yang sakit

Menyadari patogen ikan bakteri memerlukan analisis mereka dalam beberapa organ (terutama ginjal, tetapi juga
limpa, kulit, dan cairan ovaric di betina) dari sejumlah besar ikan hidup (Byers et al, 2002b;. Noga, 2010). Antara 4
dan 10 ikan yang sakit dianjurkan untuk dijadikan sampel untuk mendeteksi patogen, dan antara 10 dan 60 ikan
dalam populasi di mana ada tingkat kematian rendah atau ikan yang tampak sehat (Noga,

2010). Mendeteksi patogen dalam lendir, darah atau feses juga dianjurkan karena sampel ini tidak memerlukan ikan
harus dikorbankan (Beaz-Hidalgo et al, 2008;.. Byers et al, 2002b; Gustafson et al, 1992;. Kulkarni et al ., 2009).
Saat mencari pembawa asimtomatik, ginjal dan usus adalah organ dianjurkan untuk sampel. Kulit dan insang juga
bisa berbudaya, tapi A. salmonicida dapat ditemukan oleh adanya bakteri dominan lainnya (Noga, 2010). negatif
palsu pada ikan pembawa yang umum karena bakteri yang hadir dalam konsentrasi rendah (Byers et al, 2002b;..
Gustafson et al, 1992; Noga, 2010). lebih asimtomatik

www.intechopen.com
Molekul Deteksi dan Karakterisasi furunkulosis dan lain Aeromonas Infeksi
ikan 101

operator dapat dideteksi dengan termasuk baik langkah pra-pengayaan sebelum analisis PCR, sebagai berkomentar
sebelum (Byers et al, 2002b;.. Gustafson et al, 1992) atau dengan menginduksi stres menggunakan pendekatan
bernama 'stres diinduksi furunculosis' (SIF ). Yang terakhir membutuhkan suntikan intraperiotoneal glukokortikoid
(yang menghasilkan imunosupresi) dan kemudian paparan ikan ke heat shock (menaikkan suhu air untuk 18C
selama 14 hari). Ini nikmat proliferasi bakteri dan munculnya tanda-tanda klinis, dan juga akan meningkatkan laju
pemulihan bakteri (Austin & Austin, 2007; Bernoth et al, 1997;. Byers et al, 2002b;. Hiney & Olivier, 1999; Noga,
2010). media kultur non-selektif digunakan untuk isolasi Aeromonas strain termasuk agar trypticase kedelai (TSA),
otak infus jantung agar (BHI) atau Columbia agar darah (Austin & Austin, 2007;. Bernoth et al, 1997; Hiney & Olivier,
1999). Media lebih selektif digunakan untuk pemulihan A. salmonicida termasuk agar furunkulosis (tryptone, ekstrak
ragi, L-tirosin dan NaCl), TSA atau BHI dilengkapi dengan L-tirosin (0,1%) atau TSA dilengkapi dengan Coomassie
biru cerah (0,01%). Metode terakhir ini dirancang untuk mendeteksi strain yang memiliki A-lapisan (atau S-layer),
salah satu protein membran tertua luar terkait dengan Aeromonas infeksi pada ikan, yang terlibat dalam perlawanan
terhadap sistem komplemen host dan memungkinkan bakteri untuk mematuhi protein tuan rumah, memfasilitasi
kolonisasi (Gustafson et al., 1992). The Coomassie biru cerah menempel pada A-layer dan koloni kemudian terlihat
biru sedalam dibandingkan dengan putih atau biru muda negatif A-lapisan koloni (Austin & Austin, 2007; Bernoth et
al., 1997). Namun, metode ini tidak spesifik untuk A. salmonicida, sejak lainnya Aeromonas atau lainnya bakteri ( Pseudomonas,
Pasteurella, Corynebacterium) spesies patogen ikan juga memiliki A-layer dan mampu tumbuh dalam media kultur
ini. Setelah bakteri terisolasi mereka dapat diidentifikasi dengan serologi, fenotipe atau metode molekuler, dua
terakhir sedang dibahas di bagian berikutnya.

4. Identifikasi Aeromonas jenis

Bagian ini menjelaskan karakteristik fenotipik yang didirikan yang membedakan genus
Aeromonas dari genera terkait lainnya, keterbatasan sytems identifikasi biokimia konvensional dan miniatur untuk
membedakan semua spesies, serta panorama baru yang berasal dari penerapan teknik molekuler.

4.1 Identifikasi Fenotipik dengan metode konvensional dan sistem komersial miniatur

Aeromonas spesies fenotip dicirikan sebagai basil Gram-negatif, dengan sitokrom oksidase umumnya positif,
kemampuan untuk tumbuh pada 0% NaCl tetapi tidak sebesar 6%. Mereka tidak memproduksi asam dari inositol,
yang mampu memfermentasi glukosa dan paling tahan terhadap agen vibriostatic O / 129
2,4-diamino-6,7-diisopropil-pteridin-fosfat. genus
Aeromonas dapat dibedakan dari genera erat-terkait lainnya seperti Plesiomonas oleh fermentasi yang inositol dan
ketahanan terhadap agen vibriostatic, dan dari Vibrio oleh kemampuannya untuk tumbuh pada 0% tetapi ketidakmampuan
untuk tumbuh 6% NaCl (Martin-Carnahan & Joseph,
2005). Suhu pertumbuhan optimum untuk Aeromonas spesies 22-37C, kecuali untuk beberapa strain A. salmonicida, yang

22-25C (Martin-Carnahan & Joseph, 2005). Seperti yang ditunjukkan sebelumnya, spesies A. salmonicida termasuk 5

subspesies ( A. salmonicida
subsp. salmonicida, A. salmonicida subsp. achromogenes, A. salmonicida subsp. smithia, SEBUAH.

www.intechopen.com
102 Kesehatan dan Lingkungan di Budidaya

salmonicida subsp. masoucida dan A. salmonicida subsp. pectinolytica), yang hampir mustahil untuk membedakan
menggunakan metode fenotip atau molekul. Semua dari mereka, kecuali subspesies pectinolytica telah terlibat dalam
patologi ikan (Austin & Austin, 2007; Goldschmidt-Clermont et al, 2009;. Han et al, 2011;. Noga, 2010; Wiklund &
Dalsgaard,
1998). Tidak mampu untuk menetapkan strain terlibat dalam penyakit ikan ke salah satu subspesies
masoucida, smithia, achromogenes atau pectinolytica menggunakan karakteristik biokimia, mereka telah disebut
atipikal A. salmonicida untuk membedakan mereka dari khas A. salmonicida, istilah terbatas pada subspesies salmonicida
( Beaz-Hidalgo dkk., 2008; Goodwin & Merry, 2009; Wiklund & Daalsgard 1998). Khas A. salmonicida strain
psychrophilic, non-motil dan menghasilkan pigmen coklat. Sebaliknya, atipikal A. salmonicida adalah kelompok
yang lebih heterogen dengan fitur fenotipe yang berbeda dan biasanya diisolasi dari non-salmonid ikan (Noga,
2010). Di antara atipikal A. salmonicida strain, ada sekelompok strain yang menunjukkan perilaku mesofilik
(tumbuh pada 37C), yang motil dan tidak menghasilkan pigmen dan yang juga telah diidentifikasi dari sampel klinis
manusia (Figueras, 2005; Martnez -Murcia et al., 2005). Beberapa karakteristik yang disebutkan (motilitas dan
perilaku mesofilik) juga sifat-sifat fenotipik A. salmonicida subsp.

pectinolytica ( Pavan et al., 2000). Untuk membedakan mesofilik ini A. salmonicida strain dari spesies mesofilik lain
seperti A. bestiarum atau A. piscicola praktis tidak mungkin bila menggunakan karakteristik biokimia atau urutan gen
16S rRNA (Beaz-Hidalgo et al, 2010;.. Figueras et al, 2011b;. Martnez-Murcia et al, 2005). Namun, spesies ini dapat
dibedakan dengan urutan gen housekeeping rpoD ( Beaz-Hidalgo et al., 2010). Banyak skema biokimia telah diajukan
untuk karakterisasi Aeromonas

spesies, tetapi mereka terutama diskriminasi tiga kelompok fenotipik besar ie A. hydrophilakompleks (termasuk A.
hydrophila, A. bestiarum dan A. salmonicida dan juga yang terakhir A. popoffii),
yang Aeromonas caviae kompleks (termasuk A. caviae, A. Media dan A. eucrenophila) dan Aeromonas sobria
kompleks (termasuk A. sobria, A. veronii, A. jandaei dan A. trota) ( Abbott et al., 1992; 2003; Borrell et al., 1998; Kozi ska
et al., 2002; Martin-Carnahan & Joseph, 2005; Martnez-Murcia et al., 2005). Dalam deskripsi baru Aeromonas spesies,
kriteria wajib mengidentifikasi tes diferensial fenotip dari lain yang sudah ada Aeromonas spesies telah terpenuhi
(Figueras et al., 2011b dan referensi di dalamnya). Namun, tes biokimia mungkin menunjukkan variabilitas
intra-spesies baik karena sifat variabel dari karakter fenotipe bakteri atau karena kurangnya reproduksibilitas tes
ketika mereka dilakukan di bawah kondisi laboratorium yang berbeda, seperti suhu, dll (Figueras et al., 2011b).
identifikasi biokimia pada kenyataannya kurang presisi dan cenderung menghasilkan banyak hasil yang tidak
konsisten dibandingkan dengan yang diperoleh dengan metode molekuler (Beaz-Hidalgo et al, 2010;. Figueras et al,
2011b;. Kozi ska et al., 2002, Kozi ska, 2007; Nawaz et al., 2006). Miniatur sistem identifikasi komersial, seperti API
(20E, 20NE), Vitek, Biolog GN microplates, BBL kristal atau Microscan Berjalan / Jauh juga secara rutin digunakan di
laboratorium ichthyopathology, tetapi tidak selalu mampu mengidentifikasi Aeromonas spesies tepatnya (Figueras,
2005; Joseph & Carnahan, 1994; Kozi ska et al., 2002; Taman et al., 2003; Soler et al., 2003a). sistem yang
disebutkan biasanya cenderung untuk mengidentifikasi semua Aeromonas strain sebagai

A. hydrophila ( Figueras, 2005; Soler et al., 2003b). Beberapa penulis lain juga telah melaporkan hasil buruk dari sistem API
dan perbedaan dengan pengujian tabung tradisional saat mengidentifikasi Aeromonas strain diisolasi dari ikan (Godoy et al,
2010;.. Han et al, 2011; Joseph & Carnahan, 1994; dan referensi di dalamnya). Beberapa metode bahkan mungkin salah
mengidentifikasi Aeromonas
strain sebagai Vibrio spesies (Taman et al, 2003;.. Soler et al, 2003b). Untuk menghindari kebingungan ini,

www.intechopen.com
Molekul Deteksi dan Karakterisasi furunkulosis dan lain Aeromonas Infeksi
ikan 103

Chacon dan rekan dirancang probe tertentu berdasarkan sebuah fragmen dari glycerophospholipid-kolesterol
acyltransferase (GCAT) gen yang mampu berhibridisasi dengan semua Aeromonas spesies tapi tidak dengan strain
dari marga lain (Chacon et al., 2002).

4.1.1 Perbedaan antara metode identifikasi biokimia dan molekuler

Karena karakterisasi fenotipik dapat memberikan hasil yang tidak tepat, salah satu tidak dapat menjamin bahwa strain telah
diidentifikasi dengan benar pada tingkat spesies, terutama untuk genera kompleks seperti
Aeromonas, jika belum diverifikasi kemudian menggunakan metode molekuler diandalkan (Figueras et al., 2011a).
Menggunakan metode biokimia dan genetik secara paralel untuk identifikasi spesies telah memungkinkan perbedaan besar
untuk disorot dan sifat-sifat fenotipik karakteristik yang mungkin bertanggung jawab atas kebingungan untuk ditemukan
(Beaz-Hidalgo et al, 2010;. Kozi ska, 2007; Nawaz et al., 2006).

Dalam penelitian terbaru, Nawaz et al. (2006) menunjukkan bahwa dengan sistem Vitek-GNI 81 strain diisolasi dari
usus ikan lele ( Ictalurus punctatus) dikumpulkan dari wilayah geografis yang berbeda dari Amerika Serikat diidentifikasi
sebagai A. hydrophila ( n = 23), A. trota ( n = 7),
A. veronii ( n = 42), A. caviae ( n = 6) dan A. jandaei ( n = 3). Namun, ketika mereka dievaluasi dengan polimorfisme
panjang fragmen restriksi dari gen 16S rRNA (16S rDNA-RFLP) metode yang diusulkan untuk Aeromonas Identifikasi
(Borrell et al, 1997;.. Figueras et al, 2000), semua 81 strain diidentifikasi sebagai A. veronii ( Nawaz et al., 2006).
Dalam hal ini, kesalahan dalam identifikasi fenotipe yang masking pentingnya bahwa spesies A. veronii mungkin
memiliki di lele patologi.

Dalam studi terbaru yang lain, Beaz-Hidalgo et al. (2010) digunakan fenotipik dan metode genetik (16S rDNA-RFLP
dan sequencing dari rpoD gen) untuk menguji ulang 119 Aeromonas strain pulih dari ikan yang sakit dan kerang yang
telah diidentifikasi biokimia di laboratorium ichthyopathology rutin. Mereka menemukan bahwa, dari strain dianggap
milik genus Aeromonas menggunakan metode biokimia, 24,4% (29/119) tidak termasuk bila menggunakan metode
identifikasi PCR genus spesifik berdasarkan gen GCAT, yang spesifik untuk genus Aeromonas seperti sebelumnya
dijelaskan (Chacon et al., 2002). Sequencing gen 16S rRNA diidentifikasi strain tersebut sebagai milik genera Pseudomonas
dan Vibrio. Mengingat hanya 86 Aeromonas diisolasi dari ikan yang sakit, spesies diakui oleh metode identifikasi
biokimia adalah: A. hydrophila ( n = 63), A. salmonicida ( n = 12), A. sobria

(N = 2), A. veronii ( n = 2), A. Media ( n = 1), A. trota ( n = 1), A. bestiarum ( n = 1) dan 4 strain tidak bisa ditugaskan untuk
setiap spesies yang dikenal ( Aeromonas sp.). Namun, 66,3% (57/86) dari mereka telah diidentifikasi dengan benar fenotip
bila dibandingkan dengan hasil genetik yang menunjukkan bahwa urutan prevalensi adalah sebagai berikut: A. sobria 25,6%
(22/86), A. hydrophila
17,4% (25/86), A. salmonicida 17,4% (15/86), A. bestiarum 16,3% (14/86), A. piscicola 11,6% (10/86), A. Media 7%
(6/86), A. eucrenophila 2,3% (2/86), A. encheleia 1,2% (1/86) dan A. tecta
1,2% (1/86) (Beaz-Hidalgo et al., 2010). Alunan spesies A. veronii ( n = 2) dan A. trota
(N = 1) karena itu milik spesies yang sama sekali berbeda. Misalnya, dua A. veronii
milik A. sobria dan A. piscicola, sementara A. trota adalah A. sobria dan 4 strain
Aeromonas sp. milik A. sobria ( 2 strain), A. Media dan A. bestiarum. Selanjutnya, identifikasi genetik mengungkapkan
bahwa 50 dari 64 fenotip diidentifikasi A. hydrophila
strain tidak sebenarnya milik 8 lainnya Aeromonas spesies, termasuk 17 strain milik A. sobria dan 6 strain untuk spesies
baru A. piscicola ( Beaz-Hidalgo et al, 2009.; 2010). Penelitian ini jelas disorot sekali lagi bahwa ada kepentingan
palsu dikaitkan dengan spesies SEBUAH.

www.intechopen.com
104 Kesehatan dan Lingkungan di Budidaya

hydrophila sebagai yang paling lazim (Beaz-Hidalgo et al, 2010;. Figueras, 2005; Figueras et al, 2011b;.. Soler et al,
2003b). Mengenai A. salmonicida, 85,7% (12/14) dari strain yang menunjukkan untuk menjadi psycrophilic, non motil
dan pigmen produsen telah diidentifikasi dengan benar. Dua strain salah diidentifikasi fenotip sebagai A. hydrophila menunjukkan
perilaku mesofilik (yaitu yang motil dan tidak menghasilkan pigmen). Melihat yang paling umum Aeromonas spesies
oleh tuan rumah ikan, ditemukan bahwa A. sobria ( 15/22 strain) dan A. hydrophila ( 8/15 strain) lebih terkait dengan
trout, A. salmonicida dengan Atlantic salmon dan turbot (6/15 strain masing-masing) dan A. piscicola ( 5/10 strain) dan A.
bestiarum ( 8/14 strain) dengan Atlantic salmon (Beaz-Hidalgo et al., 2010). Satu-satunya strain dari spesies A. tecta diisolasi
dari bogue

(Chondrostoma comun), ini menjadi laporan pertama dalam jenis ikan dan laporan kedua dari ikan karena deskripsi
baru-baru ini dari trout pada tahun 2008 (Beaz-Hidalgo et al., 2010 dan referensi di dalamnya).

Hasil ini memberikan bukti dari keragaman yang lebih besar dari Aeromonas spesies yang terlibat dalam patologi ikan daripada
pikiran pertama dan bahwa spesies A. salmonicida atau A. hydrophila tidak yang paling lazim.

Meskipun keterbatasan dikenal metode identifikasi fenotipe, mereka masih digunakan di laboratorium
ichthyopathology, yang memberikan kontribusi untuk meremehkan keragaman sejati Aeromonas spesies yang
berhubungan dengan ikan yang sakit (Beaz-Hidalgo et al., 2010).

4.2 Identifikasi Molekuler

Bagian ini menjelaskan metode molekuler yang disebutkan di atas digunakan untuk mengidentifikasi
Aeromonas dalam patologi ikan (yaitu 16S rDNA-RFLP, urutan gen 16S rRNA atau gen rumah tangga lainnya) serta
berbagai deteksi dan identifikasi metode PCR yang menargetkan khas dan atipikal A. salmonicida.

4.2.1 16S rRNA dan gen housekeeping

Gen 16S rRNA sangat penting untuk bakteri dan telah digunakan sebagai penanda molekuler spesifik untuk identifikasi
mereka (Alperi et al, 2008 dan referensi di dalamnya;.. Martnez-Murcia et al,
1992). Metode RFLP berdasarkan gen ini dikembangkan oleh kelompok kami untuk membedakan semua Aeromonas spesies
dijelaskan sampai dengan 2000 (Borrel et al, 1997;.. Figueras et al, 2000) dan telah terbukti berguna untuk penulis yang
berbeda yang telah mengidentifikasi strain pulih dari ikan yang sakit (Beaz-Hidalgo et al, 2010;. Kozi ska et al., 2002;
Kozi ska, 2007; Nam & Yoh, 2007; Nawaz et al., 2006; Soriano-Vargas et al., 2010). Namun, metode ini tidak dapat
membedakan spesies yang terkait erat yang memiliki urutan gen 16S rRNA sama atau hampir sama karena
menghasilkan pola RFLP yang sama untuk mereka semua. Hal ini ditunjukkan dalam kasus spesies baru A. piscicola, yang
memiliki pola RFLP sama dengan A. salmonicida dan

A. bestiarum yang 16S rRNA urutan berbagi 99,8-100% kesamaan (Beaz-Hidalgo et al, 2010;. Figueras et al, 2011b.). Hal
yang sama berlaku dengan A. caviae dan A. aquariorum, yang menunjukkan
99,8% kesamaan dan pola RFLP yang sama (Figueras et al., 2009, 2011b). Yang terakhir, yaitu A. aquariorum, diisolasi
berasal dari ikan hias, namun belum sejauh ini telah diisolasi lagi dari ikan lainnya. Metode 16S rDNA-RFLP juga
tidak berguna untuk 8% dari
Aeromonas strain yang menunjukkan mutasi pada gen 16S rRNA di wilayah yang ditargetkan dari endonuklease yang
digunakan, karena ini menghasilkan pola yang berbeda dari yang diharapkan untuk spesies (Alperi et al., 2008).

www.intechopen.com
Molekul Deteksi dan Karakterisasi furunkulosis dan lain Aeromonas Infeksi
ikan 105

Dalam genus Aeromonas urutan gen 16S rRNA tidak alat yang sangat berguna untuk identifikasi karena hanya
beberapa spesies yang jauh dapat dibedakan dengan baik, tetapi berguna untuk mengkonfirmasikan apakah strain
bawah analisis milik genus (Figueras et al, 2011b.; Han et al., 2011).

Sebagai alat pelengkap untuk 16S rDNA-RFLP untuk mengidentifikasi semua Aeromonas spesies, kami telah
memperkenalkan penggunaan gen housekeeping yang menyusun protein penting untuk kelangsungan hidup bakteri
(Figueras et al, 2011b;.. Soler et al, 2004; Yez et al, 2003.). Pada kenyataannya, analisis 5 gen rumah tangga
adalah salah satu metode yang digunakan dalam deskripsi taksa bakteri baru yang telah direkomendasikan oleh AD
hoc komite untuk reevaluasi definisi spesies dalam bakteriologi (Stackebrandt et al., 2002). gen rumah tangga
pertama kali dijelaskan untuk identifikasi Aeromonas adalah gyrB gen, yang codifies untuk subunit B dari girase DNA
(Yez et al., 2003) dan rpoD gen, yang mengkode 70 faktor dari RNA polimerase (Soler et al., 2004). Saat ini biaya
sekuensing telah jatuh jauh yang jauh lebih murah untuk menggunakan layanan eksternal yang memberikan urutan
dari DNA diekstraksi diberikan daripada melakukan sequencing di laboratorium sendiri. Oleh karena itu kami
sarankan sekuensing rpoD atau gyrB gen untuk menentukan identitas dari strain terisolasi karena merupakan
pendekatan identifikasi lebih cepat dan lebih dapat diandalkan daripada 16S rDNA-RFLP (Figueras et al., 2011b).
Namun, salah tafsir masih mungkin terjadi ketika membandingkan urutan diperoleh dengan mereka tersedia untuk
semua spesies dari genus yang digelar di GenBank, terutama jika urutan terlalu pendek atau berkualitas buruk.
Selanjutnya database juga berisi strain salah diberi label, sehingga perbandingan harus selalu dibuat dengan urutan
dari jenis strain (Figueras et al., 2011b). Kami juga merekomendasikan untuk deposit urutan baru di GenBank untuk
perluasan lebih lanjut dari database yang ada. Gambar 1 menggambarkan pohon filogenetik dibangun dengan rpoD urutan
dari strain tipe 25 spesies yang termasuk pada saat genus dan beberapa Aeromonas strain diisolasi dari ikan yang
sakit beragam dipelajari di laboratorium kami. gen rumah tangga lain yang telah digunakan dalam Aeromonas adalah
rpoB, yang codifies untuk subunit dari polimerase RNA (Kupfer et al., 2006), dnaJ, yang codifies protein thermal
shock (Nhung et al., 2007), recA, yang codifies protein yang terlibat dalam perbaikan DNA (Sepe et al., 2008) dan cpn60,
yang codifies pendamping jenis Cpn60 saya yang terlibat dalam perakitan protein (Minana-Galbis et al., 2009).
Sebuah Analisis filogenetik multilokus (MLPA) dari genus Aeromonas baru-baru ini dibentuk dengan menggunakan
informasi bersambung berasal dari urutan 7 gen housekeeping: gyrB, rpoD, recA, dnaJ, gyrA, dnaX, dan atpD ( Martnez-Murcia
et al., 2011). Yang dihasilkan pohon filogenetik (4705 bp) setuju dengan taksonomi genus seperti yang diakui
sampai saat ini, menunjukkan bahwa MLPA adalah cara yang kuat mengidentifikasi tegas semua spesies. The
MLPA juga disebut multilokus Analisis Urutan (MLSA) oleh beberapa penulis, yang berasal dari nama asli multilokus
Urutan Typing (MLST) (Martnez-Murcia et al., 2011). Saat ini, skema MLST diakui menjadi cara terbaik untuk
membangun hubungan epidemiologi antara isolat menggunakan urutan fragmen internal beberapa gen rumah
tangga (sekitar 450-500 bp dari 7 gen). Untuk setiap gen urutan dari strain yang berbeda dibandingkan dan
masing-masing urutan yang unik diberikan sebuah nomor tertentu.

www.intechopen.com
106 Kesehatan dan Lingkungan di Budidaya

Gambar. 1. Neighbor-bergabung pohon filogenetik berdasarkan rpoD sekuens gen yang menunjukkan hubungan dari 26 Aeromonas
diisolasi dari ikan sakit beragam (dalam huruf tebal) (Beaz-

www.intechopen.com
Molekul Deteksi dan Karakterisasi furunkulosis dan lain Aeromonas Infeksi
ikan 107

Hidalgo et al., 2010) dengan 25 spesies yang termasuk dalam genus saat. Nama-nama ilmiah dari spesies ikan:
salmon Atlantik ( Salmo salar), rainbow trout ( mykis Oncorhychus),
lamprey ( Petromyzum Marinus), bogue ( Boops boops), ikan mas ( Carasius auratus), turbot ( Scopthalmus maximus). *SEBUAH.
hydrophila subsp. dhakensis dianggap sinonim dari spesies
A. aquariorum ( Figueras et al., 2011b).

Pertama Aeromonas akses terbuka skema MLST (http://pubmlst.org/aeromonas) baru-baru ini dibangun (Martino et
al., 2011) dan lain yang termasuk satu set 7 gen housekeeping (Lamy, 2011) dipresentasikan pada Simposium
Internasional ke-10 di Aeromonas dan
Plesiomonas. Terbuka akses MLST menggunakan 6 gen ( gyrB, Grol, gltA, metG, PPSA dan recA, 3084 nt) dan
diaplikasikan total 96 referensi dan bidang strain yang termasuk proporsi tinggi strain, 79,2% (76/96) yang diperoleh
dari dikenal air tawar yang sakit dan spesies ikan laut sebagian besar dikumpulkan di wilayah utara-timur Italia (
Martino et al., 2011). Pohon filogenetik dibangun dengan urutan bersambung dikelompokkan strain 76 ikan, dalam
urutan prevalensi, di A. veronii ( n = 28), A. sobria ( n = 25), A. salmonicida ( n = 6), A. bestiarum

(N = 6), SEBUAH. allosaccharophila ( n = 4), A. Media ( n = 4), A. hydrophila ( n = 2) dan A. encheleia ( n = 1). Strain dari
spesies yang berlaku A. veronii dan A. sobria berasal dari 11 dan 6 spesies ikan, masing-masing. Namun, sebagian
besar strain A. veronii berasal dari ikan lele (7 strain milik 7 ST yang berbeda) diikuti oleh ikan mas (6 strain milik 6 ST
yang berbeda) sementara
A. sobria berlaku di trout (13 strain milik 12 ST yang berbeda).

Penelitian terbaru telah menggunakan metode yang disebutkan di atas molekul (16S rDNA-RFLP dan / atau gen
housekeeping rpoD atau gyrB) dan telah mengidentifikasi A. salmonicida subsp.
salmonicida di bertani charr Arktik ( Salvelinus alpinus) di Austria (Goldschmit-Clermont et al.,
2009), A. bestiarum di ikan mas bertani di Meksiko (Soriano-Vargas et al., 2010), A. sobria dari wabah yang terjadi di
tilapias di Cina (Li & Cai, 2011), A. veronii dari lele di Amerika Serikat (Nawaz et al., 2006) dan studi yang dilakukan
oleh Kozi ska et al. (2002), Kozi ska (2007) dan Beaz-Hidalgo et al. (2010) yang ditandai banyak Aeromonas spesies
diisolasi dari ikan yang sakit di Polandia dan di Spanyol masing-masing. Juni et al. (2010), menggunakan PCR
multipleks (m-PCR) dan gen 16S rRNA, diidentifikasi A. hydrophila sebagai agen yang bertanggung jawab untuk wabah
yang menewaskan 50% dari populasi ternak dari Loach Cyprinid Korea ( Misgurnus anguillicaudatus). Nam & Yoh
(2007) menggunakan 16S rDNA-RFLP menemukan bahwa 84% (252/300) dari isolat yang diperoleh dari ikan yang
sakit milik spesies A. sobria, dan juga menemukan lainnya Aeromonas spesies dalam yaitu prevalensi yang lebih
rendah A. encheleia ( 9,3%), A. salmonicida ( 3,7%) dan A. bestiarum ( 3%). Menggunakan beberapa gen rumah tangga
( gyrB, rpoD, dnaJ, recA) juga memungkinkan Han et al. (2011) untuk mengidentifikasi A. salmonicida dari lessions
ulkus dan perdarahan di rockfish hitam ( Sebastes Schlegeli) di Korea. Para penulis ini juga sequencing vapA gen
(pengkodean A-protein, subunit dari A-layer atau S-layer) dan menemukan bahwa urutan dari terisolasi A. salmonicida strain
berkerumun dengan A. salmonicida subsp. masoucida di pohon filogenetik tetangga-bergabung yang termasuk urutan
atipikal lainnya A. salmonicida diisolasi dari ikan dan dari subspesies

salmonicida, masoucida dan smithia ( Han et al., 2011). Namun, ini dan penulis lain (Lund & Mikkelsen, 2004)
menyatakan bahwa banyak strain atipikal tidak mengelompok dengan salah satu subspsepecies dari A. salmonicida saat
menggunakan vapA urutan, dan mempertimbangkan gen ini tidak berguna dalam delineasi A. salmonicida ke tingkat
subspesies.

Pridgeon et al. (2011) diurutkan 16S-23S rDNA wilayah intergenic spacer dan 3 gen rumah tangga ( cpn60, gyrB dan rpoD),
untuk mengidentifikasi 6 isolat sebagai A. hydrophila dari

www.intechopen.com
108 Kesehatan dan Lingkungan di Budidaya

lele (yang 3 dikaitkan dengan wabah) dan penindasan digunakan subtraktif hibridisasi untuk menyelidiki perbedaan
genom antara yang sangat virulen dan strain kurang virulen, dan mereka menemukan 64 urutan yang berbeda.
Dengan melakukan reaksi PCR spesifik menargetkan urutan ini, mereka memutuskan bahwa 3 dari mereka yang
dikodekan sebuah XAUC_13870 protein hipotetis, sebuah methyltranferase diduga dan racun protein struktural RtxA
yang spesifik untuk strain virulen. PCR yang dirancang khusus untuk 3 urutan ini selanjutnya diuji di lain 7 isolat
lapangan (6 dari mereka diperoleh dari ikan) yang virulensi yang sebelumnya telah ditentukan oleh in vivo eksperimen
di lele. Kedua urutan pengkodean XAUC_13870 protein hipotetis dan methyltranferase diduga hadir dalam 4 yang
sangat virulen A. hydrophila strain namun absen di 5 strain kurang ganas, menunjukkan bahwa dua urutan ini
mungkin faktor virulensi baru dan penanda molekuler karena itu berguna untuk mengidentifikasi isolat yang sangat
virulen A. hydrophila.

4.2.2 metode PCR untuk deteksi A. salmonicida dari jaringan ikan dan air

metode molekuler PCR yang cepat, masuk akal dan spesifik dan karena itu telah dikembangkan dan diterapkan
untuk mendeteksi khas dan atipikal A. salmonicida strain memproduksi penyakit ikan (Tabel 1-5). Metode yang
bergantung pada gen 16S rRNA belum dipertimbangkan, karena seperti berkomentar atas gen ini tidak
memungkinkan pemisahan yang benar A. salmonicida dari spesies yang terkait erat A. bestiarum dan A. piscicola karena
mereka memiliki 16S rRNA urutan gen hampir identik.

Tabel 1 menjelaskan secara kronologis metode PCR yang paling relevan. Pada tahun 1992, Gustafson et al. dan
Hiney et al. primer dirancang menargetkan 2 daerah tertentu dari A. salmonicida, yang kemudian digunakan oleh
beberapa penulis untuk mendeteksi patogen dalam air dan ikan sampel (Tabel 1, 2). Metode yang dijelaskan oleh
Gustafson et al. (1992) ditargetkan vapA gen (yang mengkode A-protein dari A-lapisan, sebagai berkomentar
sebelumnya) dari A. salmonicida. Para penulis divalidasi metode PCR dengan 54 A. salmonicida strain (28 khas dan 26
atipikal) dan hanya menemukan satu strain negatif yang juga tidak mampu mengekspresikan protein membentuk
A-layer. Para penulis menyarankan bahwa vapA gen dalam strain ini memiliki mutasi yang mempengaruhi baik
amplifikasi dan ekspresi protein. Namun, mereka juga menemukan bahwa 13 PCR strain positif tidak mengungkapkan
protein (negatif dengan Western Blot) menunjukkan bahwa pada mereka strain mutasi dalam urutan vapA gen hanya
mempengaruhi ekspresi tapi tidak amplifikasi PCR. Analisis PCR lanjut dengan primer meliputi seluruh gen
mengungkapkan bahwa strain tidak mengekspresikan A-lapisan memiliki amplikon dari berat molekul lebih rendah
dibandingkan dengan strain mengekspresikan protein, menunjukkan bahwa mutasi adalah penghapusan. Sensitivitas
dari metode PCR juga divalidasi menggunakan sampel artifisial yang terinfeksi yang disusun oleh inokulasi strain A.
salmonicida dalam air tangki ikan dan menjadi homogenat jaringan ikan dan kotoran rainbow trout. Sensitivitas dari
deteksi langsung dalam jaringan ikan dari 10 CFU / mg sedangkan pada suspensi kultur murni dan air itu 1 CFU / ml
(Tabel 1). Metode ini selanjutnya diuji menggunakan jaringan ikan dan sampel feses dari 25 ikan mati yang terinfeksi
secara alami dan dari 25 tersangka ikan pembawa, mengevaluasi secara paralel hasil PCR dilakukan baik sebelum
dan setelah pengayaan inkubasi langkah dalam kaldu nutrisi. Hasil untuk semua 25 ikan mati yang terinfeksi positif
dengan kedua metodologi (dengan dan tanpa pra-pengayaan). Namun, 5 dari 25 ikan pembawa hanya positif setelah
pra-pengayaan. Selanjutnya, sampel air yang diambil dari 10

www.intechopen.com
Molekul Deteksi dan Karakterisasi furunkulosis dan lain Aeromonas Infeksi
ikan 109

Referensi wilayah target atau N dari Sebagai strain Jenis sampel Hasil dan / atau kesimpulan
gen (bp) dievaluasi

Gustafson et al. vapA ( 421 bp) coding 28 khas ( Pantat), Pengenceran kultur semua khas Pantat dan atipikal Sebagai

(1992) untuk protein A (A atau dan 26 atipikal murni. Eksperimental strain positif kecuali 1 khas Pantat ketegangan.
lapisan S). Sebagai. diinokulasi ginjal, limpa batas deteksi adalah: 1 CFU dalam kultur
dan tinja homogenates murni dan dalam 100 ml air diinokulasi dan
dan sampel air steril. 25 10 CFU / mg dalam semua jaringan. Semua
ikan mati yang terinfeksi, sampel feses dan jaringan dari 25 yang
25 yang diduga ikan terinfeksi dan 20 operator ikan yang positif,
pembawa dan tangki air 5 ikan operator hanya positif setelah langkah
mereka. pengayaan, oleh karena itu langkah ini
diperlukan untuk menghilangkan negatif
palsu.

Hiney et al. fragmen DNA (423-bp) 25 Sebagai. Pengenceran biakan Semua Sebagai positif oleh dot blot
(1992) diakui oleh Southern blot murni. hibridisasi tanpa crossreaction dengan
dengan fungsi yang tidak salah satu 14
diketahui 1. Aeromonas strain milik 4 spesies yang
berbeda lainnya. batas deteksi untuk uji PCR
dari kultur murni adalah 2,4 sel.

Miyata et al. DNA RAPD fragmen (512 bp) 10 Pantat, 2 Sebagai, 1 Pengenceran biakan Metode ini mendeteksi hanya strain khas (10
(1996) dari fungsi yang tidak asm dan 4 atipikal Sebagai. murni. Ginjal dari 15 Pantat positif) karena 2 Sebagai, 1 asm dan 4
diketahui 2. ikan eksperimental strain atipikal yang diuji negatif 3.
terinfeksi.

Batas deteksi dalam kultur murni adalah


10 fg DNA bakteri.

Reaksi positif diperoleh dari sampel ginjal


dari semua ikan eksperimental terinfeksi.

Hie et al. DNA plasmid fragmen Pantat2 Pantat, 1 Sebagai dan 1 Pengenceran biakan murni Semua strain positif kecuali hanya asm diuji.
(1997) dan Asm. dari 4 strain Pantat, 1 dari asm Produk PCR dikonfirmasi oleh hibridisasi.
Sebagai fungsi yang tidak dan 1 dari Sebagai. batas deteksi di diinokulasi ginjal dan
diketahui (710 bp). insang homogenates adalah 10 4 CFU / 100
Eksperimental diinokulasi ml. Ginjal dan sampel insang dari
ginjal dan insang diam-diam terinfeksi Atlantik salmon
homogenates. Ginjal dan negatif dengan PCR dan budaya.
insang dari 109 terselubung
terinfeksi salmon Atlantik.
Ginjal dari 88 induk liar
Atlantik salmon.
Pantat tidak terdeteksi di ginjal dari induk
salmon dengan PCR tapi 6/88 positif oleh
budaya. Namun, PCR berdasarkan gen
16S rRNA dari Sebagai positif untuk 29 dari
88 sampel ginjal dianalisis 4.

Tabel 1. Dikembangkan metode PCR untuk deteksi A. salmonicida dari berbagai terinfeksi jaringan ikan dan air.

www.intechopen.com
110 Kesehatan dan Lingkungan di Budidaya

Referensi wilayah target atau N dari Sebagai strain Jenis sampel Hasil dan / atau kesimpulan
gen (bp) dievaluasi

Oakey et al. 5 fragmen RAPD fungsi 10 Pantat, 6 Sebagai, 4 Pengenceran biakan Semua 5 probe Southern blot
(1998) yang tidak diketahui asm, 1 Pantat murni. berhibridisasi dengan Pantat dan dengan
digunakan sebagai probe beberapa subspesies, karena itu metode
dalam percobaan Southern ini tidak membedakan khas dari atipikal Sebagai
blot. strain.

Nilsson et al. fragmen DNA (749 pb) dari 29 atipikal Sebagai, 24 khas Pengenceran biakan PCR ini membedakan sebagian besar
(2006) urutan penyisipan (ISasa4) ( Pantat) murni. atipikal Sebagai ( 27/29 positif) dari khas Sebagai
dari Tapa gen yang ( 24/24 negatif. Batas deteksi adalah sekitar.
mengkode protein dari pili 250 fg template.
tipe IV.

Beaz-Hidalgo et al. fstA ( 422 bp) 66 Pantat, 2 Sebagai, 1 Pengenceran kultur bakteri Semua Sebagai strain yang diuji positif,
(2008) pengkodean asm murni dan campuran. sehingga tidak membedakan khas dari
siderophore reseptor Eksperimental diinokulasi strain atipikal. batas deteksi dari kultur
besi. (ginjal dan kulit) homogenat murni adalah 20-200 sel / ml dan dari kultur
jaringan, lendir dan darah. campuran 60-600 sel / ml. Yang terakhir
Lendir dan darah dari 31 adalah kira-kira. batas deteksi yang sama
salmon liar. untuk 100 mg dari jaringan yang terinfeksi
dengan kultur murni dan campuran. batas
deteksi dari lendir adalah 10 2

sel / ml dan dalam darah 10 5


sel / ml. 6/31 sampel salmon liar yang
positif.

gyrB ( 760 bp) pengkodean Pengenceran biakan Itu gyrB primer diperkuat ke-69 Sebagai strain
subunit B dari girase DNA. murni. tetapi menunjukkan kurang sensitivitas bila
dibandingkan dengan fstA primer, sehingga
tidak ada eksperimen lain untuk gyrB dilakukan.

Seperti, A. salmonicida; Ass, A. salmonicida subsp. salmonicida; Asa, A. salmonicida subps. achromogenes; Asm, A. salmonicida subsp.
masoucida; CFU, koloni membentuk unit.
1 Sebuah analisis Ledakan kami dilakukan mengungkapkan bahwa saham 99% kesamaan dengan gen MOBA ( nomor aksesi: AJ508382) yang

merupakan protein mobilisasi 1263 bp lokal di PAsa1 plasmid dari A. salmonicida subsp. salmonicida ( saring JF2267). 2 Urutan fragmen ini tidak
tersedia untuk perbandingan. 3 Metode ini telah digunakan dalam beberapa penelitian (Tabel 2) untuk membedakan strain atipikal berdasarkan reaksi
PCR negatif yang diperoleh dengan metode ini. 4 Kami menemukan bahwa primer 16S rRNA ini tidak membedakan A. salmonicida dari A. bestiarum dan
A. piscicola.

Tabel 1. Dikembangkan metode PCR untuk deteksi A. salmonicida dari berbagai terinfeksi jaringan ikan dan air.
(Lanjutan)

www.intechopen.com
Molekul Deteksi dan Karakterisasi furunkulosis dan lain Aeromonas Infeksi
ikan 111

tank ikan pembawa diduga hanya diselidiki menggunakan langkah pengayaan dan semua yang positif. Gustafson et al.
(1992) menyimpulkan bahwa langkah pengayaan meningkatkan sensitivitas dan menghindari kemungkinan hasil negatif
palsu (Tabel 1).

Hiney dan rekan kerja (1992) menemukan sebuah fragmen DNA tampaknya tertentu (423 bp) dari sebuah
perpustakaan DNA genomik strain 7222V dari A. salmonicida dengan hibridisasi diferensial dengan strain A.
hydrophila. Mereka menguji kekhususan fragmen ini dengan dot blot hibridisasi menggunakan 25 A. salmonicida strain,
lainnya Aeromonas spesies (8 A. hydrophila, 3 A. caviae, 2 A. sobria, 1 A. Media) dan 11 strain milik marga lain. Hasil
menunjukkan bahwa probe hanya bereaksi dengan A. salmonicida. Fragmen DNA ini diisolasi, diurutkan dan PCR
spesifik dirancang memperoleh sensitivitas 2,4 sel-sel A. salmonicida dalam budaya murni (Tabel 1). Meskipun
penulis sequencing fragmen diperkuat, mereka tidak mampu, pada waktu itu, untuk menentukan identitas urutan ini.
Dalam pencarian untuk mendirikan identitasnya, sekarang bahwa genom lengkap A. salmonicida diketahui dan yang
lebih urutan tersedia untuk perbandingan di GenBank, kami menemukan bahwa saham 99% kemiripan dengan
urutan gen MOBA ( nomor akses: AJ508382), yang merupakan protein mobilisasi 1263 bp lokal di PAsa1 plasmid
dari A. salmonicida ( Fehr et al.,

2006). Metode PCR yang dirancang oleh Hiney et al. (1992) telah digunakan dan dievaluasi dalam studi posterior yang
tercantum dalam Tabel 2.

Pada tahun 1996, Miyata et al. sequencing fragmen DNA (512 bp) dari fungsi yang tidak diketahui diperoleh dari
amplifikasi RAPD dari A. salmonicida dan mengembangkan PCR untuk deteksi dini furunkulosis, mengevaluasi
metode dengan beberapa strain khas dan atipikal A. salmonicida dan eksperimental terinfeksi ikan. Mereka
menemukan amplifikasi hanya untuk 10 A. salmonicida subsp. salmonicida strain (Tabel 1). Metode ini bisa karena
dianggap khusus untuk mendeteksi hanya furunculosis khas atau khas A. salmonicida strain (yaitu mereka yang
termasuk hanya untuk subsp tersebut. salmonicida). assay itu juga positif dalam ginjal dari 15 percobaan yang
terinfeksi Amago salmon ( Oncorhynchus rhodurus subsp. macrostomus). Sejauh ini, urutan fragmen ini belum
disimpan di GenBank dan karena target ini juga telah digunakan dalam beberapa penelitian kemudian (Tabel 2),
penting untuk mendapatkan urutan untuk mengetahui fungsinya.

Penelitian lain yang dilakukan oleh Hie et al. (1997) dan Oakey et al. (1998) juga mengembangkan PCR untuk
menargetkan fragmen DNA dari A. salmonicida fungsi yang tidak diketahui, namun metode ini tidak dapat
membedakan subspesies. Untuk pengetahuan kita, protokol ini belum digunakan sejak dalam studi kemudian dan
hasil utama dari dua studi dirangkum dalam Tabel 1.

Dua metode PCR baru dijelaskan dalam dekade pertama abad ke-21 (Beaz-Hidalgo et al, 2008;.. Nilsson et al,
2006). Salah satu Nilsson dan rekan kerja (2006) didasarkan pada kehadiran elemen penyisipan (ISE) di Tapa gen
(encoding protein pili subunit dari pili tipe IV) dari A. salmonicida, yang mereka namakan ISAsa4. Mereka
menunjukkan bahwa ISAsa4 hadir di beberapa salinan (> 30) tetapi hanya dalam strain atipikal A. salmonicida, karena
tidak ada 24 strain khas diuji PCR positif, sedangkan 27/29 strain atipikal adalah (Tabel 1). Identitas 53 strain khas
dan atipikal dikonfirmasi oleh amplifikasi positif mereka dengan menggunakan metode PCR dijelaskan oleh
Gustafson et al. (1992) (yang mendeteksi baik khas dan atipikal strain) dan oleh non-amplifikasi diperoleh untuk 29
strain atipikal menggunakan metode yang dijelaskan oleh Miyata et al. (1996) (yang hanya mendeteksi strain khas

yaitu A. salmonicida subsp. salmonicida). Atas dasar hasil mereka, Nilsson dan rekan kerja

www.intechopen.com
112 Kesehatan dan Lingkungan di Budidaya

(2006) mengusulkan metode ini berguna untuk membedakan strain yang paling atipikal. Selain itu, dengan blot
Southern, menggunakan ISasa4 sebagai probe, dan setelah sekuensing Tapa gen, penulis juga mengamati bahwa
strain atipikal menunjukkan heterogenitas yang tinggi di wilayah ini / gen dibandingkan dengan strain khas. Hasil
yang sama diperoleh sebelumnya ketika urutan asam amino dari vapA gen dari strain yang khas dan atipikal
dibandingkan, karena urutan identik ditemukan di strain yang khas, yang kontras dengan variabilitas yang signifikan
diamati dalam strain atipikal (Lund & Mikkelsen,

2004). Kami percaya bahwa variabilitas tinggi ini bisa menunjukkan bahwa kelompok strain atipikal mungkin sebenarnya tidak hanya
merangkul subspesies lain A. salmonicida tetapi juga lainnya salah diidentifikasi
Aeromonas jenis. Metode PCR ini diarahkan pada atipikal A. salmonicida strain digunakan baru-baru ini oleh Godoy et al.
(2010) untuk karakteristik strain diisolasi dari air tawar salmon Atlantik ( Salmo salar) dengan hasil yang sukses (Tabel 2),
yang akan kita bahas nanti. Metode yang dikembangkan oleh Beaz-Hidalgo et al. (2008) menargetkan fragmen 422 bp
dari fstA
gen A. salmonicida yang mengkode reseptor siderophore dan divalidasi dengan menguji 69 strain dari spesies ini
menggunakan metode Gustafson secara paralel. Semua dari 69 strain menghasilkan amplikon yang diharapkan dari fstA
gen, meskipun 4 strain tidak memperkuat dengan metode yang dirancang oleh Gustafson et al. (1992). Ini mungkin
karena adanya mutasi pada urutan DNA target dari vapA gen sebagai Gustafson et al. (1992) dibahas. Batas deteksi fstA
PCR di pengenceran kultur murni dan campuran ( A. salmonicida, Vibrio anguillarum dan A. hydrophila) adalah dalam
kisaran 20-600 sel / ml. Dalam terinfeksi artifisial ginjal dan kulit sampel kisaran relatif sama, 60-600 sel per 100mg
jaringan (Tabel 1). PCR yang diusulkan untuk A. salmonicida dianggap sebagai alat diagnostik non-destruktif bila
digunakan dalam darah atau lendir. batas deteksi lendir eksperimental terinfeksi dan sampel darah adalah 2,5 x 10 2 dan
1,5 x 10 5 CFU / ml masing-masing. Bakteri hadir dalam darah diunggulkan hanya terdeteksi pada konsentrasi tinggi
(1,5 x 10 5 CFU / ml), yang mungkin karena gangguan dengan heparin atau komponen darah yang tidak diketahui lain
yang bersaing dengan DNA bakteri dalam amplifikasi PCR (Beaz-Hidalgo et al., 2008). Masalah ini dilaporkan oleh
penulis lain sebelumnya dan bisa mungkin dihindari termasuk langkah pra-pengayaan (Byers et al, 2002b..;
Gustafson et al, 1992) (Hie et al, 1997 dan referensi di dalamnya.) atau mengevaluasi kualitas DNA diekstraksi
untuk kehadiran inhibitor (Mooney et al., 1995). Namun, tidak satupun dari pendekatan ini diuji dengan Beaz-Hidalgo
et al. (2008). Dalam mencari kemungkinan ikan pembawa asimtomatik, yang fstA protokol adalah lebih diuji dalam
lendir dan darah dari 31 salmon liar yang tidak menunjukkan tanda-tanda furunkulosis, memperoleh 4 A. salmonicida sampel
PCR positif dari lendir dan 6 darah pulih dari 6 (19%) dari 31 salmon diuji (Tabel 1). Di sisi lain, metode kultur hanya
mampu mengisolasi A. salmonicida dari satu sampel darah, menunjukkan bahwa metode PCR memiliki sensitivitas
yang lebih tinggi. Disimpulkan bahwa metode cepat, spesifik dan sensitif terhadap A. salmonicida di kedua terinfeksi
dan tanpa gejala ikan pembawa (Beaz-Hidalgo et al., 2008). Aplikasi mungkin untuk lendir dan darah, yang dapat
diperoleh tanpa perlu melakukan necropsies atau mengorbankan ikan, adalah diferensial dan karakteristik
menguntungkan atas metode molekuler lainnya yang dirancang untuk mendeteksi patogen hanya dari organ internal.
Beaz-Hidalgo et al. (2008) dalam studi yang sama juga dirancang metode tambahan yang bergantung pada
amplifikasi dari gyrB gen rumah tangga dari A. salmonicida dan yang menghasilkan amplikon yang diharapkan untuk
69 strain diuji. Namun, tidak ada penelitian lebih lanjut dilakukan dengan gyrB PCR karena batas deteksi yang lebih
tinggi dari yang diperoleh untuk fstA gen (Tabel 1). Keduanya fstA dan gyrB primer yang dirancang oleh Beaz-

www.intechopen.com
Molekul Deteksi dan Karakterisasi furunkulosis dan lain Aeromonas Infeksi
ikan 113

Hidalgo et al. (2008) telah digunakan dalam studi kemudian (Tabel 3) dan juga telah digunakan dalam metode m-PCR
dikembangkan untuk mendeteksi simultan A. salmonicida dan spesies bakteri lain yang menyebabkan penyakit ikan (Tabel
4, bagian 4.2.5). Di laboratorium kami, kami baru-baru ini dievaluasi 10 strain dari masing-masing spesies A. piscicola, A.
bestiarum dan A. salmonicida ( termasuk strain tipe semua A. salmonicida subspesies) dengan menggunakan metode
PCR dijelaskan oleh Beaz-Hidalgo et al. (2008), yang menargetkan fragmen 422 bp dari A. salmonicida fstA gen.
pengujian ini dilakukan untuk mengetahui apakah primer hanya bereaksi dengan A. salmonicida atau juga bisa bereaksi
dengan spesies yang berhubungan erat A. piscicola dan A. bestiarum. Untuk pengetahuan kita yang primer tidak pernah
diuji pada spesies baru-baru ini dijelaskan A. piscicola ( Beaz-Hidalgo et al., 2009) dan hanya dalam jenis strain A.
bestiarum

(Beaz-Hidalgo et al., 2008). Hasil menegaskan kekhususan metode untuk A. salmonicida karena hanya 10 strain dari spesies
ini menunjukkan sebuah band yang unik dari ukuran yang diharapkan dari fstA gen. Dalam kontraposisi tidak satu pun dari A.
piscicola dan A. bestiarum strain menunjukkan pita spesifik ini (422 bp) meskipun beberapa band lain ukuran yang diperkuat di
beberapa strain (hasil tidak dipublikasikan).

potensial target yang spesifik lain baru A. salmonicida adalah protein hipotetis bernama AssHPA, yang ditemukan
secara kebetulan oleh Kingombe et al. (2010) saat mereka mengembangkan m-PCR untuk deteksi tiga enterotoksin
( tindakan, alt dan ast). Karena AssHPA amplikon (148 bp) hadir dalam sembilan A. salmonicida strain diisolasi dari
ikan mati, penulis menyarankan bahwa kegunaannya sebagai target khusus untuk identifikasi spesies ini bisa
dievaluasi. Namun, itu juga hadir dalam dua jenis lainnya, satu diidentifikasi sebagai A. bestiarum dan satu
diidentifikasi sebagai milik A. caviae / A. media kompleks fenotipik. Mengingat ini, kami percaya bahwa kekhususan
reaksi PCR ini mungkin dikompromikan oleh reaktivitas silang ini dengan lainnya Aeromonas spesies dan
membutuhkan penyelidikan lebih lanjut dengan lebih banyak strain spesies lain, termasuk A. piscicola. Yang terakhir
ini juga harus dievaluasi dengan semua metode molekuler yang tersedia yang dapat membedakan A. salmonicida strain
(khas dan atipikal). Hal ini akan menjamin bahwa A. piscicola, yang umumnya menginfeksi ikan, tidak akan
mengganggu dengan memproduksi reaksi positif palsu.

4.2.3 Aplikasi atau evaluasi komparatif metode PCR yang dijelaskan

Beberapa penelitian telah dievaluasi secara individual, atau dibandingkan, metode yang dijelaskan pada Tabel 1 dan
hasil dan kesimpulan diringkas dalam Tabel 2. Dalam hal ini, Morgan et al. (1993) menggunakan metode PCR yang
dirancang oleh Hiney et al. (1992) untuk mengkonfirmasi kehadiran tidak culturable (VNC) sel-sel yang layak dari
strain A. salmonicida setelah 21 hari inkubasi di mikrokosmos danau air steril dan tidak diobati (Tabel 2). Arus
cytometry digunakan untuk menentukan jumlah sel yang layak membandingkannya dengan jumlah pulih setelah
budidaya di piring agar. Dalam mikrokosmos culturable steril A. salmonicida sel dievaluasi agar kedelai trypticase
(TSA) piring. Namun, untuk membedakan spesies ini dari bakteri adat lainnya hadir dalam air danau tidak diobati,
strain diuji ditandai menggunakan plasmid resisten kanamisin dan xylE gen (yang mengkodekan transporter
D-xylose). Pertumbuhan koloni di piring TSA agar dilengkapi dengan kanamisin mengungkapkan kehadiran diuji A.
salmonicida ketegangan di dalam air yang tidak diobati. Bakteri juga terdeteksi menggunakan PCR dirancang oleh
Hiney di al. (1992), yang menargetkan vapA gen dan dalam kasus air yang tidak diobati juga PCR spesifik
menargetkan xylE gen hanya hadir dalam ditandai A. salmonicida sel. Setelah 21 hari, jumlah sel yang layak diukur
dengan aliran

www.intechopen.com
114 Kesehatan dan Lingkungan di Budidaya

cytometry adalah 4 logaritma lebih tinggi dari sel dikultur dalam mikrokosmos steril, dan deteksi PCR positif
diperoleh pada semua kali diuji (Tabel 2). Dalam mikrokosmos tidak diobati, jumlah culturable A. salmonicida Sel-sel
telah menurun di bawah batas deteksi setelah 14 hari, meskipun kedua sel yang layak dan amplikon PCR positif
(dikonfirmasi oleh hibridisasi) diamati sampai akhir percobaan.

sama fragmen DNA ditemukan oleh Hiney et al. (1992) juga digunakan oleh O'Brien et al. (1994) untuk menyelidiki
keberadaan A. salmonicida dalam sampel tinja, limbah dan air tangki dari hatchery Atlantik smolts salmon. Hasil
penelitian mereka menunjukkan bahwa meskipun budaya dari air dan partikel dari limbah dari tangki dengan ikan
yang tampak sehat negatif untuk A. salmonicida, patogen terdeteksi oleh PCR. sensitivitas diperkirakan adalah sekitar
1000 fg dari A. salmonicida DNA (atau 200 genom setara) per g sampel dengan deteksi PCR, tetapi sensitivitas ini
meningkat 10 kali oleh dot blot hybridization (Tabel 2).

Byers dan rekan (2002a) dibandingkan tiga metode PCR yang dirancang oleh Gustafson et al. (1992), Hiney et al.
(1992) dan Miyata et al. (1996) untuk memverifikasi identitas 308 A. salmonicida strain, yang termasuk jenis dan
koleksi referensi strain serta strain pulih dari 38 ikan teleost. Mereka ditentukan sensitivitas mereka dalam diinokulasi
homogenat jaringan ikan dan dievaluasi metode lendir dan sampel lainnya (gill, lesi otot, usus, limpa dan ginjal) dari
salmonids eksperimental terinfeksi (Tabel 2). Mereka menemukan bahwa metode Hiney et al. (1992) dan Gustafson
et al. (1992) diidentifikasi dengan benar 92,5% dan 93,5% dari 308 strain (khas dan atipikal) dan penggunaan
simultan mereka memberikan hasil yang positif bagi 99,4% dari strain (Tabel 2). Dalam perjanjian dengan apa yang
digambarkan oleh Miyata et al. (1996) PCR mereka mampu mengidentifikasi 100% dari A. salmonicida subsp.

salmonicida strain tapi tidak ada strain atipikal. Yang terakhir adalah positif hanya dengan metode Hiney et al. (1992)
dan Gustafson et al. (1992). Dengan demikian mereka menyimpulkan bahwa aplikasi simultan tiga metode ini
tampaknya berguna untuk membedakan isolat khas dan atipikal A. salmonicida. Byers et al., (2002a) menemukan
bahwa beberapa PCR negatif isolat untuk metode Hiney et al. (1992) menargetkan gen vapA dari A-layer, masih
mampu menghasilkan lapisan ini dan menyarankan bahwa ini mungkin karena mutasi dalam situs primer yang tidak
mempengaruhi ekspresi gen seperti yang sudah dijelaskan dalam studi asli Hiney dan co- pekerja. Mereka
menemukan bahwa metode Hiney et al. (1992) dan Gustafson et al. (1992) lebih sensitif dibandingkan Miyata et al.
(1996) (Tabel 2). sensitivitas diperoleh dalam kultur murni berkisar 0,2-2 pg DNA dalam 50 ml, sedangkan pada
jaringan ikan diinokulasi berbeda berkisar dari 10 3 10 5 CFU per g. Selain itu, mereka mendeteksi keberadaan patogen
dalam jaringan dari semua ikan eksperimental terinfeksi (Byers et al., 2002a). Dalam sebuah penelitian yang saling
melengkapi kedua, Byers et al. (2002b) menyelidiki keberadaan A. salmonicida di diam-diam terinfeksi rainbow trout,
salmon Atlantik dan Arktik charr lagi menggunakan 3 metode PCR yang sama secara paralel dengan budaya
konvensional. Namun, mereka hanya mengevaluasi dua metode yang paling sensitif (Gustafson et al, 1992;.. Hiney
et al, 1992) untuk deteksi PCR langsung A. salmonicida pada ikan eksperimental terinfeksi. Mereka menyimpulkan
bahwa kultur adalah metode yang lebih dapat diandalkan daripada tes PCR, dan memperkirakan bahwa batas
terendah deteksi 2 metode PCR diuji (Gustafson et al, 1992;.. Hiney et al, 1992) adalah 4 x 10 5 CFU / g jaringan.
Selain itu, untuk mengevaluasi kehadiran A. salmonicida pada ikan secara terselubung terinfeksi, mereka juga
merekomendasikan penggunaan langkah pra-pengayaan budaya jaringan sebelum uji PCR (Byers et al. 2002b).
Hasil lain yang menarik adalah bahwa sampel lendir menghasilkan produk PCR lebih sering

www.intechopen.com
Molekul Deteksi dan Karakterisasi furunkulosis dan lain Aeromonas Infeksi
ikan 115

Referensi Tujuan PCR metode / nama Jenis sampel Hasil dan / atau kesimpulan
primer

Morgan et al. (1993) Untuk mempelajari Hiney et al. Eksperimental diinokulasi Jumlah bakteri pulih dari diinokulasi danau
layak tetapi tidak (1992) / AP steril dan tidak diobati air steril setelah 21 hari oleh budaya
culturable negara danau air tawar. konvensional hanya 4 CFU / 100 ml. Namun
(VNC) dari
Sebagai.

5.6 x 10 4 sel / sel layak ml dikonfirmasi


oleh aliran cytometry. Di danau tidak
diobati koloni air tidak diperoleh setelah
14 hari. Namun, bakteri yang terdeteksi
selama percobaan 21-hari dengan PCR.

A. salmonicida memiliki keadaan VNC di air


tawar diinokulasi.

O'Brien et al. (1994) Untuk mendeteksi A. Hiney et al. Tinja, limbah dan sampel air Metode ini memungkinkan deteksi A.
salmonicida dalam (1992) / AP tangki dari hatchery Atlantik salmonicida dari semua sampel. teknik
pembenihan ikan smolts salmon. kultur paralel negatif dalam sampel air
salmon Atlantik. limbah dan tangki. batas deteksi
diperkirakan dari produk PCR dengan
elektroforesis gel adalah sekitar. 200 A.
salmonicida genom setara / g sampel tapi
dot blot hybridization adalah 10 kali lebih
sensitif.

Byers et al. Untuk Gustafson et al. (1992) Pengenceran biakan murni. Dari 308 A. salmonicida
(2002a) membandingkan / PAAS Hiney et al. Eksperimental diinokulasi strain khas dan atipikal menguji AP
hasil yang diperoleh (1992) / AP Miyata et homogenat jaringan (lendir, diperkuat 285 dan PAAS 288. aplikasi
untuk deteksi dan al. (1996) / MIY insang, ginjal dan usus). paralel mereka meningkatkan hasil individu
Lendir, insang, lesi otot, usus, dan terdeteksi 306 (99,4%) strain. Metode
identifikasi 308 A. limpa dan ginjal dari ikan MIY hanya diperkuat khas Pantat
salmonicida eksperimental yang terinfeksi.

strain menggunakan
tiga metode PCR strain. AP dan PAAS metode yang
yang ada secara disediakan sensitivitas yang lebih baik di
paralel. kultur murni (0,2 pg-2 pg / 50 ml) dan
dalam jaringan (10 3- 10 5

CFU / g) dibandingkan dengan metode MIY


(200 pg-20000 pg / 50 ml dalam budaya
dan 10 6- 10 7 CFU / g dalam jaringan).
Jaringan dari semua ikan eksperimental
terinfeksi positif.

Tabel 2. Studi yang menerapkan metode PCR dijelaskan pada Tabel 1.

www.intechopen.com
116 Kesehatan dan Lingkungan di Budidaya

Referensi Tujuan PCR metode / nama Jenis sampel Hasil dan / atau kesimpulan
primer

Byers et al. Untuk Gustafson et al. (1992) Tissue (lendir, insang, limpa, Semua ikan eksperimental terinfeksi positif
(2002b) membandingkan / PAAS Hiney et al. ginjal, usus) dari salmonids dengan AP dan metode PAAS. 3 metode
hasil yang diperoleh (1992) / AP Miyata et eksperimen terinfeksi serta PCR diidentifikasi dengan benar 32 isolat
untuk deteksi dan al. (1996) / MIY diam-diam terinfeksi (atau pulih dari ikan diam-diam terinfeksi oleh
operator) salmonids. budaya. batas deteksi di salmonids
identifikasi A. diam-diam terinfeksi dengan metode AP dan
salmonicida di PAAS adalah 10 5 CFU / g. Sebuah langkah
eksperimental dan pengayaan diperlukan untuk meningkatkan
diam-diam terinfeksi sensitivitas.
rainbow trout, salmon
Atlantik dan charr Artic
menggunakan tiga
metode PCR yang ada
secara paralel.

Skugor et al. Untuk mendeteksi dan Hiney et al. Hati dan limpa dari A. salmonicida terdeteksi di hati dan limpa
(2009) menentukan tingkat A. (1992) / AP eksperimen terinfeksi dari semua ikan dianalisa tapi beban secara
salmonicida di divaksinasi dan tidak substansial lebih rendah di divaksinasi
eksperimental divaksinasi salmon Atlantik. dibandingkan dengan ikan yang tidak
terinfeksi divaksinasi divaksinasi.
dan

divaksinasi salmon
Atlantik.

Godoy et al. Untuk Gustafson et al. (1992) lesi eksternal, ginjal, hati, Karena 5 strain hanya diperkuat dengan
(2010) mengidentifikasi / PAAS Miyata et al. limpa, jantung yang hampir primer PAAS (yang tidak membedakan
dengan PCR 5 (1996) / MIY Nilsson et mati salmon Atlantik. antara yang khas dan atipikal) dan dengan
biokimia ditandai al. (2006) / ISasa4 yang dijelaskan oleh Nilsson et al. (2006)
A. salmonicida (khusus untuk strain atipikal) tapi tidak
(Khas atau atipikal) dengan primer MIY (spesifik untuk strain
diisolasi dari wabah khas), strain dianggap sebagai atipikal A.
furunculosis di air salmonicida.
tawar bertani salmon
Atlantik.

Tabel 2. Studi yang menerapkan metode PCR dijelaskan dalam Tabel 1. (lanjutan)

www.intechopen.com
Molekul Deteksi dan Karakterisasi furunkulosis dan lain Aeromonas Infeksi
ikan 117

dari jaringan seperti usus (Byers et al. 2002b). Para penulis menyarankan bahwa ini mungkin menunjukkan baik bahwa patogen
yang lebih berlimpah di bagian tubuh tertentu atau bahwa beberapa jenis jaringan yang terinfeksi dapat menghambat PCR lebih dari
yang lain. Dalam pandangan kami, itu harus dipertimbangkan bahwa lendir yang mencakup semua permukaan ikan adalah bagian
paling diakses dari tubuh untuk
A. salmonicida, yang bisa menjadi alasan lain untuk hasil ini.

Studi lain di mana beberapa metode molekuler yang digunakan secara paralel adalah salah satu yang dilakukan oleh
Godoy et al. (2010) yang bertujuan untuk re-identifikasi 5 biokimia ditandai
A. salmonicida diisolasi dari wabah furunculosis yang terjadi di Chili di sebuah peternakan air tawar ikan salmon
Atlantik. Penelitian ini mencoba untuk menentukan apakah infeksi diproduksi oleh khas atau atipikal A. salmonicida strain,
karena furunculosis atipikal telah terdeteksi sebelumnya dalam air laut di Chili. Mereka menggunakan primer yang
dirancang oleh Gustafson et al. (1992), yang mengenali baik khas dan atipikal A. salmonicida strain, orang-orang dari
Nilsson et al. (2006), yang ditargetkan diulang penyisipan elemen ISasa4 tertentu dari strain atipikal (non s almonicida
subspesies), dan mereka dirancang oleh Miyata et al. (1996), yang hanya mengakui strain khas ( A. salmonicida subsps.
salmonicida). Lima isolat positif untuk PCR yang ditargetkan ISAsa4 penyisipan elemen (Nilsson et al., 2006) dan
PCR yang ditargetkan wilayah DNA dari Gustafson et al. (1992), tetapi negatif untuk itu dari Miyata et al. (1996).
Hasil ini menunjukkan bahwa air tawar isolat salmon adalah strain atipikal A. salmonicida. Sequencing hampir gen
16S rRNA lengkap juga dilakukan dan mengungkapkan bahwa lima isolat yang diperoleh dari sakit Atlantik salmon
yang dipelihara di air tawar dibagi 100% kemiripan dengan A. salmonicida subsp. achromogenes dan A. salmonicida subsp.
masoucida, sedangkan dengan A. salmonicida subsps. salmonicida kesamaan adalah 99,85%. Dalam pandangan kami
Godoy et al. (2010) lupa untuk mempertimbangkan bahwa spesies A. bestiarum

menunjukkan 16S rRNA urutan gen identik dengan A. salmonicida subsp. achromogenes dan A. salmonicida subsp. masoucida
( Martinez-Murcia el al., 2005). Selain itu, beberapa strain baru-baru ini diusulkan spesies baru A. piscicola juga berbagi
100% 16S rRNA kesamaan gen dengan strain A. bestiarum dan A. salmonicida, termasuk subspesies achromogenes dan

masoucida. Ketika penulis diuji lain 12 atipikal A. salmonicida strain diisolasi dari ikan laut berbudaya, mereka
menemukan bahwa ISasa4 PCR negatif. Godoy et al. (2010) menyarankan bahwa ini mungkin disebabkan karena
angka yang lebih rendah dari salinan elemen penyisipan ini hadir dalam atipikal A. salmonicida strain mereka
terisolasi dari lingkungan laut, dibandingkan dengan mereka yang terisolasi dari air tawar, atau karena variasi dalam
urutan yang ditargetkan. Namun, tidak satupun dari saran ini telah diselidiki secara eksperimental atau dibuktikan
dengan sekuensing wilayah tertentu.

4.2.4 Studi yang mengembangkan teknologi PCR lainnya menggunakan target dijelaskan sebelumnya

Penulis lain telah menggunakan primer PCR atau bagian dari wilayah target tertentu yang dijelaskan dalam penelitian
sebelumnya untuk mengembangkan teknologi PCR lainnya, seperti PCR nested, metode PCR kuantitatif (Balcazar et
al, 2007 (Mooney et al, 1995.).; Goodwin & Merry, 2009) atau loop dimediasi isotermal amplifikasi (LAMP) (Kulkarni et
al., 2009), yang semuanya dirangkum dalam Tabel 3 dan diuraikan dalam bagian ini. Dalam studi yang dilakukan oleh
Mooney et al. (1995), mereka menerapkan metode yang dijelaskan oleh Hiney et al. (1992) untuk deteksi A.
salmonicida dalam darah 61 liar Atlantik salmon, tapi semua sampel negatif. Untuk memverifikasi ini, penulis
mengembangkan ditingkatkan prosedur ekstraksi dan tes untuk mengevaluasi kualitas DNA dengan melakukan tes
kesesuaian PCR. Yang terakhir ini terdiri dari PCR menargetkan wilayah genom inang ikan untuk menentukan
apakah sampel bebas

www.intechopen.com
118 Kesehatan dan Lingkungan di Budidaya

inhibitor PCR yang mungkin mengganggu deteksi PCR dari A. salmonicida. Selain itu mereka mengembangkan
prosedur PCR nested (melibatkan dua PCR berturut-turut) untuk meningkatkan sensitivitas. Jadi, setelah PCR
konvensional (menggunakan primer dari Hiney et al., 1992) dilakukan, primer spesifik yang lebih lanjut diperkuat
sub-region (278 bp) dari amplikon asli (423 bp) dirancang dan digunakan dalam kedua PCR. Dengan cara ini,
Mooney et al. (1995) dapat memperoleh band amplifikasi pada ukuran yang diharapkan dalam 87% dari sampel
darah 61 ikan (Tabel 3).

Balcazar et al. (2007) mengembangkan kuantitatif real-time PCR (Q-PCR) untuk mendeteksi A. salmonicida dalam
jaringan ikan diinokulasi dan ikan yang terinfeksi secara alami. Q-PCR ditargetkan 131 bp terletak dalam 423 bp dari MOBA
gen yang Hiney et al. (1992) diperkuat dengan keuntungan untuk dapat mengukur produk PCR (Tabel 1, 3).
Kekhasan metode ini dikonfirmasi oleh hasil positif yang diperoleh untuk 16 A. salmonicida isolat diuji (milik 3
subspesies: salmonicida, achromogenes dan masoucida) dan hasilnya negatif untuk 10 strain milik lainnya Aeromonas
spesies dan untuk 16 strain dari genera bakteri yang berbeda. Sensitivitas dari Q-PCR adalah serupa dalam kultur
murni dan dalam jaringan diinokulasi dan berada dalam kisaran 0,5 pg sampai 50 ng DNA yang didirikan untuk
menjadi setara dengan 16 CFU (Tabel 3). Dalam rangka untuk lebih memvalidasi dirancang Q-PCR, itu diterapkan
untuk ikan dari wabah alami furunkulosis, dan tingkat A. salmonicida per g jaringan (ginjal, hati dan limpa) yang
diperoleh berkisar antara 5,12 x 10 2 untuk 1,05 x 10 4 CFU. Dalam sebuah penelitian yang lebih baru, Goodwin &
Selamat (2009) menggunakan tiga pasang primer yang sebelumnya dijelaskan oleh Gustafson et al. (1992), Hiney et
al. (1992) dan Miyata et al. (1996) dan disesuaikan mereka untuk Q-PCR untuk menganalisis sampel swab 62 ulkus
diperoleh dari ikan mas untuk menyelidiki kemungkinan hubungan khas dan atipikal A. salmonicida dalam penyakit
ulseratif ikan mas. Menggunakan PCR konvensional, mereka menunjukkan bahwa strain atipikal hadir di 84%
(52/62) dari bisul ikan mas dianalisis. Seperti dalam studi lain (Byers et al., 2002a) perbedaan antara strain khas dan
atipikal didasarkan pada amplifikasi positif yang diperoleh menggunakan primer dari Hiney et al. (1992) dan
Gustafson et al. (1992) dan amplifikasi negatif menggunakan orang-orang dari Miyata et al. (1996). Enam belas
persen (10/62) dari sampel yang ditemukan menjadi PCR negatif, yang bertepatan dengan sampel swab ulkus
diambil dari ikan mas yang hidup di air dengan suhu tinggi. penulis menyarankan bahwa suhu meningkat cenderung
negatif mempengaruhi kelangsungan hidup patogen atau untuk membantu sistem kekebalan tubuh ikan mas untuk
menghilangkannya (Goodwin & Selamat 2009). Menggunakan primer Hiney ini, Goodwin & 2- 7.74 x 10 7 salinan genom
A. salmonicida

per ug DNA tuan diekstraksi dari sampel ulkus swab dari ikan mas (Tabel 3). Secara paralel, penulis juga tumbuh budaya dari
penyeka tetapi gagal untuk mengisolasi bakteri dan mereka berpendapat bahwa ini adalah kemungkinan besar karena pertumbuhan
berlebih dari bakteri lain, terutama cepat tumbuh aeromonads motil (yang mungkin juga bertanggung jawab untuk penyakit) seperti
yang terjadi dengan insang dan kulit di mana bakteri dominan menutupi keberadaan bakteri prevalensi yang lebih rendah. Para
penulis menyimpulkan bahwa protokol Q-PCR mungkin menjadi alat baru yang berguna untuk mempelajari A. salmonicida

epidemiologi dari ulkus ikan mas (Goodwin & Selamat 2009).

Metode lain yang sama sekali berbeda adalah lingkaran-dimediasi amplifikasi isotermal (LAMP) assay yang
dikembangkan oleh Kulkarni et al. (2009) untuk deteksi furunculosis di Atlantic cod ( Gadus morhua). Untuk
pengembangan metode, penulis merancang 5 set primer menargetkan gyrB daerah gen dijelaskan oleh Beaz-Hidalgo et
al. (2008) sebagai berguna untuk mendeteksi
A. salmonicida. Teknik LAMP pertama kali dijelaskan oleh Notomi et al. (2000) untuk mendeteksi

www.intechopen.com
Molekul Deteksi dan Karakterisasi furunkulosis dan lain Aeromonas Infeksi
ikan 119

Referensi Objektif Jenis sampel Hasil dan / atau kesimpulan

Mooney et al. Untuk meningkatkan sensitivitas sampel darah dari 61 liar Konvensional PCR tidak mendeteksi A.
(1995) PCR dari Hiney et al. (1992) Atlantik salmon. salmonicida dalam darah salmon liar
meningkatkan ekstraksi DNA tetapi metode ditingkatkan positif untuk
(mengembangkan prosedur 53 dari 61 ikan dievaluasi. Hasil ini
untuk pengujian kualitas) dan diperkuat dengan hibridisasi.
melakukan nested-PCR. Sensitivitas adalah <100

A. salmonicida genom setara /


sampel ikan.

Balcazar et al. Untuk mengembangkan timePCR Jaringan ikan yang terinfeksi A. salmonicida terdeteksi dan dihitung
(2007) nyata kuantitatif (Q-PCR) untuk secara alami pulih dari dalam semua ikan yang terinfeksi secara
mendeteksi A. salmonicida dari outbreaks.Dilutions dari kultur alami (dalam konsentrasi mulai dari 5,12
jaringan ikan menggunakan sebuah murni. Eksperimental diinokulasi x10 2 CFU / g menjadi 1,05 x 10 4 CFU / g).
fragmen yang lebih kecil (131 bp) dari homogenat jaringan ikan (hati, batas deteksi dalam budaya murni dan
wilayah yang ditargetkan oleh Hiney et ginjal, limpa dan usus). dalam jaringan diinokulasi (hati, ginjal,
al. (1992). usus, limpa) adalah sekitar 16 CFU per
reaksi Q-PCR.

Goodwin & Untuk membangun kejadian Penyeka dari lesi ulseratif ikan 52 dari 62 strain pulih dari ulkus dianggap
Selamat (2009) yang khas dan atipikal A. mas yang sakit. atipikal dan karena itu mereka adalah Sebagai
salmonicida strain yang berhubungan dengan
pada lesi ulseratif dari ikan mas penyakit ulseratif ikan mas. Kisaran
menggunakan primer yang genom salinan A. salmonicida dalam
dirancang oleh Gustafson et al. sampel swab ulkus adalah 9,83 x 10 2 untuk
(1992), Hiney et al (1992) dan 7.74 x 10 7 / ug DNA.
Miyata et al. (1996) dan digunakan
mereka dalam Q-PCR.

Kulkarni et al. Untuk mengembangkan Limpa diperoleh dari ikan Uji LAMP adalah khusus untuk A.
(2009) protokol LAMP untuk deteksi eksperimen yang terinfeksi dan salmonicida dan positif untuk semua
cepat, sensitif dan spesifik tidak terinfeksi. Pengenceran sampel ikan eksperimental terinfeksi.
biakan murni. Eksperimental LAMP lebih sensitif dibandingkan
furunculosis di Atlantic cod diinokulasi lendir dari ikan yang deteksi PCR konvensional di kultur
menggunakan 5 A. salmonicida primer
sehat. murni (1 pg DNA / ml vs 100 pg DNA /
spesifik untuk gyrB ml) dan lendir yang terinfeksi (10 pg
DNA / ml vs 1000 pg DNA / ml).
gen yang ditargetkan oleh
BeazHidalgo et al. (2008).

LAMP, loop-dimediasi amplifikasi isotermal.

Tabel 3. Studi yang meningkatkan metode PCR dijelaskan pada Tabel 1 atau menggunakan daerah sasaran dan / atau primer untuk
merancang metode lain.

www.intechopen.com
120 Kesehatan dan Lingkungan di Budidaya

virus hepatitis B dan memiliki keuntungan menjadi lebih cepat (45 menit) dari PCR konvensional dan tidak
membutuhkan thermocycler atau peralatan canggih. Selanjutnya, deteksi di tempat patogen dapat dilakukan dengan
visualisasi langsung dari pewarnaan neon (SYBR Aman hijau) produk LAMP di bawah sinar UV genggam (Kulkarni
et al.,
2009). Dalam bekerja, Kulkarni et al. (2009) dibandingkan uji LAMP dengan PCR konvensional menggunakan gyrB dan
fstA primer yang sebelumnya dirancang oleh Beaz-Hidalgo et al. (2008). Mereka diuji pengenceran DNA seri dari
kultur murni A. salmonicida dan mencapai sensitivitas 1 pg DNA bakteri / ml dengan LAMP, yang merupakan
perbaikan 100 kali lipat lebih deteksi PCR konvensional. Kedua LAMP dan PCR konvensional yang diuji inokulasi
sampel lendir, dan batas deteksi 10 pg DNA bakteri / ml dan 1000 pg dari bakteri DNA / ml, masing-masing, yang
dicapai (Tabel 3). Penggunaan teknik LAMP jarang dilaporkan dalam literatur, studi oleh Kulkarni et al., (2009)
menjadi orang pertama yang menggunakannya untuk mendeteksi sebuah Aeromonas ikan patogen. Studi validasi
lebih lanjut diperlukan untuk itu harus diterapkan di laboratorium diagnostik dan di program on-site (Kulkarni et al.,
2009).

4.2.5 Multiplex PCR (m-PCR) metode untuk mendeteksi secara bersamaan A. salmonicida dan bakteri patogen
ikan lainnya

Keuntungan dari menggunakan m-PCR adalah kemampuannya untuk mendeteksi beberapa urutan target secara
bersamaan, memungkinkan adanya beberapa patogen untuk dievaluasi sekaligus, menjadi kurang memakan waktu dan
biaya lebih efektif daripada PCR individu. Gonzlez et al. (2004) mengembangkan m-PCR yang dapat disesuaikan dengan
microarray yang ditargetkan A. salmonicida dan 4 bakteri patogen ikan laut penting lainnya yaitu V. anguillarum, Photobacterium
damselae
subsp. damselae, Vibrio parahaemolyticus dan Vibrio vulnificus ( Tabel 4). untuk mendeteksi A. salmonicida, 2 daerah
dari vapA gen pengkodean A-lapisan dipilih, sebuah wilayah 177 bp berbeda dari Gustafson et al. (1992) dan
fragmen yang lebih kecil (101 bp) dari daerah yang sama (423 bp) dijelaskan oleh Hiney et al. (1992). Mereka
menguji total 75 strain, yang mewakili 28 spesies beberapa genera, termasuk 3 strain A. salmonicida subsp.

salmonicida dan 3 strain milik lainnya Aeromonas spesies (Tabel 4). Kekhasan assay adalah 100%, tetapi penulis
menunjukkan bahwa negatif palsu mungkin timbul sebagai akibat dari mutasi yang terjadi secara alami di wilayah
sasaran primer. Sensitivitas diperoleh dengan kultur bakteri murni (4-5 CFU) adalah serupa dengan yang diperoleh
dengan metode PCR lainnya yang telah dibahas sebelumnya (Altinok et al, 2008;.. Gustafson et al, 1992;. Hiney et al,
1992; Onuk et al. 2010).

Altinok et al. (2008) dijelaskan lain m-PCR untuk mendeteksi A. hydrophila, A. salmonicida subsp. salmonicida dan 3
besar patogen ikan bakteri lainnya ( Flavobacterium columnare, Renibacterium salmoninarum dan Yersinia ruckeri) ( Tabel
4). untuk mendeteksi A. salmonicida, modifikasi dari Hiney et al. (1992) primer yang digunakan, sedangkan untuk
mendeteksi
A. hydrophila primer adalah mereka yang sebelumnya dijelaskan oleh Nielsen et al. (2001) menargetkan gen 16S
rRNA. Namun, ketika kita mencari kemungkinan reaktivitas silang dari A. hydrophila dengan urutan lainnya Aeromonas spesies,
kami menemukan bahwa urutan komplementer ke daerah primer juga hadir dalam spesies A. molluscorum ( hanya
dikenal dari kerang) dan A. encheleia ( awalnya diisolasi dari belut Eropa di Valencia, Spanyol dan ditemukan dalam
hubungan dengan penyakit ikan dalam penelitian lain). Hal ini tampaknya menunjukkan bahwa mereka primer tidak
dapat dianggap khusus untuk mendeteksi A. hydrophila, dan ini perlu diuji secara eksperimental menggunakan
beberapa strain spesies campur disebutkan. Metode

www.intechopen.com
Molekul Deteksi dan Karakterisasi furunkulosis dan lain Aeromonas Infeksi
ikan 121

Referensi Deteksi simultan: wilayah target atau N dari Aeromonas Hasil dan / atau
gen (bp) strain dan jenis sampel kesimpulan
dievaluasi

Gonzlez et al. A. salmonicida Sebuah wilayah yang berbeda 3 A. salmonicida batas deteksi untuk A.
(2004) Photobacterium dari 177 bp dari subsp. salmonicida, 1 salmonicida dalam budaya murni
damselae vapA gen yang ditargetkan A. caviae, 1 A. hydrophila dan adalah <20 fg DNA genom,
subsp. damselae, Vibrio oleh Gustafson et al. (1992) 1 A. sobria. yang setara dengan 4-5 CFU.
vulnificus Vibrio anguillarum dan fragmen yang lebih kecil Produk m-PCR digunakan untuk
Vibrio parahaemolyticus (101 bp) dari wilayah (423 bp) Pengenceran biakan mengembangkan microarray
yang ditargetkan oleh Hiney murni. dan sinyal hibridisasi yang jelas
et al. (1992) 1. untuk kedua daerah diperoleh.

Altinok et al. (2008) A. salmonicida subsp. Sebuah fragmen sedikit lebih 5 A. salmonicida batas deteksi di kultur murni
salmonicida kecil (416 bp) dari wilayah subsp. salmonicida, 4 adalah 1 CFU. Dari 558 trout
A. hydrophila (423 bp) yang ditargetkan A. hydrophila dan 2 A. sobria. pelangi yang sakit diperoleh dari
Flavobacterium oleh Hiney et al. (1992) 1 31 peternakan, 112 positif untuk
columnare Pengenceran biakan murni. mendeteksi salah satu dari 3
Renibacterium untuk A. salmonicida. Tissue (hati, limpa, ginjal, patogen termasuk 35 positif bagi A.
salmoninarum Wilayah dari gen 16S insang, kulit dan sirip) dari hydrophila dan 22 untuk
Yersinia ruckeri rRNA diusulkan oleh sakit rainbow trout bertani.
Nielsen et al. (2001)
untuk A. hydrophila.

A. salmonicida.

Onuk et al. A. salmonicida subsp. wilayah identik ( fstA, 422 bp)9 A. salmonicida batas deteksi adalah 30 CFU
(2010) salmonicida sebagai Beaz-Hidalgo et al. subsp. salmonicida. dalam budaya murni dan 250
Flavobacterium (2008). Pengenceran biakan murni. CFU dalam hati yang terinfeksi.
psychrophilum Eksperimental diinokulasi Semua A. salmonicida
Yersinia ruckeri homogenat jaringan hati yang
diperoleh dari salmon yang subsp. salmonicida
sehat. positif.

Kulkarni et al. (2010) A. salmonicida Francisella wilayah identik ( gyrB, 760 1 A. salmonicida Batas deteksi 10g-50 ng DNA /
piscicida bp) sebagai Beaz-Hidalgo et Pengenceran biakan ml dalam kultur murni.
V. anguillarum al. (2008). murni. Satu-satunya ketegangan
(Tiga patogen utama dalam referensi A. salmonicida
bertani Atlantic cod).
diuji positif.

1 Hiney et al. (1992) menunjukkan bahwa urutan ini memiliki fungsi yang tidak diketahui. Namun, analisis ledakan kami dilakukan mengungkapkan
bahwa saham 99% kesamaan dengan gen MOBA ( nomor aksesi: AJ508382), yang merupakan protein mobilisasi 1263 bp lokal di PAsa1 plasmid dari A.
salmonicida subsp.
salmonicida ( saring JF2267).

Tabel 4. Studi yang mengembangkan multiplex-PCR (m-PCR) untuk mendeteksi secara bersamaan Aeromonas
spp. (terutama A. salmonicida) dan patogen ikan lainnya.

www.intechopen.com
122 Kesehatan dan Lingkungan di Budidaya

tampaknya tertentu untuk 5 strain A. salmonicida dievaluasi, dengan tidak ada reaksi silang dengan bakteri lain
(Altinok et al., 2008). Batas deteksi dalam pengenceran kultur murni adalah 2 CFU untuk A. hydrophila dan 1 CFU
untuk A. salmonicida, masing-masing, dan uji yang terdeteksi A. hydrophila di 35 ikan dan A. salmonicida di 22 ikan
dari 558 berpenyakit rainbow trout dianalisis (Tabel 4).

Dalam sebuah penelitian yang sangat baru-baru ini, Onuk et al. (2010) telah mengembangkan m-PCR untuk
mendeteksi simultan A. salmonicida dan dua bakteri lain ( Flavobacterium psychrophilum dan Y. ruckeri) mampu
menghasilkan Infeksi menular di salmonids (Tabel 4). Batas deteksi adalah 30 CFU dari A. salmonicida dari suspensi
budaya dan 250 CFU dari diinokulasi jaringan hati homogenated (Tabel 4). Untuk desain m-PCR, mereka diuji di
paralel
vapA primer dari Hiney et al. (1992) dan orang-orang dari fstA dari Beaz-Hidalgo et al. (2008), menunjukkan bahwa yang
terakhir memiliki spesifisitas yang lebih baik karena tidak ada 9 strain dianalisis menunjukkan reaksi negatif palsu atau
amplifikasi non-spesifik. negatif palsu, namun diperoleh untuk 2 dari 9 A. salmonicida isolat (2,2%) menggunakan primer
dari Hiney et al. (1992). Kegagalan beberapa A. salmonicida isolat untuk memperkuat dengan primer kedua setuju
dengan hasil yang diperoleh oleh Byers et al. (2002a), yang melaporkan tidak ada amplifikasi di 23 dari 308 isolat (7,5%)
diperiksa dengan primer tersebut. Untuk memantau kehadiran A. salmonicida, Francisella piscicida dan V. anguillarum,

dianggap tiga patogen paling penting dalam berbudaya cod Atlantik, Kulkarni et al. (2010) mengembangkan m-PCR.
untuk mendeteksi A. salmonicida mereka menggunakan primer dari gyrB
gen yang dirancang oleh Beaz-Hidalgo et al. (2008). M-PCR adalah spesifik untuk mendeteksi strain tunggal A.
salmonicida diuji tanpa reaksi silang dengan patogen lain diuji secara bersamaan dan memiliki batas deteksi yang
baik ketika diuji di suspensi bakteri (Tabel 4).

5. Dampak perubahan iklim di Aeromonas infeksi

Beberapa penelitian telah melaporkan bahwa perubahan iklim dapat mempengaruhi sektor budidaya dan produksi,
karena dapat meningkatkan kerentanan ikan budidaya untuk penyakit akibat peningkatan suhu air dan / atau
penurunan kualitas air (Alborali, 2006; Karvonen et al, 2010;. Marcogliese, 2008;. Marcos-Lpez et al, 2010;.
Mohanty et al, 2010;. Tam et al, 2011). Hal ini juga diketahui bahwa perubahan kecil dalam suhu air mengubah baik
metabolisme ikan dan fisiologi yang mungkin memiliki konsekuensi karena adanya pertumbuhan, kesuburan atau
makan perilaku (Alborali, 2006; Marcogliese, 2008; Mohanty et al, 2010.). Peningkatan suhu air menyebabkan ikan
menderita stres termal, membuat mereka lebih rentan terhadap infeksi (oleh patogen oportunistik seperti Aeromonas spp)
dan menurunkan habitat lingkungan mereka, menurunkan konsentrasi oksigen dan mengubah tingkat nutrisi
(Alborali, 2006;. Karvonen et al, 2010;. Marcogliese, 2008;. Marcos-Lpez et al, 2010;. Tam et al, 2011) . Namun,
juga harus dipertimbangkan bahwa pada suhu air yang lebih tinggi banyak bakteri mereplikasi pada tingkat yang
lebih tinggi dan karena itu mereka mungkin akan lebih berlimpah, mendukung penyebaran penyakit menular
(Marcos-Lpez et al., 2010). motil oportunistik Aeromonas

spesies memiliki suhu pertumbuhan optimal dalam kondisi laboratorium dari 25-30C, dan suhu air yang ideal untuk A.
salmonicida untuk bertahan hidup adalah dalam kisaran 12.8C ke 21.1C (Tam et al., 2011 dan referensi di
dalamnya). Klasik, wabah Aeromonas septicaemias dan furunculosis terkait dengan kenaikan suhu, biasanya terjadi
selama musim semi dan musim panas (Tam et al., 2011). Peningkatan suhu juga dapat memperpanjang transmisi

www.intechopen.com
Molekul Deteksi dan Karakterisasi furunkulosis dan lain Aeromonas Infeksi
ikan 123

wilayah target atau Urutan set-primer oligonukleotida Kondisi Referensi


gen (bp)

vapA ( 421) AP-1- 5'-GGC TGA TCT CTT CAT CCT CAC CC-3'AP-2- 5'-CAG AGT 25s 94C 1s 57C Gustafson et al.
GAA ATC TAC CAG CGG TGC-3' x 35 (1992)
25s 73C

wilayah yang tidak PAAS-1- 5'-CGT TGG ATA TGG CTC TTC CT-3'PAAS-2- 5'-CTC 94C 1min 55C 1min Hiney et al.
diketahui 1 ( 423) AAA ACG GCT GCG TAC CA-3' x 30 (1992)
72C 1min

wilayah yang tidak MIY-1- 5'-AGC CTC CAC GCG CTC ACA GC-3'MIY-2- 5'-AAG 30-an 94C 30-an Miyata et al.
diketahui (512) AGG CCC CAT AGT GTG GG-3' 60C x 30 (1996)
72C 1min 72C 5
menit

IS urut ISasa4 ISasa4F- 5'-CCT GCA CCG CCT CAT TTC TC-3'ISasa4R- 5'-GAA 94C 2.5min 94C Nilsson et al.
(749) AAC CCA GTG ATC TGA GC-3' 30-an 30-an 67C (2006)
x 30
72C 30-an 72C
9.5min

gyrB ( 422) Asg1- 5'-TGG CAT GGA ACA TTC CTC CT-3'Asg2- 5'-GTC 95C 3 menit Beaz-Hidalgo et al.
GCC TGC TTT TTC CAG CA-3' 30-an 95C 30-an (2008) 2

57C x 40
72C 1min 72C 5
menit

fstA ( 760) Fer3- 5'-CGG TTT TGG CGC AGT GAC G-3'Fer4- 5'AGG CGC 92C 3 menit 92C Beaz-Hidalgo et al.
TCG GGT TGG CTA TCT-3' 1min 60C 1min (2008)
x 30
72C 1min 72C 5
menit

1 Ledakan analisis kami dilakukan mengungkapkan bahwa saham 99% kesamaan dengan gen MOBA ( nomor aksesi: AJ508382), yang merupakan
protein mobilisasi 1263 bp lokal di PAsa1 plasmid dari A. salmonicida subsp. salmonicida ( saring JF2267). 2 kondisi amplifikasi tidak ditunjukkan
dalam studi itu sehingga mereka ditunjukkan berasal dari Kulkarni et al. (2010). Semua metode ini terdeteksi strain khas dan atipikal kecuali Miyata
et al. (1996) yang terdeteksi hanya khas dan Nilsson et al. (2006) yang terdeteksi hanya atipikal.

Tabel 5. Primer dan kondisi metode PCR yang paling umum digunakan untuk mendeteksi khas dan atipikal A.
salmonicida strain.

musim, yang mengarah ke prevalensi lebih tinggi dari penyakit dan epidemi yang lebih luas (Karvonen et al., 2010).
Mungkin juga ada perubahan ekologis antara spesies atau strain, yang mengakibatkan munculnya strain patogen baru
yang mempengaruhi lebih luas host (Karvonen et al, 2010;.. Marcos-Lpez et al, 2010). Selain itu, bakteri mungkin
menunjukkan virulensi yang lebih besar, misalnya A. hydrophila telah menunjukkan virulensi yang lebih besar di bass
largemouth ( Micropterus salmoides) pada suhu yang lebih hangat karena baik resistensi berkurang dari tuan rumah atau
untuk peningkatan ekspresi faktor virulensi (Marcogliese, 2008 dan referensi di dalamnya). Dalam penelitian terbaru,
Tam et al. (2011) dilakukan penilaian dampak regional perubahan iklim dalam kaitannya dengan furunculosis menyelidiki
populasi ikan di dua danau di Kanada.

www.intechopen.com
124 Kesehatan dan Lingkungan di Budidaya

suhu air danau 1963-2001 digunakan untuk model untuk memproyeksikan temperatur danau masa depan
(2011-2100) mempertimbangkan skenario yang berbeda dan menghitung suhu air vertikal dan permukaan dari skala
waktu yang berbeda. Mereka mengakui kenaikan signifikan dalam suhu udara sejak tahun 1963 dan pada
pertengahan tahun 1990 mereka mendeteksi terjadinya furunculosis ketika suhu udara rata-rata adalah 12.8C dan
musim panas berarti suhu air yang 15C. Antara 2011 dan 2100 mereka memprediksi bahwa musim panas berarti
suhu air akan naik dari 15-15.5C ke 16.5-17.4C, kondisi berada dalam kisaran suhu kelangsungan hidup A.
salmonicida ( 12.8-21.1C). Selain itu, mereka melihat bahwa diperkirakan kisaran suhu antara 16,5 dan 17.4C
relatif dekat dengan 18C di mana virulensi A. salmonicida lebih baik diekspresikan (Daher et al., 2011). Tam et al.,
(2011) menilai bahwa efek perubahan iklim mungkin juga akan ditransfer ke dampak antropogenik lainnya, seperti
kontaminasi yang berdampak pada kualitas air. Ini adalah faktor lain yang mungkin mendukung pengembangan
furunculosis.

Kesimpulannya, kita bisa mengatakan bahwa ada kesepakatan umum bahwa sebagai konsekuensi dari pemanasan global,
suhu air akan meningkat dan sebagai hasilnya penyakit endemik seperti furunculosis akan menjadi lebih umum dan lebih
sulit untuk mengontrol populasi ikan immunodepressed (Marcos-Lpez et al., 2010). Dalam jangka panjang, budidaya
harus merespon perubahan iklim dengan meminimalkan pelepasan ke dalam ekosistem air, cobalah untuk mengurangi
dampak negatif dari perubahan iklim kualitas air dan menghindari crowding ikan untuk meminimalkan penularan penyakit
(Marcos-Lpez et al., 2010).

6. Kesimpulan dan perspektif

Klasik spesies Aeromonas terlibat dalam penyakit ikan yang telah dianggap penting dalam ichthyopathology berada A.
salmonicida dan A. hydrophila. Namun, baru-baru panorama ini spesies telah diperluas dengan penemuan spesies
baru seperti A. piscicola dan A. tecta, yang telah diisolasi terutama dari salmonids sakit dan turbot. Spesies baru
mungkin memiliki peran penting dalam patologi ikan yang perlu dieksplorasi di masa depan. spesies lain seperti A.
veronii atau A. sobria tampaknya memiliki peran khusus dalam patologi ikan lele dan ikan trout, masing-masing.
Semua spesies ini harus tetap bertopeng di bawah A. hydrophila ketika hanya metode identifikasi biokimia yang
diterapkan. Oleh karena itu metode ini harus dihindari karena mereka memberikan hasil yang menggambarkan
prevalensi nyata dan / atau keragaman spesies. spesies A. salmonicida termasuk keragaman yang luas dari strain,
beberapa mampu dan orang lain tidak dapat memproduksi pigmen atau menjadi motil dalam kondisi laboratorium.
Perilaku heterogen ini telah menyebabkan pengenalan 'khas' dan strain istilah 'atipikal' (subspesies yang berbeda
dari salmonicida), yang dalam pandangan kami sangat membingungkan. Namun, strain kedua kelompok diketahui
menyebabkan furunculosis dan penyakit ulcerative dalam berbagai host ikan, di mana mereka menghasilkan
karakteristik klinis yang serupa. Selain itu, telah ada bukti selama bertahun-tahun bahwa identifikasi strain A.
salmonicida sebagai milik subspesies yang berbeda (selain salmonicida) adalah baik fenotip dan genetik kompleks.
Oleh karena itu, mungkin waktu untuk menyadari bahwa pemisahan spesies ini menjadi subspesies yang berbeda
tidak memenuhi tujuan membantu untuk memperjelas identitas isolat atas dasar fenotipik dan genetik karakter stabil,
tetapi hanya membuat situasi lebih sulit dan membingungkan . Kami percaya bahwa setelah konfirmasi genetik,
mungkin lebih baik untuk menghindari penggunaan istilah 'khas' dan 'atipikal' dan untuk merujuk pada strain hanya
sebagai A. salmonicida.

www.intechopen.com
Molekul Deteksi dan Karakterisasi furunkulosis dan lain Aeromonas Infeksi
ikan 125

Dalam ichthyopathology, identifikasi yang benar adalah penting untuk menentukan etiologi sebenarnya dari penyakit
selama wabah di fasilitas akuakultur dan ini adalah dasar untuk menetapkan program pengobatan dan pencegahan yang
memadai. deteksi cepat dan handal dari Aeromonas adalah elemen kunci untuk meminimalkan dampak dari infeksi. Selain
itu, pemantauan terus menerus dari Aeromonas pada ikan peternakan (baik air dan ikan) diperlukan karena bakteri ini
adalah asli dari lingkungan air dan dapat bertindak patogen sebagai oportunistik. metode fenotipik tidak dapat diandalkan
untuk mengidentifikasi Aeromonas jenis. Oleh karena itu perlu upaya langsung terhadap penggunaan teknik molekuler
cocok dan dapat diandalkan. Ada panorama luas metode berbasis PCR dikembangkan untuk mendeteksi A. salmonicida dalam
jaringan ikan (lendir, darah, dan jaringan lain) yang telah terbukti memberikan spesifisitas yang baik dan kecenderungan di
masa depan akan terus menggunakan metode m-PCR yang akan memungkinkan untuk menyaring beberapa patogen
secara bersamaan. Sekuensing gen housekeeping (yaitu rpoD dan

gyrB) strain pulih dari ikan telah terbukti berguna untuk mengidentifikasi
Aeromonas spesies dan penggunaan rutin akan kembali pada klarifikasi keragaman spesies yang terlibat dalam
penyakit ikan.

Juga lebih banyak pengetahuan akan dikumpulkan di masa depan dari genom lengkap dari kedua bakteri dan ikan
inang terinfeksi. Dalam genus Aeromonas hanya ada satu genom lengkap dari tersedia 3 milik ketegangan pulih dari
ikan yang sakit (ikan) dari spesies A. salmonicida ( regangan A449). Hal ini dapat diharapkan segera yang lain akan
tersedia. genom ini dapat memberikan informasi penting tentang gen diekspresikan dalam host, dalam menanggapi
vaksinasi atau infeksi yang dapat berguna untuk memilih populasi ikan tahan di masa depan.

Hal ini jelas bahwa salah satu efek prediksi perubahan iklim akan terjadi peningkatan suhu air, kecenderungan yang
telah diamati dan yang dapat mengubah Imunokompetensi dan kerentanan ikan terhadap penyakit dan
mempengaruhi perikanan dan akuakultur. Ada bukti yang menunjukkan bahwa munculnya, distribusi dan transmisi
banyak bakteri patogen seperti Aeromonas akan meningkatkan di bawah pengaruh pemanasan global, tetapi dampak
antropogenik lainnya seperti yang berasal dari kontaminasi air mungkin juga driver penting dalam memperburuk
masalah. Beberapa penelitian telah mencoba untuk memprediksi dampak perubahan iklim pada ikan Aeromonas infeksi
dan karena ini perlu dieksplorasi lebih lanjut untuk mencari langkah-langkah perbaikan yang tepat waktu yang dapat
diterapkan untuk melawan efek dari pemanasan global.

7. Ucapan Terima Kasih

Para penulis berterima kasih kepada Dr Jess Lpez Romalde, Dr Juan Luis Barja dan Dr Alicia Estevez Toranzo dari
University of Santiago de Compostela untuk menyediakan informasi dan
Aeromonas strain ikan yang digunakan dalam beberapa artikel kami yang dilaporkan dalam bab ini.

8. Referensi

Abbott, SL; Cheung, WK & Janda, JM (2003) Genus Aeromonas: biokimia


karakteristik, reaksi atipikal, dan skema identifikasi fenotipe. Jurnal Mikrobiologi Klinik 41, pp. 2348-2357.

www.intechopen.com
126 Kesehatan dan Lingkungan di Budidaya

Abbott, SL; Cheung, WK; Kroske-Bystrom, S .; Malekzadeh, T. & Janda, JM (1992).


identifikasi Aeromonas strain ke genospecies tingkat di laboratorium klinis.
Jurnal Mikrobiologi Klinik 30, pp. 1262-1266.
Alborali, L. (2006) Variasi Iklim Terkait dengan Penyakit Ikan dan Produksi Dokter hewan
Penelitian Komunikasi, 30, hlm. 93-97.
Alperi, A., Figueras, MJ; Inza, I. & Martnez-Murcia, AJ (2008). Analisis gen 16S rRNA
mutasi pada subset dari Aeromonas strain dan dampaknya dalam delineasi spesies.
Mikrobiologi Internasional 11, hlm. 185-194.
Altinok, I .; Capkin, E. & Kayis, S. (2008). Pengembangan multipleks PCR assay untuk
Deteksi simultan dari lima patogen ikan bakteri. Mikrobiologi Kedokteran hewan 131, pp. 332-338.

Austin, B .; Austin, DA (2007). patogen ikan bakteri, penyakit ikan ternak dan liar ( 4 th
edition) Springer-Praxis, ISBN 978-1-4020-6068-7, Chichester, UK. Balcazar, JL; Vendrell, D .; de Blas, saya .;
Ruiz-Zarzuela, saya .; Girones, O. & Muzquiz, JL (2007).
deteksi kuantitatif Aeromonas salmonicida dalam jaringan ikan oleh real-time PCR menggunakan
self-padam, primer fluorogenik. Journal of Microbiology Medis 56, hlm. 323-328.

Beaz-Hidalgo, R .; Alperi, A .; Bujan, N .; Romalde, JL & Figueras, MJ (2010). Perbandingan dari


Identifikasi phenotypical dan genetik Aeromonas diisolasi dari ikan yang sakit. Sistematis dan Mikrobiologi
Terapan 33, hlm. 149-153.
Beaz-Hidalgo, R .; Alperi, A .; Figueras, MJ & Romalde, JL (2009). Aeromonas piscicola sp.
November, terisolasi dari ikan yang sakit. Sistematis dan Mikrobiologi Terapan 32, hlm. 471-
479.
Beaz-Hidalgo, R .; Magi, GE; Balboa, S .; Barja, JL & Romalde, JL (2008). Perkembangan dari
protokol PCR untuk mendeteksi Aeromonas salmonicida pada ikan oleh amplifikasi fstA ( ferric siderophore
reseptor) gen. Mikrobiologi Kedokteran hewan 128, pp. 386-
394.
Bernoth, EM; Ellis, A .; Midtlyng, P .; Olivier, G. & Smith, P. (1997). furunculosis
Multidisiplin Ikan Penelitian Penyakit ( 1 st edition), Academic Press, ISBN 0-12093040-4.

Borrell, N .; Acinas, SG; Figueras, MJ & Martnez-Murcia, AJ (1997). identifikasi


Aeromonas isolat klinis oleh polimorfisme panjang fragmen restriksi dari PCRamplified 16S rRNA gen. Jurnal
Mikrobiologi Klinik 35, pp. 1671-1674.
Borrell, N., Figueras, MJ & guarro, J. (1998). identifikasi fenotip Aeromonas
genomospecies dari sumber klinis dan lingkungan. Canadian Journal of Microbiology 44, pp. 7-12.

Byers, HK; Gudkovs, N. & Crane, MS (2002a). tes berbasis PCR untuk patogen ikan
Aeromonas salmonicida I. Evaluasi tiga PCR primer set untuk deteksi dan identifikasi. Penyakit Perairan
Organisme 49, hlm. 129-138.
Byers, HK; Cipriano, RC; Gudkovs, N. & Crane, MS (2002b). tes berbasis PCR untuk
patogen ikan Aeromonas salmonicida II. evaluasi lebih lanjut dan validasi tiga PCR primer set dengan ikan
yang terinfeksi. Penyakit Perairan Organisme 49, hlm. 139-144.

www.intechopen.com
Molekul Deteksi dan Karakterisasi furunkulosis dan lain Aeromonas Infeksi
ikan 127

Chacon, MR; Castro-Escarpulli, G .; Soler, L .; Guarro, J. & Figueras, MJ (2002). Sebuah DNA
menyelidiki khusus untuk Aeromonas koloni. Diagnostik Mikrobiologi dan Penyakit Infeksi
44, hlm. 221-225.
Daher, RK; Filion, G .; Tan, SG; Dallaire-Dufresne, S .; Paquet, VE, & Charette, SJ (2011).
Perubahan faktor virulensi dan penataan ulang dari plasmid pAsa5 disebabkan oleh pertumbuhan Aeromonas
salmonicida dalam kondisi stres. Mikrobiologi Kedokteran hewan 152, pp. 353-360.

Fehr, D .; Casanova, C .; Liverman, A .; Blazkova, H .; Orth, K .; Dobbelaere, D .; Frey, J. & Burr,


SE (2006). AopP, tipe III efektor protein dari Aeromonas salmonicida, menghambat NF-kappaB signaling
jalur. Mikrobiologi 152, pp. 2.809-28.018.
Figueras, MJ (2005). relevansi klinis dari Aeromonas. Ulasan di Mikrobiologi Medis 16, hlm. 145-153.

Figueras, MJ; Alperi, A .; Saavedra, MJ; Ko, WC; Gonzalo, N .; Navarro, M. & Martnez-
Murcia A (2009). relevansi klinis yang baru saja dijelaskan aquariorum Aeromonas. Jurnal Mikrobiologi
Klinik 47, pp. 3742-3746.
Figueras, MJ; Alperi, A .; Beaz-Hidalgo, R .; Stackebrandt, E .; Brambilla, E .; Monera, A. &
Martnez-Murcia, AJ (2011a). Aeromonas rivuli sp. November, terisolasi dari wilayah hulu anak sungai air
karst di Jerman. International Journal of Microbiology sistematis dan Evolusi 61, hlm. 242-248.

Figueras, MJ; Beaz-Hidalgo, R .; Collado, L. & Martnez-Murcia, AJ (2011b) Sudut pandang


pada recomendations untuk baru deskripsi spesies bakteri dan dampaknya terhadap genus Aeromonas dan
Arcobacter. Buletin Bergey's Internasional Society for Microbial Sistematika 2, bagian 1, pp. 1-16.

Figueras, MJ; Soler, L .; Chacon, MR; Guarro, J. & Martnez-Murcia, AJ (2000). Penggunaan
polimorfisme panjang fragmen restriksi dari gen 16S rRNA PCR-diperkuat untuk identifikasi Aeromonas spp.
Jurnal Mikrobiologi Klinik 38, pp. 2023-2025.

Godoy, M .; Gherardelli, V .; Heisinger, A .; Fernndez, J .; Olmos, P .; Ovalle, L .; Ilardi, P. &


Avendano-Herrera, R. (2010). deskripsi pertama furunculosis atipikal di air tawar bertani salmon Atlantik, Salmo
salar L., di Chili. Jurnal Penyakit Ikan
33, hlm. 441-449.
Goldschmidt-Clermont, E .; Hochwartner, O .; Demarta, A .; Caminada, AP & Frey, J. (2009).
Wabah penyakit ulseratif dan hemoragik di Arctic char Salvelinus alpinus disebabkan oleh Aeromonas
salmonicida subsp. smithia. Penyakit Perairan Organisme
86, hlm. 81-86.
Gonzlez, SF; Krug, MJ; Nielsen, ME; Santos, Y. & Call, DR (2004). Serentak
deteksi patogen ikan laut dengan menggunakan multipleks PCR dan microarray DNA.
Jurnal Mikrobiologi Klinik 42, pp. 1414-1419.
Goodwin, AE & Merry, GE (2009). Apakah semua kasus koi ulkus berhubungan dengan infeksi oleh
atipikal Aeromonas salmonicida? Polymerase tes reaksi berantai penyeka kulit ikan koi yang disampaikan oleh
penggemar. Journal of Aquatic Kesehatan Hewan 21, hlm. 98-103.
Gudmundsdttir, BK & Bjrnsdttir, B. (2007). Vaksinasi terhadap furunculosis atipikal
dan penyakit maag musim dingin ikan. Vaksin 25, pp. 5512-5523.

www.intechopen.com
128 Kesehatan dan Lingkungan di Budidaya

Gustafson, CE; Thomas, CJ, & Trust, JT (1992). deteksi Aeromonas salmonicida dari
ikan dengan menggunakan polymerase chain amplifikasi reaksi dari permukaan virulensi gen array yang protein. Mikrobiologi
Terapan dan Lingkungan 58, pp. 3816-3825.
Han, HJ; Kim, DY; Kim, WS; Kim, CS; Jung, SJ; Oh, MJ & Kim, DH (2011). atypical
Aeromonas salmonicida infeksi pada rockfish hitam, Sebastes Schlegeli Hilgendorf, di Korea. Jurnal Penyakit
Ikan 34, hlm. 47-55.
Hiney, M .; Dawson, MT; Heery, DM; Smith, PR; Gannon, F. & Powell, R. (1992). DNA
menyelidiki untuk Aeromonas salmonicida. dan Terapan Lingkungan Mikrobiologi 58, pp. 1039-
1042.
Hiney, M. & Olivier, G. (1999) furunculosis ( Aeromonas salmonicida). di, Penyakit Ikan dan
Gangguan, Vol. 3. Viral, bakteri dan jamur Infeksi. PTK Woo dan DW Bruno (Eds), hlm. 341-425. CABI
Publishing, ISBN 9781845935542, New York, Amerika Serikat. Hie, S .; Heum, M. & Thoresen, OF (1997).
Evaluasi rantai polimerase reaction-
assay berdasarkan untuk deteksi Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida di Atlantic salmon Salmo salar.
Penyakit Perairan Organisme 30, hlm. 27-35.
Janda, JM & Abbott, SL (2010). genus Aeromonas, taksonomi, patogenisitas, dan
infeksi. Ulasan Mikrobiologi Klinik 23, hlm. 35-73.
Joseph, SW & Carnahan, A. (1994). Isolasi, identifikasi dan sistematika dari
mobil Aeromonas jenis. Ann Rev Ikan dise 4, pp. 315-343.
Juni, JW; Hyung, KJ; Gomez, DK; Choresca, CH; Han, JE; Shin, SP & Chang, PS
(2010). Terjadinya resisten terhadap tetrasiklin Aeromonas hydrophila infeksi pada Loach cyprinid Korea ( Misgurnus
anguillicaudatus) Afrika Jurnal Mikrobiologi Penelitian 4, pp. 849-855.

Karvonen, A .; Rintamki, P .; Jokela, J. & Valtonen, ET (2010). Peningkatan suhu air


dan risiko penyakit pada sistem perairan, perubahan iklim meningkatkan risiko beberapa, tapi tidak semua, penyakit. Jurnal
Internasional untuk Parasitologi 40, pp. 1483-1488.
Kingombe, CI; D'Aoust, JY; Huys, G .; Hofmann, L .; Rao, M. & Kwan, J. (2010). Multiplex
Metode PCR untuk deteksi tiga Aeromonas gen enterotoksin. Mikrobiologi Terapan dan Lingkungan 76,
hlm. 425-433.
Kozi ska, A. (2007) spesies patogen dominan dari aeromonads mesofilik diisolasi dari
ikan yang sakit dan sehat berbudaya di Polandia. Jurnal penyakit ikan 30, pp. 293-
301.
Kozi ska, A .; Figueras, MJ; Chacon, MR & Soler, L. (2002). karakteristik fenotipik dan
patogenisitas Aeromonas genomospecies diisolasi dari ikan mas ( Cyprinus carpio L.) Jurnal Mikrobiologi
Terapan 93, pp. 1034-1041.
Kulkarni, A .; Caipang, CM; Brinchmann, MF & Kiron, V. (2010). deteksi simultan
patogen menyebabkan francisellosis, furunkulosis dan vibriosis di Atlantic cod oleh polymerase chain
reaction multipleks. Budidaya Penelitian 41, pp. 1533-1538.
Kulkarni, A .; Caipang, CM; Brinchmann, MF; Korsnes, K. & Kiron, V. (2009). loop-
dimediasi amplifikasi isotermal, assay untuk mendeteksi furunculosis atipikal yang disebabkan oleh Aeromonas
salmonicida di Atlantic cod, Gadus morhua. Jurnal Metode Cepat dan Otomasi di Mikrobiologi 17, hlm.
476-489.
Kupfer, M .; Kuhnert, P .; Korczak, BM; Peduzzi, R. & Demarta, A. (2006). genetik
hubungan Aeromonas strain disimpulkan dari 16S rRNA, gyrB dan rpoB gen

www.intechopen.com
Molekul Deteksi dan Karakterisasi furunkulosis dan lain Aeromonas Infeksi
ikan 129

urutan. International Journal of Microbiology sistematis dan Evolusi 56, pp. 2743-2751.

Lamy, B. (2011). Pengembangan dan evaluasi penggunaan multilokus Urutan Skema


untuk seluruh genus Aeromonas. 10 Simposium Internasional Aeromonas dan
Plesiomonas. Galveston, Texas, Amerika Serikat, Mei 2011.
Li, Y. & Cai, SH (2011). Identifikasi dan patogenisitas Aeromonas sobria pada ekor-busuk
penyakit pada ikan nila remaja Oreochromis niloticus. Mikrobiologi saat ini 62, hlm. 623-
627.
Lund, V. & Mikkelsen, H. (2004). keragaman genetik di antara A-protein strain atipikal
Aeromonas salmonicida. Penyakit Perairan Organisme 61, hlm. 257-262.
Marcos-Lpez, M .; Gale, P .; Oidtmann, BC & Peeler, EJ (2010). Menilai dampak dari
perubahan iklim terhadap munculnya penyakit pada ikan air tawar di Inggris.
Lintas batas dan Kemunculan Penyakit 57, hlm. 293-304.
Marcogliese, DJ (2008). Dampak perubahan iklim terhadap parasit dan menular
penyakit hewan air. Revue Scientifique et Teknik-Office International des Epizooties 27, hlm. 467-484.

Martin-Carnahan, A. & Joseph, SW (2005). Keluarga I. Aeromonadaceae Colwell, Macdonnell


dan deley 1986. Dalam Pedoman Bergey ini Sistematik Bakteriologi, 2nd Ed., Vol. 2. Brennan DJ, Krieg NR,
Staley JT, Garrity GN (Eds.), Pp.556-578, Springer-Verlag, ISBN 0-387-95040-0, New York, Amerika Serikat.

Martnez-Murcia, AJ; Benlloch, S. & Collins, MD (1992). hubungan timbal balik filogenetik
anggota genera Aeromonas dan Plesiomonas ditentukan oleh 16S sekuensing DNA ribosom, kurangnya
kesesuaian dengan hasil hibridisasi DNA-DNA.
International Journal of Bacteriology Sistematis 42, hlm. 412-421.
Martnez-Murcia, A .; Morena, A .; Saavedra, MJ; Ocina, R .; Lpez-lvarez, M .; Lara, E. &
Figueras, MJ (2011). Multilokus filogenetik Analisis Genus Aeromonas. Sistematis dan Mikrobiologi
Terapan 34, hlm. 189-199.
Martnez-Murcia, AJ; Soler, L .; Saavedra, MJ; Chacon, MR; Guarro, J .; Stackebrandt, E. &
Figueras, MJ (2005). Fenotipik, genotip, dan perbedaan filogenetik untuk membedakan Aeromonas
salmonicida dari Aeromonas bestiarum. Internasional
Mikrobiologi 8, pp. 259-269.
Martino, ME; Fasolato, L .; Montemurro, F .; Rosteghin, M .; Manfrin, A .; Patarnello, T .;
Novelli, E. & Cardazzo, B. (2011). Penentuan keragaman mikroba
Aeromonas strain atas dasar urutan mengetik multilokus, fenotipe, dan kehadiran gen virulensi diduga. Mikrobiologi
Terapan dan Lingkungan 77, pp. 4986-5000.

Minana-Galbis, D .; Urbizu-Serrano, A .; Farfan, M .; Fust, MC & Loren, JG (2009).


analisis filogenetik dan identifikasi Aeromonas spesies berdasarkan urutan dari cpn60 Target universal. International
Journal of Microbiology sistematis dan Evolusi 59, pp. 1976-1983.

Miyata, M .; Inglis, V. & Aoki, T. (1996) Identifikasi cepat dari Aeromonas salmonicida
bagian jenis salmonicida oleh reaksi berantai polimerase. Budidaya 141, pp. 13-
24.

www.intechopen.com
130 Kesehatan dan Lingkungan di Budidaya

Mohanty, B .; Mohanty, S .; Sahoo, J. & Sharma, A. (2010). Perubahan Iklim, Dampak pada
Perikanan dan Budidaya. Di Perubahan Iklim dan Variabilitas, Suzanne Simard (Ed.), ISBN,
978-953-307-144-2, Intech, Diperoleh dari,
http, //
www.intechopen.com/articles/show/title/climate-change-impacts-onfisheries-and-aquaculture.
Mooney, J .; Powell, E .; Clabby, C. & Powell, R. (1995). Deteksi Aeromonas salmonicida di
salmon Atlantik liar menggunakan tes DNA Probe tertentu. Penyakit Perairan Organisme
21, hlm. 131-135.
Morgan, JAW; Rhodes, G. & Pickup, RW (1993). Kelangsungan hidup non-culturable Aeromonas
salmonicida di air danau. Mikrobiologi Terapan dan Lingkungan 59, hlm. 874-880.
Nam, IY & Yoh, K. (2007). deteksi cepat faktor virulensi Aeromonas diisolasi dari
trout pertanian oleh hexaplex-PCR. Jurnal Mikrobiologi 45, hlm. 297-304.
Nawaz, M .; Sung, K .; Khan, SA; Khan, AA & Steele, R. (2006). Biokimia dan molekuler
karakterisasi resisten terhadap tetrasiklin Aeromonas veronii isolat dari ikan lele.
Mikrobiologi Terapan dan Lingkungan 27, pp. 6461-6466.
Nhung, PH; Hata, H .; Ohkusu, K .; Noda, M .; Shah, MM; Goto, K. & Ezaki, T. (2007). Menggunakan
penanda filogenetik Novel dnaJ dan DNA-DNA hibridisasi untuk memperjelas hubungan timbal balik
dalam genus Aeromonas. International Journal of Microbiology sistematis dan Evolusi 57, pp. 1232-1237.

Nielsen, ME; Hoi, L .; Schmidt, AS; Qian, D .; Shimada, T .; Shen, JY & Larsen, JL (2001) adalah
Aeromonas hydrophila motil yang dominan Aeromonas spesies yang menyebabkan wabah penyakit dalam
produksi perikanan budidaya di Provinsi Zhejiang Cina? Penyakit Perairan Organisme 46, hlm. 23-29.

Nilsson, WB; Gudkovs, N. & Strom, MS (2006). strain atipikal Aeromonas salmonicida
berisi beberapa salinan penyisipan elemen ISAsa4 berguna sebagai penanda genetik dan target untuk pengujian
PCR. Penyakit Perairan Organisme 70, hlm. 209-217
Noga, EJ (2010). Penyakit ikan ( 2 nd edition) Willey-Blackwell, ISBN 978-0-8138-0697-6,
Singapura.
Notomi, T .; Okayama, H .; Masubuchi, H .; Yonekawa, T .; Watanabe, K .; Amino, N. & Hase,
T. (2000). Loop-dimediasi amplifikasi isotermal dari DNA. Asam Nukleat Penelitian
28, hlm. E63.
Oakey, H .; Gibson, LF & George, AM (1998). Co-migrasi amplikon RAPD-PCR dari
Aeromonas hydrophila. Janin Mikrobiologi Surat 164, pp. 35-38.
O'Brien, D .; Mooney, J .; Ryan, D .; Powell, E .; Hiney, M .; Smith, PR & Powell, R. (1994)
deteksi Aeromonas salmonicida, agen penyebab furunculosis pada ikan salmonid, dari limbah tangki
smolts Atlantik salmon hatchery-dipelihara. Mikrobiologi Terapan dan Lingkungan 60, pp. 3874-3877.

Onuk, EE; Ciftci, A .; Findik, A. & Durmaz, Y. (2010). Pengembangan dan evaluasi dari
PCR multiplex untuk deteksi simultan Flavobacterium psychrophilum, Yersinia ruckeri dan Aeromonas
salmonicida subsp. salmonicida perikanan budaya.
Journal of Veterenary Sains 11, pp. 235-241.
Park, TS; Oh, SH; Lee, EY; Lee, TK; Park, KH; Figueras, MJ & Chang, CL (2003).
kesalahan identifikasi Aeromonas veronii sobria biovar sebagai Vibrio alginolyticus oleh sistem Vitek. Surat
Mikrobiologi Terapan 37, hlm. 349-353.

www.intechopen.com
Molekul Deteksi dan Karakterisasi furunkulosis dan lain Aeromonas Infeksi
ikan 131

Pavan, ME; Abbott, SL; Zorzpulos, J. & Janda, JM (2000). Aeromonas salmonicida subsp.
pectinolytica subsp. November, subspesies pektinase-positif baru diisolasi dari sungai tercemar berat. International
Journal of Microbiology sistematis dan Evolusi 50, pp. 1119-1124.

Pridgeon, J .; Klesius, PH; Mu, X .; Carter, D .; Fleming, K .; Xu, D .; Srivastava, K. & Reddy,
G. (2011). Identifikasi DNA unik sekuens hadir dalam sangat virulen 2009 Alabama isolat Aeromonas
hydrophila. Mikrobiologi Kedokteran hewan 152, pp. 117-
125.
Sepe, A .; Barbieri, P .; Peduzzi, R. & Demarta, A. (2008) Evaluasi recA sequencing untuk
klasifikasi Aeromonas strain di tingkat genotipe. Surat Mikrobiologi Terapan 46, hlm. 439-444.

Shaw, JG (2011). chracterization molekul dari sistem flagellar dari Aeromonas jenis.
10 Simposium Internasional Aeromonas dan Plesiomonas. Galveston, Texas, Amerika Serikat, Mei 2011.

Skugor, S .; Jrgensen, SM; Gjerde, B. & Krasnov, A. (2009). ekspresi gen hati
profiling mengungkapkan tanggapan pelindung di Atlantic salmon divaksinasi furunculosis. BMC
Genomics 10.503.
Soler L, Figueras MJ, Chacon MR, guarro J, Martnez-Murcia AJ (2003a). Perbandingan dari
tiga metode molekuler untuk mengetik Aeromonas popoffii isolat. Antonie van Leeuwenhoek 83, hlm.
341-349.
Soler, L .; Marco, FF; Vila, J .; Chacon, MR; Guarro, J. & Figueras, MJ (2003b) Evaluasi
dua sistem miniatur Microscan W / A dan BBL kristal E / NF untuk identifikasi isolat klinis Aeromonas spp.
Jurnal Mikrobiologi Klinik 41, pp. 5732-
5734.
Soler, L .; Yaez, MA; Chacon, MR; Aguilera-Arreola, MG; Cataln, V .; Figueras, MJ &
Martnez-Murcia, AJ (2004). analisis filogenetik dari genus Aeromonas didasarkan pada dua gen rumah
tangga. International Journal of Microbiology sistematis dan Evolusi 54, pp. 1511-1519.

Soriano-Vargas, E .; Castro-Escarpulli, G .; Aguilera-Arreola, MG; Vega-Castillo, F. &


Salgado-Miranda, C. (2010). Aislamiento e identificacin de Aeromonas
bestiarum a partir de carpa comn de cultivo ( Cyprinus carpio L.) procedentes de Santa Mara Chapa de
Mota, Estado de Mxico, Mxico. Veterinaria Mxico 41, hlm. 111-115.

Stackebrandt, E .; Frederiksen, W .; Garrity, GM; Grimont, PAD; Kmpfer, P .; Gadis,


MCJ; Nesme, X .; Rossello-Mra, R .; Ayunan, J .; Trper, HG; Vauterin, L .; Menangkal,
AC & Whitman, WB (2002). Laporan komite ad hoc untuk reevaluasi definisi spesies dalam bakteriologi. Internationa
Journal of Systematic dan Evolusi Mikrobiologi 52, pp. 1043-1047.

Tam, B .; Gough, WA & Tsuji, L. (2011). Dampak pemanasan pada penampilan


furunculosis dalam ikan dari wilayah James Bay, Quebec, Kanada. Perubahan Lingkungan Daerah 11,
hlm. 123-132.
Wiklund, T. & Dalsgaard, I. (1998). Terjadinya dan pentingnya atipikal Aeromonas
salmonicida di non-salmonid dan host ikan salmonid. Penyakit Perairan Organisme
32, hlm. 49-69.

www.intechopen.com
132 Kesehatan dan Lingkungan di Budidaya

Yaez, MA; Cataln, V .; Apraiz, D .; Figueras, MJ & Martnez-Murcia, AJ (2003).


analisis filogenetik dari anggota genus Aeromonas berdasarkan gyrB urutan gen. International Journal of
Microbiology sistematis dan Evolusi 53, hlm. 875-883.

www.intechopen.com
Kesehatan dan Lingkungan di Budidaya

Disunting oleh Dr. Edmir Carvalho

ISBN 978-953-51-0497-1 Hard

cover, 414 halaman

Penerbit Intech

dipublikasikan secara online 11, April 2012

Diterbitkan dalam edisi cetak April 2012

Budidaya telah berkembang di tingkat yang cepat, dan pengembangan lebih lanjut harus bergantung pada asimilasi pengetahuan ilmiah dari berbagai bidang

seperti biologi molekuler dan seluler, dan ekologi. Memahami hubungan antara spesies ternak dan patogen dan parasit, dan hubungan ini dengan lingkungan

merupakan suatu tantangan besar. masyarakat ilmiah terlibat dalam membangun model untuk budidaya yang tidak membahayakan ekosistem dan

menyediakan sumber terpercaya seafood sehat. Buku ini memiliki kontribusi dari penulis internasional yang terkenal, menyajikan bab ilmiah berkualitas tinggi

menangani isu-isu kunci untuk manajemen kesehatan yang efektif dari hewan air berbudaya. Tersedia untuk akses internet yang terbuka, buku ini merupakan

upaya untuk mencapai difusi luas pengetahuan yang berguna untuk kedua sektor akademik dan produktif.

Cara referensi

Untuk benar referensi karya ilmiah ini, merasa bebas untuk copy dan paste berikut: Roxana Beaz Hidalgo dan Mara Jos Figueras (2012). Molekul Deteksi

dan Karakterisasi furunkulosis dan lain Aeromonas Ikan Infeksi, Kesehatan dan Lingkungan di Budidaya Perikanan, Dr. Edmir Carvalho (Ed.), ISBN:

978-953-51-0497-1, Intech, Tersedia dari: http: // www. intechopen.com/books/health- dan lingkungan-in-budidaya /

diupdate-informasi-dari-Aeromonas-infeksi-dan-furunculosis yang diturunkan-dari- molekul-methods-

Intech Eropa Intech Cina

Kampus Universitas langkah Ri Slavka Unit 405, Block Office, Hotel Equatorial Shanghai No.65, Yan An Road (Barat),

Krautzeka 83 / A 51000 Rijeka, Kroasia


Shanghai, 200040, Cina Telepon: + 86-21-62489820 Fax: + 86-21-62489821
Telepon: 385 (51) 770 447 Fax: 385 (51)

686 166 www.intechopen.com

Anda mungkin juga menyukai