RESUMEN

En la prctica realizada se prepar el agar PDA picando las papas en cuadros pequeos,
con 200 ml de agua llevndolos al microondas para una coccin total introduciendo las
esporas en cada matraz, agitamos 20 minutos con la tela introducida, filtrando el agua
realizando el lavado con agua por repetidas veces, pasamos a contar las esporas en el
que obtuvimos en el cuadrante 1 185 y en el cuadrante 2 se obtuvo 168, obtenido una
media de 176.5 esporas; lo que pasamos a realizar diluciones a 108 en 12 ml den la que
inocula la biopelicula agitando por 20 minutos para seguir con la etapa de adhesin se
realiza tres lavados los dos primeros por 15 minutos y el ultimo por 10 minutos para
obtener la lectura de biomasa en esporas y biomasa en biopeliculas.

Siguiendo con la prctica se procedi a realizar la evaluacin de la actividad enzimtica

en la que se realiz el clculo de la curva de calibracin en la que se realiz los clculos
de glucosa para realizar posteriores clculos, posteriormente tambin se realiz la curva
patrn en la que se prepar diluciones con el buffer acetato y la solucin madre, lo que
nos es de ayuda para hallar la ecuacin de la curva; se realiz la muestra en el que fue
necesario buffer muestra y el buffer de papel filtro lo que nos sirve para calcular la glucosa
encontrada en la biomasa producida .

En la produccin de biomasa se obtuvo en sumergido un 0.11 y 0.16 % y en la prueba de

biopelicula se obtuvo 0.0262 y 0.0705% los que nos sirvi en la evaluacin enzimtica en
la que se obtuvo en glucosa para biopelicula 0.033, 0.036 y 0.039 en los distintos tubos;
en glucosa para sumergido 0.22, 0.43 y 0.30 en distintos tubos los que se leen en mg/ml.
obteniendo las siguientes actividades enzimticas en biopelicula 0.13, 0.14 y 0.15 y una
actividad enzimtica en sumergido de 0.82, 1.62 y 1.14 respectivamente. Logrando
evaluar la actividad enzimtica de la celulosa.

SUMMARY

In practice on PDA agar was prepared chopping potatoes into small squares, with 200 ml
of water taking them to microwaves for a total cooking introducing spores in each flask, we
shake 20 minutes with the introduced material, performing filtering water washing water
repeatedly passed to count the spores in which we obtained in quadrant 1 185 and 168 in
quadrant 2 was obtained, an average of 176.5 obtained spores; which we had to make
dilutions to 108 in 12 ml den which inoculates the biofilm stirring for 20 minutes to continue
the bonding step three washes the first two for 15 minutes and last for 10 minutes is
performed to obtain the reading of biomass spores and biofilm biomass.
Continuing with the practice proceeded to the evaluation of enzyme activity in the
calculation of the calibration curve in which the calculations glucose was performed to
further calculations subsequently also standard curve was performed was performed in
which dilutions with acetate buffer and the stock solution was prepared, which is to help us
find the equation of the curve; the sample in the sample buffer was necessary buffer
and filter paper which serves to calculate the glucose found in the biomass
produced was performed.In the production of biomass it was obtained dipped 0.11 and
0.16% and testing biofilm 0.0262 and 0.0705% was obtained which served us in enzymatic
assessment that was obtained glucose for biofilm 0.033, 0.036 and 0.039 in various pipes;
immersed into glucose to 0.22, 0.43 and 0.30 in different tubes which are read in mg / ml.
obtaining the following enzyme activities in biofilm 0.13, 0.14 and 0.15 and an enzymatic
activity dipped 0.82, 1.62 and 1.14 respectively. Achieving assess the enzymatic activity of
cellulose.

INTRODUCCIN

Desde 1950, las enzimas lignocelulolticas han incrementado su importancia en diferentes

industrias como en la produccin de alimentos, industria textil, industria papelera,
agricultura e investigacin (Bhat, 2000), principalmente debido a las ventajas que otorgan
en la optimizacin de procesos. Adems, por caractersticas como: su especificidad de
sustrato, el requerimiento de condiciones suaves de pH, temperatura y presin para su
actividad (comparando con procesos qumicos), su contribucin al cuidado del
medioambiente haciendo los procesos ms limpios y su posibilidad de inmovilizacin,
evitando la presencia de stas en los productos finales (MacCabe et al., 2002).
Las enzimas lignocelulolticas incluyen a celulasas y xilanasas. Las celulasas constituyen
un sistema enzimtico de cuatro enzimas: la endo -glucanasa, que hidroliza
randomizadamente celulosa a glucooligosacridos; la exo -glucanasa, que libera glucosa
de la celulosa; la celobiohidrolasa, que libera celobiosa de la celulosa cristalina; y la -
glucosidasa (Szijrto et al., 2004). Asimismo, las xilanasas constituyen tambin un
complejo enzimtico responsable de la hidrlisis de xilano, siendo las principales enzimas
involucradas la endo-1,4- xilanasa, que rompe los enlaces glucosdicos de la cadena
principal de xilano produciendo oligmeros de -D xilopiranosil, y la -xilosidasa que
hidrolizan xilobiosa y xilanooligosacridos (Polizeli et al., 2005).
En respuesta a la demanda creciente de estas enzimas, se ha impulsado la investigacin
y el estudio de diferentes microorganismos lignocelulolticos. Los hongos filamentosos son
la fuente principal de hidrolasas, incluyendo celulasas y xilanasas, debido a su fcil
manejo y costos reducidos. Los principales gneros incluyen
aAspergillus, Trichoderma y Penicillium (MacCabe et al., 2002). Aspergillus niger es uno
de los microorganismos ms utilizados en la produccin de enzimas industriales,
principalmente por sus altos niveles de secrecin de protena, y su estatus GRAS
(generally regarded as safe) (Ward et al., 2006; Schuster et al., 2002; De Vries y Visser,
2001).
De otro lado, el sistema de cultivo ms empleado en la produccin de enzimas
comerciales es la fermentacin sumergida (MacCabe et al., 2002). En este aspecto, en la
produccin de enzimas con hongos filamentosos, la morfologa es de crucial importancia
para lograr una mayor produccin (Villena et al., 2010; Papagianni, 2004; Pazouki y
Panda, 2000). Los factores que afectan la morfologa incluyen el tipo y concentracin de
la fuente de carbono, la concentracin del inculo, los niveles de hidrgeno, fsforo y
otros minerales traza, el O2 y CO2 disueltos, el pH y la temperatura, y factores fsicos
como geometra del fermentador, tipo de agitacin, reologa y sistema de cultivo
(Grimm et al., 2005; Papagianni y Mattey, 2004).
Las principales morfologas desarrolladas en sistemas de fermentacin sumergida
corresponden al crecimiento miceliar o filamentoso y el crecimiento tipo pellet, este ltimo
caracterizado por ser una esfera de micelio. Existen tres tipos principales de pellets, los
de centro compacto y contorno laxo, los totalmente compactos, y los de interior vaco
debido a autolisis (Pazouki y Panda, 2000).
OBJETIVOS
Desarrollar una curva patrn de calibracin
Determinar la actividad enzimtica.

MARCO TEORICO

ACTIVIDAD ENZIMATICA
Se define actividad enzimtica (U) como la cantidad de enzima que cataliza la conversin
de 1 mol de sustrato en un minuto. La actividad especfica es el nmero de unidades de
enzima por miligramo de protena (U/mg prot) o por mililitro de disolucin (U/ml).

Recientemente, el Sistema Internacional de unidades (SI) ha definido la unidad de

actividad enzimtica como la cantidad de enzima que transforma 1 mol de sustrato por
segundo. Esta unidad se llama katal (kat). Como 1 mol son 106 moles y 1 minuto son 60
segundos, resulta que 1 katal equivale a 60 x 106 U. Esta unidad es muy grande, de
forma que se utilizan frecuentemente los submltiplos como el microkatal (kat, 10-6 kat)
o el nanokatal (nkat, 10-9 kat).

Las enzimas actan de acuerdo con la siguiente secuencia: La enzima (E) y el sustrato
(S) se combinan para formar un complejo intermedio enzima sustrato (E-S), el cual se
descompone formando un producto y regenerando la enzima.
Factores que afectan la actividad enzimtica

Concentracin del sustrato.- A mayor concentracin del sustrato, a una

concentracin fija de la enzima se obtiene la velocidad mxima. Despus de que
se alcanza esta velocidad, un aumento en la concentracin del sustrato no tiene
efecto en la velocidad de la reaccin.
Concentracin de la enzima.- Siempre y cuando haya sustrato disponible, un
aumento en la concentracin de la enzima aumenta la velocidad enzimtica hacia
cierto lmite.
Temperatura.- Un incremento de 10C duplica la velocidad de reaccin, hasta
ciertos lmites. El calor es un factor que desnaturaliza las protenas por lo tanto si
la temperatura se eleva demasiada, la enzima pierde su actividad.
pH.- El pH ptimo de la actividad enzimtica es 7, excepto las enzimas del
estmago cuyo pH ptimo es cido.

Presencia de cofactores.- Muchas enzimas dependen de los cofactores, sean

activadores o coenzimas para funcionar adecuadamente. Para las enzimas
que tienen cofactores, la concentracin del cofactor debe ser igual o mayor que
la concentracin de la enzima para obtener una actividad cataltica mxima.

Regulacin de la actividad enzimtica

Una molcula de enzima no tiene por qu actuar siempre a la misma velocidad. Su
actividad puede estar modulada por:

Cambios en el pH
Cambios en la temperatura
Presencia de cofactores
Las concentraciones del sustrato y de los productos finales
Presencia de inhibidores
Modulacin alostrica
Modificacin covalente
Activacin por proteolisis
Isoenzimas

Efecto del pH sobre la actividad enzimtica

Los enzimas poseen grupos qumicos ionizables (carboxilos -
COOH; amino -NH2; tiol -SH; imidazol, etc.) en las cadenas
laterales de sus aminocidos. Segn el pH del medio, estos grupos pueden tener carga
elctrica positiva, negativa o neutra. Como la conformacin de las protenas depende, en
parte, de sus cargas elctricas, habr un pH en el cual la conformacin ser la ms
adecuada para la actividad cataltica (Figura de la derecha). Este es el llamado pH ptimo.

La mayora de los enzimas son muy sensibles a los cambios de pH. Desviaciones de
pocas dcimas por encima o por debajo del pH ptimo pueden afectar drsticamente su
actividad. As, la pepsina gstrica tiene un pH ptimo de 2, la ureasa lo tiene a pH 7 y la
arginasa lo tiene a pH 10 (Figura de la izquierda). Como ligeros cambios del pH pueden
provocar la desnaturalizacin de la protena, los seres vivos han desarrollado sistemas
ms o menos complejos para mantener estable el pH intracelular: Los amortiguadores
fisiolgicos.

Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimtica

En general, los aumentos de temperatura aceleran las

reacciones qumicas: por cada 10C de incremento, la
velocidad de reaccin se duplica. Las reacciones
catalizadas por enzimas siguen esta ley general. Sin
embargo, al ser protenas, a partir de cierta
temperatura, se empiezan a desnaturalizar por el calor.
La temperatura a la cual la actividad cataltica es
mxima se llama temperatura ptima (Figura de la
derecha). Por encima de esta temperatura, el aumento
de velocidad de la reaccin debido a la temperatura es
contrarrestado por la prdida de actividad cataltica
debida a la desnaturalizacin trmica, y la actividad
enzimtica decrece rpidamente hasta anularse.
Efecto de los cofactores sobre la actividad
enzimtica
A veces, un enzima requiere para su funcin la presencia de sustancias no proteicas que
colaboran en la catlisis: los cofactores. Los cofactores pueden ser iones inorgnicos
como el Fe++, Mg++, Mn++, Zn++ etc. Casi un tercio de los enzimas conocidos requieren
cofactores. Cuando el cofactor es una molcula orgnica se llama coenzima. Muchos de
estas coenzimas se sintetizan a partir de vitaminas. En la figura de la izquierda podemos
observar una molcula de mioglobina (protena que transporta oxgeno al tejido muscular)
y su coenzima (el grupo hemo, representado en color verde). Cuando los cofactores y las
coenzimas se encuentran unidos covalentemente al enzima se llaman grupos prostticos.
La forma catalticamente activa del enzima, es decir, el enzima unido a su grupo
prosttico, se llama holoenzima. La parte proteica de un holoenzima (inactiva) se llama
apoenzima, de forma que:

Apoenzima + grupo prosttico= holoenzima

Efecto de las concentraciones sobre la actividad enzimtica

La velocidad de una reaccin enzimtica depende de la concentracin de sustrato. La
Figura de la derecha muestra la velocidad de una reaccin enzimtica a 6
concentraciones distintas de sustrato.

Adems, la presencia de los productos finales puede hacer que la reaccin sea ms lenta,
o incluso invertir su sentido (Figura inferior).

Efecto de los inhibidores sobre la actividad enzimtica

Ciertas molculas pueden inhibir la accin cataltica de un enzima: son los inhibidores.
Estos inhibidores bien pueden ocupar temporalmente el centro activo por semejanza
estructural con el sustrato original (inhibidor competitivo) o bien alteran la conformacin

espacial del enzima, impidiendo su unin al sustrato (inhibidor no competitivo) (Figuras

inferiores).
MATERIALES Y METODOS

MATERIALES:

ESPORAS: Para la produccin de esporas es necesario 200 ml de PDA (agar

papa dextrosa), 2 litros de agua destilada, 4 matraces vacos estriles, 4 matraces
con 70 ml de agua para el mtodo vander.
PARA LA INOCULACIN: Para la inoculacin se necesita 8 telas esteriles, 2
mecheros, matraces con esporas anteriormente preparadas, 100ml de agua
esteril y 6 tubos con tapa esteril
EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA:
CURVA DE CALIBRACIN: Refractmetro, papel filtro, DNS (cido
dinitrosaliclico) para la preparacin de tampn acetato, tubos de ensayo.
CURVA PATRON: Glucosa, bufer acetato, dns (acido dinitrosalicilico), tubos de
ensayo, refractmetro, agua destilada.
MUESTRA: Tubos de ensayo, papel filtro, incubadora, DNS (acido dinitrosalicilico),
refractmetro, agua destilada.

METODO:

- PRODUCCIN DE BIOMASA
1. Cua hongo

Adicional 10ml
de h2o agitar

Por incorporacin sembrar esporas:

 + 50 ml. PDA

Incubar por 48 horas.

2. Adiconar 40 ml de agua para contar las esporas

40 ml. H2O
agitar

Hacer una dilucion de 100 x 104 ml, seguidamente llevar a centrifugacin a 28C por 72
horas a 175 RPM para luego filtrar

70 ml medio
mandels

Incubar se trabaja con telas esteriles, de medida 3.1 x 3.1

3. Adhesin por 20 minutos a 175 RPM.
4. Se realiza un lavado 20 minutos a 175 PRM
5. Se realiza un segundo lavado a 20 minutos por 175RPM
6. Se realiza el conteo de esporas

- EVALUACIN ACTIVIDAD ENZIMATICA

CURVA DE CALIBRACIN
1. Preparar diluciones 1/10, 1/50,1/100.

1mg/m
l

BUFFER 1 1 1

+
+ +

Enzima 10
50 100

Las diluciones se realizan por triplicado cada uno.

2. Introducir el papel filtro

3. Llevar a 50 C en bao maria por un tiempo determinado de 60 minutos.
4. Adicionamos el DNS, llevar a temperaturas de ebullicin por 5 minutos en
la que el DNS acta cocinando a la enzima lo que corta la reaccin y el
azcar libre se agarra de otros.
5. Se lleva a tubos de ensayo las diluciones y se tiene un tubo con sustancia
blanca.
6. Se realiza la lectura de la absorbancia en el refractmetro para con los
datos ledos formar la curva de calibracin.
= ()0.38

CURVA PATRN
1. Preparar solucin madre de glucosa 1.0 mgr/ml a n pH de 4.8; se realiza
por duplicado
 1mg/ml

BUFFER

Acetato 1.4 1.3 1.2 1.1 1

PH 4.8

+ + +
+ +

Sol. 0.1 0.4 0.5

0.2 0.3
MODE

2. Adicionamos 3ml DNS a cada tubo

3ml D.N.S
1.5 * 3ml

3. Rx/ 5 minutos a temperatura ebullicin cortar Rx.

4. Adicionar 5ml de agua destilada
5. Leo absorbancia 540 nm
6. Hallar la ecuacin recta.
MUESTRA
1. Realizar las diluciones de las enzimas 1/10, 1/50, 1/100 se realiza por
duplicado tanto el Bufer de papel filtro y el Bufer muestra

1ml
BUFFER + 0.5ml A E = 3 /ml
4.8 Enzima
 2. Llevar a temperatura de 50 C por 5 minutos.
3. Adicionamos sustrato (papel filtro cortado).

6cm

1cm
1.5

4. Incubar a 50 C * 60 min.
5. Adicionamos 3ml D.N.S.
6. Llevar por 5 minutos a temperatura de ebullicin.
7. Enfriar la Rx
8. Adicionamos 5ml de agua.
9. Leer la absorbancia a 540mn
10. Calcular (glucosa)
= ( + ) ( )

RESULTADOS

- PRODUCCIN DE BIOMASA
- Cuadro 01: obtencin de biomasa en biopelicula
biopelicula tela 1(gr) tela 2(gr)
peso del papel 0.86 0.85
peso del papel + 0.97 1.01
tela
Peso de tela 0.11 0.16
Peso de las telas 0.0838 0.0895
biomasa 0.0262 0.0705
- Cuadro 02: obtencin de biomasa en sumergido
sumergido tela 1(gr) tela 2(gr)
peso del papel 0.87 0.88
peso del papel + 0.88 0.89
tela
biomasa 0.01 0.01
-
 CHART TITLE

0.16

0.11
BIOMASA

0.0705

0.0262

1 2 3 4
SUMERGIDO BIOPELICULA

- EVALUACIN ACTIVIDAD ENZIMATICA

CURVA DE CALIBRACIN

muestra patrn
Diluciones A B promedio
0.1 0.487 0.706 0.5965
0.2 1.3 0.897 1.0985
0.3 0.892 1.563 1.2275
0.4 2.574 2.311 2.4425
0.5 3.3 2.886 3.093

3.5
y = 6.337x - 0.2095
3 R = 0.9352

2.5

2
Series1
1.5 Linear (Series1)

0.5

0
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

Y= ?
M= 6.337

X= ?

B= -0.2095

factor 0.38
dilucin 10

concentraciones
(1)/(10) (1)/(100) (1)/(50)
biopelicula sumergido biopelicula sumergido biopelicula sumergido
0.578 0.942 0.028 0.025 0.037 0.046
0.599 0.58 0.054 0.048 0.026 0.025
0.617 0.739 0.039 0.26 0.027 0.071

biopelicula sumergido
Y X Y X
0.578 0.05815054 0.942 0.11559097
0.599 0.06146442 0.58 0.05846615
0.617 0.06430488 0.739 0.08355689

y x
BPF 0 0.033059807
BM 0.025 0.037004892

(glucosa)= (BPF + BM)-(GM)

reemplazando en la glucosa
glucosa para glucosa para
biopelicula sumergido (mg/ml)
G1 0.03315054 G1 0.21627986
G2 0.03646442 G2 0.42759784
G3 0.03930488 G3 0.29919736

Resolviendo para la actividad enzimtica

resolviendo para la actividad enzimtica

AE = (glucosa) x 0.38 x dilucin
AE biopelicula AE sumergido
AE1 0.125972069 0.82186348
AE2 0.138564778 1.62487179
AE3 0.149358529 1.13694995

promedio SD CV
biopelicul 0.12597206 0.1385647 0.1493585 0.1379651 0.0117047 8.4838514
a 9 8 3 3 6 8
sumergid 0.82186348 1.6248717 1.1369499 1.1945617 33.869517
o 1 9 5 4 0.4045923 4

Sumergido

1.6
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
1 2

BIOPELICULA
0.137965125 0.0110459
0.18
0.16
0.14
0.12
0.1
0.08
0.06
0.04
0.02 0.011704756
0
-0.02 1 2
-0.04
DISCUSIONES

Obtuvimos un rendimiento de 0.16 en la muestra de sumergido lo cual indica un

factor entre los mrgenes establecidos debido a que en la biomasa, en cultivos
como la papa (Solanum tuberosum L.), es la muestra de todo el potencial de
fotosntesis y acumulacin de asimilados de la planta (Fernandez, C. 2001).
Resultando en las biopeliculas un 0.075 siendo menor ya que la calidad y capa
fina de estas ltimas afecta a la biomasa acortaron las etapas de desarrollo pero
no mostraron mayor biomasa final de tubrculos que las sumergidas segn
MulerL. 1964 porque el ndice de crecimiento del cultivo tuvo un mximo y luego
diminuy por efecto de la maduracin y senescencia del cultivo, adems
debindose tambin a otros ndices como los cultivares y por sus orgenes del
tubrculo ya que estos influyen en un lento crecimiento de las cepas cultivadas, lo
cual pudimos evidenciar en la prctica realizada.
La temperatura es un factor determinante en las reacciones enzimticas porque
acelera o retarda la accin de las enzimas, lo que se evidencia con la produccin
de burbujas.
Para que la catalasa funcione correctamente debe tener un ph neutro y
temperatura ambiente.
Segn Vander (1975); la curva de patrn esta dado con datos reales, los grficos
que se obtienes no son tan ideales, pero esta situacin es un obstculo ya que
dentro de ciertos valores es posible trazar la recta ms probable que une un aserie
de puntos, con el uso de los programas de clculos lo de las computadoras. Hay
que advertir que una respuesta en lineal no se obtiene en todo el rango de
concentraciones posibles sino dentro de un conjunto de valores que dependen de
numerosos factores dependientes del mtodo de medicin. Por otra parte este tipo
de curvas no se limita solamente a la determinacin de un elemento compuesto
qumico si no tiene mltiples aplicaciones. Donde se ve la linealidad de la lnea
recta de la cantidad de glucosa con la absorbancia ya que como dice el autor esta
curva est dada por una serie de factores.
Segn Van Weel (1959); la espectrofotometra es el mtodo de anlisis ptico ms
usado en las investigaciones biolgicas. El espectrofotmetro es un instrumento
que permite comparar la radiacin absorbida o transmitida por una solucin que
contiene una cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad
conocida de la misma sustancia. Espectro de absorbancia. Cada especie
absorbente, que recibe el nombre de cromgeno, tiene un determinado espectro
de absorcin. El espectro de absorcin es un grfico donde se representa en
ordenadas la absorbancia y en abscisas la longitud de onda. La medida de la
cantidad de luz absorbida por una solucin es el fundamento de la
espectrofotometra de absorcin. En la grfica se ve una relacin entre la cantidad
de absorbancia la cual depender de su cantidad de glucosa y en la grfica vemos
que la absorbancia se obtiene aumentando la absorbancia del tubo
CONCLUCION
Se desarroll la curva patrn donde el coeficiente de determinacin es de 0.9352.

Se lleg a determinar la actividad enzimtica en unidades usc (unidad Street

close), en la que la absorbancia corregida se obtiene disminuyndole la
absorbancia del tubo blanco; a la vez sirve para llenarla a la grfica y hallar la
cantidad de glucosa residual que queda en el tubo problema y en el tubo testigo.

BIBLIOGRAFIA

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