Secuenciacin, Bases

de datos y diagnostico
molecular
Dr. Eder U. Arredondo E.
Secuenciar una molcula de ADN consiste en determinar en qu orden se
disponen los cuatro nucletidos (A, T, C y G) que componen la molcula.

SECUENCIACIN
Replicacin celular
Replicacin celular
Replicacin celular
Secuenciacin
Involucra:
La degradacin especfica y el fraccionamiento de los
polinucletidos de inters a fragmentos suficientemente pequeos
para ser secuenciados.
La secuenciacin de los fragmentos pequeos.
El ordenamiento de los fragmentos a travs de la repeticin de los
pasos anteriores, usando un procedimiento de degradacin que
produce una serie de fragmentos de polinucletidos que traslapan
el punto de corte en la primera serie..
Inicio de la secuenciacin
El primer mtodo diseado para secuenciar el ADN fue desarrollado
por Allan Maxam y Walter Gilbert en 1977.
Es un mtodo qumico que somete la molcula de DNA a distintos
mtodos de ruptura. Cada mtodo escinde la molcula all donde
haya un nucletido especfico.
Este mtodo es bastante laborioso y, hoy en da, ha sido sustituido
por mtodos enzimticos que, adems, se pueden llevar a cabo de
forma automatizada.
Inicio de la secuenciacin
En 1977, Frederick Sanger desarroll el mtodo de secuenciacin
de ADN conocido como mtodo de Sanger.
Dos aos ms tarde emple esta tcnica para secuenciar el genoma
del bacterifago Phi-X174, el primer cido nucleico secuenciado
totalmente en la historia. Realiz este trabajo manualmente, sin
ayuda de ningn automatismo.
Este trabajo fue base fundamental para proyectos tan ambiciosos
como el Proyecto Genoma Humano, y por l se le concedi su
segundo Premio Nobel en 1980, que comparti con Walter Gilbert.
 Mtodo Sanger
Es un mtodo enzimtico que permite determinar la secuencia del molde a
medida que se sintetiza su hebra complementaria.
Se necesitan los siguientes componentes:
un ADN de cadena sencilla que acta como molde
un cebador para iniciar la sntesis de ADN
los cuatro desoxirribonucletidos trifosfato (dATP, dGTP, dCTP y dTTP)
la enzima ADN-polimerasa
los cuatro didesoxirribonucletidos trifosfato (ddATP, ddGTP, ddCTP ddTTP)
Que son utilizados por la ADN polimerasa para construir la nueva hebra pero,
una vez incorporados, impiden la adicin de nuevos nucletidos.
La secuenciacin se lleva a cabo en cuatro tubos. Cada tubo contiene el molde,
el cebador, los cuatro desoxirribonucletidos trifosfato (dNTP), la polimerasa y
un didesoxirribonucletido trifosfato (ddNTP) distinto en cada caso.
Mtodo Sanger
Mtodo Sanger
Mtodo Sanger
Mtodo Sanger
Mejoras al mtodo de Sanger
Los ddNTP terminadores de cadena estn marcados fluorescentemente.
Cada ddNTP se marca con un fluorforo distinto, que no interfiere en la
reaccin de la polimerasa y que emite luz con una longitud de onda
caracterstica.
De este modo, la reaccin se lleva a cabo en un slo tubo, no en cuatro.
Se sustituye la ADN polimerasa por la Taq-polimerasa. De este modo es
posible automatizar el proceso como si se tratara de una PCR. En cada
ciclo aumenta de forma exponencial el nmero de fragmentos generados,
cada uno marcado con una molcula fluorescente que emite luz de
distinto color, en funcin del ddNTP terminal.
Por eso, a este mtodo tambin se le conoce como secuenciacin cclica.
Mejoras al mtodo de Sanger
Mejoras al mtodo de Sanger
La separacin de los fragmentos se realiza mediante electroforesis capilar,
que es ms rpida que la electroforesis en gel. Los fragmentos de distintos
tamaos llegan al final del capilar, donde son excitados con un lser y se
detecta la fluorescencia emitida por el ddNTP terminal.
El color de esta fluorescencia determina de qu nucletido se trata. El
grfico resultante se denomina electroferograma, en el que se observan
picos de diversos colores.
Cada color indica qu nucletido ocupa cada posicin en la molcula de
ADN o, lo que es lo mismo, su secuencia.
Mejoras al mtodo de Sanger
ABI PRISM 310
ABI PRISM 310
DNA secuenciacin
DNA secuenciacin
DNA secuenciacin
Pirosecuenciacin
Bibliotecas de DNA genomico
Colecciones de fragmentos de DNA clonado de un organismo particular
contenidos dentro de bacterias o virus como hospederos.
Bibliotecas de DNAc
Microcrips de DNA
Microcrips de DNA
Microcrips de DNA
Microcrips de DNA
Microcrips de DNA
Microcrips de DNA
Microcrips de DNA
Segunda generacin de secuanciadores

Los mtodos de la primera generacin son capaces de secuenciar

hasta 100 kb al da, con lo que se necesitan varios aos para
secuenciar el genoma humano. Durante esta ltima dcada se han
desarrollado los denominados "mtodos de segunda generacin"
que son capaces de llevar a cabo el proceso de secuenciacin de
forma muchsimo ms rpida.
Estos mtodos se caracterizan porque secuencian de forma masiva
y simultnea (en paralelo) la genoteca completa y permiten
secuenciar la totalidad del genoma humano en cuestin de das.
Segunda generacin de secuanciadores

La primera fase de este mtodo consiste en la preparacin de una

genoteca.
Se fragmenta el ADN genmico por mtodos suaves como, por
ejemplo, la nebulizacin, que genera fragmentos de entre 300 y 800
pares de bases. Se marcan los extremos de los fragmentos con dos
tipos de adaptadores, que denominaremos A y B (uno permitir
que el fragmento se una a las esferas de agarosa y el otro es
complementario al oligonucletido que actuar como cebador en
las fases de amplificacin y secuenciacin).
Se seleccionan los fragmentos marcados en uno de sus extremos
con el adaptador A y en el otro con el adaptador B.
Segunda generacin de secuanciadores
Segunda generacin de secuanciadores

En la segunda fase se hace una PCR en emulsin, es decir, en una mezcla

de aceite y agua. Para ello, primero se mezclan los fragmentos de la
genoteca con esferas de agarosa recubiertas con un oligo complementario
a uno de los adaptadores. Se hace la mezcla de forma que cada esfera slo
se una a un fragmento de la genoteca.
Despus se aade una emulsin que contiene, en su fase acuosa, todos los
reactivos necesarios para la PCR. Cada esfera queda aislada en una gota
acuosa rodeada de aceite y separada de las dems esferas. Cada gota se
convierte en un microrreactor en el que se lleva a cabo la PCR.
En cada gota aumenta exponencialmente el nmero de fragmentos de
ADN (todos ellos idnticos) que, a su vez, se unen a los oligonucletidos
que recubren la esfera.
Al final del proceso, cada esfera est recubierta de aproximadamente dos
millones de fragmentos de ADN.
Segunda generacin de secuanciadores
Segunda generacin de secuanciadores

A continuacin, se deshace la emulsin y se depositan las esferas

recubiertas de ADN en una placa que contiene cientos de miles de
pocillos con un dimetro medio de 44 m, de manera que en cada
pocillo slo cabe una esfera. Algunos pocillos pueden quedar
vacos.
A continuacin se aaden otras esferas ms pequeas sobre las que
se han inmobilizado dos de las enzimas que intervienen en el
proceso de pirosecuenciacin (la sulfurilasa, que convierte el PPi en
ATP, y luciferasa, que convierte la luciferina en oxiluciferina y genera
un fotn de luz).
Segunda generacin de secuanciadores
Segunda generacin de secuanciadores

En la tercera fase se lleva a cabo la pirosecuenciacin. El sistema de

flujo hace pasar de manera secuencial cada uno de los cuatro
nucletidos a travs de la placa que contiene los pocillos.
Se aaden siempre en el mismo orden (TACG) con lo que se
consigue una secuenciacin masiva en paralelo (cientos de miles de
pocillos, cada uno con dos millones de fragmentos de ADN). Cada
vez que en uno de los pocillos se incorpora un nucletido se genera
una seal quimioluminiscente que es recogida por una cmara
digital.
Esta seal es proporcional al nmero de nucletidos que se
incorporan en cada pocillo.
Segunda generacin de secuanciadores
Segunda generacin de secuanciadores
Solid
Ilumina
Ion torrent 3er generacin
Aplicaciones
Aplicaciones
Aplicaciones
Aplicaciones
Aplicaciones
Aplicaciones
Aplicaciones
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NCBI
NCBI
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