PENGUKURAN AKTIVITAS PROTEASE

Oleh :
Nama : Mutia Utaminingtyas
NIM : B1J014070
Rombongan : III
Kelompok :3
Asisten : Ristiandani Riana P

LAPORAN PRAKTIKUM FISIOLOGI NUTRISI

KEMENTERIAN RISET, TEKNOLOGI, DAN PENDIDIKAN TINGGI

UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
FAKULTAS BIOLOGI
PURWOKERTO
2016
 I. PENDHULUAN

1.1 Latar Belakang

Enzim merupkan katalis protein yang dibentuk di dalam sel tubuh makhluk
hidup. Katalis adalah suatu zat yang bertugas mempercepat atau memperlambat reaksi.
Pada ahir reaksi tersebut dilepaskan, zat tersebut akan kembli ke bentuk semula.
Katalisator yang ada di daalam sel makhluk hidup dapat disebut dengn biokatalistor.
Tentunya, sebagai katalis, enzim memiliki fungsi yang relatif dominan dn menyangkut
seluruh aktivitas kehidupan manusia, hewan maupun tumbuhan (Suranto, 2011).
Menurut Sumardjo (2006), enzim merupakan kelompok protein yang bersifat katalis
dan mengatur perubahan senyawa kimia dalam sistem biologis. Enzim dapat
dihasilkan oleh hewan, tumbuhan dan mikroorganisme. Secara katalitik, enzim
menjalankan fungsinya dalam berbagai reaksi seperti hidrolisis, oksidasi, reduksi,
isomerasi, adisi, transfer gugus, dan kadang-kadang pemutusan rantai karbon.
Kinetika enzim dipengaruhi oleh laju reaksi enzimatik dalah konsentrsi
sunstrt dan enzim, demikin pula faktor-faktor lain seperti pH, suhu dan ada tidaknya
kofaktor ion logm. Kajin mengenaai bagaimana suatu laju bergantung pada variabel-
variabel yang diperoleh secr percobaan dapat menyebabkan perbedaan di aantara
mekaanisme-mekanisme yang mungkin terjadi. Prinsip aksi masa menyatakan bahwa
untuk tahapan reksi kimia yang tunggal dan tidak dapat baalik, laju reksiny sebnding
dengan konsentrasi reaktn yaang terlibat dalam proses tersebut. Tetapan
kesebandingan disebut dengan tetapan laju (Kuchel & Ralston, 2002).
Kondisi perubahan keberadaan pakan sering dihadapi oleh hewan, termasuk
ikan, selama siklus hidupnya. Kondisi ini dapat terjadi baik di lingkungan alami
maupun pada kondisi budidaya. Pada kondisi budidaya, perubahan keberadaan pakan
terjadi karena diterapkannnya strategi pemuasaan dan pemberian pakan. Beberapa
penelitian berkaitan dengan pemuasaan dan pemberian pakan telah membuktikan
bahwa pemuasaan dan pemberian pakan kembali dapat memicu munculnya
pertumbuhan kompensatori seperti yang terjadi (Zhu et al., 2004).

1.2 Tujuan

Tujuan dari praktikum kali ini adalah mengetahui kapasitas pencernaan ikan
yang terukur sebagai aktivitas protease pada ikan yang memperoleh asupan pakan
dengan kapasitas berbeda.
 II. MATERI DAN METODE

2.1 Materi

Bahan yang digunakan pada praktikum kali ini adalah ikan lele (Clarias
batrachus), nilem (Osteochilus vittatus), balok es, buffer ph 8,1 350 L Tris-HCl
buffer, pakan ikan, ekstak enzim 50 L, larutan TCA, larutan tirosin standar, label dan
aquabides.
Alat yang digunakan adalah alat bedah, bak preparat, homogenizer,
eppendoft, sentrifuges, tabung reaksi, rak tabung reaksi digital scales, glovers, beaker
glass, pipet dan tissue, vortex, refrigtor, spektofotometer.

2.2 Metode

a. Prosedur preparasi jaringan

1. Alat dan bahan disiapkan
2. Ikan dibedah diatas balok es, saluran digesti diisolasi dan ditimbang.
3. Larutan 50 mM Tris-HCl buffer ditambahkan pada saluran digesti dengan rasio
1:8.
4. Saluran digesti yang sudah dicampur dengan Tris-HCl dilumat dengan
homogenizer.
5. Dipindahkan ke eppendoft dan disentrifuge 12.000 rpm, selama 15 menit dengan
suhu 4C.
6. Supernatan diambil dan disimpan pada suhu -80 C.

b. Pengukuran aktivitas protease

1. Aktivitas protease diukur dengan metode hidrolisis ksein (metode Walter, 1984
dalaam Hidalgo et all., 1999).
2. Buffer Tris HCl pH 8,1 (350 L) dan ekstrak enzim (50L) dimasukan pada
tabung sampel.
3. Inkubasi selma 10 menit pada 37o C, setelah inkubasi ditambahkan substrat
kasein 1% sebaanyak 350 L. Campuran reaksi kemudian diinkubasi ulang
pada 37o C selmaa 30 menit.
4. Reaksi dihentikan dengan penambahan 750 L dari 8% (w/v) aasam
trichlorocetat (TCA).
5. Untuk blanko dilakukan prosedur yang sama kecuali ekstak enzim ditmbahkan
setelah pemberian TCA sebanyak 750 L.
6. Untuk standard, 4 tabung standar diisi masing-masing dengan 50 L, 100 L,
200 L, 400 L larutan tirosin standar (konsentrasi 1000 L/mL), lalu
diencerkn dengan akuabides hingga volume 400 L. Pada semu tabung
ditambahkan 350 L substrat kasein, inkubasi pada suhu 37oC selama 30
menit.
7. Setelah didimkan minimal selama 60 menit di dalaam refrigator, campuran
reaksi disentrifugasi pad kecepatan 6000 rpm selma 10 menit.
8. Supernatan diambil sebanyak 1000 L daan dimsukkn dlam tabung reaksi yang
telah berisi aquabides 1500 L.
9. Campuran reaksi dihomogenkan dengan menggunakan vorteks.
10. Absorbansi campuran reaksi diukur pda panjang gelombang 280 nm.
11. Aktivitas protease dihitung menggunakan kurva standar tirosin yang diperoleh
12. Unit aktivitas enzim akan dinyatakan sebagi U/mg jaringan.
 III. HASIL DAN PEMBAHASAN

3.1 Hasil

Tabel 3.1.1 Hasil Preparasi Jaringan Digesti

Kelompok Jenis Ikan Berat Usus (gram) Berat Tris-HCl
(gram)

Lele Makan 1,30

10,4
1
Lele Puasa 0,75
6
Lele Makan 1,13
9,04
2
Lele Puasa 0,61
4,88
Nilem Makan 0,73
5,84
3
Nilem Puasa 0,97
7,76
Nilem Makan 0,94
7,52
4
Nilem Puasa 0,66
5,28

Tabel 3.1.2 Hasil Pengukuran Aktivitas Protease Ikan Nilem

No. Tabung Nilai Absorbansi Nilai Konsentrasi
Standard 1 0,125 25,000
Standard 2 0,144 50,000
Standard 3 0,306 100,000
Standard 4 0,422 200,000
Standard 5 0,762 400,000
61 (Ikan makan) 0,652 330,229
62 (Ikan makan) 0,536 262,682
63 (Blanko ikan makan) 0,208 71,401
64 (ikan puasa) 0,428 199,371
65 (ikan puasa) 0,565 279,184
66 (blanko ikan puasa) 0,243 91,572

Perhitungan Tris-HCl rasio (1:8) :

Kelompok 1 Kelompok 3
Lele makan = berat usus x 8 Nilem Makan = berat usus x 8
= 1,30 x 8 = 0,73 x 8
= 10,4 gram = 5,84 gram
Lele Puasa = berat usus x 8 Nilem Puasa = berat usus x 8
= 0,75 x 8 = 0,97 x 8
 = 6 gram = 7,76 gram
Kelompok 2 Kelompok 4
Lele makan = berat usus x 8 Nilem Makan = berat usus x 8
= 1,13 x 8 = 0,94 x 8
= 9,04 gram = 7,52 gram
Lele Puasa = berat usus x 8 Nilem Puasa = berat usus x 8
= 0,61 x 8 = 0,66 x 8
= 4,88 gram = 5,28 gram

Pehitungan aktivitas protease

Aktivitas enzim dinyatakan dalam konsentrasi (X)
1+ 2
1. Ikan makan =
2
330,229+262,682
= 71,401
2

= 296,455 71,401
= 225,054 U
1+ 2
2. Ikan puasa =
2
199,371+279,184
= 91,572
2

= 239,277 91,572
= 147,705 U
Aktivitas enzim dinyatakan dalam konsentrasi/menit
225,054
1. Ikan makan = = 11,252 U/menit
20
147,705
2. Ikan Puasa = = 7,385 U/menit
20
3.2 Pembahasan

Hidrolisat merupakan proses pemecahan secara enzimatik konversi protein

menjadi peptida yang lebih kecil. Umumnya, protein dihidrolisat menjadi fragmen
kecil peptida yang mengandung 2-20 asam amino. Protein dihidrolisis oleh protein
enzim. Enzim menurunkan ukuran peptida dengan demikian membuat hidrolisat yang
digunakan sebagai sumber asam amino untuk persediaan berbagai fungsi fisiologis
(Chalamaiah et al., 2012)
Protease adalah salah satu enzim golongan hidrolase yang berfungsi
memecah protein menjadi molekul yang lebih sederhana dengan adanya air. Protease
berperan penting dalam semua makhluk hidup karena bersifat esensial dalam proses
metabolisme protein, antara lain membantu pencernaan protein dalam makanan,
menggunakan kembali protein intraseluler, sebagai enzim, hormon, serta
neurotransmiter (Irwan et al., 2014). Semakin besar asam amino dihasilkan dari reaksi
pemecahan protein tersebut maka dapat dikatakan bahwa protease tersebut memiliki
aktivitas yang tinggi. Seperti halnya enzim pada umumnya, maka aktivitas protease
juga banyak dipengaruhi oleh berbagai faktor. Diantara faktor-faktor yang dominan
pengaruhnya adalah suhu, pH, jenis substrat, serta aktivator dan inhibitor enzim
(Yusirh & Kuswytasari, 2013)
pH berpengaruh terhadap kecepatan aktivitas enzim dalam mengkatalis suatu
reaksi. Hal ini disebabkan konsentrasi ion hidrogen mempengaruhi struktur dimensi
enzim dan aktivitasnya. Setiap enzim memiliki pH optimum di mana pada pH tersebut
struktur tiga dimensinya paling kondusif dalam mengikat substrat. Bila konsentrasi ion
hidrogen berubah dari konsentrasi optimal, aktivitas enzim secara progresif hilang
sampai pada akhirnya enzim menjadi tidak fungsional. Aktivitas enzim yang menurun
karena perubahan pH disebabkan oleh berubahnya keadaan ion substrat dan enzim.
Perubahan tersebut dapat terjadi pada residu asam amino yang berfungsi untuk
mempertahankan struktur tersier dan kuartener enzim aktif (Yusirh & Kuswytasari,
2013).
Perubahan ionisasi juga dapat dialami oleh substrat atau kompleks enzim-
substrat, yang juga berpengaruh terhadap aktivitas enzim . Perubahan aktivitas enzim
protease disebabkan oleh ion H+ yang ada dalam larutan enzim mengalami perubahan.
Perubahan memberi efek tolakan pada gugus fungsi yang berinteraksi ionik pada
bagian katalitik enzim sehingga konformasi enzim protease berubah mengakibatkan
aktivitas enzim berubah (Baehaki dkk. 2005),
Faktor lain yang berpengaruh terhadap aktivitas protease adalah suhu.
Adanya peningkatan suhu akan meningkatkan energi kinetik, sehingga menambah
intensitas tumbukan antara substrat dan enzim. Akan tetapi, peningkatan suhu lebih
lanjut akan menurunkan aktivitas enzim. Hal ini disebabkan karena enzim akan
mengalami denaturasi. Enzim mengalami perubahan konformasi pada suhu yang
terlalu tinggi, sehingga substrat terhambat dalam memasuki sisi aktif enzim (Yusirh &
Kuswytasari, 2013).
Pengukuran aktitivitas protease menggunakan metode walter dengan
menggunakan kasein sebagai substrat yang diukur dengan metode spektrofotometri
pada panjang gelombang maksimum 275 nm. Nilai absorbansi protease yang diperoleh
dimasukkan ke dalam persamaan kurva baku tirosin untuk mendapatkan nilai tirosin
yang terbentuk pada reaksi enzimatis. Pengukuran aktivitas enzim protease dilakukan
menggunakan rumus (Walter, 1984) :
Aktivitas enzim = Tirosin x v x fp
Mr Tirosin pxq
Dimana : v = volume total sampel (mL)
q = waktu inkubasi (menit)
fp = faktor pengencaran
p = jumlah enzim (mL)
Satu unit aktivitas protease dinyatakan dengan banyaknya jumlah mikro mol tirosin
yang dihasilkan dari hidrolisis kasein oleh 1 mL protease per menit (Kuswantoro et
al., 2012)
Asam amino yang dihasilkan dari hidrolisis kasein oleh protease, dipisahkan
dari protein yang belum terhidrolisis menggunakan asam trikloroasetat (TCA). Asam
amino dan peptida akan dilarutkan dengan TCA, sedangkan protein yang memiliki
bobot molekul yang besar akan mengendap. TCA juga berfungsi menginaktifkan
protease dan menghentikan waktu inkubasi protease. Tahap pemisahan asam amino
dan peptida yang terbentuk selama inkubasi dengan protein yang mengendap atau
dengan substrat yang belum terhidrolisis dibantu oleh sentrifugasi pada kecepatan
6000 rpm selama 10 menit. Supernatan yang terbentuk melalui tahap pemisahan
tersebut merupakan asam amino hasil hidrolisis kasein oleh protease. Kemudian
diukur absorbansinya pada spektofotometer. Tirosin merupakan asam amino aromatik
yang dapat menyerap panjang gelombang 275 nm sebagai larutan standar dalam uji
aktivitas protease untuk mengukur aktivitas. Aquabides digunakan sebagai larutan
pelarut tirosin (Yusirh & Kuswytasari, 2013).
Berdasrkan perhitungan absorbansi didaptkan nilai aktivitas enzim ikan
makan yag dinyaakan dalam konsenrasi sebesar 225,054 U sedangkan aktivitas enzim
ikan makan yang dinyatakan dalam konsentrasi/menit adalah 11,252 U/menit.
Perhitungan absorbansi ikan puasa yang dinyatakn dalam konsentrasi sebesar 147,705
U sedangkan aktivitas enzim ikan puasa yang dinyatakan dalam konsentrasi /menit
sebesar 7,385 U/menit. Terlihat ikan makan memiliki aktivitas enzim yang lebih besar
dari pada ikan puasa. Pemberian pakan membuat aktivitas enzim meningkat. Menurut
Susilo et al., (2013), ikan lele, Clarias gariepinus, pemberian pakan kembali, setelah
sebelumnya mengalami kondisi ketiadaan pakan, menyebabkan peningkatan aktivitas
protease.
Pertumbuhan komponsatori yang dipicu oleh pemuasaan dan pemberian pakan
kembali, seringkali juga selaras dengan perubahan fisiologi pada ikan yang mengalami
pertumbuhan kompensatori. Perubahan fisiologi yang dimaksud adalah perubahan
aktivitas enzim digesti ikan. Beberapa studi aktivitas enzim digesti berkaitan dengan
penerapan pemuasaan dan pemberian pakan kembali juga telah dilakukan. Pada ikan
lele, Clarias gariepinus, yang tidak diberi pakan memperlihatkan perubahan yang
tidak signifikan dalam aktivitas enzim digesti, baik protease gastrik, protease pankreas
dan amilase, tetapi ikan yang diberi pakan merespon dengan meningkatkan level enzim
digesti (Susilo et al, 2013).
 IV. KESIMPULAN DAN SARAN

4.1 Kesimpulan

Berdsar hasil analisis diatas dapat disimpulkan bahwa:

1. Aktivitas enzim ikan yang diberi pakan lebih besar dibandingkan dengan ikan
puasa sebagai respon pemberian pakan

4.2 Saran

Sebaiknya lebih berhati pada saat memindahkan alat-alat yang terbuat dari
kaca yang masih berisi larutan yang akan diabsorbansi. Apabila pecah laruta akan
tumpah dan akan sulit mebuatnya kembali kerena menyangkut ekstrak enzim pada
praktikum preparasi jaringan yang telah dilakuakan minggu lalu.
 DAFTAR REFERENSI

Baehaki, A., Suhartono, M.T., Palupi, N.S., dan Nuhayati, T., 2004, Karakterisasi
protease dari bakteri patogen Staphylococcus aureus dan Klebsiella sp.
ProsidingSeminar Nasional dan Kongres PATPI: 281 287.
Chalamaiah, M.,Dinesh, K.,. Hemalatha, T., Jyothirmayi. 2012. Fish protein
hydrolysates: Proximate composition, amino acid composition, antioxidant
activities and applications: A review. Elsevier Journal 135: 30203038
Irwan, R., Hasnah,N.M., Rugaiyah, A. 2014. Pengaruh Penambahan MnCl2 Terhadap
Produksi Enzim Protease Dari Bacillus licheniformis HSA3-1a. Jurnal
Biokimia Universiatas Hasanudin: 1-7
Kuchel , P.W & Ralston, G.B . 2002. Biokimia. Eralangga : Jakarta
Kuswantoro,B., Aulanniam,. Dyah, A.O. 2012. Studi Paparan Lipopolisakarida pada
Tikus (Rattus norvegicus) Model Asma Terhadap Aktivitas Protease dan
Gambaran Histopatologi Sel Epitel Bronkiolus. Jurnal Univerditas
Brawijaya: 1-9
Sumardjo, D., 2006, Pengantar Kimia, Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta
Suranto, Adji. 2011. Terapi Enzim. Penebar Plus: Jakarta
Susilo, U., Nuning, S., Farida, N.R. 2013. Aktivitas Protease dan Komposisi Proksimat
Tubuh Ikan Sidat (Anguilla bicolor Mcclelland) pada Kondisi Puasa dan
Pemberian Pakan Kembali.Biosfera 30 (2): : 96-103
Yusriah & Kuswytasari, N.D. 2013 . Pengaruh pH dan Suhu Terhadap Aktivitas
Protease Penicillium sp. Jurnal Sains Dan Seni Pomits 2 (1): (2013) 2337-
3520