UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER

ESCUELA DE BACTERIOLOGA Y LABORATORIO CLNICO

PROGRAMA DE MICROBIOLOGIA Y BIOANALISIS
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL

Laura Vanessa Parada Rangel-2131153, Brayan Manuel Almeida Caldern-2131764

Jesus Andres Daza Parra-2121634, Diego Mauricio Quintero Santander-2131718

Informe N2
MTODOS DE DETERMINACIN DE CLULAS Y BIOMASA BACTERIANA
Fecha de realizacin: 10, 13 y 20 de Octubre de 2016

OBJETIVOS
Hacer una estimacin poblacional de una suspensin de levaduras Saccharomyces
cerevisiae utilizando conteo en cmara de Neubauer y turbidimetra en la escala de
Macfarland.
Implementar mtodos directos e indirectos para la determinacin de clulas
presentes en una suspensin.

INTRODUCCIN

Entre los mtodos directos para la determinacin de biomasa, est el recuento celular en
cmara: Para el recuento de microorganismos se pueden emplear diferentes tipos de
cmaras como la cmara de Neubauer, Thoma, Brker, Ttirk, Fuchs-Rosenthal, Malassez,
Petroff Hauser, etc. El recuento de microorganismos se realiza en la cuadrcula central cle la
cmara y se multiplica por la profundidad, y por el factor de dilucin, en el caso que la
muestra est diluida, y se obtiene el nmero de microorganismos por unidad de volumen
(nmero de clulas/ml, generalmente). Este mtodo tiene como desventajas que se pueden
presentar irregularidades en la distribucin de la muestra, o que puede no identificarse
correctamente las clulas y estas sean confundidas con otras formas orgnicas e
inorgnicas existentes en el medio.

La escala de McFarland, consiste en una serie de tubos con diferentes grados de turbidez
que son empleados para la preparacin de suspensiones de microorganismos. La escala se
prepara utilizando cido sulfrico (1%) y Cloruro de Bario (1%), lo que genera un precipitado
de sulfato de bario suspendido

METODOLOGA

Recuento en cmara de Neubauer

Se realiz un montaje en cmara Neubauer a partir de una suspensin de levaduras
de la cual se tomaron 100 L, se descartaron las 3 primeras gotas y se procedi a
servir en la cmara. Seguidamente se realiz el conteo de levaduras en 5
cuadrantes (el conteo se realiz 3 veces). Finalmente se realiz el clculo para
determinar el nmero de clulas/mL.
 Imagen 1. Cuadrantes para conteo de levaduras.

Peso seco
Se pes una caja de petri la cual en su interior se deposit un papel filtro (poro de
celulosa 0.45 m) sobre un vidrio reloj, despus se procedi a realizar una filtracin
por membrana utilizando una bomba al vaco en la cual se sirvi una muestra sobre
el papel filtro, luego de esto se llev a secar a un horno durante 24 horas a 72C.
Pasadas las 24 horas se pes el vidrio reloj con el papel filtro para determinar el
peso de la masa seca despus de la filtracin.

Imagen 2. Montaje para realizar filtracin por membrana.

Escala de MacFarland
Se prepar la escala de McFarland llevando a un volumen final de 5 mL, preparando 10
tubos con cido sulfrico y cloruro de Bario en diferentes cantidades segn lo establecido
como estndar, y 1 tubo que contena solo cido sulfrico, con el fin de usarlo como blanco
en la medicin por medio de un colormetro y con la medicin de la turbidez o densidad
ptica de cada tubo de la escala de McFarland, crear una curva que permita cuantificar la
biomasa de una suspensin de cantidad desconocida de levaduras de Saccharomyces
cerevisiae por medio de la absorbancia de esta y as poder estimar el nmero de
clulas/mL.

RESULTADOS
 Recuento en cmara de Neubauer
241 x 50000 = 12,05 x 106 clulas/mL

Peso seco
Peso filtro y vidrio reloj = 32,86 g
Factor de capacidad de Absorcin de humedad del filtro = 0,113 g

32,86 g - 0,113 g = 32,747 g

Peso inicial = 32,747 g

Peso despus de filtrar = 32,8599 g

32,8599 g - 32,747 g = 0,1129 g

Peso final = 0,1129 g

Escala de MacFarland
El patrn o la escala de McFarland consiste en una serie de tubos hermticamente
cerrados,previamente calibrados y con una densidad ptica diferente originada por la
aparicin de un precipitado de sulfato de bario (SO4Ba) resultante de la reaccin entre el
cloruro de bario (Cl2Ba) y el cido sulfrico (H2SO4).
Estos estndares son comparados visualmente o colorimtricamente con una suspensin
de microorganismos, con el fin de cuantificar la biomasa presente en la suspensin

Tabla 1. Patrn escala de McFarland

TUBO H2SO4 1% (ml) BaCl2 1% (ml) Clulas/mL

0 5 0 0

1 4,95 0,05 3x108

2 4,90 0,10 6x108

3 4,85 0,15 9x108

4 4,80 0,20 12x108

5 4,75 0,25 15x108

6 4,70 0,30 18x108

7 4,65 0,35 21x108

8 4,60 0,40 24x108

9 4,55 0,45 27x108

10 4,50 0,50 30x108

 Grfica 1. Escala de McFarland

Solucin Peso (g en 100 ml) Peso (50%) Absorbancia

1 0,2513 0,1256 1,704

2 0,1513 0,0756 1,249

Las absorbancias obtenidas de la soluciones se utilizaron en la ecuacin de la recta de las

escalas de McFarland realizada, para cuantificar la cantidad de clulas presentes,
obteniendo los siguientes resultados:

Solucin Clulas/mL Gramos/L

1 6,94x108 1,256

2 4,65x108 0,756

CONCLUSIONES

Se puede observar en la grfica 1, que el valor obtenido del coeficiente de correlacin (r2)
es de 0.9518.
Dicho valor nos indica que:
El grado de correlacin entre las variables, pese a que se encuentra un poco por
debajo de lo esperado, nos indica que existe una relacin lineal entre las dos
variables aleatorias, por lo tanto es viable implementar la curva de calibracin para la
cuantificacin de clulas/ml de la prctica.
Los resultados obtenidos en la curva de calibracin sugieren fallos durante la
realizacin del procedimiento tales como errores del operario (volumtricos, de
manipulacin de los equipos, etc) o instrumentales (calibracin, defectos propios de
los instrumentos), los cuales intervinieron directamente en la linealidad de la curva
ms sin embargo no invalidaron la prctica.

La determinacin de biomasa bacteriana por mtodos turbidimtricos es un mtodo

indirecto muy usado en la prctica cotidiana del laboratorio, puesto que permite cuantificar
la gran mayora de analitos de inters en base a su capacidad de absorcin de luz a una
determinada longitud de onda.

Las longitudes de onda ptimas, para la determinacin de microorganismos en

suspensiones, dadas por la literatura son:
Bacterias = 540 nm
Protozoos = 580 nm
Levadura= 600 nm

La determinacin de microorganismos por mtodos directos (pesos seco, peso hmedo)

son tecnicas utiles para muestras con altos volmenes pero son herramientas un poco
tediosas puesto que requieren de tiempo y son muy susceptibles a errores propios del
operario.

BIBLIOGRAFA
Carmen Arniz, Laura Isac y Julin Lebrato. DETERMINACIN DE LA BIOMASA
EN PROCESOS BIOLGICOS. Grupo de Tratamiento de Aguas Residuales.
Escuela Universitaria Politcnica. Universidad de Sevilla.
Rentera Vanessa. PRODUCCIN DE BIOMASA. Universidad Central del Ecuador,
Facultad de Ciencias Qumicas
BECTON dickinson and company/ patrn de turbidez BBL preparado- Mcfarland
turbidity standard /2005.