Detoksifikasi sianida dalam tepung singkong oleh Linamarase Bacillus

subtilis KM05

Terisolasi dari kulit ubi jalar

Surfamar sianogenik glukosida linamarin menyumbang 80% kandungan

sianida dari singkong dan diketahui menyebabkan penyakit parah pada konsumsi

terus-menerus. Detoksifikasi sianida ini akan meningkat kualitas gizi dan

karenanya nilai pasar tepung singkong. Kami mengisolasi glukosida sianogenik

memanfaatkan bakteri pribumi dari limbah kulit singkong yang kaya singkong

dan memanfaatkan potensinya detoksifikasi. Di antara isolat tersebut, Bacillus

subtilis KM05 memanfaatkan glikosida sianogenik melalui degradasi asimilasi

dengan pelepasan hidrogen sianida dan amonia. Sebagian dimurnikan Enzim

linamarase (53 KDa) dari organisme ini menunjukkan aktivitas yang cukup besar

(9,6 U / ml) dan dilakukan pengurangan sianida cepat dalam tepung singkong.

Hasilnya menunjukkan ruang lingkup untuk detoksifikasi enzimatik Sianida

singkong tanpa mengurangi nutrisi pada industri sagu.

PENGANTAR

Singkong, makanan penting di daerah tropis Afrika, Asia dan Amerika Latin

adalah sumber kalori terpenting ketiga di daerah tropis, setelah padi dan jagung.

Akar tanaman singkong yang membesar mengandung pati yang sangat mudah

dicerna dari nilai gizi penting. Produk yang berasal dari singkong merupakan

sumber makanan utama 500 juta sampai 1 miliar orang di negara tropis

(Sornyotha et al., 2010). Lebih dari 160 juta ton singkong diproduksi secara

global per tahun, memeringkatnya sebagai tanaman ke-4 dalam produksi di

seluruh dunia setelah padi, gandum dan jagung (Ugwuanyi et al., 2007). Makanan
stabil utama ini memiliki dua kekurangan utama, yaitu kandungan sianogenik

glukosida linamarin beracun yang beracun (dan pada tingkat yang lebih rendah,

lotaustralin), dan kandungan protein rendah dan asam amino bebas (Cooke dan

Coursey, 1981). Umbi yang mudah rusak biasanya disimpan sebagai tepung

singkong, pengganti gandum dan beras. Tepung singkong terutama dihasilkan

oleh penggilingan singkong ubi jalar basah yang mencakup lima tahap berikut:

persiapan (pengelupasan dan pencucian), serak / pulping / kisi, pemurnian

(pencucian tepung), pengeringan dan pengeringan, dan finishing (penggilingan

dan pengemasan ). Setelah gangguan jaringan, glukosida sianogenik dibawa

dalam kontak dengan glikosidase dan lyase hydroxynitrile dan terdegradasi

menjadi sianohidrin, sianida hidrogen dan keton (Conn, 1980). Ketika produk

singkong digunakan sebagai makanan pokok utama, pengolahan hati-hati untuk

menghilangkan unsur-unsur toksik ini diperlukan untuk menghindari keracunan

sianida kronis (Onabolu et al., 2002). Sianogen ini pada asupan dapat

menyebabkan keracunan sianida dengan gejala muntah, mual, pusing, nyeri perut,

kelemahan, sakit kepala dan diare dan kadang-kadang kematian (Akintonwa et al.,

1994; Mlingi et al., 1995). Sementara hasil pengolahan yang tidak lengkap dalam

paparan sianida tinggi dan penyakit parah yang terkait seperti neuropati atopik

atik, konzo, dan lain-lain, pemrosesan yang hati-hati umumnya mengakibatkan

hilangnya protein, vitamin dan mineral. Oleh karena itu, metode yang terorganisir

dengan baik untuk mendetoksifikasi singkong tanpa kehilangan unsur hara.

Meskipun sejumlah proses yang bertujuan untuk degradasi dan dengan demikian

pengurangan kandungan sianida dikembangkan, semuanya gagal menghasilkan

pengurangan yang diharapkan pada sianida atau menghasilkan pengurangan

komposisi unsur hara.

Silano dkk. (1982) melaporkan bahwa sekitar 50% kandungan nitrogen singkong

berupa asam amino bebas dan bisa hilang selama pemrosesan. Pemisahan butiran

pati dari umbi dalam bentuk murni sangat penting dalam pembuatan tepung

singkong. The linamarin adalah -glukosida aseton sianohidrin dan etil-metil-

keton-sianohidrin yang ikatan Linamarin- hanya dapat dipecah di bawah tekanan

tinggi, suhu tinggi dan penggunaan asam mineral, sementara pemecahan

enzimatiknya terjadi dengan mudah (Cereda dan Mattos, 1996). Oleh karena itu

pemindahan atau konversi dari glikosida sianogenik antinutrisi ini dimungkinkan

melalui konversi enzimatik target tertentu jika metode penerapannya

distandarisasi. Linamarase atau -D-glukosidase (EC3.2.1.21), enzim yang

ditemukan di banyak tanaman termasuk singkong dan dalam mikroorganisme

mengubah senyawa yang mengandung sianida menjadi sianohidrin aseton, yang

secara spontan terurai menjadi hidrogen sianida (HCN) (Rolle, 1998). HCN

kemudian larut dengan mudah dalam air atau dilepaskan ke udara (Gambar 1).

Bila akar benar-benar terganggu, semua linamarin akan keluar bersentuhan

dengan enzim hidrolitiknya (linamarase), sehingga terjadi hidrolisis dan

selanjutnya menghilangkan produk pemecahan saat mencuci. Kemudian,

penambahan linamarase eksogen langsung ke akar yang benar-benar terganggu

cukup untuk menghidrolisis semua linamarin bebas. Beberapa peneliti telah

menyelidiki linamarase untuk memfasilitasi proses detoksifikasi sianida singkong

(Ikediobi dan Onyike, 1982; Petruccioli et al., 1999; Yeoh and Sun, 2001). Tujuan

dari penelitian ini adalah untuk memperbaiki kualitas pati singkong melalui
bioproses, terhadap pengurangan linamarin yang tersisa di mash tanpa kompromi

gizi dan jika memungkinkan secara simultan meningkatkan kandungan protein

dengan menggunakan linamarase yang diisolasi dari bakteri pribumi yang

menurunkan limbah kulit singkong linamarin yang kaya.

BAHAN DAN METODE

Isolasi bakteri yang merendahkan sianida

Komposit tanah dan kulit singkong sebagian terkumpul dikumpulkan dari tempat

pembuangan limbah di unit pengolahan singkong, produk SPAC tapioka dan

pabrik sagu Chellapa yang terletak di Poonachi, distrik Erode di Tamilnadu, India.

Mikroorganisme sianida-tilizing diisolasi dari limbah tanah kulit singkong dengan

menginokulasi 1 g sampel ke dalam media isolasi yang mengandung

K2HPO.2H2O, 1,0 g; MgSO4.7H2O, 0,2 g; CaCl2, 0,01 g; NaCl2, 0,01 g;

MnSO4, 0,2 mg; CuSO4 .5H2O, 0,2 mg; ZnSO4, 0,2 mg; Glukosa, 2,0 g;

Tryptone, 1,0 g (Watanabe et al., 1998). Budaya yang diperkaya disaring untuk
penggunaan linamarin dan produksi linamarase dengan menyebarkan

pertumbuhan diencerkan secara tepat pada piring agar nutrisi steril yang memiliki

2 ml glukosida 1-p-nitrofenil--D (PNPG). Sebuah piring kontrol berisi PNPG

tapi bukan organisme. Semua piring diinkubasi pada suhu 30 C dan diperiksa

setelah 24 jam. Karena linamarase adalah -glukosidase, PNPG brokedown

menjadi nitro-fenol berwarna citron-kuning yang berdifusi ke medium di sekitar

koloni yang menunjukkan aktivitas linamarase. Isolat positif dinilai dengan cara

yang sama seperti uji linamarin, berdasarkan kekuatan dan penyebaran pewarnaan

kuning. Isolat yang tumbuh di piring tapi tanpa pewarnaan kuning di luar batas

koloni dianggap negatif (Ugwuanyi et al., 2007).

Penggunaan sianida glikogenik oleh isolat dikonfirmasi dengan media yang

mengandung bakteriologis, 0,5 g; Bubuk ekstrak daging, 0,2 g; Tween 80, 0,1 ml;

Larutan mineral (ZnSO4.7H2O, 1 g; CuSO4. 5H2O, 0,5 g / 100 ml), 0,5 ml; Agar,

1 g; Buffer sodium fosfat, 0,1 M; Dan linamarin 0,01% [sebelumnya diisolasi dari

daun muda singkong dan sebagian dimurnikan seperti yang dijelaskan oleh King

dan Bradbury (1995). Pelat agar-agar diinokulasi kemudian diinkubasi pada suhu

37 C selama 48 sampai 72 jam. Rincian linamarin selama pertumbuhan

terdeteksi dengan cara menempatkan secara aseptis kertas saring yang diresapi

dengan asam sitrat basa ke dalam ruang kepala kemiringan agar-agar. Perubahan

warna kertas saring yang disebabkan oleh HCN diambil sebagai indikasi aktivitas

linamarase (Okafor dan Ejiofor, 1986). Kontrol dilakukan dengan cara

menginkubasi media yang tidak diinokulasi. Isolasi bakteri yang merendahkan

sianida yang diperoleh dicirikan dan diidentifikasi berdasarkan morfologi sel dan
koloni, pewarnaan Gram, reaksi fisiologis dan biokimia menurut manual Bergey

(Holt et al., 1994).

Pola pemanfaatan sianida isolat

Penentuan produksi sianida hidrogen (Lorck, 1948)

Medium agar nutrisi yang dimodifikasi yang memiliki pepton, 10 g; NaCl, 5 g

dengan 4,4 g glisin / lit sudah disiapkan dan disterilkan. Bakteri yang

merendahkan sianida dilapisi dan kertas saring Whatman No 1 direndam dalam

natrium karbonat (2%) dalam larutan asam sitrat 0,5% ditempatkan di bagian atas

piring. Pelat disegel dengan parafilm dan diinkubasi pada suhu 37 C selama

empat hari. Setelah inkubasi, perubahan warna dari kuning ke coklat diamati.

Penentuan dan kuantifikasi pelepasan amonia (Ahmad et al., 2002)

Pemanfaatan bakteri sianida diinokulasi ke dalam 10 ml air peptone di setiap

tabung dan diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37 C. Setelah inkubasi, 0,5 ml

reagen Nessler ditambahkan ke dalam tabung dan perubahan warnanya diamati

(kuning pucat sampai kuning tua). Amonia yang dilepaskan diuji dengan

mencampurkan 0,5 ml sampel dengan volume pengenceran 1: 3 yang setara

dengan pelarut Nessler yang ada di pasaran dan mengukur absorbansi pada 420

nm menggunakan spektrofotometer SmartSpec 3000 (Laboratorium Bio-Rad,

Richmond, AS).

Ekstraksi enzim

Ekstrak bebas sel dibuat dari sel yang tumbuh dalam media minimal M9 (tanpa

amonium dan sitrat) yang disesuaikan dengan pH 9,5 pada rotatory shaker
(Thermoscientific, USA) pada 230 rpm dan 30 C dengan adanya larutan mam

linamarin 2 mM sebagai sumber nitrogen. Dan 50 mM asetat sebagai sumber

karbon (Luque-Almagro et al., 2005). Sel dipanen pada tahap terakhir dari

pertumbuhan eksponensial dan disuspensikan kembali ke dalam 50 mM buffer

Tris / HCl (pH 8,5). Sel-sel rusak oleh kavitasi dan tiga pulsa 5 S pada 90 W.

Setelah dilakukan sentrifugasi (Sigma Laborzentrifugen GmbH, Jerman) pada

19000 g, superkutan dikumpulkan dan digunakan sebagai sumber enzim. Ekstrak

bebas sel diambil dari presipitasi amonium sulfat (30 sampai 60%) dan endapan

yang diperoleh setelah sentrifugasi, dilarutkan dalam 20 mm buffer Tris-HCl (pH

8.0) dan dialisis terhadap buffer yang sama. Konsentrasi protein ditentukan seperti

yang dijelaskan (Bradford, 1976) dengan menggunakan albumin serum sapi

sebagai standar. Luas kemurnian sediaan dan massa molekul dari preparasi enzim

yang dimurnikan ditentukan oleh analisis elektroforesis gel poliakrilamida sulfat

natrium dodesil sulfat (SDS-PAGE). Larutan sampel uji disiapkan dengan

pengenceran (1: 1) pada buffer pelarut sampel, yang ditempatkan selama 10 menit

dalam rendaman air mendidih (100 C). Setelah pendinginan sampai suhu kamar,

sampel dipintal selama 1 menit. Sampel yang mengandung protein dalam jumlah

yang sama dimasukkan ke dalam sumur gel poliakrilamida. Penanda berat

molekul jarak menengah digunakan dan elektroforesis dilakukan pada voltase

konstan 75 V selama 2 jam. Gel itu diwarnai dengan larutan biru cemerlang

Coomassie 0.2%.

Enzim assay

Aktivitas linamarase isolat dihitung seperti yang dijelaskan (Ugwuanyi et al.,

2007). Kuantifikasi linamarase didasarkan pada degradasi analog PNamar ganas

dan penentuan pelepasan p-nitrophenol (Ikediobi et al., 1980). Pengujian itu

media termasuk 0,5 ml ekstrak enzim, dan 1,0 ml 5 mM PNPG dalam buffer

fosfat 0,01 M dengan pH 6,8. Campuran diinkubasi selama 15 menit pada 65 C,

dan reaksinya diakhiri dengan penambahan 2 ml buffer borat 0,2 M dengan pH

9,8. Warna pelepasan p-nitrophenol diukur pada 425 nm pada Genesys 20

Spectrophotometer terhadap enzim yang kosong. Enzim yang diaktivasi suhu

digunakan sebagai blank. Satu unit aktivitas linamarase dinyatakan sebagai

jumlah yang menyebabkan perubahan absorbansi 0,01 unit terhadap enzim kosong

di bawah kondisi uji yang ditentukan (Ugwuanyi et al., 2007).

Pengaruh perlakuan enzimatik terhadap tepung singkong

Aliran kuadrat 500 mg sampel tepung singkong dimasukkan ke dalam botol

plastik, dan kertas saringan kecil yang diimpregnasi dengan buffer pH 6 adalah

ditempatkan di botol Linamarase, diikuti oleh 2,5 ml air dan kertas picrate kuning

ditambahkan ke botol dan tutupnya segera ditutup dan dibiarkan pada suhu 30 C

semalam. Keesokan harinya, kertas picrate kuning-coklat dipisahkan dari plastik

strip dan ditempatkan di 25 ml air. Penyerapan larutan diukur pada 510 nm dan

total kandungan sianida dalam ppm dihitung dengan mengalikan 396 (Bradbury et

al., 1999). Untuk mengetahui dan membandingkan pengaruh perlakuan enzim

terhadap tepung singkong, dua set masing-masing berisi 5 g tepung diambil dalam

gelas kimia. Satu batch dicampur dengan baik dengan 6,25 ml air, yang lainnya

dengan 5 ml air dan 1,5 ml enzimatik ekstrak. Botol diletakkan di dalam inkubator

pada suhu 30 C selama 5 jam, setelah itu analisis sianida dilakukan dilakukan

seperti yang dijelaskan (Cumbana et al., 2007). Perubahan kelembaban (923,03),

protein kasar (metode Kjeldhal, N 6,25), lemak (Metode Soxhlet) dan abu
(923.10) juga ditentukan seperti yang ditentukan oleh Asosiasi Ahli Kimia

Analitik Resmi (AOAC,

1995).

HASIL

15 isolat dengan morfologi koloni yang berbeda yang menunjukkan pemanfaatan

sianida pada media penyaringan diperoleh dan semua isolat disaring karena

kemampuannya memanfaatkan sianogenik glikosida sebagai substratnya. Isolat

positif dinilai berdasarkan kekuatan dan penyebaran pewarnaan kuning pada

media PNPG. Dari 15 isolat bakteri, hanya satu yang dipilih berdasarkan pola

pemanfaatan glikosida sianogenik dan perubahan warna kertas picrate dari kuning

ke coklat. Berdasarkan uji biokimia dan budaya, bakteri memanfaatkan gyanosida

sianogenik diidentifikasi sebagai Bacillus subtilis. Karakteristik budaya dan

biokimia dari B. subtilis KM05 disajikan pada Tabel 1. Mereka membentuk

koloni retikulat kasar bulat yang memiliki diameter 5 sampai 7 mm pada piring

agar-agar nutrisi. Telah diamati bahwa B. subtilis menghasilkan hidrogen sianida

(HCN) sebagai tambahan amonia selama penggunaan sianogenik glikosida.

Hasil yang diperoleh untuk pemurnian parsial enzim pendegradasi sianida B.

subtilis KM05 dengan fraksinasi amonium sulfat konvensional ditunjukkan pada

Gambar 2. Endapan protein yang terbentuk dalam kisaran jenuh 30 sampai 60%

ditemukan untuk mempertahankan aktivitas enzim. Analisis elektroforesis ekstrak

kasar dan presipitasi amonium sulfat menunjukkan adanya pita tunggal dengan

massa molekul 53 KDa (Gambar 2). Konsentrasi protein dalam preparasi enzim

ditemukan 0,23 mg / ml dan aktivitas linamarase ditemukan 9,6 U / ml. Juga

disimpulkan bahwa enzim tersebut memiliki kemampuan untuk menurunkan

glikosida sianogenik secara efektif.

Hasil yang disajikan pada Tabel 2 menunjukkan bahwa tepung singkong yang

tidak diobati memiliki kandungan sianida yang lebih tinggi dan penurunan yang

signifikan pada tepung yang diolah dan diolah dengan enzim. Sebelum inokulasi,

konsentrasi sianida tepung ditemukan 210 ppm / kg. Ekstrak bebas sel pada

perlakuan ekstrak tepung singkong di malam hari menyebabkan pengurangan

cepat konsentrasi sianida 8 ppm / kg, sedangkan pada kontrol yang tidak diobati,

konsentrasi sianida tetap sebesar 35 ppm / kg (Tabel 2). Juga diamati bahwa tidak

ada perubahan signifikan pada tingkat gizi kecuali peningkatan kecil protein.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa enzim B. subtilis KM05 secara efektif

mendetoksifikasi sianogenik glikosida singkong.

Table 1. Taxonomic characteristics of B. subtilis KM05.

S/N Nama Tes Hasil

1 Pewarnaan Gram Gram positif, lurus, besar, seragam multiseptate

2 Endospora Positive

3 Pewarnaan Asam Cepat Negative

4 Oksidase Negative

5 Katalase Positive

6 Vogus- Proskaur Negative

7 Metil merah Negative

8 Indole Negative
 9 Sitrat Positive

10 Hidrolisis Esculin Positive

11 Hidrolisis kasein Positive

12 Hidrolisis gelatin Positive

13 Pertumbuhan pada 6,5% NaCl Negative

14 Pertumbuhan di atas 55.c Negative

DISKUSI

Metode pengolahan singkong yang tidak memadai sering mengakibatkan

linamarin dan produk hidrolitiknya sianohidrin, sebagai residu dalam produk.

Oleh karena itu, ada kebutuhan untuk memperbaiki metode pengolahan singkong

menjadi makanan yang populer di berbagai komunitas di daerah tropis (Oluwole

et al., 2002). Metode pengolahan baru yang disarankan untuk menghilangkan

sianogen dari tepung singkong melibatkan pencampuran tepung kering dengan air

dan membiarkan tepung basah di lapisan tipis di bawah naungan selama 5 jam

atau selama 2 jam di bawah sinar matahari untuk memungkinkan pemecahan

katalis linamarin menjadi hidrogen. Sianida, memfasilitasi pengurangan tiga

sampai enam kali lipat total kandungan sianida tepung singkong. Tepung basah

yang diperoleh bisa digunakan untuk memasak pada hari yang sama (Bradbury

dan Denton, 2010). Meskipun kadar sianida yang cukup banyak berkurang,

berkali-kali, kadar sianida residual melebihi batas FAO 10 ppm dan juga

bergantung secara eksklusif pada tingkat enzim endogen yang menunjukkan

variasi yang cukup besar.

Beberapa mikroorganisme termasuk Bacillus sp. (Amoa-Awua dan Jakobsen,

1995), bakteri asam laktat (Cohen, 1994), Lactobacilli, Leuconostoc, Streptococci

dan ragi (Obilie et al., 2004), strain Aspergillus, Fusarium, Penicillium dan

Trichoderma (Yeoh et al., 1995). ) Dikenal karena aktivitas detoksifikasi mereka

pada fermentasi singkong asli. Untuk pengetahuan penulis, penelitian ini

melaporkan untuk pertama kalinya potensi organisme pengurang limbah kulit

singkong dalam detoksifikasi singkong dimaksudkan untuk penggunaan manusia.

Spesies Bacillus, Pseudomonas dan Klebsiella oxytoca telah dilaporkan mengurai

sianida menjadi produk akhir yang tidak beracun dengan menggunakan sianida

sebagai satu-satunya sumber nitrogen di bawah lingkungan aerob dan / atau

anaerobik (Kaewkannetra et al., 2009). Beberapa penelitian sebelumnya

melaporkan keterlibatan spesies Bacillus dalam detoksifikasi yang terkait dengan

fermentasi singkong. Namun, peran mereka bervariasi sesuai dengan jenis

fermentasi (Amoa-Awua dan Jakobsen, 1995; Oyewole dan Odunfa, 1988).

Oyewole (1992) mencatat bahwa dalam proses fermentasi terendam untuk

produksi 'fufu', spesies Bacillus yang muncul pada awal fermentasi punah

menjelang akhir proses, sementara Amoa-Awua dan Jakobsen (1995) melaporkan

kejadian tinggi dan Kegigihan spesies Bacillus di seluruh fermentasi adonan

selama fermentasi solid state (SSF) singkong sampai 'agbelima' seperti yang

dilakukan di Ghana. Oleh karena itu alih-alih menerapkan keseluruhan fermentasi

sel, penerapan enzimnya akan mencapai hasil yang diinginkan.

Mikroorganisme sianotrofik memerlukan jalur asimilasi yang mampu mengubah

sianida menjadi amonium (Luque-Almagro et al., 2005). Pembentukan HCN dan

pelepasan amonia sebagai produk akhir membuktikan degradasi asimilasi

linamarin oleh B. subtilis KM05. Hal ini juga terbukti bahwa bakteri ini mampu

tumbuh, memanfaatkan linamarin sebagai satu-satunya sumber N dan asetat

sebagai sumber C. Oleh karena itu, strain ini menawarkan perspektif baru dalam

detoksifikasi sianida singkong. Kenaikan kandungan protein dari produk singkong

dapat dikaitkan dengan penambahan ekstrak enzim. Telah diamati sebelumnya

bahwa SSF, yang menggunakan berbagai jamur meningkatkan kandungan protein

dan juga mengurangi antinutrien namun pemisahan organisme fermentasi dari

massa praktis sulit dan membatasi penerapannya. Oleh karena itu, penelitian

tentang pengayaan dan detoksifikasi hara tepung singkong menggunakan enzim

dari bakteri Bakteri non-patogen yang mudah tumbuh B. subtilis KM05 akan

meningkatkan produktivitas, efisiensi dan output kualitas dalam operasi

pengolahan industri berbasis singkong di banyak negara berkembang.

Gambar 2. SDS-PAGE dari B. subtilis KM05 linamarase yang menunjukkan

lajur 1 (penanda protein rentang menengah), jalur 2 dan 3 (ekstrak kasar) dan jalur

4 (sampel presipitasi amonium sulfat).

Tabel 2. Perubahan kadar hara dan sianida pada tepung singkong yang diolah dan

mentah.

Nutritional parameter
S/ Type of
Moistur Crude Cyanid
N treatment Fat Ash
e protein e

0.160.0 0.960.0
1 Raw flour 140.4 1.360.2 2107
1 1

Enzyme treated 0.170.0 0.960.0

2 130.5 1.460.4 82
flour 2 2

0.150.0 0.960.0
3 Wet treated flour 130.6 1.310.2 355
1 1

PENGAKUAN

Penulis mengakui Rektor, KSU dan Dekan Riset Ilmiah, Pusat Penelitian Ilmu

Pengetahuan, Universitas Raja Saud atas dukungan mereka terhadap proyek ini.