LTM Rekayasa Genetika II

Nama : Maghfira Risang K. Dikumpulkan Tanggal : 7-11-17

NPM : 1506675705 Paraf Asisten :

OUTLINE
1.1. Teknik Pemurnian Plasmid
1.1.1. Elektroforesis Gel Agarosa
1.2. Teknik Sekuensing
1.2.1. Metode Sekuensing Sanger
1.2.2. Metode Sekuensing Maxam-Gilbert

PEMBAHASAN
1.1. Teknik Pemurnian Plasmid
Plasmid Plasmid merupakan salah satu vektor pembawa molekul DNA di
dalam proses rekayasa DNA melalui teknologi DNA rekombinan. Plasmid banyak
sekali digunakan dalam pengklonan DNA, karena relatif mudah dalam
penanganannya. Plasmid adalah molekul DNA utas ganda sirkuler (tidak berujung)
yang berukuran kecil yang terdapat di dalam sitoplasma dan dapat melakukan
replikasi secara autonom (Suharsono dan Widyastuti, 2006). Setelah DNA berhasil
diisolasi, perlu dilakukan pemurnian yang dapat diterapkan dengan metode
elektroforesis gel agarosa.

1.1.1. Elektroforesis Gel Agarosa

Elektroforesis merupakan teknik yang digunakan untuk memisahkan dan
memurnikan suatu makromolekul khususnya protein dan asam nukleat berdasarkan
perbedaan ukuran. Elektroforesis merupakan metode yang paling banyak dipakai saat
ini dalam percobaan biokimia dan biologi molekuler (Magdeldin, 2012).

Elektroforesis gel agarosa adalah teknik paling baik yang pernah dibuat dan
secara rutin digunakan di laboratorium klinis untuk analisis protein dan DNA pada
berbagai cairan biologis (serum, urin, CSF). Teknik ini merupakan teknik yang
menggunakan prinsip elektroforesis zona. Seperti yang diketahui, molekul protein
bermigrasi pada medium padat/gel yang direndam dengan suatu larutan penyangga di
bawah pengaruh medan listrik. Migrasi ini tergantung pada muatan listrik, titik
isoelektrik bersih dan massa molekul protein (Jean and Francois G., 2010)

Pada metode ini, makromolekul yang bermuatan listrik ditempatkan pada

medium berisi tenaga listrik. Molekul-molekul tersebut akan bermigrasi menuju kutub
positif atau kutub negatif berdasarkan muatan yang terkandung di dalamnya
(Magdeldin, 2012). Molekul-molekul yang bermuatan negatif (anion) akan bergerak
menuju kutub positif (anoda), sedangkan molekul-molekul yang bermuatan positif
(kation) akan bergerak menuju kutub negatif (katoda) (Klug and Cummings, 1994).
 Elektroforesis gel dapat digunakan untuk memisahkan asam nukleat
berdasarkan ukurannya di dalam agar atau gel poliakrilamida. Metode ini dapat
memisahkan pecahan-pecahan asam nukleat dengan ukuran 20bp hingga 20 kb. Gel
agarose ideal digunakan untuk pemisahan DNA, produk PCR, dan gen DNA atau
RNA sebelum dilakukan kloning, pengurutan (sequencing), Southern atau Northern
Blotting. Gel poliakrilamida dapat digunakan untuk elektroforesis gel poliakrilamida
atau PAGE.

Semua teknik elektroforesis membutuhkan arus listrik untuk menggerakkan

molekul bermuatan melalui matriks atau gel. Pada elektroforesis setiap
makromolekul, prinsipnya molekul yang lebih kecil akan bergerak lebih cepat dan
karena itu akan lebih jauh pada gel. Asam nukleat yang akan dianalisis dimasukkan
ke dalam gel agarose. Gel agarose tersebut akan berperean sebagai matrix untuk
menampung dan memisahkan molekul-molekul target. Gel tersebut dicelupkan dalam
ruang/peralatan elektroforesis beserta larutan penyangga yang memiliki arus listrik.
Larutan penyangga dibutuhkan untuk meminimalisir perubahan PH yang diakibatkan
medan listrik dan untuk mencegah gel menjadi terlalu panas akibat adanya arus listrik.

Tahapan pada elektroforesis:

o DNA dipotong-potong dengan enzim restriksi sesuai dengan

recognition site yang diinginkan.
o Sampel kemudian diletakkan dalam media agar. Media agar yang
digunakan adalah media agarose dan poliakrilamid.
o Sampel diletakkan pada kutub negatif sumbu-sumbu agar. Sampel
diberi pemberat berupa larutan buffer seperti polietilenglikol atau
gliserin, bromofenol biru dan aquades agar dapat masuk ke gel dengan
baik.
o Gel kemudian dialiri listrik dan sampel DNA akan bergerak menuju
kutub positif. Semakin panjang rantai DNA maka semakin banyak pula
waktu yang dibutuhkan untuk menuju kutub positif.
o Kemudian sampel diberi warna (staining) agar dapat terlihat jelas.
Dalam metode elektroforesis, dibutuhkan pewarna untuk
memudahkan penampakan molekul asam nukleat. Pewarna ini
dibutuhkan karena molekul asam nukleat tidak memiliki warna.
Terdapat beberapa pewarna yang dapat digunakan, beberapa
diantaranya adalah bromophenol blue dan ethidium bromide. Pewarna
ethidium bromide merupakan pewarna fluoresens yang digunakan
untuk proses staining pada DNA di gel agarose.
1.2. Teknik Sekuensing
Dalam genetika dan biokimia, sekuensing berarti penentuan struktur primer
(atau sekuens primer) rantai biopolimer tak bercabang. Sekuensing menghasilkan
penggambaran linear simbolik yang disebut sekuens yang meringkas sebagian besar
struktur tingkat atom atas molekul yang di-sekuensing. Sebagai contoh, sekuensing
DNA akan menghasilkan sekuens DNA yang digambarkan sebagai untaian abjad
lambang nukleotida-nukleotida penyusun DNA, yaitu "A" (nukleotida berbasa
adenin), "T" (nukleotida berbasa timin), "G" (nukleotida berbasa guanin), dan "C"
(nukleotida berbasa sitosin).

DNA Sequencing adalah penentuan urutan basa DNA dalam segmen molekul
DNA yang relatif pendek. Pengurutan atau sequencing asam nukleat memungkinkan
kita mengetahui kode genetik dari molekul DNA. DNA sequencing menggunakan
metode PCR (Polymerase Chain Reaction) sebagai pijakannya. DNA yang akan
ditentukan urutan basa ACGT-nya dijadikan sebagai cetakan (template) untuk
kemudian diamplifikasi menggunakan enzim dan bahan-bahan yang mirip dengan
reaksi PCR, namun ada penambahan beberapa pereaksi tertentu.

Proses ini dinamakan cycle sequencing. DNA Sekuensing dapat dibagi

menjadi dua metode, yaitu dengan metode sanger dan metode maxam-gilbert.

1.2.1. Metode Sekuensing Sanger

Metode Sanger merupakan merode yang paling popular, adaptable, dan dapat
digunakan untuk sekuensing dalam jumlah yang besar. Metode Sanger dilakukan
dengan mengekstensi primer/ terminasi rantai. Metode Sanger memanfaatkan dua
sifat salah satu subunit enzim DNA polimerase yang disebut fragmen klenow.
Keduanya memiliki kemampuan untuk menyintesis DNA dengan adanya dNTP dan
ketidakmampuannya dengan ddNTP.

Jika molekul dNTP hanya kehilangan gugus hidroksil (OH) pada atom C
nomor 2 gula pentosa, molekul ddNTP atau dideoksinukleotida juga mengalami
kehilangan gugus OH pada atom C nomor 3 sehingga tidak dapat membentuk ikatan
fosfodiester. Artinya, jika ddNTP disambungkan oleh fragmen klenow dengan suatu
molekul DNA, maka polimerisasi lebih lanjut tidak akan terjadi atau terhenti.

Basa yang terdapat pada ujung molekul DNA ini dengan sendirinya adalah basa yang
dibawa oleh molekul ddNTP.

Tahapan metode Sanger:

o Pemisahan strand DNA yang diinisiasi dengan panas dan dilanjutkan

 dengan penempelan primer.
o Pemanjangan oleh DNA polymerase melalui penambahan dNTP.
o Pemanjangan terhenti jika ddNTP yang ditambahkan bukan merupakan
dNTP.
o Melakukan elektroforesis gel pada DNA.

Gambar 1. Tahap Metode Sanger

(Sumber: mokkka.hu)

1.2.2. Metode Sekuensing Maxam-Gilbert

Metode ini dikembangkan oleh A.M Maxam dan W. Gilbert pada tahun 1987.
Metode Maxam-Gilbert dikenal juga dengan metode kimia. Metode ini merupakan
pengakhiran rantai (chain termination) dan degradasi kimia. metode ini didasarkan
pada pembelahan nukleotida oleh bahan kimia spesifik. Pemotongan DNA terjadi
secara kimia sehingga reagen kimia tertentu harus ditambahkan kedalam system
reaksi. Reagen kimia yang digunakan diantara lain hidrazin, piperidin, dimetil sulfat,
dan asam format.
Tahapan Metode Maxam-Gilbert:

o Sekuen molekul DNA untai ganda yang akan digunakan dipotong

bagian posisi ikatan anara fosfat dan guladeoksiribosa menggunakan
piperidin Fragmen DNA diberi label pada salah 1 ujungnya / pada
32
nukleotida 3 menggunakan sifat fosfat radioaktif ( P).

o Basa dimodifikasi dengan spesfik menggunakan bahan kimia tertentu,

yaitu Dimetilsulfat memetilasi basa menghidrolisis C dan T; Hidrazin,
piperidin, dan garam bekerja pada C. Dengan demikian, akan
dihasilkan empat macam fragmen, masing-masing dengan ujung G,
ujung A atau G, ujung C atau T, dan ujung C.

o Dilakukan elektroforesis untuk melihat urutannya

o Setelah elektroforesis gel dan autoradiografi hanya fragmen yang
32
memiliki gugus 5 terminal P grup fosfat muncul pada gel pada
posisi dasar dimodifikasi.

Gambar 2. Tahap Metode Maxam-Gilbert

(Sumber: generasibiologi.com)
DAFTAR PUSTAKA

Howe, Christopher. 2007. Gene Cloning and Manipulation. New York: Cambridge
University Press

Howe, Christopher. 2007. Gene Cloning and Manipulation. New York: Cambridge
University Press

Liu H, Naismith JH. 2008. An Efficient One-Step Site-Directed Deletion, Insertion,

Single, and Multiple-Site Plasmid Mutagenesis Protocol. BMC Biotechnology,
8:91