KHUSNUL LAYLI PUTRI

1506675642

TINJAUAN PUSTAKA

Isolasi DNA
Isolasi DNA merupakan suatu proses untuk mendapatkan DNA murni dari suatu
organisme. DNA dapat di isolasi dari berbagai sel yang memiliki inti sel. Isolasi DNA secara
garis besar meliputi tahap-tahap sebagai berikut:
Lisis sel
Pembuangan remukan sel
Pemisahan DNA dari protein dan RNA

Prinsipnya yang digunakan dalam isolasi DNA secara umum adalah sentrifugasi dan
presipitasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat
molekul komponennya dimana berat molekul yang lebih besar akan berada di bagian bawah
tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung sehingga akan menunjukkan
dua macam fraksi yang terpisah. Sedangkan presipitasi merupakan langkah yang
dilakukan untuk mengendapkan suatu komponen dari campuran DNA. Hasil isolasi
dapat dikatakan baik apabila mempunyai tingkat kemurnian yang tinggi dan tidak mengalami
fragmentasi.

Isolasi DNA dapat dilakukan dengan dua pilihan metode, yaitu dengan melakukan lisis
sel yang merupakan metode sederhana agar DNA yang diinginkan dapat keluar dari sel dan
mudah di ekstraksi, sedangkan yang kedua adalah dengan metode isolasi DNA murni.
Perbedaan antara keduanya adalah sebagai berikut:

Metode Lisis Sel : Merusak dinding sel menggunakan buffer lisis untuk mendapat
DNA yang diinginkan tanpa harus merusaknya. Komposisi buffer bergantung pada
jenis sampel.

Isolasi DNA : Pemecahan dinding sel yang diikuti dengan pemisahan DNA kromosom
dari komponen lain agar diperoleh kualitas DNA yang murni.
Polymerase Chain Reaction (PCR)

Metode PCR berfungsi sebagai metode dengan tujuan amplifikasi DNA target. Hal
tersebut dikarenakan metode ini dapat memperbanyak DNA spesifik dengan waktu yang lebih
singkat dan efisien. Komponen yang dibutuhkan dalam PCR adalah:
DNA target yang telah diisolasi, dalam hal ini adalah iso-1-sitokrom C
DNA primer untuk inisiasi DNA polymerase dalam proses penggandaan
DNA polymerase Sebagai katalis untuk reaksi polimerisasi DNA atau ekstensi DNA
dengan menambahkan nukleotida bebas

Tabel XXXXXXX. Perbedaan Jenis DNA Polimerase

(Sumber: Presentasi Coaching, 2017)
Perbedaan Jenis DNA Polimerase
Taq PFU
Error tinggi Error rendah
Kurang akurat Lebih akurat
Tidak terlalu tahan panas Lebih tahan panas
Proses kerjanya cepat Proses kerja lambat

dNTPs, yaitu suatu campuran yang terdiri atas dATP, dTTP, dCTP dan dGTP yang
berfungsi
sebagai building block dalam proses ekestensi DNA
Larutan buffer untuk menstabilkan DNA polymerase
Ion logam sebagai kofaktor DNA polymerase, dalam hal ini dapat digunakan Mg2+
atau K+

Sementara itu dalam setiap siklus proses PCR yang dilakukan terbagi menjadi tiga
tahapan sebagai berikut:
Denaturasi pada suhu 94 C selama 30 detik yang dilakukan untuk memisahkan
strain DNA dengan memutus ikatan hidrogennya
Annealing pada suhu 56 C selama 45 detik yang bertujuan untuk mengoptimasi
penempelan primer pada DNA target
 Extension pada suhu 72 C selama 10 menit bertujuan untuk sintesis DNA dengan
bantuan DNA polymerase dan dNTPs

Proses PCR tersebut dapat dilakukan berkali-kali untuk mendapatkan DNA target yang
spesifik dengan jumlah yang banyak dalam waktu singkat. Pada umumnya, setiap jam proses
PCR dapat melakukan 20 hingga 30 siklus bergantung pada kebutuhannya dimana total kopian
akhir dapat ditentukan dengan perhitungan 2(jumlah siklus). Hasil DNA target spesifik yang diperoleh
dari proses PCR umumnya diuji kemurniannya dan dapat dilakukan dengan metode
elektroforesis.

Desain Primer
Dalam pembuatan primer yang baik, terdapat beberapa aturan yang harus diikuti yaitu
sebagai berikut:
Panjang primer dalam range 18 hingga 30 nukleotida
Terdapat nukleotida GC sebanyak 40 60% dengan ketentuan pengukuran sebagai
berikut
+
% = 100%

Memiliki titik leleh atau melting temperature (Tm) dalam range 60 hingga 75oC
dengan ketentuan pengukuran sebagai berikut
41 (( + ) 16.4)
= 64.9 +

Hal hal lain yang perlu diperhatikan dalam pembuatan primer selain syarat utama diatas
yaitu:
Menghindari adanya pengulangan nukleotida dalam primer (maksimal 2 kali
pengulangan). Hal tersebut dapat menyebabkan terbentuknya hairpin structure
sehingga primer dapat menempel antara satu sama lain dalam primer itu sendiri.
Usahakan G hairpin lebih rendah dari -0,5 Kcal/mol
Dimerisasi kecil yaitu dengan menghindari deretan nukleotida yang sama. Usahakan
G dimer yang lebih rendah dari -4,0 Kcal/mol
Membuat ujung primer memiliki G atau C karena ikatan dari kedua nukleotida
 tersebut memiliki 3 ikatan hydrogen sehingga penempelannya lebih kuat
Diusahakan primer tidak saling komplemen terhadap dirinya sendiri atau primer
pasangannya
Temperatur annealing antara primer forward dan reverse diusahakan serupa

Dalam membuatprimer yang terdiri dari primer reverse dan primer forward, terdapat
beberapa ketentuan pembuatan primer sebagai berikut:
a) Ketentuan Forward Primer (primer yang menempel pada bagian bawah strand DNA)

5 Situs Start 3
Ekstensi GOI*
Restriksi Kodon

*GOI yang digunakan dapat disubtitusi dengan menuliskan ulang nukleotida

bagian awal dari strand atas DNA. Hal tersebut dikarenakan sudah mewakili
komplemen dari strand bagian bawah yang akan ditempeli forward primer
nantinya.

b) Ketentuan Reverse Primer (Primer yang menempel pada bagian atas strand DNA)

Situs Stop
5 Ekstensi GOI** 3
Restriksi Kodon

**GOI yang digunakan dapat dituliskan dengan cara menuliskan ulang nukleotida
bagian akhir dari strand bawah DNA, lalu membuat komplemen dan membalikan
urutan penulisan nukleotida hasil komplemen tersebut. Hal ini dikarenakan dengan
cara tersebut maka dapat terwakili komplemen strand bagian atas yang akan
ditempeli reverse primer nantinya.
Ligasi
Ligasi adalah proses penyambungan antar fragmen DNA dengan pembentukan kembali
ikatan fosfodiester antara 2 nukleotida yang biasa terjadi pada penyambungan fragmen DNA
ke fragmen atau plasmid lainnya menggunakan bantuan enzim ligase. Walaupun kerjanya
paling efektif digunakan pada gabungan fragmen yang berbentuk komplementer (protruding)
tetapi enzim DNA ligase dapat menyambungkan fragmen dengan ujung tumpul juga.

Gambar XXXXXX. Hasil gabungan antara fragmen biakan dan plasmid sebagai vektor.
(Sumber: Nicholl, Desmond S.T. 2008. An Intoduction to Genetic Engineering. UK: Cambridge
University Press.)

Setelah gen berhasil disisipkan dalam vektor, terdapat beberapa opsi tahapan selanjutnya
yaitu pemasukan gen ke dalam sel. Opsi tersebut yaitu transduksi dengan perantara virus,
transformasi dan transfeksi, transfer gen agrobacterium pada tanaman, dan injeksi gen
menggunakan alat eksternal.

PEMBAHASAN

Teknik Kloning
1. Isolasi DNA Iso-1-Sitokrom C
Miselium yang mengandung gen target Iso-1-Sitokrom C diremajakan dalam
medium agar dengan metode spread plate dan diinkubasi pada temperatur 37C
selama 4 hari. Isolasi DNA dilakukan pada miselium setelah berumur 4 hari dengan
metode kit Wizard Genomic ex Promega Corp. Metode ini menggunakan enzim
litikase untuk memecah dinding sel dan membran sel fungi.
 Miselium yang telah diremajakan kemudian dikerik dari cawan petri kemudian
ditambahkan EDTA (pH 8) dan enzim litikase. Campuran tersebut dihomogenkan dan
diinkubasi pada suhu 37C selama kurang lebih 60 menit. Campuran didinginkan pada
suhu kamar dan disentrifugasi pada 13.000 x g selama 2 menit untuk mendapatkan
endapan. Endapan ditambahi larutan pelisis inti sel (Nuclei Lysis Solution) dan
dihomogenkan kembali.

Campuran tersebut kemudian didiamkan di es selama 5 menit dan disentrifugasi

pada 12.000 x g selama 3 menit untuk diambil supernatannya. Supernatan yang
mengandung DNA tersebut dipindahkan ke dalam tabung mikro telah berisi isopropanol
pada suhu kamar dan dihomogenkan. Sampel kemudian disentrifugasi pada 13.000 x g
selama 5 menit untuk mendapatkan pelet DNA yang kemudian dikeringkan dengan
membalikkan tabung di atas tisu.

Pelet DNA ditambahkan dengan etanol 70% untuk pencucian lalu disentrifugasi
pada 13.000 x g selama 5 menit untuk diambil bagian peletnya dan dikeringkan kembali
dengan membiarkan tabung terbuka selama 10-15 menit. Pelet DNA yang dihasilkan
kemudian ditambahkan larutan dehidrasi DNA dan larutan RNAse dan divorteks selama
5 detik. Isolat DNA diinkubasi pada suhu 37C selama 15 menit dan selanjutnya
didiamkan pada suhu kamar selama 24 jam. Isolat DNA disimpan di lemari es pada suhu
2-8C.

Hasil isolasi DNA dapat dideteksi kemurniannya menggunakan elektroforesis gel

agarosa. Gel agarosa hasil elektroforesis direndam dalam larutan etidium bromida dan
diamati dengan bantuan sinar UV yang akan memperlihatkan adanya pita-pita DNA
menandakan bahwa DNA telah berhasil diisolasi.

2. Desain Primer
Primer yang digunakan dalam cloning berbeda dengan primer mutagenik.
Primer yang digunakan ini terdiri dari dua tipe, yaitu primer forward dan primer
reverse. Berdasarkan desain primer baik dengan Tm antara 55-65C, kandungan GC 40-
60% dan panjang basa primer 18-30 pasang basa, maka jika digunakannya enzim restriksi
BamHI (GGATCC) dan XhoI (CTCGAG) dapat disusun primer yang memenuhi semua
 ketentuan sebagai berikut
Primer forward 5-GCACC-GGATCC-ATG-TTATTCTTATTTCTTC-3
dengan panjang 30 basa, Tm 58.9oC dan GC sebesar 40%.
Primer reverse 5-CGTGG-CTCGAG-TGA-ATAAATACCACCCAAA-3
dengan panjang 29 basa, Tm 61.6oC dan GC sebesar 46.7%.

3. Amplifikasi Gen Iso-1-Sitokrom C dengan PCR

Pada tahap persiapan PCR, semua komponen yang dibutuhkan dicampurkan
dalam satu tabung yaitu larutan buffer, Mg+ sebagai kofaktor enzim, isolat DNA iso-1-
sitokrom C, dNTP, primer forward, primer reverse, dan Taq polimerase. Semua
komponen tersebut disentrifugasi selama beberapa detik dan segera dimasukkan ke
dalam thermal cycler untuk proses amplifikasi PCR. Program PCR diset dengan
kondisi awal 94C selama 3 menit, lalu dilanjutkan tahap denaturasi 94 C selama 30
detik, annealing pada suhu 56C selama 45 detik dan ekstensi pada suhu 72 C selama 3
menit. Jumlah siklus yang dilakukan sebanyak 30 siklus. Hasil PCR dielektroforesis
menggunakan gel agarosa untuk kemudian dilihat di atas UV transluminator dan
selanjutnya dipurifikasi.

4. Ligasi produk PCR (Gen Iso-1-Sitokrom C) ke vektor Pet-23(+)

Ligasi dilakukan dengan mencampurkan gen iso-1-sitokrom C hasil PCR, vektor
Pet-23(+), larutan buffer ligase, dan T4 DNA ligase dalam mikro tubes, dihomogenkan
dan diinkubasi pada suhu 4C selama 24 jam. Namun dibutuhkan juga penambahan
alkalin fosfatase pada larutan vektor sebelum proses ligasi untuk menghilangkan gugus
5P menjadi 5OH agar meminimalisir kemungkinan terjadinya ligasi antar vektor itu
sendiri

5. Transformasi (lanjut bagian mae)

Kesimpulan
Mutagenesis gen iso-1-sitokrom c dari ragi Saccharomyces cerevisiae dapat dilakukan
dengan menggunakan metode mutagenesis PCR site direct
Sebelum melakukan proses mutagenesis, terlebih dahulu gen iso-1-sitokrom c dikloning
dari genom ragi Saccharomyces cerevisiae pada vektor plasmid pET-23(+) kemudian
 ditransformasi ke dalam sel Escherichia coli DH10B
Setelah proses kloning dilakukan isolasi untuk kemudian dilakukan mutagenesis
menggunakan primer mutagenik pada PCR yang akan menghasilkan gen iso-1- sitokrom
c mutan Q69E/K96A/T103C.
Hasil PCR kemudian diberikan perlakuan enzim restrriksi DpnI untuk mendigesti
plasmid rekombinan induk yang tidak termutasi.
Plasmid rekombinan hasil mutagenesis kemudian dipurifikasi dan ditransformasi ke sel
super-kompeten Escherichia coli XL-1 Blue.
Hasil transformasi kemudian dapat diseleksi menggunakan metode seleksi kromogenik
dan antibiotik. Sedangkan hasil mutagenesis kemudian dapat diuji menggunakan
metode sekuensing dan elektroforesis gel agarosa.

Daftar Pustaka

Nicholl, Desmond S.T. 2008. An Intoduction to Genetic Engineering. UK: Cambridge

University Press

Handoyo, Danno. 2000. Prinsip Umum dan Pelaksanaan Polymerase Chain Reaction.
Surabaya : UBAYA
Howe, Christopher. Gene Cloning and Modification, 2nd Edition. Cambrige: University
Cambrige Press