Anda di halaman 1dari 10

TEKNIK ISOLASI DNA DAN PROTEIN PADA TUMBUHAN

Disusun untuk Memenuhi Tugas Mata Kuliah


Teknik Analisis Biologi Molekuler
yang dibimbing oleh Bapak Hendra dan Ibu Dr. Umie Lestari, M.Si

Oleh :
Kelompok 1
Offering I/2015

Aisyatir Rodliyah Bahtiar (150342607659)


Arrum Larasati Rohmania (15034260........)
Clara Kartika Aprilia Pratiwi (150342606501)

UNIVERSITAS NEGERI MALANG


FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
JURUSAN BIOLOGI
November 2017
TEKNIK ISOLASI DNA PADA TUMBUHAN
Menurut Lubis (2013), molekul DNA dalam suatu sel dapat diekstraksi atau diisolasi
untuk berbagai macam keperluan seperti amplifikasi dan analisis DNA melalui elektroforesis.
Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti
protein, lemak, dan karbohidrat. Prisnsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni
penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan
protein, serta pemurnian DNA. Ada beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam proses
isolasi DNA antara lain harus menghasilkan DNA tanpa adanya kontaminan seperti protein
dan RNA; metodenya harus efektif dan bisa dilakukan untuk semua spesies metode yang
dilakukan tidak boleh mengubah struktur dan fungsi molekul DNA; dan metodenya harus
sederhana dan cepat. Isolasi DNA bergantung pada:

1. Banyaknya DNA yang ingin didapatkan dari isolasi.


2. Jenis organisme yang akan diisolasi DNA nya.
Penggunakan CTAB berfungsi untuk mengurangi kontaminan, mengurangi browning
dan untuk menjaga DNA agar tidak rusak
Alat dan Bahan
Alat dan Bahan yang digunakan :
Alat : 10. alat gelas
1. Timbangan analitis 11. mortar dan pestel
2. mesin PCR 12. spatula
3. perangkat elektroforesis 13. gunting
4. gel documentation 14. mikrotube
5. waterbath 15. mikropipet
6. sentrifuge 16. tip mikro
7. microwave oven 17. pH meter
8. lemari es dan freezer 18. tabung mikrosentrifus dan
9. vortex mixer 19. sarung tangan karet.
Bahan :
1. Sampel tanaman muda yang akan diisolasi
2. 300 l buffer ekstraksi CTAB
3. Larutan Chloroform: Isolamyl alkohol atau Chisam
4. Isopropanol
5. 70% etanol
6. 5 L buffer TE (10 mM Tris-HCL, 1 mM EDTA, pH 7,5)
7. 1 L RNAse A (10 mg/mL)
Fungsi Bahan
Komponen-komponen yang terkandung dalam bufer CTAB adalah Tris-Cl, EDTA,
NaCl, CTAB, PVP, dan merkaptoetanol. Tris-Cl berfungsi untuk mendenaturasi protein.
NaCl berfungsi sebagai bahan penetral pada gula fosfat DNA. EDTA berfungsi sebagai
penghancur sel dengan cara mengikat ion magnesium yang diperlukan oleh sel untuk
menjaga keutuhan selubung sel secara keseluruhan. Larutan CTAB, PVP, dan
merkaptoetanol berfungsi untuk mendegradasi senyawa-senyawa metabolit sekunder
sekaligus mengurangi browning akibat oksidasi (Lubis, 2013).
Tahap pertama, perusakan atau penghancuran membran dan dinding sel pelisisan.
Pada proses lisis dengan menggunakan detergen, sering digunakan Sodium Dodecyl
Sulphate (SDS) sebagai tahap pelisisan membran sel. Detergen tersebut selain berperan
dalam melisiskan membran sel juga dapat berperan dalam mengurangi aktivitas enzim
nuklease yang merupakan enzim pendegradasi DNA. Selain digunakan SDS, detergen
yang lain seperti Cetyl Trimethylammonium Bromide (CTAB) juga sering dipakai untuk
melisiskan membran sel pada isolasi DNA tumbuhan (Lubis, 2013).
Penggunaan buffer CTAB seringkali ditambahkan reagen-reagen lain seperti NaCl,
EDTA, Tris-HCl, dan 2-mercaptoethanol. NaCl berfungsi untuk menghilangkan
polisakarida sementara 2-mercaptoethanol befungsi untuk menghilangkan kandungan
senyawa polifenol dalam sel tumbuhan. 2-mercaptoethanol dapat menghilangkan
polifenol dalam sel tanaman dengan cara membentuk ikatan hidrogen dengan senyawa
polifenol yang kemudian akan terpisah dengan DNA. Senyawa polifenol perlu
dihilangkan agar diperoleh kualitas DNA yang baik. Polifenol juga dapat menghambat
reaksi dari enzim Taq polimerase pada saat dilakukan amplifikasi. Di samping itu
polifenol akan mengurangi hasil ektraksi DNA serta mengurangi tingkat kemurnian
DNA. Penggunaan 2-mercaptoethanol dengan pemanasan juga dapat mendenaturasi
protein yang mengkontaminasi DNA (Lubis, 2013).
Pada tahapan ekstraksi DNA, seringkali digunakan chelating agent seperti
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) yang berperan menginaktivasi enzim DNase
yang dapat mendenaturasi DNA yang diisolasi, EDTA menginaktivasi enzim nuklease
dengan cara mengikat ion magnesium dan kalsium yang dibutuhkan sebagai kofaktor
enzim DNAse. DNA yang telah diekstraksi dari dalam sel selanjutnya perlu dipisahkan
dari kontaminan komponen penyusun sel lainnya seperti polisakarida dan protein agar
DNA yang didapatkan memiliki kemurnian yang tinggi. Fenol seringkali digunakan
sebagai pendenaturasi protein, ekstraksi dengan menggunakan fenol menyebabkan
protein kehilangan kelarutannya dan mengalami presipitasi yang selanjutnya dapat
dipisahkan dari DNA melalui sentrifugasi (Lubis, 2013).
Setelah sentrifugasi akan terbentuk 2 fase yang terpisah yakni fase organik pada
lapisan bawah dan fase aquoeus (air) pada lapisan atas sedangkan DNA dan RNA akan
berada pada fase aquoeus setelah sentrifugasi sedangkan protein yang terdenaturasi akan
berada pada interfase dan lipid akan berada pada fase organic. Selain fenol, dapat pula
digunakan campuran fenol dan kloroform atau campuran fenol, kloroform, dan isoamil
alkohol untuk mendenaturasi protein. Ekstrak DNA yang didapat seringkali juga
terkontaminasi oleh RNA sehingga RNA dapat dipisahkan dari DNA ekstrak dengan
cara pemberian RNAse (Lubis, 2013).
Asam nukleat adalah molekul hidrofilik dan bersifat larut dalam air. Disamping itu,
protein juga mengandung residu hidrofobik yang mengakibatkan protein larut dalam
pelarut organik. Berdasarkan sifat ini, terdapat beberapa metode deproteinisasi
berdasarkan pemilihan pelarut organik. Biasanya pelarut organik yang digunakan adalah
fenol atau kloroform yang mengandung 4% isoamil alkohol. Penggunaan kloroform
isoamil alkohol (CIA) berdasarkan perbedaan sifat pelarut organik. Kloroform tidak
dapat bercampur dengan air dan kemampuannya untuk mendeproteinisasi berdasarkan
kemampuan rantai polipeptida yang terdenaturasi untuk masuk atau termobilisasi ke
dalam fase antara kloroform air. Konsentrasi protein yang tinggi pada fase antara
tersebut dapat menyebabkan protein mengalami presipitasi. Sedangkan lipid dan
senyawa organik lain akan terpisah pada lapisan kloroform (Lubis, 2013).
Isoamil alkohol berfungsi sebagai emulsifier dapat ditambahkan ke kloroform untuk
membantu pembentukan emulsi dan meningkatkan luas permukaan kloroform-air yang
mana protein akan mengalami presipitasi. Penggunaan kloroform isoamil alkohol ini
memungkinkan untuk didapatkan DNA yang sangat murni, namun dengan ukuran yang
terbatas (20.00050.000 bp). Fungsi lain dari penambahan CIA ini adalah untuk
menghilangkan kompleks CTAB dan meninggalkan DNA pada fase aquoeus. DNA
kemudian diikat dari faseaquoeus dengan presipitasi etanol (Lubis, 2013).
Pada umumnya digunakan etanol atau isopropanol dalam tahapan presipitasi. Kedua
senyawa tersebut akan mempresipitasi DNA pada fase aquoeus sehingga DNA
menggumpal membentuk struktur fiber dan terbentuk pellet setelah dilakukan
sentrifugasi. Presipitasi juga berfungsi untuk menghilangkan residu-residu kloroform
yang berasal dari tahapan ekstraksi (Faatih, 2009).
Pelarutan kembali dengan buffer TE juga dapat memisahkan antara RNA yang
mempunyai berat molekul lebih rendah dibandingkan DNA sehingga DNA yang
didapatkan tidak terkontaminasi oleh RNA dan DNA sangat stabil ketika disimpan dalam
keadaan terpresipitasi pada suhu -20C (Rosana, 2014).
Langkah Kerja :
Ekstraksi dan Purifikasi DNA
Protokol yang digunakan untuk ekstraksi DNA adalah prosedur ekstraksi yang
dikembangkan oleh Doyle dan Doyle (1987) berbasis CTAB dengan modifikasi
penambahan 1,5% Polivinilpolipirolidon (PVPP).
1. Sampel daun muda segar ditimbang sebanyak 0,5 0,7 g, lalu diletakkan dalam
cawan porselen steril dan ditambahkan 300 l buffer ekstraksi CTAB kemudian
digerus dengan mortar steril sampai daun lumat.
2. Daun sampel yang telah lumat dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 2 ml,
kemudian ditambahkan kembali buffer ekstraksi CTAB sebanyak 300 l dan
divortex selama 2-3 menit.
3. Tahapan selanjutnya dilakukan inkubasi sampel dalam water bath bersuhu 65C
selama 15 menit sambil tabung dibolak-balik setiap 5 menit. Tahapan ini
dilakukan untuk mengoptimalkan kerja buffer ekstrak yang ditambahkan ke dalam
sampel.
4. Sampel kemudian divortex selama 2-3 menit, selanjutnya dilakukan sentrifugasi
sampel dengan kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit pada suhu 25C.
Tujuannya untuk memisahkan debris dan komponen sel lain yang menjadi
penyebab kontaminasi dengan DNA.
5. Supernatan yang telah diperoleh kemudian diambil dan ditambahkan dengan
larutan Chloroform:Isolamylalkohol atau Chisam dengan perbandingan 24:1.
Penambahan Chisam ini dilakukan untuk mengekstraksi DNA dari kontaminan.
Chloroform merupakan pelarut organik yang dapat melarutkan protein, lipid dan
molekul lain seperti polisakarida, sehingga diharapkan akan diperoleh supernatan
berisi DNA yang bebas kontaminan. Suspensi kemudian divortex sampai rata
untuk optimalisasi homogenasi.
6. Selanjutnya suspensi disentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm pada suhu 25C
selama 10 menit, sehingga diperoleh suspensi dengan tiga lapisan: lapisan atas
berwarna hijau jernih, lapisan tengah berwarna hijau keruh dan lapisan bawah
berupa pelet yang berwarna hijau tua.
7. Supernatan pada lapisan paling atas diambil dan ditambahkan dengan 2/3 x
volume larutan isopropanol dingin untuk presipitasi DNA. Supernatan yang telah
ditambahkan isopropanol kemudian digoyang perlahan-lahan dengan cara
membolak-balikkan tabung. Untuk mengendapkan DNA (pelet DNA), larutan
disentrifugasi kembali pada kecepatan 12000 rpm pada suhu 4C selama 20 menit.
8. Endapan DNA dicuci dengan 70% etanol sebanyak 500 l selama dua kali,
disentrifugasi selama 5 menit pada kecepatan 12.000 rpm dengan suhu 4C.
9. kemudian cairan etanol dibuang dan pelet DNA dikeringanginkan, lalu dilarutkan
dalam 50 L buffer TE (10 mM Tris-HCL, 1 mM EDTA, pH 7,5) dan
ditambahkan 1 L RNAse A (10 mg/mL) kemudian diinkubasi pada suhu 37C
selama 30 menit sampai 1 jam. DNA disimpan dalam refrigerator sampai siap
digunakan.
Pengukuran Konsentrasi dan Kemurnian DNA
Pengecekan kuantitas dan kualitas DNA hasil isolasi dilakukan untuk melihat
konsentrasi dan kemurniannya dengan menggunakan spektrofotometer dan
elektroforesis gel. Pengukuran konsentrasi DNA dengan spektrofotometer dilakukan
pada panjang gelombang 260 nm, sedangkan protein diukur pada panjang gelombang
280nm.
1. DNA yang sudah diukur konsentrasinya diencerkan sehingga mendapatkan
konsentrasi yang seragam untuk digunakan dalam analisis PCR. Selanjutnya
dilakukan pengecekan kualitas DNA dengan elektroforesis gel untuk mengetahui
tingkat kemurnian DNA dari kontaminan RNA dan keutuhan DNA hasil isolasi.
Amplifikasi DNA
Reaksi amplifikasi DNA dilakukan menggunakan Mesin PCR (MJ Research
tipe PCT- 100), dengan kondisi PCR sebagai berikut:
1. Satu siklus 3 menit pada suhu 94C, dan diikuti dengan 45 siklus selama 1 menit
pada suhu 94C (denaturasi), 1 menit pada suhu 37C (annealing), 2 menit pada
suhu 72C (ekstensi).
2. Seluruh produk amplifikasi DNA dilengkapi dengan ekstensi selama 1 menit pada
suhu 72C.
3. Analisis PCR dilakukan dengan total reaksi 20 l mengandung 10 ng DNA
genomik cetakan, masing-masing dNTP 0,1 M (dATP, dCTP, dGTP, dan dTTP),
masing-masing primer RAPD 0,25 mol, enzim Taq DNA polymerase 0,04 unit
dalam larutan buffer 1X (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA,
1 mM DTT, 50% glycerol, 0,5% Tween 20, 0,5% nonidet P40 dan MgCl2 1.5
mM).
4. Hasil amplifikasi divisualisasikan menggunakan elektroforesis horizontal dengan
gel agarose 1,5% (w/v) dalam buffer 1X TAE.
5. Gel agarose kemudian direndam di larutan EtBr, sehingga pola pita dapat dilihat
di bawah sinar ultraviolet.
6. Hasil elektroforesis difoto menggunakan BIO-RAD Gel Doc EQ.

TEKNIK ISOLASI PROTEIN PADA TUMBUHAN


Alat dan Bahan :
Alat : 6. Inkubator
1. Kulkas 7. Mikropipet
2. Mortar dan pistil 8. Mikrotip
3. Shaker 9. Sarung tangan
4. Sentrifuge 10. Perangkat elektroforesis
5. Tabung ependorf

Bahan :
1. Sampel tanaman yang akan diisolasi
2. 500 L ekstrak buffer dingin
3. 26 L PMSF 40 mM
4. TCA 20% (1 ml volume supernatan berbanding dengan 200 L TCA 20%)
5. 1000 ml aceton absolute
6. 15 L aquades
Langkah Kerja :
Isolasi Protein Prosedur Stacy dan Aalen, dan Presipitasi (Pengendapan) dengan
TCA:
1. Daun sebanyak 0,1 gram digerus dengan ditambahkan 500 L ekstrak buffer dalam
keadaan dingin.
2. Setelah homogen dipindahkan ke eppendorf yang telah diisi dengan 250 L ekstrak
buffer,
3. Homogenate ditambahkan dengan 26 L PMSF 40 mM dan diinkubasi selama satu
jam dalam refrigerator dengan dishaker sekali 15 menit,
4. Sentrifugasi pada 13.000 rpm selama lima menit dengan suhu 40C. Supernatan yang
didapatkan dipindahkan ke tabung eppendorf baru dan disimpan dalam refrigerator.
5. Pellet disuspensikan dengan menambah 500L ekstrak buffer dan 26L PMSF 40
mM (6,97 mg PMSF dalam 1 ml dMSO).
6. Inkubasi pada suhu 40C selama satu jam dan digoyang sekali 15 menit.
7. Sentrifugasi pada 13.000 rpm selama lima menit dengan suhu 40C.
8. Supernatan yang didapatkan dicampur dengan supernatant pertama dan diendapkan
dengan TCA 20% (1 ml volume supernatan berbanding dengan 200 L TCA 20%)
9. Inkubasi pada suhu -20C selama satu jam.
10. Campuran kemudian disentrifugasi pada 13.000 rpm dengan suhu 40C selama lima
menit.
11. Supernatan yang didapatkan dibuang dan peletnya dicuci dengan menambahkan 1000
ml aceton absolute.
12. Sentrifugasi dengan 13.000 rpm 40C selama satu menit.
13. Pellet yang didapatkan dicuci kembali dengan menambahkan 1000 ml aceton
absolute.
14. Sentrifugasi 13.000 rpm 40C satu menit.
15. Pellet yang didapatkan adalah protein, untuk menghilangkan aseton pellet dikering
anginkan.
16. Protein yang didapatkan dilarutkan dengan 15 L aquades dan selanjutnya
dielektroforesis.
Teknik isolasi DNA metode Saghai-maroof
Alat : 4. Waterbath
1. Mikropipet 5. Inkubator
2. Mikrotip 6. Sentrifuge
3. Mikrotube 7. Kulkas & Freezer
Bahan : 8; 14 M -mercaptoetanol; 2 %
1. Sampel tanaman yang akan diuji (1 CTAB)
gram) 4. PVP sebanyak 0,1 gram.
2. Nitrogen cair 5. Kloroform
3. Buffer CTAB (dH2O; 1 M Tris-HCl 6. Isopropanol
pH 9; 5 M NaCl; 0,5 M EDTA pH 7. Larutan Etanol 70%
8. Buffer TE
Fungsi Bahan
Langkah Kerja :
1. Sampel daun sebanyak 1 gram dipotong halus dan digerus menggunakan nitrogen cair
didalam mortar.
2. Hasil gerusan dimasukkan ke tabung mikro steril ukuran 50 ml. Ditambahkan 1
volume buffer CTAB (dH2O; 1 M Tris-HCl pH 9; 5 M NaCl; 0,5 M EDTA pH 8; 14
M -mercaptoetanol; 2 % CTAB) yang telah dipanaskan pada suhu 65C dan PVP
sebanyak 0,1 gram.
3. Tabung yang berisi campuran dibolak-balik agar homogen.
4. Tabung dimasukkan ke waterbath lalu dilakukan inkubasi selama 60-90 menit pada
suhu 65C, selanjutnya disentrifus dengan kecepatan 4000 rpm selama 10 menit.
5. Hasil sentrifus menghasilkan dua lapisan, lapisan atas yang disebut dengan supernatan
(fase cair) dan lapisan bawah yang disebut pelet (fase padat).
6. Supernatan dipindahkan dengan pipet mikro 1000 l ke tabung mikro baru steril yang
berukuran 1,5 ml. Tabung steril yang berisi supernatan, ditambahkan 1 volume
klorofom dan disentrifus dengan kecepatan 4000 rpm selama 10 menit.
7. Supernatan dipindahkan ke tabung mikrotube baru steril berukuran 1,5 ml.
8. Selanjutnya ditambahkan 1 volume isopropanol lalu dibolakbalik hingga terbentuk
benang-benang DNA.
9. Tabung selanjutnya disentrifus kembali selama 10 menit dengan kecepatan 4000 rpm.
Bagian supernatan dari hasil sentrifus ini dibuang. Pelet dikeringkan pada suhu 37C.
10. Selanjutnya pelet yang mengandung DNA ditambahkan 500 L TE (pH 8) lalu
dibiarkan selama semalam untuk memaksimalkan pelarutan DNA.
11. Perbesar volume DNA dengan cara ditambahkan 200 l TE, lalu tambahkan dengan
700 l fenol, disentrifus selama 10 menit dengan 4000 rpm.
12. Supernatan dari hasil sentrifus diambil, dipindahkan ke tabung baru steril yang
berukuran 1,5 ml. Ditambahkan dengan 1 volume isopropanol dan disentrifus kembali
dengan kecepatan 4000 rpm selama 10 menit.
13. Supernatan dari hasil sentrifus dibuang dan pelet dikeringkan pada suhu 37C. Setelah
itu pelet dibilas dengan 500 l etanol 70% dan dikeringkan. DNA yang telah diperoleh
dilarutkan kembali dengan penambahan buffer TE 100 l. DNA stok disimpan pada
suhu -20C (freezer). Dan DNA kerja disimpan di dalam kulkas pada suhu 4C