Anda di halaman 1dari 3

METODE KERJA

ALAT DAN BAHAN

Bahan yang digunakan adalah , aquades, metanol, n-heksan, etil asetat, n-butanol,
Liberman-Burchard, plat KLT silika gel F254, anhidrida asam asetat, asam sulfat pekat,
dan methanol.

Peralatan utama yang digunakan adalah seperangkat alat KLT, lampu UV-Vis,
spektrometer KG-SM QP-2010 merk Shimadzu kolom Rtx-5MS, spektrometer KG-SM
merk Agilent Technologies kolom DB-5MS.

METODE

1. Pembuatan serbuk simplisia


Proses penyiapan sampel diawali dengan pemilihan sampel tanaman yang akan
digunakan seuai dengan kriteria sampel yang telah ditentukan. Sampel tanaman
yang telah disiapkan kemudian dilakukan pencucian, perajangan, dan
pengerinagn menggunakakan oven pada suhu 50C. Simplisia yang telah kering
kemudian dilakukan penyerbukan hingga diperoleh ukuran simplisia yang
diinginkan.
2. Ekstraksi
Metode ekstraksi buah M. casturi menggunakan metode maserasi. Sampel serbuk
simplisia ditimbang sebanyak 350 g dimaserasi menggunakan mettanol dengan
perbandingan 1 : 2,5. Maserat yang diperoleh diuapkan dengan rotary evaporator
pada suhu 50C.
3. Fraksinasi
Fraksinasi dilakukan menggunakan pelarut organik dengan tingkat kepolaran
yang berbeda, yaitu n-heksan, etil asetat, dan n-butanol.
4. Uji skrining fitokimia steroid
Sebanyak 2 mL larutan sampel ditambah 2 mL asam asetat anhidrat dan 2 mL
asam sulfat pekat (pereaksi Liberman-Burchard). Hasil positif ditandai dengan
perubahan warna menjadi hijau kebiruan.
5. Analisis Fitosterol Teknik KLT
Sampel ditotolkan pada plat silika G254, kemudian dimasukkan ke dalam chamber
yang berisi eluen kloroform-metanol (9:0,5). Plat KLT dikeringkan setelah elusi
berakhir. Pengamatan dilakukan di bawah sinar UV 254 dan 366. Penampakan
bercak yang digunakan adalah pereaksi semprot anisaldehid asam sulfat. Hasil
positif apabila timbul bercak warna ungu-merah atau ungu setelah penyemprotan
di bawah lampu UV 366.
6. Isolasi ekstrak fitosterol menggunakan Kromatografi Cair Vakum

Empat puluh lima gram silika gel 60 for column chromatography


dimasukkan ke dalam kolom sedikit demi sedikit sambil divakum dan diratakan.
Tujuh gram sampel dilarutkan dalam 3 mL campuran metanol - kloroform (1:1
v/v), selanjutnya ditambahkan 5 gram silika gel sedikit demi sedikit sambil
digerus hingga terbentuk serbuk kering yang homogen. Serbuk sampel
dimasukkan ke dalam kolom yang telah terisi silika sambil divakum dan
diratakan. Sampel dielusi dengan campuran gradien fase gerak n-heksana - etil
asetat (9:1; 8:2; 7:3; 6:4; 5:5; 4:6; 3:7; dan 2:8) v/v, etil asetat : metanol (5:5 v/v),
dan 100% metanol. Masing-masing eluen ditampung dalam wadah yang telah
diberi label yang menunjukkan bercak kromatogram yang sama digabung.

7. Pemeriksaaan Kemurnian dengan KLT 2 Dimensi


Senyawa hasil isolasi ditotolkan pada plat KLT lalu dikembangkan dengan
satu sistem fase gerak sehingga campuran terpisah menurut jalur yang sejajar
dengan salah satu sisi. Lempeng diangkat, dikeringkan dan diputar 90o, dan
diletakkan dalam bejana kromatografi yang berisi fase gerak kedua, sehingga
bercak yang terpisah pada pengembangan pertama terletak dibagian bawah
sepanjang lempeng (Harborne, 1987). Fase gerak yang pertama n-heksana - etil
asetat - metanol (5:3:2) dan kedua ditingkatkan kepolarannya n-heksana - etil
asetat - metanol (5:4:2).

8. Analisis dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi.

Ekstrak hasil dari kromatografi kolom ditimbang dengan seksama lalu


dilarutkan dalam kloroform sebanyak 5 mL, disaring menggunakan saringan
membran porositas 0,25 m dimasukan ke dalam vial dan dilakukan sonikasi
selama 15 menit, kemudian di injek sebanyak 20 L ke dalam alat KCKT .
Ditentukan kadar sitosterol

8. Identifikasi senyawa aktif


Ekstrak dan fraksi hasil analisis KLT diinjeksikan ke dalam alat KG-SM. Kondisi
0
running KG-SM QP-2010 merk Shimadzu yaitu temperatur injeksi 280 C. Gas
pembawa yang digunakan adalah gas helium dengan tekanan sebesar 149,9 KPa
dan laju alir 2,77 mL/menit. Kondisi running KG-SM merk Agilent Technologies
yaitu temperatur injeksi 290C, gas pembawa yang digunakan adalah helium
dengan tekanan sebesar 165,47 KPa dan total alir 24,1 mL/menit.