Tcnicas de siembra

En la naturaleza, los microorganismos se encuentran formando poblaciones

mixtas con otros tipos de microorganismos. Los cultivos de estas mezclas se
llaman por ello cultivos mixtos. Sin embargo, el conocimiento de los
microorganismos se consigue mediante el estudio de cepas aisladas, cultivadas
en el laboratorio en cultivos puros (o axnicos).

Aislamiento: Es la separacin de un determinado microorganismo del resto de

microorganismos que le acompaan. El mtodo ms usual es la siembra por
estra simple sobre un medio de cultivo slido adecuado dispuesta en una placa
de petri.

Para ello se toma una pequea cantidad de muestra con un asa de platino y se
reparte sobre la superficie del medio de cultivo. Sobre el medio quedan separadas
e inmovilizadas las clulas bacterianas. Tras la incubacin en condiciones
adecuadas, cada clula viable origina una colonia visible resultado de sucesivas
divisiones celulares.
Cada colonia bacteriana tiene unas caractersticas determinadas en cuanto a su
forma, borde, elevacin, tamao, consistencia, etc. Los tipos de bacterias
presentes en la muestra original son visibles como tipos diferentes de colonias. A
partir de colonias separadas suficientemente es posible obtener un cultivo puro de
cada uno de los tipos de bacterias presentes en la muestra original.
Estras mltiples

Con un asa de siembra, previamente esterilizada, se toma una muestra del cultivo
de microorganismos y se extiende sobre un rea pequea de la superficie de la
placa con agar, en forma de estras muy juntas, pero sin hacer presin para no
daar el agar.
Se flamea el asa, se enfra y despus de rozar la siembra realizada previamente,
se extiende de nuevo por otra zona de la placa haciendo nuevas estras. Este
proceso se repite sucesivamente, flameando y enfriando el asa al comienzo de las
sucesivas siembras en estra. Se lleva la placa a incubar, a la temperatura
adecuada, siempre en posicin invertida.
Mediante esta tcnica se obtienen colonias aisladas a partir de una muestra que
contenga un elevado nmero de grmenes.
Tcnica de los cuatro cuadrantes:

Se divide la placa en cuatro cuadrantes.

Se toma el inoculo y se siembra consecutivamente en 1-2-3-4.Incubar.
En el cuarto cuadrante, al menos, obtendramos colonias aisladas.

Estra por agotamiento

Con ste procedimiento se puede conseguir una buena separacin de las

colonias y aislarlas fcilmente. Para ello se funde el medio de cultivo, se vuelca en
caja de Petri y se deja solidificar. Con el asa previamente esterilizada se toma
material de un cultivo heterogneo y se descarga sobre la superficie del medio
formando estras. Esto puede realizarse de varias formas:

A- Al comienzo se coloca el inoculo, luego se contina con las estras. Cuando

se quiere obtener colonias muy separadas se puede utilizar dos o tres
cuadrantes de la caja de Petri, para lo cual se repite la operacin sin tomar
con el asa nuevo material.
El xito del aislamiento, de la separacin sobre el medio de cultivo, depende de la
superficie sobre la que se ha distribuido la muestra. Es muy importante realizar el
mayor nmero de estras posible. En las primeras estras aparecern colonias
confluentes o una masa continua de microorganismos. En las estras finales
debern aparecer colonias separadas unas de otras. El aislamiento requiere un
reducido inculo de partida. La sucesiva disminucin del tamao de la poblacin
sobre el asa (por descarga sobre el medio de cultivo) al recorrer el medio de
cultivo, debe asegurar que finalmente algunas clulas queden suficientemente
separadas (aisladas unas de otras) sobre la superficie.

Por picadura o puncin

Con una aguja se toma el material que se quiere sembrar y se lo introduce en el

tubo, con medio semislido. Introducir la aguja hasta el fondo, formando un canal
de puncin, trayecto por el cual la retiraremos luego. Este mtodo se utiliza para
estudiar la movilidad de los microorganismos.
Medio de cultivo. Semislido (Medio SIM y MIO)
Instrumento: aguja bacteriolgica
Por picadura y estra en la superficie:

En este mtodo se siembra por picadura en el fondo del tubo y a medida que va
saliendo del botn se realiza una estra en la superficie del gel, esto se hace con la
finalidad de estudiar los cambios que ocurrirn en superficie y profundidad. A lo
largo del canal se desarrollan los microorganismos, y segn lo hagan en la parte
superior o inferior del tubo, estarn indicando su comportamiento frente a los
nutrientes del medio.

Asada en caldo:

Se esteriliza el asa y se toma el inoculo con el asa con punta redondeada y se

esteriliza la boca del tubo y el tapn y posteriormente se introduce el asa dentro
del tubo que contiene medio lquido y se agita con dos o tres movimientos
circulares, se saca el asa del tubo y se vuelve a esterilizar para eliminar el exceso
de microorganismo que haya quedado adherido.
Tcnica de Barry o vaciado en placa

En una placa de Petri vaca se deposita un pequeo volumen conocido de muestra

y a continuacin se aade el medio de cultivo (agar) fundido y atemperado
aproximadamente a 45C. Se mezclan ambos por rotacin suave de la placa. De
esta forma los microorganismos se distribuirn de forma homognea en el medio
de cultivo, permitiendo el desarrollo de colonias separadas por todo el agar.

Tcnica de dilucin seriada

Se basa en contar las colonias de microorganismos que se desarrollan despus

de inocular en un medio de cultivo adecuado e incubar a una temperatura y tiempo
determinados un volumen determinado de muestra. Se utiliza para determinar el
nmero de clulas aisladas o microorganismos unicelulares viables como
bacterias, levaduras, tambin se utiliza para el conteo de esporas fngicas
presentes en la muestra.

La muestra a inocular debe ser homognea y no contener conglomerados de

clulas. Despus de la incubacin cada microorganismo o clula viable formar
una masa visible de organismos, o sea una colonia. De esta manera el nmero de
colonias permitir a su vez determinar el nmero de organismos viables en la
muestra sembrada. Se pueden utilizar sistemas de siembra en superficie, o en
profundidad.

Generalmente la muestra original se diluye para que el nmero de colonias

desarrolladas en la placa se encuentren entre 30 y 300 colonias y as permitir un
ptimo crecimiento y facilitar la lectura. En primer lugar, la muestra se diluye
seriadamente, transfiriendo 1 ml de la muestra a 9 ml de medio estril y se
mezclan adecuadamente. Este proceso se repite hasta obtener una dilucin
apropiada en este ejemplo, 1:100000 (10-5). Posteriormente se aade 0,1 ml a
una placa de agar nutritivo, bien extendindolo en la superficie de la misma
(mtodo de extensin en placa) o mezclndolo con el medio (mtodo de vertido en
placa). Las placas se incuban y se recuentan las colonias que se desarrollan.
Debido a razones estadsticas, las placas deben contener entre 30 y 300 colonias.

Cuando la muestra se diluye el clculo del resultado se realiza contando las

colonias en aquellas placas que tengan entre 30 y 300, se promedia y se multiplica
por el factor de dilucin. Los resultados se expresan en colonias por ml. Los
resultados tambin pueden expresarse en unidades formadoras de colonias
(UFC), el valor de UFC es un valor que expresa el nmero relativo de
microorganismos de un taxn determinado en un volumen de un metro cbico de
muestra.
Tcnica de siembra con asa de Dygralski

Es una tcnica usada para el aislamiento de colonias, que permite igualmente el

recuento de bacterias viables en la muestra, si conocemos exactamente la
dilucin. Consiste en depositar sobre la superficie de una placa con agar una
gota 0,1 ml de una determinada dilucin del cultivo de microorganismos
problema y extenderlo con ayuda del cayado de un asa de Dygralski, previamente
esterilizado, en todas las direcciones hasta que est completamente seco.

Todas las tcnicas de siembra van acompaadas de una incubacin, las placas,
en posicin invertida, a la temperatura deseada (durante 24, 48 72 horas) segn
el tipo de microorganismo. La posicin invertida evitar que el agua de
condensacin se deposite sobre la superficie del medio, dificultando la obtencin
de colonias aisladas. Y los tubos en posicin vertical en una gradilla o frasco de
contencin.

El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado por

una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos, son ajenos por
completo al propio medio. Entre ellos destacan:

Disponibilidad de nutrientes adecuados

Consistencia adecuada del medio
Presencia (o ausencia) de oxgeno y otros gases
Condiciones adecuadas de humedad
Luz ambiental
pH
Temperatura
Esterilidad del medio