PRCTICA No.

Clculos para la preparacin del coctail de reaccin para la PCR

TIPO DE PRCTICA: 1 persona TIEMPO DE DURACIN: 1 h

OBJETIVO
El alumno ser capaz de calcular las cantidades necesarias para preparar
el coctail de reaccin en la PCR de punto final

INTRODUCCIN

La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) es una tcnica cientfica en

biologa molecular para amplificar una o varias copias de una pieza de DNA de
varios ordenes de magnitud, generalmente miles de millones de copias de una
secuencia particular de DNA. La PCR es una tcnica comn e indispensable
utilizada en los laboratorios de investigacin biolgica por su amplia variedad de
aplicaciones (Joshi, 2010). Diversos estudios han demostrado que la
especificidad, el rendimiento y la fidelidad de la PCR se encuentra directamtente
influenciada por diversos componentes que integran la tcnica: 1. La mezcla de
reaccin, 2. regimen de reciclaje y 3. ADN polimerasa. Resulta necesario planificar
en cada caso una metodologa en la que pueda existir un equilibrio entre estos
parmetros, ya que desafortunadamente al ajustar algunas condicioens de la
reaccin para lograr la mayor especificidad no siempre es compatible con un alto
rendimiento, y tratar de optimizar la fidelidad pudiera reducir la eficiencia. Tal es el
caso, que muchas veces el investigador debe decidir cul de estos parmetros
prefiere sobre todo, vindose a veces la necesidad de sacrificar uno por otro
segn sea el caso. La importancia de la PCR en el campo microbiolgico por su
uso, urge la necesidad de concientizar sobre la importancia de revisar y optimizar
los protocolos de procedimiento para cada determiancin que se desee,
estudiando en detalle los posibles factores que influyen negativamente (Bolivar,
2014).

MATERIAL
Materiales

Calculadora
Lpiz
Borrador
Tabla de conversiones

PROCEDIMIENTO

La preparacin de la PCR de punto final se lleva a cabo en dos partes, en

un tubo de 0,5 mL se adiciona el ADN y en un segundo tubo de 2 mL se realiza el
coctail de reaccin. Dicho coctail se preprar en base a las especificaciones del
artculo Confirmational Identification of Escherichia coli, a Compariton of
Genotypic and Phenotypic Assays for Glutamate Descarboxylase and D-
Glucoronidase las cuales se describen en la tabla 1.

Tabla 1. Descripcin del coctail

Buffer 1,25 X
MgCl2 2,5 mM
dNTP 200 M
Oligo 1 0,5 M
Oligo 2 0,5 M
Taq polimerasa 2,5 U

-Preparacin del coctail de reaccin:

1. Revisar las concentraciones de los reactivos como se adquieren. La Taq
polimerasa es adquirida en la EMPRESA PREPARADORA DE REACTIVOS S.A. de
C.V. y las concentraciones con la que son entregados se describen en la tabla 2.

EMPRESA PREPARADORA DE REACTIVOS S.A.

de C.V.
Tabla 2. Inserto Taq polimerasa
Cada caja contiene:
Cantidad Reactivo
24 L Taq polimerasa 5 U
1,25 mL 10 X buffer PCR sin MgCl2
1 mL MgCl2 50 mM
 Los dNTP es adquirida en la EMPRESA PREPARADORA DE REACTIVOS
S.A. de C.V. y las concentraciones se describen en la tabla 3.

EMPRESA PREPARADORA DE REACTIVOS S.A. de C.V.

Tabla 3. Inserto dNTP's
Cada caja contiene:
1,3 mL 2. Mezcla de dGTP, dCTP, dATP, dTTP ; 10 mM de cada
uno

Los oligonucletidos se preparan en un stock de trabajo (20 M).

3. Clcular los volumenes de cada reactivo necesarios para alcanzar las
concentraciones necesarias para la PCR para un volumn de reaccin de
50 L.
4. Calcular el agua adicionada sumando los volumenes de todos los reactivos
y restandselos al volumen de reaccin.
5. Llenar una lista con los reactivos y sus concentraciones, la concentracin
necesaria recomendada para la mezcla de reaccin y el volumen a
adicionar en L.

Nota: Se cuidadoso (a) con las unidades en las que estn los reactivos y las
especificaciones del artculo, deben ser iguales, en caso contrario, convierte
alguno de los dos para que puedan ser utilizadas en los clculos.

RESULTADOS
-Calculos para obtener los volumenes de los reactivos necesarios para
confeccionar el coctail.

1. Buffer

Datos:
Concentracin recomendada 1.25X Volumen de reaccin 50L

Concentracin reactivo 6.25 L

-Usa la frmula C1V1=C2V2; C es la concentracin y V el volumen

X (10X) = (1.25X)(50 L)

X= 6.25 L

2. Cloruro de magnesio (MgCl2)

Datos:
Concentracin recomendada 50 mM Volumen de reaccin 50 L
Concentracin reactivo 50 L

-Usa la frmula C1V1=C2V2; C es la concentracin y V el volumen

X (50 Nm)=(25 L)(50 L)

X= 25 L

3. dNTP

Datos:
Concentracin recomendada 200 nM Volumen de reaccin 50 L

Concentracin reactivo 10 nM

-Usa la frmula C1V1=C2V2; C es la concentracin y V el volumen

200 M = A 1 M/1000 M= 0,2 mM

X (10Mm) = (0,2Mm)(50 M)

X= 1 L

4. Oligonucletido F

Datos:
Concentracin recomendada 0.5 M Volumen de reaccin 50 L

Concentracin reactivo 20 nM

-Usa la frmula C1V1=C2V2; C es la concentracin y V el volumen

X (20Mm)=(50 L)(o,5 M)

X= 1.25 L
 5. Oligonuclotido R

Datos:
Concentracin recomendada 0.5 M Volumen de reaccin 50 L

Concentracin reactivo 20 nM

-Usa la frmula C1V1=C2V2; C es la concentracin y V el volumen

X (20Mm)=(50 L)(o,5 M)

X= 1.25 L

6. Agua adicionada

Bu 6,35

MgCl 25

Oligo f 1.25

Oligo 1.25

DNTP 1

TAQ pol 0,5

= 12.75 -50L= 37.2

 Los volumenes de los reactivos para elaborar el coctail se completan en las
tabla 4.

Tabla 4. Volmen en microlitros de los reactivos

necesarios para el coctail
Agua adicionada 37.2
Buffer 6.25
MgCl2 25
dNTP 1
Oligo 1 1,25
Oligo 2 1,25
Taq polimerasa 0,5

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OBSERVACIONES

aprendimos como calcular estos a diferentes concentraciones ya que el laboratorio

te lo manda en una concentracin y debes de preparar a partir de ellas las
concentraciones a las cuales necesitas, adems que se debe de tener cuidado al
preparar el coctail ya que este depende el PCR.

CONCLUSIONES

Se calcul que cada concentracin para la preparacin del coctail, la cuales son
clculos muy bsicos ya que si se conoce a que concentracin se necesitan los
reactivos solo se necesita sustituir la ecuacin C1V1=C2V2.
BIBLIOGRAFA

1. Bolivar, A.M., Rojas, A., y Garca-Lugo, P., 2014. PCR y PCR multiplex:
parmetros crticos y protocolo de estandarizacin. Avances en Biomedicina
3, 25-33.
2. Joshi, M., and Deshpnade, J. D., 2010. Polymerase Chain Reaction:
Methods, Principles and Application. International Journal of Biomedical
Research 1, 81-97.
3. McDaniels, A.E., Rice, E.W., Reyes, A.L., Johnson, C.H., Haugland, R.A.,
Stelma, G.N., Jr., 1996. Confirmational identification of Escherichia coli, a
comparison of genotypic and phenotypic assays for glutamate
decarboxylase and beta-D-glucuronidase. Appl Environ Microbiol 62, 3350-
3354.
CUESTIONARIO

1. Cules son los cuidados que debo tener al momento de realizar el

micropipeteo?

Al realizar el micropipeteo es necesario soltar el pistn de manera adecuada para

que el contenido selecionado sea el que se agregado

2. En qu consisten las concentraciones dadas en X?

Es una medida de la concentracin de un soluto en una disolucin, ya sea

alguna especie molecular, inica, o atmica. Se define como
la cantidad de soluto (expresada en moles) por litro de disolucin, o por unidad de
volumen disponible de las especies.

3. Cmo se define la molaridad?

Se define como la cantidad de soluto (expresada en moles) por litro de disolucin,

o por unidad de volumen disponible de las especies.

4. Por qu las enzimas se miden en unidades (U)?

Se define como la actividad cataltica responsable de la transformacin de

un mol de sustrato por minuto en condiciones ptimas de la enzima. Se utiliza
tambin en combinacin con otras unidades (U/mg de protena o U/mL) para
sealar, respectivamente, la actividad enzimtica especfica o la concentracin de
actividad enzimtica.

5. Por qu razn se adicionan la mayora de los reactivos al agua adicionada?

Para no modificar la concentracin de cada una de los reactivos que se le integran
al coctail.

MECANISMO DE EVALUACIN

La presente se calificar en una escala del 0 al 100 y los puntos a evaluar se listan a
continuacin:

Aspecto a evaluar Porcentaje

Asistencia, puntualidad y disciplina en la prctica 5
Resolucin completa del cuestionario antes de la prctica 20
Evaluacin oral 30
Desempeo y solucin a problemas 20
Registro de datos 5
Resultados y conclusiones 20

MEDIDAS DE SEGURIDAD Y SALUD OCUPACIONAL

La presente prctica no representa ningua actividad que requiera medidas

de seguridad o salud ocupacional.

DISPOSICION DE DESECHOS FSICOS, QUMICOS Y BIOLGICOS

En sta prctica no se generan residuos fsicos, qumicos o biolgicos.