Anda di halaman 1dari 4

I.

Pembahasan
Pada praktikum kali ini dilakukan uji untuk mengetahui kinetika reaksi enzim yang
berikatan dengan substrat.
Pertama-tama pengujian dilakukan pada saat t = 0 menit.
Disiapkan tabung reaksi sebanyak 5 buah kemudian diisi oleh buffer fosfat dalam
berbagai konsentrasi. Di sini buffer fosfat berguna untuk mempertahankan pH optimum
enzim agar tidak mudah berubah akibat penambahan sedikit asam maupun basa. Lalu
dimasukkan tripsin ke dalam masing-masing tabung. Tripsin di sini berperan sebagai
enzimnya. Di mana fungsi enzim tripsin adalah untuk mengubah tripsinogen menjadi
tripsin aktif dan menghidrolisis protein yang dihasilkan oleh pancreas, seperti teori yang
disampaikan Poedjiadi (2006). Kemudian ke dalam masing-masing tabung ditambahkan
larutan TCA 20%. Larutan TCA ini berguna sebagai zat yang dapat menghentikan
mekanise pengikatan antara enzim dan substrat, serta pH optimum enzim tripsin adalah
sekitar 7.8-8.7 (Anonim2, 2015) . Berikutnya semua tabung diinkubasi pada suhu 35oC,
suhu ini merupakan suhu optimum kerja enzim tripsin. Setelah diinkubasi, tabung
diambil dan ke dalam masing-masing tabung dimasukkan larutan kasein dalam berbagai
konsentrasi, kasein berperan sebagai substrat, di mana kasein merupakan golongan
protein yang komposisinya mencapai 80% dari komposisi keseluruhan protein susu
(Anonim, 2014). Setelah itu semua tabung direndam di dalam air es dengan tujuan
memperjelas bentuk dari endapan jika terdapat endapan. Setelah penambahan kasein dan
didinginkan di air es tersebut, hasil yang didapat praktikan adalah bahwa dari tabung ke 1
sampai tabung ke 5 kekeruhan pada larutan terlihat semakin jelas. Hal ini terjadi karena
perbedaan konsentrasi buffer fosfat dan konsentrasi substrat yang berbeda pada setiap
tabung. Dapat dinyatakan bahwa selain menurunnya konsentrasi buffer fosfat pada
tabung 1 sampai tabung 5, konsentrasi substrat malah semakin banyak, namun bukannya
meningkatkan kinetika reaksi enzim, tetapi malah menurunkan kinetikita reaksinya
disebabkan konsentrasi enzim yang konstan diberikan pada setiap tabung, sehingga hanya
tabung 1 saja yang dapat lebih banyak mengubah substrat menjadi produk yang ditandai
lebih banyaknya larutan yang bening dibandingkan dengan larutan yang putih keruh.
Sebaliknya, pda tabung 5 keseluruhan larutan berwarna putih keruh dan terdapat
endapan, adanya endapan menandakan bahwa enzim terdenaturasi sehingga tidak dapat
mengubah substrat menjadi produk. Tahap selanjutnya, kelima larutan disentrifugasi dan
disaring untuk mendapatkan supernatantnya. Hasil filtrasi lebih lanjut dilakukan dengan
cara metode Anson, yaitu memakai prinsip kerja spektrofotometri yang menggunakan
instrument uv-vis. Untuk mendapatkan data serapan dari kelima supernatant yang ada
harus ditambahkan dulu oleh NaOH, yang berguna untuk menetralkan TCA-filtrat yang
bersifat asam, danditambahkan ragen Folin-Ciocalteu yang berguna sebagai senyawa
kromogenik sekaligus senyawa yang akan mencari gugus aromatic pada enzim yang
berada di supernatant agar dapat mengubah fosfotungstat dan malibdan menjadi tungstat
dan malibdenum yang hasilnya merupakan senyawa berwarna biru kehijauan agar dapat
diukur serapannya pada instrument spektrofotometer yang memiliki syarat bahwa larutan
harus bersifat netral, tidak boleh asam maupun basa, dan larutan yang diukur serapannya
harus memiliki warna agar dapat terbaca.
Setelah kelima supernatant telah berwarna, segera dilakukan pencarian nilai
absorbansi yang sebelumnya harus ditunggu selama 10 menit guna mengoptimalkan kerja
reagen Folin-Ciocalteu terhadap supernatant. Pengujian dilakukan pada panjang
gelombang 650 nm (panjang gelombang sinar tampak). Lalu di dapatlah hasil beberapa
serapan seperti yang ada pada data pengamatan.

Pengujian dilakukan pada saat t = 20 menit.


Pada pengujian ini yang dilakukan pertama kali adalah menginkubasi kelima
tabung yang sudah berisi kasein (sebagai substrat) pada suhu 35oC, yaitu suhu optimum
bagi enzim tripsin. Tiap tabung diaduk agar homogeny tetapi tidak boleh sampai berbusa.
Kemudian pada tiap tabung ditambahkan buffer fosfat dalam berbagai konsentrasi diikuti
penambahan larutan tripsin yang jumlahnya konstan. Setelah itu semua tabung diinkubasi
pada suhu 35oC tepat 20 menit setelah penambahan tripsin, hal ini dilakukan dengan
tujuan enzim dapat bekerja optimal lagi pada suhu 35oC setelah sebelumnya telah
mengalami penurunan suhu yang drastis. Untuk menghentikan reaksi enzim-substrat,
ditambahkan larutan TCA 20% ke dalam masing-masing tabung dan diaduk agar
homogen, dan kelima tabung kembali direndam di dalam air es dengan tujuan untuk
menyempurnakan pengendapan. Setelah penambahan TCA dan telah direndam di dalam
air es, didapat hasil yang sama seperti pada t = 0, di mana larutan akan semakin keruh
dan menghasilkan endapan pada tabung 4 dan tabung 5 akibat perbedaan konsentrasi
substrat, konsentrasi enzim, konsentrasi buffer dan perubahan suhu lingkungan yang
drastis di awal percobaan t = 20 menit ini. Hal ini menandakan bahwa pada tabung 4 dan
5, enzim sudah terdenaturasi karena terdapatnya endapan pada dasar tabung.
Setelah itu kelima tabung disentrifugasi, kemudian disaring untuk diambil
supernatantnya. Filtrate yang sudah didapat selanjutnya dilakukan dengan metode Anson.
Perlakuannya sama, ditambahkan NaOH untuk menetralkan asam dari TCA, dan
ditambahkan reagen Folin-Ciocalteu untuk member warna pada supernatant agar dapat
diuji pada instrument spektrofotometer, dan pengujian juga dilakukan pada panjang
gelombang 650 nm. Kemudian data absorbansi dari maing-masing supernatant dapat
diperoleh sesuai yang dicantumkan pada data pengamatan.

Penjelasan Kurva
Kurva pertama adalah kurva Michealis-Menten, pada kurva ini terlihat fluktuatif
sehingga sulit sekali ditentukan Vmaks dari kurva tersebut. Seharusnya kurva yang
terbentuk seperti:

Sehingga jika kurva seperti yang ada di atas, maka dapat langsung dihitung Vmaks dan
dapat ditentukan nilai KM-nya. Namun kurva yang didapat tidak sesuai yang praktikan
inginkan, beberapa faktor penyebab terjadinya fluktuatif pada kurva ini yaitu akibat
enzim yang digunakan mungkin saja sudah mendekati batas daluwarsanya, dan data
absorbansi pada tabung 2 pada t = 20 menit kami dapatkan dari kelompok lain, yaitu dari
kelompok 4 karena pada saat pengerjaan tabung 2 oleh kelompok 2 mengalami kesalahan
dalam data absorbansinya, sehingga tidak memungkinkan praktikan pada kelompok ini
untuk memakai data absorbansi dari kelompok 2.
Kurva yang kedua adalah kurva Linewaver-Burk, kurva ini dibuat dengan tujuan
agar kurva yang dihasilkan memiliki kemiringan sehingga dapat dengan tepat didapatkan
hasil regresi yang digunakan untuk menghitung nilai Vmaks dan KM.
Kesimpulan dari kedua kurva adalah bahwa kemampuan berikatan enzim dan
substrat menurun akibat beberapa faktor, baik dari konsentrasi enzimnya, konsentrasi
substratnya, senyawa tambahan yang bersifat menghentikan mekanisme kerja ezim
berikatan dengan substrat, dan suhu serta pH optimum enzim.
Nilai Vmaks yang dihasilkan seharusnya sedikit lebih besar karena jika
konsentrasi substrat meningkat, maka hal tersebut dapat meningkatkan kecepatan awal
reaksi serta meningkatkan kemampuan enzim untuk berikatan dengan substrat. Dan saat
sudah dalam keadaan enzim yang jenuh akibat banyaknya substrat akan dihasilkan nilai
Vmaks yang konstan, nilai ini seharusnya cukup besar jika kemampuan berikatan enzim
dan substatnya benar-benar tinggi, namun hasil yang praktikan dapatkan yaitu nilai
Vmaks hanya 0,0118 dan nilai KM = 0,01192. Yang menandakan benar bahwa
kemampuan berikatan enzim dan substrat menurun ditandai tidak besarnya nilai Vmaks
yang dihasilkan. Dan karena nilai Vmaks kecil, maka mempengaruhi hasil dari nilai KM
juga, sehingga nilai KM yang didapat juga kecil.